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pdf-Dokument - ULB Bonn :: Amtliche Bekanntmachungen und

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1. Fotos M Diestelhorst Einige Firmen haben Applikationshilfen entwickelt um die Compliance zu verbes sern Die Firma Chibret bietet einen kleinen Spiegel an der mit einer Haltevorrichtung an der Augentropfflasche fixiert werden kann Beim Eintr ufeln der Augentropfen kann der Patient durch einen Blick in den Spiegel kontrollieren ob sich der Tropfer unmit telbar ber dem Auge befindet Damit kann der Tropfen exakt platziert werden 25 Eine Studie die dem Vergleich der Anwendung mit und ohne Augenspiegel dienen sollte zeigte eine Abnahme der Fehlapplikationen durch Zuhilfenahme des Spiegels Zus tzlich konnten die Spiegel Probanden ihre Therapiezeit mit einem Flaschenin halt verl ngern also die Tagestherapiekosten senken 74 2 THEORETISCHER TEIL Ein weiteres von der Firma Owen Mumford entwickeltes Hilfsmittel zur Applikation von Augentropfen ist ein Trichter mit Gewinde Autodrop Fa Owen Mumford Bielefeld Nach Einschrauben der Augentropfflasche an der verjUngten Seite des Trichters wird dieser mit der weiten Seite ber beide Lider des ge ffneten Auges gest lpt und der Tropfen in den Bindehautsack getr ufelt Die Firma Blokland Pack Rowa Techniek ljsselstein Niederlande hat eine hnliche Applikationshilfe mit dem Namen Drip Aid entwickelt Aus Schweden kommt der Sonyl Novum Tropfbeh lter bei dem ein Schutzring sowohl die Verunreinigung der Flasche durch die Ber hrung des Lidrandes als auch die Ver
2. I VII G lker C Gefriertrocknung biotechnologischer Produkte J Pharm Tech 1989 10 30 Greaves RIN Centrifugal Vacuum Freezing Its Application to the Drying of Biological Materials from the Frozen State Nature 1944 153 485 487 Grunthal S Dry Drops Entwicklung und Pr fung eines Trockengel Applikators zur Anwendung am Auge Dissertation Bonn 1996 Infinity Meters INFT 1001 Operator s Manual Newport Electronics GmbH Deckenpfronn Jennings TA Lyophilization for the Pharmaceutical Industry Seminar Notes Phase Instruments Inc Bala Cynwyd Pennsylvania USA 1993 Jennings TA Role of Product Temperature in the Lyophilization Process Insight Journal online www phase technologies com April 1998 1 2 Jennings TA Lyophilization Introduction and Basic Principles Denver Colorado USA Interpharm Press 1999 187 31 32 34 36 37 Jumo Mess und Regeltechnik Typenblatt 90 1221 fur Mantel Thermoelemente nach DIN 43 710 und IEC 584 M K Juchheim GmbH amp Co Fulda Deutschland Kang HW Tabata Y Ikada Y Fabrication of porous gelatine scaffolds for tissue engineering Biomaterials 1999 20 1339 1344 Kircher W Hinweise zur richtigen Aufbewahrung und Anwendungstechnik von Arzneimitteln in Gebler H Kindl G Pharmazie f r die Praxis 3 Auf lage Stuttgart Deutscher Apotheker Verlag 1998 212 214 Kramer M Innovatives Einfrierverfahren zur Minimierung d
3. Q e Wes Warmemenge Energiemenge J g c spezifische W rme von Wasser zwischen 20 C und 10 C 4 19 J g K Q Schmelzwarme von Eis 60131 J mol 334 J g c spezifische W rme von Eis temperaturabhangig J g K T Gefriertemperatur des Wassers 0 C T Anfangstemperatur des Wassers 20 C Raumtemperatur T Endtemperatur des Eises 0 C Da hier nur die W rmeabgabe bis zum Einfrieren ber cksichtigt werden soll ist die Endtemperatur des Eises identisch mit der Gefriertemperatur des Wassers Dadurch vereinfacht sich Gleichung 1 wie folgt 45 2 THEORETISCHER TEIL 2 Or IW es Cw l 7 1 Q H Da in der Pharmazie h ufig sterilfiltrierte L sungen verwendet werden kommt es beim Einfrierprozess zu einer deutlichen Unterk hlung der L sung Diese Unterkuh lung muss energetisch mit berucksichtigt werden Im Folgenden wird eine Unterkuh lung von 10 K angenommen Nach dem Einsetzen des Kristallisationsprozesses steigt die Eistemperatur dann wieder auf 0 C an Deshalb kann trotzdem mit der vereinfachten Gleichung 2 gerechnet werden Durch Einsetzen der Werte ergibt sich J K J Qes W es 4 19 20 10 334 pa Z g K g Ore Wes 459 1 Z Diese Energiemenge pro Gramm muss der w ssrigen L sung von 20 C entzogen werden um diese bei einer angenommenen Unterkuhlung von 10 K vollstandig durchzufrieren Beim schnellen Evakuieren der Trockenkammer
4. die Anzahl der Gasmolek le berechnen die sich im Volumen V aufhalten Deren Anzahl ist gleich der Anzahl der Kollisionen Allgemeines Gasgesetz P V n R T 2 P Kammerdruck N m V durchsetztes Volumen m n Stoffmenge des Gases mol R allgemeine Gaskonstante J mol K T Gastemperatur C Um die Anzahl an Gasmolek len zu erhalten muss die Avogadrokonstante N mol in die Gleichung 2 eingef hrt werden Dazu werden beide Seiten mit dieser multipliziert 3 Ny P V n N R T 3 42 2 THEORETISCHER TEIL Jetzt setzt man n N z welches der Anzahl der Partner entspricht mit denen das Molekul kollidiert Aus 3 ergibt sich N R T 8 Zur Vereinfachung wird nun die Boltzmann Konstante k in Gleichung 4 eingef hrt mit k J K ergibt sich A Jetzt wird 1 in 5 eingesetzt 7 d v 2 m N si ok t d v m m N K 6 mit Nem J j eae k T K s m J S Zeit amp Daraus ergibt sich folgender Zusammenhang indem aus der Zeit r ber die Geschwindigkeit v die in dieser Zeit zur ckgelegte Strecke sm berechnet wird ae es Sm z gt t mit v ergibt sich sm t n 43 2 THEORETISCHER TEIL Die MFW oder die durchschnittliche Distanz zwischen zwei Gas Gas Kollisionen errechnet sich nun nach 7 mit J N m kd V kT er amp Distanz K m2 N Kollision In den Gefriertrocknungsversuchen soll mit Prozessdr cken unt
5. en offenen Kan le im Inneren des Lyophilisates und die Oberfl chenstruktur mit Gefrierkonzentration als Gesamtbild betrachten Abb 4 35 Schematisch ist dieser Aufbau noch einmal als Zeichnung in Abb 4 36 dargestellt Abb 4 31 bis 4 35 REM Aufnahmen von OLCS die unter Atmosph rendruck eingefroren wurden Methode 1 250 ug HPMC E50 204 ug Fluorescein Natrium Abb 4 31 Detailaufnahme der Lyophilisatun Abb 4 32 Lyophilisatr ckst nde auf der terseite Durch die filigrane Bodenstruktur PTFE Folie lassen sich in der Tiefe die gro en weiten Kan le erkennen 127 4 ERGEBNISSE UND DISKUSSION Abb 4 33 AuBere Form des Abb 4 34 Gefrierkonzentration Lyophilisattropfens Detailaufnahme der Produktoberflache mit auskristallisiertem Wirkstoff YAAN Af i Abb 4 35 Vertikalschnitt durch die Lyophilisatmitte 128 4 ERGEBNISSE UND DISKUSSION surface layer ice interstitial solution columnar zone equiaxed zone i C EN bottom of sample container Abb 4 36 Schematische Darstellung der Lyophilisatstruktur erhalten durch langsames Einfrieren 33 Methode 2 Beim Einfrieren unter langsamem Evakuieren mit 13 4 mbarL s Ventilstellung 530 ergaben sich Lyophilisate mit einer durchschnittlichen Haftfestigkeit von 14 4 g vgl Tabelle 11 Durch den gleichzeitigen W rmeentzug von unten durch die kalte Kondensatorfl che und von oben durch Verdampfung des L sungsmittels kommt es
6. free drug delivery system Graefe s Arch Clin Exp Ophthalmol 1999 237 394 398 Diestelhorst M Betablocker Prostaglandin Analoga Die Therapie muss patientenfreundlicher werden in Erb C Krieglstein GK Glaukom Fragen zur Praxis K ln Agamede Verlag 2000 166 179 Dinslage S Weichselbaum A S verkr p R Diestelhorst M Krieglstein GK Fluorescein Lyophilisate Pharmacokinetics of Fluorescein in the Human Anterior Segment Investigative Ophthalmology and Visual Science 2000 41 4 Dolan JP Use of Volumetric Heating to Improve Heat Transfer during Vial Freeze Drying Dissertation Virginia Polytechnic Institute and State University Blacksburg Virginia 1998 Dolder R Skinner F Ophthalmika Pharmakologie Biopharmazie und Galenik der Augenarzneimittel 4 Auflage Stuttgart Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft mbH 1990 354 372 399 186 20 22 23 24 25 26 27 28 29 Eckhardt B Lyophilisation von niedermolekularen Substanzen Peptiden und Proteinen in Essig D Oschmann R Lyophilisation Stuttgart Wissen schaftliche Verlagsgesellschaft 1993 Flink J in Goldblith SA et al Freeze Drying and Advanced Food Technol ogy Academic Press 1975 143f Fluorescein Natrium Pr fzertifikat Firma Synopharm GmbH Barsb ttel 1999 Franks F Improved Freeze Drying An Analysis of the Basic Scientific Principles Process Biochemistry 1989 24 1 Supplement ProBioTech
7. g 5 0 5 10 15 20 25 30 35 Evakuiergeschwindigkeit mbarL s Abb 4 30 Abh ngigkeit der Haftfestigkeit von der Evakuiergeschwindigkeit Lyophilisate aus 250 ug HPMC E50 und 204 ug Fluorescein Natrium jeweils n 10 ein Fehlerbalken entspricht einer Standardabweichung Anhand einer statistischen Auswertung soll nun berpr ft werden ob die Haftfestig keitsdifferenzen signifikant sind Die Annahme homogener Varianzen wird mit p 0 614 nicht verletzt Levene Test Der Kolmogorov Smirnov Test ergibt mit p 0 255 das Vorliegen einer Normalvertei lung Damit sind beide Voraussetzungen erfullt um eine einfaktorielle Varianzanaly se durchzuf hren Es zeigt sich ein statistisch h chst signifikanter p lt 0 001 Unterschied zwischen den drei Evakuiergeschwindigkeiten in Bezug auf die Haftfestigkeit der Lyophilisate auf der PTFE Folie Post hoc wird mit dem Fischers Least Significance Difference LSD Test gezeigt dass sich alle drei Methoden h chst signifikant voneinander unterscheiden jeweils p lt 0 001 Eine Ver nderung der Evakuiergeschwindigkeit auf den untersuchten Niveaus hat also einen h chst signifikanten Einfluss auf die resultierende Haftfestigkeit der 129 4 ERGEBNISSE UND DISKUSSION entsprechenden Lyophilisate Dieser signifikante Unterschied hat praktische Rele vanz da die geringsten Haftfestigkeiten bei Methode 1 in einem Bereich liegen in dem sich die Lyophilisate bei der Handhabung bereits vom
8. l Fl ssigstickstoff Reservoir Dichtfl che Thermoelement f r Produkttemperatur Edelstahlkasten Stopfen mit radialer o Ring Dichtung TI Dja p aL ZZ NT m u Y Thermoclemen zur Steuerung der Trockenkammer Heizpatrone Kondensator Abb 4 1 Schemazeichnung des Prototyp 1a Technische Zeichnung B Neff Fertigung S Horst 85 4 ERGEBNISSE UND DISKUSSION Aluminiumblock mit integrierter Heizpatrone Kunststoffring und Thermof hler zum Enteisen des Kondensators Kunststoffstopfen Ausfr sung zur Aufnahme m Abdichtung des Lyophilisattr gers mit hier ohne O Ring Thermof hler Abb 4 2 Produkthalter des Mini Gefriertrockners Prototyp 1a Problematik bei der Verwendung von Prototyp 1a Der direkte Kontakt der metallischen Dichtfl che Abb 4 1 Dichtfl che zum 196 C kalten Kondensator f hrte innerhalb k rzester Zeit zu einem starken W rmeentzug an der Dichtfl che Trotz der Verwendung von bis 80 C temperaturbest ndigem Viton als Material f r den O Ring verspr dete dieser dadurch reversibel dichtete nicht mehr ausreichend ab und das Vakuum in der Trockenkammer brach zusammen Prototyp 1b Abb 4 3 Um die starke Abk hlung der Ringdichtung zu vermeiden wurde ein 3 cm langes sehr d nnes Edelstahlrohr mit neuer Dichtfl che um das urspr ngliche Trockenrohr auf den Metallkasten aufgeschwei t Aufgrund der durch das sehr d nne und somit schlecht w rmeleitende Met
9. 3 8 1 ist f r diesen Fall ann hernd das Ausgangsverh ltnis erreicht Schlie lich zeigt die graphische Darstellung der R ckstandsmengen bei Lyophilisa ten mit 68 ug Wirkstoffgehalt abh ngig von Einfrierbedingungen und Polymergehalt eindeutig eine Ver nderung zwischen 13 4 mbarL s und 33 5 mbarL s Von 1 65 mbarL s ber 10 0 mbarL s bis 13 4 mbarL s Evakuiergeschwindigkeit nehmen die Restmengen unabh ngig vom Polymergehalt linear stark zu Bei 33 5 mbarL s fallen die Werte pl tzlich deutlich ab Abb 4 79 Die Zusammenstellung der verschiedenen Effekte belegt dass sich zwischen einer Evakuiergeschwindigkeit von 13 4 mbarL s und 33 5 mbarL s die Einfrierrichtung umkehrt Durch ein Entgasen der L sungen k nnten eventuell noch h here Evaku iergeschwindigkeiten erreicht und reproduzierbar angewendet werden ohne dass rothing Sch umen die Proben zerst rt Eine genauere Untersuchung dieses Bereiches k nnte weitere interessante Effekte zeigen die sich zur Einstellung bestimmter Eigenschaften der Lyophilisate eignen k nnten 173 4 ERGEBNISSE UND DISKUSSION 4 4 6 Restfeuchtebestimmung der Lyophilisate nach Karl Fischer Jeweils 5 Lyophilisate mit 68 ug Fluorescein Natrium und 125 ug 250 ug und 375 ug HPMC E50 hergestellt unter verschiedenen Einfrierbedingungen wurden nach der Karl Fischer Methode auf ihre Restfeuchte untersucht Der Prototyp 4 des Mini Gefriertrockners diente zur Herstellung Es wurde berpr ft ob
10. 4 2 Charakterisierung der verwendeten Polymerl sungen 98 4 2 1 Bestimmung der Dichte bei 20 C 98 4 2 2 Bestimmung der Viskosit t nach Ubbelohde 98 4 2 3 Bestimmung der Dosiergenauigkeit der verwendeten Pipette 101 INHALTSVERZEICHNIS 4 3 Gefriertrocknung 4 3 1 Verlauf der Einfrier und Trocknungskurven 4 3 2 Entwicklung verschiedener Einfriermethoden 4 3 3 Reproduzierbarkeit von Einfrier und Trocknungsbedingungen 4 3 4 Einfluss der Wirkstoffkonzentration auf den Trocknungsverlauf 4 4 Einfluss von Lyophilisatzusammensetzung und Einfrierbedingungen auf die Eigenschaften von OLCS 4 4 1 Aufzeichnung von Kraft Weg Diagrammen zur Ermittlung der Haftfestigkeit von Lyophilisaten auf der PTFE Folie 4 4 1 1 Einfluss der Einfriermethode auf die Haftfestigkeit 4 4 1 2 Einfluss des Wirkstoffgehaltes auf die Haftfestigkeit 4 4 1 3 Einfluss des Polymergehaltes auf die Haftfestigkeit 4 4 1 4 Sonstige Erkenntnisse zur Haftfestigkeit Ver nderung des Anlagendesigns 4 4 2 Einfluss auf die Druckfestigkeit der Lyophilisate 4 4 2 1 Einfluss der Einfriermethode auf die Druckfestigkeit 4 4 2 2 Einfluss des Polymergehaltes auf die Druckfestigkeit 4 4 2 3 Quantifizierung der Druckfestigkeit 4 4 3 Erkenntnisse zu Haft und Druckfestigkeiten durch klinische Studien 4 4 4 Restmengenbestimmung auf den Tr gerfolien 4 4 4 1 Abh ngigkeit der Restmengen von den Einfrierbedingungen 4 4 4 2 Abh ngigkeit der Restmenge vom Wirkstoffgehal
11. Abschnitt wurde gezeigt dass ein Einfluss des Wirkstoffgehaltes auf die Haftfestigkeit besteht Da nicht der Wirkstoffgehalt zur Einstellung der Haftfestigkeit und somit des Abl severhaltens der OLCS herangezogen werden kann wird nun untersucht ob die Haftfestigkeit ber die Ver nderung des Polymergehaltes in Kom bination mit der Evakuiergeschwindigkeit gezielt variiert werden kann Dazu wird der in den bisherigen Haftfestigkeitstests untersuchte Polymergehalt von 250 ug pro OLCS einprozentige Ausgangsl sung halbiert 0 5 HPMC E50 in der L sung 125 ug pro OLCS und um die H lfte erh ht 1 5 Polymer in der L sung 375 ug pro OLCS Aus diesen Polymerl sungen werden OLCS mit einem Fluorescein Natrium Gehalt von 68 ug entsprechend der Normaldosis von handels blichen Fluo resceinaugentropfen bei vier unterschiedlichen Einfrierbedingungen hergestellt jeweils n 5 In Abb 4 53 zeigt sich eine nderung in der Haftfestigkeit bei einfach dosierten OLCS nur im Bereich einer Evakuiergeschwindigkeit zwischen 0 und 13 4 mbarL s Daher soll im folgenden Versuch dieser Bereich n her untersucht werden Deshalb wurden Evakuiergeschwindigkeiten von 1 65 mbarL s 10 mbarL s und 13 4 mbarL s ausgew hlt 137 4 ERGEBNISSE UND DISKUSSION Um zu untersuchen ob sich auch bei unterschiedlichen Polymergehalten eine weite re Erh hung der Evakuiergeschwindigkeit nicht mehr deutlich auf die Haftfestigkeit auswirkt ist auch die Methode mit 33
12. An diese Aluminiumkammer wurde wiederum eine Trockenkammer vakuumdicht angeschlossen Allerdings wur de diese jetzt aus Messing statt aus Acrylglas gefertigt Um den Gefriertrocknungs prozess weiterhin beobachten zu k nnen wurde ein kleines Sichtfenster eingebaut Abb 4 10 Die Kondensatorfl che wurde nach vorne bis in die Trockenkammer aus Messing unterhalb der Strahlungsheizung verl ngert um die Distanz zwischen Sub limationsfront und Kondensator so klein wie m glich zu halten Ein integriertes Ther moelement diente der berpr fung ob das vordere Ende des Kondensators schnell genug ausreichend kalt wurde Der kapazitive Drucksensor wurde wieder hinter die Kammer zum Rohrsystem verlegt Der Vorratsbeh lter aus Rohacell wurde an der Kontaktfl che zur Aluminiumkammer mit einer d nnen Edelstahlfolie beklebt Abb 4 7 vergr erter Ausschnitt Dies diente der Abdeckung der por sen Roha cell Struktur und sollte eine mikrobiologische Kontamination einschr nken Dadurch w re zus tzlich ein Sterilisieren mit ges ttigtem gespannten Wasserdampf m glich 93 4 ERGEBNISSE UND DISKUSSION Kupferzylinder K hlmittelreservoir aus Rohacell Strahlungsheizung K re apazitiver Druckmesser i HX Sichtfenster A i sa et a s H N ondensatorkammer Trocknungskammer aus Aluminium aus Messing Thermoelement zur Ermittlung Halbrohr aus der Kondensatortemperatur Messing als
13. Applizierbarkeit der OLCS zu gew hrleisten Eine alleinige Angabe der Haftkraft reicht also nicht aus Aufgrund der besonderen Applikations weise der OLCS gibt es f r jedes Haftfestigkeitsintervall einen dazu geh renden optimalen Druckfestigkeitsbereich der experimentell ermittelt werden muss Durch die beiden Parameter Evakuiergeschwindigkeit und Polymergehalt l sst sich in dem physiologisch akzeptablen Bereich HPMC E50 Gehalt lt 1 5 in der L sung 179 5 ZUSAMMENFASSUNG Haftfestigkeit lt 20 g mit dem Mini Gefriertrockner nahezu jedes Verhaltnis von Druck und Haftfestigkeit gezielt einstellen Dabei konnte gezeigt werden dass bei einer Verst rkung der Haftfestigkeit auch die Druckfestigkeit entsprechend erh ht werden muss um ein Zusammendr cken und Verschmieren des Lyophilisates bei der Applikation zu vermeiden Bei geringer Haftfestigkeit kann auch die Strukturfes tigkeit entsprechend reduziert werden Die Restmengenuntersuchungen belegen dass bei einem richtigen Gr enverh ltnis dieser beiden Eigenschaften in vivo mehr als 90 der Wirkstoffdosis reproduzierbar appliziert werden kann Die applizierbare Menge l sst sich bereits zuvor mit dem In vitro Abrei test n herungsweise ermitteln Sie ist sowohl abh ngig von der Einfriermethode als auch vom Wirkstoffgehalt Der Polymergehalt spielt dagegen keine Rolle Die Restfeuchtebestimmung der Lyophilisate ergab keinen Hinweis auf einen Zusammenhang zwischen Restfeucht
14. Darstellung einer Lyophilisatunterseite Simulation einer gleichmaBi gen Abkuhlung bei mittlerer Einfriergeschwindigkeit Methode 3 Beim Einfrieren durch schnelles Evakuieren mit 33 5 mbarL s Ventilstellung 600 ergaben sich Lyophilisate mit einer durchschnittlichen Haftfestigkeit von 32 5 g Durch das rasche Evakuieren spielt der konvektive Warmeentzug von der Unterseite des Tropfens durch die Kondensatorflache nahezu keine Rolle mehr Der schnelle und starke W rmeentzug an der Tropfenoberfl che durch verdampfendes L sungs mittel f hrt dort schnell zur Eisbildung vakuuminduziertes Einfrieren snap freezing Da der innere Teil des Tropfens noch nicht so stark abgek hlt ist kommt es zur Ausbildung eines deutlich ausgepr gten Temperaturgradienten 42 Fehlen u ere Einfl sse bei der Kristallisation neigen die Eiskristalle dazu zuf llig zu wachsen das hei t ohne bevorzugte Richtung wie es ann hernd bei Methode 2 erreicht wurde Abb 4 42 rechts Wird die Kristallisation allerdings beeinflusst wie beim Snap Freezing durch raschen W rmeentzug an der Oberfl che orientieren sich die schnell wachsenden Eiskristalle senkrecht entlang des gebildeten Tempera turgradienten 31 50 Hier wird sich die Porengr e senkrecht zum Temperatur gradienten verkleinern in Richtung des Gradienten allerdings vergr ern so dass man von zylindrisch geformten Eiskristallen sprechen kann Abb 4 42 Mitte 31 Unter extremen Bedingun
15. Das Bestimmtheitsma von 0 9932 spricht f r eine gute Korrelation der In vitro und In vivo Daten Der In vitro Abrei test mit anschlie ender Quantifizierung der Rest mengen l sst also tendenziell eine Voraussage der Gr enordnung der Restmenge nach In vivo Applikation zu Somit erh lt man eine Aussage ber den zur Anwendung kommenden Teil der Dosis 4 4 5 Effekte durch Variation der Einfrierbedingungen im Mini Gefriertrockner Zu sammenfassung und Diskussion Um die Herstellung der OLCS so einfach und schnell wie m glich zu gestalten findet der Einfrierprozess direkt im Mini Gefriertrockner statt Da im Mini Gefriertrockner eine temperierbare Stellfl che fehlt sind die Einfrierbedingungen ber diese nicht regelbar Die Temperatur des Kondensators l sst prinzipiell nur eine 170 4 ERGEBNISSE UND DISKUSSION Einfriergeschwindigkeit zu Die Kondensatorflache k hlt das Gas das der einzufrie renden L sung durch Konvektion W rme entzieht Durch das Variieren des Prozessparameters Evakuiergeschwindigkeit ergab sich die M glichkeit verschiedene Einfrierbedingungen und ihre Effekte auf das Produkt zu untersuchen Durch Verminderung des Gasdrucks im Gefriertrockner kommt es zu einem st rke ren Verdampfen des verwendeten L sungsmittels Die dazu ben tigte Energie wird der L sung in Form von W rme von der Oberfl che her entzogen Dies kann bei entsprechend schnellem Evakuieren bis zur Eisbildung f hren Durch Variat
16. E 0 001 20 0 0001 40 60 0 00001 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Zeit min Abb 4 22 Methode 3 Produkttemperatur und Druckverlauf Schnelles vakuuminduziertes Einfrieren Auff llig ist dass die Trocknungskurven sowohl in der Prim r als auch in der Sekund rtrocknungsphase zum Teil deutlich voneinander abweichen Dieses Ph nomen ist bei der Messung der Produkttemperatur w hrend der Gefriertrocknung durchaus bekannt Thermoelemente wie auch temperaturabh ngige Widerst nde messen immer nur ihre eigene Temperatur Die ihrer Umgebung messen sie nur wenn sie in engem Kontakt mit ihr stehen Die Bedingung des engen Kontaktes ist allerdings nur ganz zu Beginn der Prim rtrocknungsphase erf llt Danach h ngt der gemessene Temperaturwert ganz entscheidend von der Lage des Sensors im Pro dukt ab So wurden zum Beispiel zwischen zwei Flaschen der gleichen Charge w h rend der Prim rtrocknung Temperaturunterschiede von 10 C bis 15 C gemessen 54 Schelenz et al zeichneten unter anderem die Temperaturprofile an unterschied lichen Stellen im Glasvial in einer 30 mL Mannitoll sung auf Abb 4 23 a und b 69 119 4 ERGEBNISSE UND DISKUSSION C a 30 Glass Bottom Border of the container 20 N Middle of the container OW N a 1 10 C b af b Glass 8 mm above the bottom 20 10 TYTTTTHTTTITTTTTTMTTTTMTTTTTTTT Abb 4 23 a und b Temperaturverlauf in Abh ngigkeit von der Pos
17. Einfriermethode vgl Abb 4 66 151 4 ERGEBNISSE UND DISKUSSION 4 4 2 3 Quantifizierung der Druckfestigkeit Um verschiedene Druckfestigkeitsprofile direkt miteinander vergleichen zu k nnen ist eine numerische Darstellung g nstig Zur Quantifizierung der Druckfestigkeit soll die Steigung der Druckkurven herangezogen werden Dabei m ssen jedoch diejeni gen Eigenschaften der Lyophilisate ber cksichtigt werden die unabh ngig von der Druckfestigkeit der inneren Struktur den Kurvenverlauf beeinflussen Eine Korrektur der Druckprofile ist notwendig So zeigen Lyophilisate die unterschiedlich schnell eingefroren wurden deutliche Unterschiede in ihrem u eren Erscheinungsbild Beim Einfrieren unter Atmosph rendruck oder bei niedrigen Evakuiergeschwindigkei ten wie zum Beispiel 1 65 mbarL s ergibt sich eine u ere Form wie in Abb 4 68 dargestellt Die Lyophilisate haben am h chsten Punkt der Halbkugel eine deutlich erkennbare Spitze durch Gefrierkonzentration Im Gegensatz dazu zeigt Abb 4 69 einen Tropfen der mit 13 4 mbarL s Evakuiergeschwindigkeit eingefroren wurde Seine Oberfl che ist durchgehend halbkugelf rmig Diese unterschiedlichen Oberfl chenformen sind der Grund daf r dass Druckprofile von Lyophilisaten hergestellt mit niedriger Evakuiergeschwindigkeit im unteren Bereich einen aufw rts gekr mmten Kurvenverlauf aufweisen Abb 4 66 rechte Kurve w hrend sich bei Druckfestigkeitsmessungen der OLCS eingefroren
18. Eis sublimiert kommt es zu einem starken Temperaturanstieg Der Endpunkt der Sublimationsphase l sst sich durch den nahezu senkrecht anstei genden Temperaturverlauf eindeutig und sehr genau detektieren Das L sungsmittel ist nun vollst ndig entfernt Es herrscht jedoch eine gewisse Restfeuchte durch Haft und Hydratwasser Um diese m glichst gering zu halten wird das Produkt bei Endvakuum noch kurze Zeit einer erh hten Temperatur ausgesetzt So werden noch adsorbierte Wassermolek le entfernt Dann wird die Heizung ausgeschaltet die Trockenkammer kann bel ftet und das fertige Produkt entnommen werden Mit Hilfe der sehr kleinen Messspitze des Thermoelementes und der extrem kurzen Ansprechzeit war es m glich selbst in einem Tropfen von nur 25 uL Volumen den Temperaturverlauf sehr genau zu erfassen Ein Vergleich mit dem von Rahm 104 4 ERGEBNISSE UND DISKUSSION gegebenen Beispiel fur den gesamten Temperaturverlauf einer Gefriertrocknung zeigt deutlich dass der Gefriertrocknungszyklus im Mini Gefriertrockner mit dem konventioneller Gefriertrockner durchaus vergleichbar ist Abb 4 15 61 Allein durch die deutlich kurzere Dauer der einzelnen Phasen ergeben sich kleine Unter schiede So sind im eben beschriebenen Beispiel fur das Auskristallisieren der reinen Eiskristalle und das Durchfrieren des Eutektikums keine getrennten Plateauphasen detektierbar Das liegt an der kurzen Einfrierphase von nur etwa 3 Minuten im Mini Gefriertr
19. Erst kurz vor der Verwendung wurde die Autokla vierfolie aufgeschnitten und die Streifen einzeln mit der Pinzette entnommen 3 2 1 3 Herstellung der Lyophilisate a f r die Prozessentwicklung F r die Ermittlung geeigneter Prozessparameter wird zur Temperaturerfassung in den Tropfen ein Thermoelement eingebracht In den einzelnen Applikator wird im Bereich der PTFE Folie zentral ein kleines Loch f r das Thermoelement gestochen Abb 3 2 58 3 EXPERIMENTELLER TEIL LLL Abb 3 2 Applikator mit Loch zum Durchf hren des Thermoelements Dazu wird er auf eine weiche Styroporplatte gelegt am Handgriff festgehalten und die PTFE Folie vorsichtig mit einer Nadel perforiert Dann wird der Applikator auf den Probentrager berf hrt Dieser besitzt eine kleine Bohrung am vorderen Ende der Auflagefl che durch die der Thermof hler senkrecht von unten durchgef hrt wird Der Applikator wird nun mit dem Loch auf die Bohrung des Probentr gers gelegt mit einer Pinzette angedr ckt und das Thermoelement vorsichtig von unten durch die Folie gedr ckt Anschlie end wird die Position der F hlerspitze auf der sich der Messpunkt von 0 5 mm Durchmesser befindet so eingestellt dass sie sich etwa 1 mm ber der PTFE Folie befindet Zum Schluss wird noch die PTFE Folie vorsichtig mit einer feinen Pinzette fest um die Spitze des F hlers gedr ckt um zu vermeiden dass nach dem Aufbringen des Tropfens ein Teil der L sung durch Kapil larwirk
20. Evakuiergeschwin digkeit und Polymergehalt die Restfeuchte beeinflussen Die Ergebnisse der Restfeuchtebestimmung sind in Abb 4 82 dargestellt Gehalt HPMC ug 125 15 250 14 13 2 11 o 10 9 O TE o 7 C 6 5 4 3 2 0 5 10 15 20 25 30 35 Evakuiergeschwindigkeit mbarL s Abb 4 82 Graphische Darstellung der Ergebnisse der Restfeuchtebestimmung von Lyophilisa ten mit 68 ug Wirkstoff in Abh ngigkeit von Einfrierbedingungen und Polymergehalt jeweils n 5 ein Fehlerbalken entspricht einer Standardabweichung Es zeigt sich eine deutliche Abh ngigkeit der Restfeuchte vom Polymergehalt Auch eine Abh ngigkeit von der Einfriermethode k nnte eventuell bestehen Die Zunahme der Restfeuchte bei abnehmendem Polymergehalt l sst sich dadurch erkl ren dass die W rme bertragung auf und in das halbkugelf rmige Lyophilisat 174 4 ERGEBNISSE UND DISKUSSION w hrend der Sekund rtrocknung schwieriger wird je weniger Strukturmaterial f r eine Warmeleitung zu Verf gung steht Da sich die Warmestrahlung der IR Strahlungsheizung nur auf die obersten Schichten des Lyophilisates beschr nkt kann die W rme bertragung ins Lyophilisatinnere nur durch W rmeleitung ber die Feststoffbr cken erfolgen 66 Daher erw rmen sich die Lyophilisate schlechter je geringer der Polymergehalt und damit je filigraner die Struktur ist Da die Sekund r trocknungsrate stark von der Tempera
21. F r den Laborma stab eignete sich das Autoklavierband als Handgriff besonders gut da es zus tzlich die M glichkeit bot durch den Farbumschlag des integrierten Thermoindikators von 57 7 3 EXPERIMENTELLER TEIL hellbeige nach dunkelbraun das Erreichen der erforderlichen Sterilisationstempera tur im Autoklaven anzuzeigen Schlie lich wurde die nicht verklebte Seite des PTFE Streifens noch vorsichtig mit einer Nagelschere abgerundet damit der Applikator auf der Seite mit der das Lyophilisat zum Auge gef hrt wird keine Ecken und Kanten aufweist Abb 3 1 Handgriff PTFE Streifen b Seitenansicht Abb 3 1 Aufsicht und Seitenansicht eines Lyophilisattr gers Nun wurde der PTFE Teil mit Isopropanol gereinigt um Reste der geschnittenen Fo lie Flusen oder Staubk rner die sich durch elektrostatische Aufladung an die Folie angelagert hatten zu entfernen Dazu wurde jeder Tr ger auf eine glatte Glasplatte gelegt und der PTFE Teil mit einem isopropanolgetr nkten Steriltupfer abgerieben Zum Schluss wurden die Applikatoren noch kurz in einem Isopropanolbad abgespult um eventuelle Fasern des Steriltupfers zu entfernen und in ein Metallk stchen mit perforiertem Boden gelegt Diese wurden schlie lich in Autoklavierfolie einge schwei t und mit ges ttigtem gespanntem Wasserdampf f r 15 min bei 121 C und 2 bar autoklaviert Danach wurden die autoklavierten Beh lter ber Nacht bei 50 60 C im Trockenschrank getrocknet
22. Gl hdrahtheizung reagiert u erst schnell und pr zise auf nderungen in der Spannungszufuhr und l sst sich daher genau steuern Da die W rme bertragung jetzt durch die Strahlungsheizung erfolgte konnte der volumin se Aluminiumzylinder durch eine d nne Kunststoffplatte ersetzt werden Der Thermof hler zur Erfassung der Produkttemperatur wurde nun gesch tzt vor direkter W rmeeinstrahlung unterhalb dieser Platte entlang gef hrt Er wurde dann unmittel bar unterhalb des Tropfens durch ein kleines Loch im Kunststofftr ger senkrecht nach oben in den Tropfen gef hrt Dadurch wurde w hrend der Trocknung ein Energietransport durch den Thermof hler in das Produkt weitestgehend vermieden Die Temperaturmessung ergab genauere Werte Ein verfr htes Beenden der Trocknung aufgrund falsch hoher Temperaturwerte kam nicht mehr vor Da unterhalb 10 mbar die Konvektion der Gasphase zum Erliegen kommt konnte durch ein besseres Vakuum schlie lich auch die Konvektion in der Trockenkammer weitestgehend vermieden und die W rmestrahlung effizient genutzt werden 66 Damit wurden auch die Trocknungsbedingungen reproduzierbar 89 4 ERGEBNISSE UND DISKUSSION Stickstoffreservoir aus Rohacell Strahlungsheizung oberhalb des Produktes Eingeklebtes Edelstahlrohr Thermoelement zur Temperaturer Kunststoffhalterung zur Aufnah fassung im Tropfen me des Lyophilisattr gers Abb 4 4 Schemazeichnung des Prototyp 2 Technische Zeichnung un
23. Kompromiss gefunden werden Einerseits sollen ausreichend viele Gasmolek le in der Trockenkammer zu Verf gung stehen damit der konvektive Warmetransport ausreichend effizient ist Ande rerseits soll die Diffusion von Wassermolek len zum Kondensator nicht behindert 31 2 THEORETISCHER TEIL werden F r die Trocknung von Produkten in Glasvials wird deshalb ein Kammer druck von gr er als 1 mbar angestrebt 66 Soll dagegen die W rme bertragung durch einen reinen W rmestrahler erfolgen wird die gr te Effizienz durch Anlegen eines m glichst hohen Vakuums erreicht 4 Energie bertragung durch W rmestrahlung findet erst unterhalb von 0 1 mbar Umgebungsdruck merklich statt Die verbesserte Wasserdampfdiffusion bei diesen Prozessdr cken verringert zus tzlich die Trockenzeit Pikal et al machten Gefriertrocknungsversuche mit sehr kleinen Proben in einem speziellen Probenhalter Die Warmezufuhr erfolgte hierbei nicht durch Warmeleitung sondern ber W rmestrahlung Pikals Untersuchungen ergaben dass niedrigere Kammerdr cke in diesem Fall die Sublimationsrate erh hen 59 Dolan untersuchte die Abh ngigkeit der Sublimationsrate vom Kammerdruck unter Verwendung von Mikrowellenstrahlung Diese hat den Vorteil in ihrer Wirkung unab h ngig vom Druck bzw Vakuum zu sein Er trocknete Proben bei unterschiedlichem Kammerdruck die er durch die Mikrowellenstrahlung jeweils ann hernd auf der glei chen Temperatur hielt Bei den V
24. Kristallisationstemperatur W hrend die L sung dar ber langsam und gleichm ig abk hlt ist der untere Bereich schon stark unterk hlt Dies f hrt zur schnellen Bildung eines schmalen Bandes kleiner unregelm ig geformter Eiskristalle 68 Daraus resultiert nach der Trocknung eine engmaschige filigrane Lyophilisatstruktur Abb 4 31 Diese hat nur wenige schwa che Verbindungen zur PTFE Folie und kann daher leicht abgel st werden Anhand 126 4 ERGEBNISSE UND DISKUSSION der Aufnahme der zugehorigen PTFE Folie ist erkennbar dass nur wenige kleine Kontaktpunkte bestehen Abb 4 32 Der Kristallisation des schmalen Bandes klei ner unregelm ig geformter Kristalle folgt in der dar ber stehenden gleichm ig abgek hlten L sung ein langsames senkrecht zur Oberfl che hin gerichtetes Wachstum gro er Eiskristalle vgl Temperaturkurvenverlauf bei langsamem Einfrie ren Kapitel 4 3 2 Dadurch werden im Lyophilisat weite Kan le erzeugt vgl Abb 4 31 27 68 Aus diesem s ulenartigen Eiskristallwachstum resultiert eine Aufkonzentrierung gel ster Substanzen an der Oberfl che der gebildeten Matrix 68 Die Gefrierkonzentration ist erkennbar an der spitzen Form des Tropfens an seiner Oberseite und der dichten geschlossenen Oberfl chenstruktur durch auskris tallisierten Wirkstoff Abb 4 33 und Abb 4 34 Anhand des Vertikalschnittes lassen sich das schmale Band der dichten filigranen Bodenstruktur die vergleichsweise gro
25. OLCS die unter schnellem Evakuieren mit 33 5 mbarL s Evakuiergeschwindigkeit eingefroren wurden Methode 3 250 ug HPMC E50 204 ug Fluorescein Natrium RT X ai Fant ao A T HEA i o oT eae a i eat a Abb 4 44 Detailaufnahme der Bodenstruktur Abb 4 45 Detailaufnahme der langen d nnen Eiskan le auf der Unterseite N i B 7 i A i K es x ki ba eS 4 Ar u m gt T zt k T or ee so e 1 l i Li r ie ay ha h et i e x TE ay i A cal Abb 4 46 Detailaufnahme der zum Teil offe Abb 4 47 Detailaufnahme der nen zum Teil geschlossenen Bodenstruktur geschlossenen Bodenstruktur 133 4 ERGEBNISSE UND DISKUSSION N T SMM u Abb 4 48 Eisstrukturen wie man sie beim Einfrieren von L sungen in einem K ltebad erh lt Hier wachsen die Eiskristalle parallel zur Oberfl che Die entstehende geschlossene Oberfl chenstruktur behindert den Wasserdampftransport 29 Die Oberfl chenstruktur der Lyophilisate die nach Methode 3 hergestellt wurden ist im Gegensatz zu den Oberfl chenstrukturen nach Methoden 1 und 2 sehr locker und weitmaschig mit gro en Poren Abb 4 49 Abb 4 50 Die beiden letzt genannten Einfrierbedingungen ergeben dagegen Lyophilisate bei denen eher die Kontaktfl chen zum PTFE die offenen und weitmaschigen Strukturen aufweisen Abb 4 49 bis 4 52 REM Aufnahmen von OLCS die unter schnellem Evakuieren mit 33 5 mbarL s Evakuier
26. Stichproben p 0 001 Daher wird f r jeden Faktor getrennt ein nicht parametrischer Test durchgef hrt Evakuiergeschwindigkeit Nur f r die Datenserie Evakuiergeschwindigkeit wird erneut der Test nach Levene durchgef hrt Er ergibt auch f r diese Datengruppen keine Varianzhomogenit t p lt 0 001 Der Kruskal Wallis Test zeigt dass sich die Haftfestigkeits Mittelwerte der vier Niveaus f r die Evakuiergeschwindigkeit auf dem Signifikanzniveau a 0 05 deutlich unterscheiden mit H 23 134 gt x2 0 05 7 81 p lt 0 001 139 4 ERGEBNISSE UND DISKUSSION Das heiBt mindestens eine der vier Datengruppen unterscheidet sich statistisch signi fikant von den anderen Der post hoc durchgefuhrte bei nicht gegebener Varianz homogenitat indizierte Games Howell Test ergibt fur die vier Niveaus folgendes Evakuiergeschw mbarL s p 0 001 p 0 002 Tabelle 13 p Werte fur die Evakuiergeschwindigkeiten auf allen drei Niveaus des Polymerge haltes statistisch signifikante Unterschiede Betrachtet man den Einfluss der Evakuiergeschwindigkeit gleichzeitig auf allen drei Niveaus des Polymergehaltes so unterscheidet sich nur die Evakuiergeschwindigkeit auf dem Niveau 1 65 mbarL s bez glich des Einflusses auf die Haftfestigkeit signifi kant von allen drei brigen Niveaus Ansonsten l sst sich kein statistisch signifikanter Unterschied nachweisen Auf Grund von Abb 4 54 l sst sich allerdings vermuten dass
27. a und b Vertikalschnitt eines Lyophilisates hergestellt durch Einfrieren unter Atmo sph rendruck Es gibt zwei Porenpopulationen Der durchschnittliche Porendurchmesser der gro en Poren betr gt etwa 60 70 um Abb 4 73 aundb Vertikalschnitt eines Lyophilisates hergestellt durch Einfrieren mit einer Evakuiergeschwindigkeit von 13 4 mbarL s Der durchschnittliche Porendurchmesser betr gt etwa 40 50 um 157 4 ERGEBNISSE UND DISKUSSION Abb 4 74 a und b Vertikalschnitt eines Lyophilisates hergestellt durch Einfrieren mit einer Evakuiergeschwindigkeit von 33 5 mbarL s Der durchschnittliche Porendurchmesser betragt etwa 50 um Die Bestimmungen der Porendurchmesser je n 4 ergeben zwar keine Unterschie de beim vakuuminduzierten Einfrieren mit 13 4 mbarL s und 33 5 mbarL s allerdings f hrt das Einfrieren unter Atmosph rendruck im Mittel zu deutlich gr eren Poren Tabelle 19 Dies hat offensichtlich weder einen ma geblichen Einfluss auf die Strukturfestigkeit noch auf die Dauer der Sublimationstrocknung vgl Kapitel 4 3 3 Atmosph rendruck Evakuiergeschw Evakuiergeschw 0 mbarL s 13 4 mbarL s 33 5 mbarL s PorengroBe in Rel St Abw Tabelle 18 PorengroBe im Vertikalschnitt bei unterschiedlichen Einfriermethoden statistische Auswertung 158 4 ERGEBNISSE UND DISKUSSION 4 4 3 Erkenntnisse zu Haft und Druckfestigkeiten durch klinische Studien Weichselbaum berichtete dass Lyophilisate deren A
28. deutlich an Auch der Polymergehalt beeinflusst die Haftung der Lyophilisate Die Haftfestigkeit nimmt mit steigender Polymerkonzentration statistisch h chst signifikant zu wobei sich dieser Effekt bei gr eren Evakuiergeschwindigkeiten verst rkt Beide Faktoren sind zur Einstellung der Haftfestigkeit geeignet Mit der Apparatur zur Bestimmung der Strukturfestigkeit lie en sich Druckprofile in Abh ngigkeit von Polymergehalt und Einfriermethoden aufzeichnen Die statistische Auswertung der Daten zeigt keine signifikante Wirkung der Evakuiergeschwindigkeit auf die Druckfestigkeit der Lyophilisate obwohl eine Bestimmung des mittleren Porendurchmessers einen deutlichen Unterschied in der Porengr e zwischen dem vakuuminduzierten Einfrieren und dem Einfrieren bei Atmosph rendruck ergab Dagegen ist die Druckfestigkeit h chst signifikant abh ngig vom Polymergehalt Eine Erh hung der Polymerkonzentration der Ausgangsl sung f hrt zu einer wesentlichen Verst rkung der Strukturfestigkeit des resultierenden Lyophilisates Die durchgef hrten klinischen Studien erbrachten neben den guten biopharmazeuti schen Ergebnissen hilfreiche Erkenntnisse zu den Parametern Haft und Druckfes tigkeit Das bereits von Weichselbaum genannte Intervall von Haftfestigkeiten zwischen 2 g und 20 g erwies sich als zweckm ig 82 Es zeigte sich jedoch dass ein geeignetes Verh ltnis von Haft und Druckfestigkeit gefunden werden muss um die gute und vollst ndige
29. eine Temperatur von 70 C entspricht diesem Wert ein S ttigungsdampfdruck von 0 0026 mbar Aufgrund dieses herrschenden Druckgradienten erfolgt die Wasser dampfdiffusion in Richtung Kondensator sehr rasch und der Partialdruck ber dem Produkt und somit in der Kammer ist immer kleiner als 1 04 mbar Die treibende Kraft sowohl f r die Prim r als auch die Sekund rtrocknung ist diese Differenz zwischen dem Dampfdruck des gefrorenen Produktes und dem Dampf druck des Eises am Kondensator 52 Daher muss immer eine zumindest minimale Differenz zwischen diesen Dampfdr cken herrschen sonst kommen Sublimation und Diffusion zum Erliegen 84 Erh ht man die Kondensatortemperatur nun auf die Temperatur des gefrorenen Pro duktes 20 C so kondensiert an den Kondensatorfl chen im Vergleich zur subli mierten Menge immer weniger Wasserdampf Der Wasserdampfpartialdruck in der Kammer steigt bis er dem S ttigungsdampfdruck des Eises am Kondensator also 1 04 mbar entspricht Die Sublimation kommt zum Erliegen da die Druckdifferenz jetzt null ist Eine erh hte Kondensatortemperatur bedingt einen geringen Druckgradienten und somit eine verl ngerte Trockenzeit Eine m glichst niedrige Kondensatortemperatur ist vorteilhaft Kondensatoren in Industrieanlagen sind blicherweise zwischen 50 und 90 C kalt 50 Auf jeden Fall muss die Kondensatortemperatur unter der Produkttemperatur liegen Mit einer Temperaturdifferenz von mindestens
30. fur den Mini Gefriertrockner programmierten Datenerfassungs programms ComGraph V1 0 Programmierung R Schroeder ist es m glich kontinu ierlich die Werte f r den Druck in der Trocknungskammer und die Temperatur im Produkt aus den entsprechenden Messgeraten auszulesen Abb 4 11 und sowohl numerisch als auch graphisch aufzuzeichnen Zudem wird die genaue Prozesszeit erfasst tens call Se P S y WN V VN www Si le 7 v WoW w Ww ew Ww J J K 1 1 gt w W W y W W y W My y y y t Hee f yA Ay Abb 4 11 Erfassung und Aufzeichnung von Druck und Temperatur Uber die Benutzeroberflache des Programms werden Datum und Uhrzeit aufgezeichnet und maximale Messdauer Messintervall und Schnittstellenparameter definiert Abb 4 12 96 4 ERGEBNISSE UND DISKUSSION gt ComGraph 1 0 L1911013 cgd E Datei Optionen Hilfe x Kanal 1 Temperatur M aktiv Newport INFT 1001 Bezeichnung Titel Datum 19 11 200 Uhrzeit Schnittstellenparameter Heizung Hekinterwall fo a fi Sa pe aktiv Mena MKS PR 40005 Schnittstellenparameter MeBintervall fo ern fi Sale Speicheime Drucken HMelwertenassung staten mar Meldauer 30 Abb 4 12 Screenshot der Benutzeroberflache des Datenerfassungsprogramms ComGraph V1 0 Programmierung R Schroeder Schnittstellenparameter Betriebsger t zur Temperaturerfassung Newport INFINITY INFT 1001 26 B
31. in der Kammer dem Gleich gewichtsdampfdruck des Eises entspricht Ein nachlassender oder fehlender Druckanstieg zeigt das Ende der Prim rtrocknung an Zudem l sst sich aus einem Wasserdampf Temperaturdiagramm f r Eis der Gleichgewichtsdampfdruck in die entsprechende Eistemperatur umrechnen Dies stellt eine weitere M glich keit dar auf indirektem Weg und nicht invasiv die Produkttemperatur zu sch tzen 54 e Restfeuchtemessung durch Nahinfrarotspektroskopie NIR oder Gasanalyse W hrend der Prim rtrocknung l sst sich der noch vorhandene Restdruck in der evakuierten Trockenkammer nahezu vollst ndig auf den Dampfdruck der Was sermolek le zur ckf hren Wenn alles Eis aus dem Produkt sublimiert ist sinkt der Partialdruck des Wassers stark ab Dieser Punkt im Trocknungsprozess kann durch einen elektronischen Feuchtesensor durch NIR oder mit Hilfe der Restgasanalyse detektiert werden 64 2 2 5 7 Der kontrollierte Gefriertrocknungszyklus ein Beispiel F r eine Beispielformulierung mit einer Kollapstemperatur von 23 C werden zun chst effiziente Prozessparameter ermittelt Danach wird der Trocknungsverlauf anhand dieser Parameter erl utert 3 2 THEORETISCHER TEIL Ermittlung der Prozessparameter Produkttemperatur Die Produkttemperatur soll unterhalb der eutektischen oder Kollapstemperatur liegen Daher wird man hier f r die Prim rtrocknung unter Ber cksichtigung der Sicherheitsspanne von 2 5 C vgl Kapite
32. kann es dazu kommen dass der Stempel w hrend der Messung in Schr glage kommt und mit einer Kante den Aluminiumblock ber hrt bevor die Messung beendet ist Dies w rde das Messergebnis verf lschen Dann kann mit der Druckfestigkeitsmessung begonnen werden Dazu wird der Alu miniumblock langsam nach oben bewegt Dabei legt er wiederum 0 58 mm min zur ck Die Waage ist auf Null tariert Mit der ersten Ber hrung des Stempels durch das Lyophilisat registriert die Waage eine Entlastung die umso gr er wird je weiter das Lyophilisat zusammengedr ckt wird In diesem Moment beginnt die Zeiterfas sung manuell mit einer Stoppuhr Beim Erreichen einer Entlastung von 20 Gramm werden die Messungen beendet Zur graphischen Darstellung wird das Vorzeichen der negativen Messwerte ge n dert Diese Werte werden gegen den aus der Messzeit ermittelten zur ckgelegten Weg aufgetragen 3 2 6 Restmengenbestimmung des Fluorescein Natriums auf den Tr gerfolien Die Restmengenbestimmung des Fluorescein Natriums auf den Tr gerfolien erfolgte in Anlehnung an die Methode des USP 24 78 Material Boratpuffer pH 9 USP 24 Fluorescein Natrium Stamml sung USP 24 Ger t Fluoreszenzspektrophotometer Perkin Elmer 650 40 Extinktionswellenl nge 485 nm Emissionswellenl nge 515 nm 69 3 EXPERIMENTELLER TEIL Methode Bei der Fluorimetrie handelt es sich um eine Methode der Emissionsspektroskopie bei der Molek le durch Licht zur Fluoreszen
33. ndig durchgefroren ist also keine Kristallisationsenergie mehr freigesetzt wird k hlt das Eis sehr schnell ab und n hert sich der Temperatur an die nach der Dampfdruckkurve des Eises durch das Endvakuum in der Trocken kammer vorgegeben ist Dies ist an einem leichten Abflachen der Temperaturkurve erkennbar Das Endvakuum betragt in diesem Fall 0 024 mbar die asymptotische Endtemperatur entsprache demnach 54 C Phase II Prim rtrocknung Sublimationstrocknung Nachdem die Probe eine ausreichend tiefe Temperatur erreicht hat in diesem Fall unter 40 C wird die Infrarotheizung IR Heizung mit einer Heizleistung von ca 8 W Heizspannung 7 V bei ca 1 1 A zugeschaltet Es kommt sofort zu einer deutlichen Erw rmung des Eises Die Eistemperatur steigt nun w hrend der Trock nung kontinuierlich an bis sich die W rmezufuhr durch die IR Heizung und der W rmeentzug zum einen durch die zur Sublimation ben tigte W rmeenergie zum anderen durch die kalte Kondensatorfl che kompensieren Die Produkttemperatur bleibt nun konstant und es ergibt sich ein weiteres Plateau Jetzt sind Heizungs und Produkttemperatur sowie der Kammerdruck konstant es herrscht der angestrebte kontrollierte Gefriertrocknungsprozess 29 Wenn das gefrorene Bulkwasser gegen Ende der Gefriertrocknung weitestgehend entfernt ist und die Sublimationsgeschwindigkeit zur ckgeht steigt die Produkttemperatur an Phase Ill Sekund rtrocknung Ist auch das letzte
34. sich in vivo durch ein l nger anhaltendes Fremd k rpergef hl bemerkbar Dies f hrte zu einer schlechteren Akzeptanz durch die Probanden gegen ber den OLCS der Studie 2 Ein Unterschied im Fremdk rperge f hl gegen ber den OLCS der Studie 1 mit der dreifachen Wirkstoffkonzentration war jedoch nicht auszumachen Auch Weichselbaum fand dass mit ansteigender Polymerkonzentration das Fremd k rpergef hl zu Beginn der Applikation zunahm Sie stellte fest dass bei einer HPMC E50 Konzentration von 2 in der Ausgangsl sung eine OLCS Applikation gut m glich und das Fremdk rpergef hl nur schwach ausgepr gt ist 82 Doch schon ab einem Polymergehalt von 1 5 empfindet der Patient das Fremdk rperge f hl als unangenehm wie Studie 3 belegt Damit die Vertr glichkeit der OLCS nicht wesentlich schlechter als die der konventionellen Augentropfen ist sollte eine Polymerkonzentration ber 1 5 in der L sung vermieden werden Zusammenfassend bleibt festzuhalten dass eine gute Applikation der OLCS nicht nur von der Haftfestigkeit sondern auch von der Druckfestigkeit abh ngt Aufgrund der besonderen Applikationsweise der OLCS Andr cken und Abstreifen vgl Abb 2 8 Kapitel 2 1 2 gibt es f r jede Haftfestigkeit eine dazu geh rende optimale Druckfestigkeit die ermittelt werden muss Je niedriger die Haftfestigkeit umso nied riger kann auch die Druckfestigkeit gew hlt werden Bei der Wahl der Haftfestigkeit muss immer gew hrleistet
35. sind Kristallgr e und Kristall form des Eises entscheidend f r die Porenstruktur des Lyophilisates Dadurch sollte sich auch die Haftfestigkeit der Lyophilisate auf der Tr gerfolie ver ndern Ob und in welchem Ausma dies der Fall ist wird in Kapitel 4 4 1 1 n her untersucht 109 4 ERGEBNISSE UND DISKUSSION 4 3 3 Reproduzierbarkeit von Einfrier und Trocknungsbedingungen Untersucht werden sollte ob sowohl die verschiedenen Einfriermethoden als auch die zugeh rigen Trocknungsverl ufe reproduziert werden k nnen F r drei unterschiedliche Einfrier und Trocknungszyklen wurden jeweils 8 Kurven aufgezeichnet und ausgewertet Die Konzentrationen der Ausgangsl sung betrugen 0 816 Fluorescein Natrium und 1 0 HPMC E50 Methode 1 Tabelle 6 Abb 4 19 Langsames Einfrieren bei Atmosph rendruck Der Probenhalter wird in die Trocknungskammer eingebracht ohne dass diese eva kuiert wird Die Abk hlung erfolgt hier also ausschlie lich durch W rmeentzug Uber Konvektion durch die kalte Kondensatorfl che Da in der Kammer Atmosph rendruck herrscht ist dieser Effekt stark genug ausgepr gt um in kurzer Zeit die Kristallisation auszul sen Der Tropfen friert langsam durch Unterk hlung Gefrierpunkt Beginn Dauer der C C des Ein Plateau frierens phase min min 207 gt 9 BEE e arb aoe BEE _ Tabelle 6 Methode 1 Einfrierparameter n 8 Nach etwas mehr als 3 Minuten ist hier der Tropf
36. und b Die Aufnahmen zeigen den beim Durchfrieren von der u eren Oberfl che zum Zentrum der Bodenfl che hin gebildeten Keil mit einem Winkel von etwa 166 ee H Abb 4 56 a und b Detailaufnahmen vom mittleren Bodenbereich der durch den Eiskeil gebildeten Lyophilisatstruktur Die Abb 4 55 a und b sowie Abb 4 56 a und b zeigen statt der vermuteten planen Unterseite eine keilf rmig zur Mitte hin zulaufende Auflagefl che Diese Beobachtung l sst sich wie folgt erkl ren Eis nimmt bekanntlich ein gr eres Raumvolumen ein als Wasser Bei 0 C entspricht 1 Raumteil fl ssiges Wasser 1 0906 Raumteilen Eis 8 Friert nun der Fl ssigkeitstropfen schnell von au en nach innen durch so wird das noch fl ssige Wasser immer weiter durch das sich bildende Eis in Richtung Mittelpunkt gedr ngt 50 142 4 ERGEBNISSE UND DISKUSSION Die schnell wachsenden langen und d nnen Eiskristalle hinterlassen nach dem Ge friertrocknen ein strahlenf rmig zum Zentrum der Bodenfl che hin verlaufendes Netz von Kan len Abb 4 57 Abb 4 58 und Abb 4 59 Schlie lich reicht dem Wasser zwischen PTFE Folie und der halbkugelf rmigen Eish lle das noch zur Verf gung stehende Volumen nicht aus um auszukristallisieren ohne die Tropfenform zu ver ndern Es bildet sich ein flacher Eiskeil aus der daf r sorgt dass sich das in seiner n heren Umgebung mit der PTFE Folie in Kontakt befindliche Eis leicht von der Folie abhebt vgl Abb 4 6
37. verdampft ein Teil des L sungsmittels Die dazu ben tigte Verdampfungsenergie wird der fl ssigen Formulierung entzogen bis diese vollst ndig durchgefroren ist 46 2 THEORETISCHER TEIL ll Zum Verdampfen ben tigte W rmemenge Energiemenge Dampf ist der infolge Temperatur und Druck Einfluss in den Gaszustand uberge gangene Anteil einer bei Raumtemperatur fl ssigen oder festen Substanz Die Beziehung zwischen Dampfdruck und absoluter Temperatur einer Fl ssigkeit ist durch die Clausius Clapeyronsche Gleichung 3 gegeben P AH T 1 3 log S 8 3303 R T T 2 P P Dampfdr cke mbar bei den Temperaturen T T K AHy molare Verdampfungsw rme J mol das hei t die Warmemenge die n tig ist um 1 mol Fl ssigkeit zu verdampfen R allgemeine Gaskonstante J mol K Durch Aufl sen der Clausius Clapeyronschen Gleichung 3 nach AHy ergibt sich 4 P log 2 303 R T T 4 AH a 2 Z T T mol Mit dieser Gleichung 4 l sst sich aus den Dampfdr cken bei zwei verschiedenen Temperaturen ein Durchschnittswert f r AHy berechnen Im Fall des vakuuminduzier ten Einfrierens wird angenommen dass die Ausgangstemperatur der w ssrigen L sung 20 C Raumtemperatur betr gt Durch Unterkuhlung kann sich die Flus sigkeit bis deutlich unter den Gefrierpunkt abk hlen ohne zu gefrieren Im Folgenden wird eine Endtemperatur von 10 C angenommen 47 2 THEORETISCHER TEIL Die Ausgan
38. von 68 ug 25 uL oder 0 272 Daneben werden auch Lyophilisate mit der dreifachen Einzeldosis f r Studienzwecke hergestellt und untersucht Wirkstoffkonzentration 204 ug 25 uL oder 0 816 Um den Einfluss der Polymerkonzentration auf die Eigenschaften der OLCS untersu chen zu k nnen werden wirkstoffhaltige L sungen mit 0 5 1 0 und 1 5 HPMC hergestellt Rezeptur 1 0 272 Fluorescein 0 5 HPMC Fluorescein Natrium 0 136 9 Methocel E50 0 250 g Aqua ad injectabilia 49 614 g Rezeptur 2 0 272 Fluorescein 1 0 HPMC Fluorescein Natrium 0 136 9 Methocel E50 0 500 g Aqua ad injectabilia 49 364 g Rezeptur 3 0 272 Fluorescein 1 5 HPMC Fluorescein Natrium 0 136 9 Methocel E50 0 750 g Aqua ad injectabilia 49 114 9 Rezeptur 4 0 816 Fluorescein 1 0 HPMC Fluorescein Natrium 0 408 9 Methocel E50 0 500 g Aqua ad injectabilia 49 092 g 56 Gehalt pro Lyophilisat 68 ug 125 ug Gehalt pro Lyophilisat 68 ug 250 ug Gehalt pro Lyophilisat 68 ug 375 ug Gehalt pro Lyophilisat 204 ug 200 ug 3 EXPERIMENTELLER TEIL Herstellung der L sung 1 Aqua ad injectabilia wird in ein Becherglas mit Magnetr hrst bchen eingewo gen Das Becherglas wird mit Alufolie abgedeckt und auf dem Magnetr hrer mit Heizung bis zum Sieden erhitzen 2 Das Becherglas mit dem siedenden Wasser wird auf einen zweiten Magnetr hrer ohne Heizung berf hrt und die abgewogene Menge HPMC auf die Wasser
39. 0 und Abb 4 56 a An den R ndern des gefrorenen Tropfens bleibt das Eis jedoch fest mit der PTFE Unterlage verbunden da hier die Adh sions Kr fte am st rksten sind und die PTFE Folie flexibel ist Damit erkl rt sich zum einen die von 180 abweichenden Winkel etwa 166 f r die Bodenfl che Abb 4 55 a und b andererseits das Erscheinungsbild der Restmen gen des Lyophilisates auf den PTFE Folien nach dem Abrei en der Tropfen Abb 4 61 und Abb 4 62 Abb 4 57 Schematische Darstellung eines Vertikalschnittes Die langen d nnen Eiskan le verlaufen strahlenf rmig zum Zentrum Die Mitte der Bodenfl che befindet sich am oberen rechten Bildrand 143 4 ERGEBNISSE UND DISKUSSION Abb 4 58 und Abb 4 59 REM Aufnahmen von OLCS die unter schnellem Evakuieren mit 33 5 mbarL s Evakuiergeschwindigkeit eingefroren wurden Methode 3 375 ug HPMC E50 68 ug Fluorescein Natrium Abb 4 58 Detailaufnahmen eines Vertikal Abb 4 59 Der Mittelpunkt der Bodenfl che schnittes Das Zentrum der Bodenfl che befindet sich am oberen Bildrand in der Mitte befindet sich am oberen Bildrand rechts Die Eiskan le sind zu diesem Punkt hin ausgerichtet Lyophilisat yop Keilf rmige Bodenstruktur PTFE Folie Abb 4 60 Nicht ma st bliche Schemazeichnung des Querschnitts eines Lyophilisates eingefroren durch vakuuminduziertes Einfrieren mit einer Evakuiergeschwindigkeit von 33 5 mbarL s Ausgebildete keilformige Bodenstruktu
40. 15 bis 20 C ist ein ausreichender Wasserdampfentzug gesichert 9 66 27 2 THEORETISCHER TEIL Zusammenfassung Um eine ausreichende Sublimationsrate zu erhalten das hei t akzeptable Prozess zeiten muss der Wasserdampfpartialdruck in der Kammer wesentlich niedriger als der S ttigungsdampfdruck des Produktes sein Dazu muss aber auch die Kondensa tortemperatur deutlich niedriger als die wahrend der Trocknung angestrebte Eistem peratur des Produktes sein Dann entfernt der Kondensator kontinuierlich den anfal lenden Wasserdampf und halt somit dessen Partialdruck in der Trockenkammer niedrig Die Vakuumpumpe hat die Aufgabe den Partialdruck der unkondensierbaren Gase in der Trockenkammer haupts chlich Stickstoff und Sauerstoff soweit zu senken dass ungehinderte Diffusion des Wasserdampfes von der Sublimationsfront zum Kondensator stattfinden kann Erst dann erfolgen Sublimation und Diffusion ausreichend schnell 2 2 5 3 3 Die temperierbare Stellfl che Die Stellflachen eines Gefriertrockners k nnen je nach vorliegendem Modell entweder nur geheizt oder sowohl geheizt als auch gek hlt 2 werden Im Fall der k hlbaren Stellflachen ist es m glich das Produkt direkt in der Trockenkammer einzufrieren Die Abk hlrate K min die Endtemperatur sowie der Temperatur Zeit Verlauf z B in Intervallen sind dabei meist steuerbar Da der Einfrierprozess bereits erl utert wurde vgl Kapitel 2 2 5 1 soll im Folgenden d
41. 5 4 ERGEBNISSE UND DISKUSSION Bei Anwendung der gleichen Gefriertrocknungsmethode resultieren daraus folgende Veranderungen a Geringf gige Erh hung der Evakuiergeschwindigkeit bei identischer Ventilstel lung Dies spricht fur eine Verbesserung der Dichtigkeit der Anlage nach Austausch der Acrylglastrockenkammer b Verbesserung des Endvakuums von 0 012 mbar auf 0 006 mbar vgl a c Durch Reduzierung der Kondensatorflache um etwa den Faktor 3 wird das Gas in der Trocknungskammer langsamer abgek hlt Dies f hrt zu einem deutlich langsameren W rmeentzug der fl ssigen Probe d Deutlich verbesserte Handhabung der Anlage keine Kondenswasserbildung au en an der Trockenkammer Die Temperatur und Druckkurven in Abb 4 63 wurden unter identischen Bedingun gen Methode 2 Evakuiergeschwindigkeit 13 4 mbarL s Ventilstellung 530 mit 0 272 Fluorescein Natrium und 1 HPMC E50 in den Prototypen 3 und 4 aufgezeichnet 100 80 60 a 0 1 20 Temperatur C Druck mbar 20 0 001 40 60 0 0001 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Zeit min Abb 4 63 Temperatur und Druckverlauf fur identische Proben bei der gleichen Methode und unterschiedlichem Gefriertrockner Design 146 4 ERGEBNISSE UND DISKUSSION Bei Prototyp 4 l sst sich neben der deutlichen Erh hung der Evakuiergeschwindig keit Linksverschiebung der Druckkurve auch die Verbesserung des Endvakuums etwa um den Faktor 2 erkennen Abb 4 63
42. 5 mbarL s in die Versuche mit einbezogen worden Die Ergebnisse sind in Tabelle 13 und Abb 4 54 dargestellt Evakuiergeschw Polymergehalt im Mittelwert St Abw mbarL s g g Tabelle 12 Haftfestigkeit in Abh ngigkeit von Polymergehalt und Evakuiergeschwindigkeit statistische Auswertung n 5 Die Abb 4 54 zeigt einen prinzipiell f r alle drei Polymerkonzentrationen hnlichen Kurvenverlauf Es ergibt sich ein nahezu linearer Anstieg der Haftfestigkeit bei 250 ug und 375 ug Polymergehalt bis zu einer Evakuiergeschwindigkeit von 13 4 mbarL s Danach flacht die Kurve in jeder Datenreihe deutlich ab Die Haftfestigkeit nimmt mit steigender Polymerkonzentration deutlich zu wobei sich dieser Effekt mit zunehmender Evakuiergeschwindigkeit verst rkt 138 4 ERGEBNISSE UND DISKUSSION 40 Lyophilisate mit 68 ug Fluorescein Natrium und A 375 ug HPMC 35 250 ug HPMC 30 I 1 b Haftfestigkeit g 0 G 10 t9 20 25 30 35 Evakuiergeschwindigkeit mbarL s Abb 4 54 Abh ngigkeit der Haftfestigkeit vom Polymergehalt bei unterschiedlichen Evakuier geschwindigkeiten bei einfach dosierten Proben jeweils n 5 ein Fehlerbalken entspricht einer Standardabweichung Statistisch soll uberpruft werden inwieweit die beiden Faktoren Polymergehalt und Evakuiergeschwindigkeit einen signifikanten Einfluss auf die Haftfestigkeit der Lyophilisate haben Levene s Test ergibt keine Homogenit t der Varianzen der
43. 843 Vitor Cortes F Van Caekenberghe D Freeze drying past present and future Ann Med Milit Belg 1997 11 1 10 13 Waldman SR Patrowics TC Effects of Hydroxypropyl Methylcellulose and Polyvinyl Alcohol on Intraocular Penetration of Topical Fluorescein in Man Invest Ophthalmol 1970 9 12 96 97 Weast RC Handbook of Chemistry and Physics 55 Edition Cleveland Ohio USA Chemical Rubber Company Press 1974 D 137 D 138 Weichselbaum A Herstellung und Prufung von Lyophilisaten auf hydro phoben Tragerfolien Haftfestigkeit und Bioverfugbarkeit Dissertation Bonn 2002 Weitlaufer JS Dash JG Melting Below Zero Scientific American Februar 2000 34 37 Willemer H Troubleshooting Lyophilization Pharmaceutical Technology Europe Mai 1999 15 22 193 85 86 Willemer H May H Anforderungen an die Prozesstechnik und Anlagen berwachung bei Gefriertrocknungsanlagen f r Pharmazeutische Produk te DKV Tagungsbericht 1988 15 Jahrgang M nchen 16 18 November 1988 Woog H Stabilisierung von Wirkstoffen durch Gefriertrocknung in Essig D Oschmann R Lyophilisation Stuttgart Wissenschaftliche Verlagsge sellschaft 1993 194
44. Abb 4 22 Schnelles Einfrieren bei Ventilstellung 600 Evakuiergeschwindigkeit 33 5 mbarL s Direkt nach Einbringen des Probenhalters mit dem flussigen Tropfen auf dem PTFE Applikator wird die Trocknungskammer schnell evakuiert Dadurch ergibt sich ein starker W rmeentzug durch verdampfendes L sungsmittel an der Oberfl che des Tropfens Dies f hrt zu einem noch schnelleren Durchfrieren der Probe als es bei Methode 2 der Fall ist Der zus tzliche W rmeentzug durch die kalte Kondensatorfl che bleibt hier vergleichsweise gering da die Konvektion durch das zunehmende Vakuum behindert wird Nach nicht einmal 2 Minuten ist der Tropfen vollst ndig gefroren die Temperatur f llt steil ab 113 4 ERGEBNISSE UND DISKUSSION Beginn Dauer der des Ein Plateau frierens phase min min Tabelle 8 Methode 3 Einfrierparameter n 8 Da der Kammerdruck schon unter 1 mbar abgesunken ist wird die Evakuierge schwindigkeit nicht zus tzlich erh ht Das angestrebte Endvakuum von 0 02 mbar stellt sich auch so ausreichend schnell ein Kurz darauf nachdem die Temperatur kurve beginnt abzuflachen wird die Strahlungsheizung eingeschaltet Das ist hier nach etwa 3 Minuten der Fall Ab jetzt beginnt die Sublimationstrocknung Sie ist bei dieser Methode ebenfalls im Durchschnitt 12 Minuten nach dem Einschalten der Heizung abgeschlossen 114 4 ERGEBNISSE UND DISKUSSION 80 10 60 40 0 1 O z 2 420 2 k 0 01 Q z 5 0
45. Der kontrollierte Gefriertrocknungszyklus ein Beispiel 2 3 Die mittlere freie Wegl nge MFW 2 4 Vakuuminduziertes Einfrieren 3 EXPERIMENTELLER TEIL 3 1 Materialien 3 1 1 Tr gerfolie 3 1 2 Hydrophiles Polymer 3 1 3 Arzneistoff 11 11 12 14 19 15 15 21 22 29 32 35 3 41 45 91 51 51 52 53 INHALTSVERZEICHNIS 3 2 Methoden 55 3 2 1 Der Herstellungsprozess 55 3 2 1 1 Herstellung der wirkstoffhaltigen Polymerl sung 56 3 2 1 2 Herstellung der Applikatoren 57 3 2 1 3 Herstellung der Lyophilisate 58 3 2 2 Charakterisierung der verwendeten Polymerl sungen 62 3 2 2 1 Bestimmung der Dichte 62 3 2 2 2 Bestimmung der Viskosit t 62 3 2 2 3 Bestimmung der Dosiergenauigkeit 63 3 2 3 Charakterisierung der Lyophilisate mittels Rasterelektronenmikroskopie REM 63 3 2 4 Abl severhalten von der Tragerfolie 66 3 2 5 Druckfestigkeit der Lyophilisate 68 3 2 6 Restmengenbestimmung des Fluorescein Natriums auf den Tr gerfolien 69 3 2 7 Bestimmung der Restfeuchte der Lyophilisate mit Hilfe der Karl Fischer Titration 71 3 2 8 Statistische Methoden 75 4 ERGEBNISSE UND DISKUSSION 79 4 1 Entwicklung eines Mini Gefriertrockners 79 4 1 1 Zielsetzung 79 4 1 2 Auswahl der Komponenten 82 4 1 2 1 Temperaturmessung Endpunktdetektion 82 4 1 2 2 Druckmesser 82 4 1 2 3 Ventile 83 4 1 2 4 Vakuumpumpe 83 4 1 2 5 Kuhlmedium 83 4 1 3 Entwicklungsgang der Prototypen 84 4 1 4 Kontrolle und Aufzeichnung der Prozessparameter 96
46. Dosierung kann demnach eine Beeinflussung des Wirkstoffgehaltes der Einzeldosen durch den Polymergehalt ausgeschlossen werden In Kapitel 4 2 3 wird dies nochmals genauer berpr ft 4 2 2 Bestimmung der Viskosit t nach Ubbelohde Die Viskosit t der verwendeten Polymerl sungen kann sich ganz entscheidend sowohl auf die Lyophilisatherstellung als auch auf die Anwendung auswirken Was Dosierbarkeit und Filtrationsf higkeit angeht ist eine niedrige Viskosit t vorteilhaft 98 4 ERGEBNISSE UND DISKUSSION Eine h here Viskosit t verl ngert zwar w hrend der Rehydratation des Lyophilisates die Kontaktzeit des Wirkstoffes am Auge und damit die Bioverf gbarkeit des Arznei stoffs jedoch verst rkt sich auch das Fremdk rpergef hl im Auge und es kommt zu einer schlechteren Akzeptanz durch den Anwender Die kinematische Viskosit t v cSt errechnet sich aus der Konstanten K des verwen deten Kapillarviskosimeters und der Durchflusszeit t s unter Einbeziehung des Hagenbach Korrekturfaktors v Ke t v V kinematische Viskosit t cSt K Konstante der Kapillare cSt s t Durchflusszeit s V Hagenbach Korrekturfaktor s Mit Hilfe der Dichte kann aus der kinematischen Viskosit t die dynamische Viskosit t n cP berechnet werden n V p n dynamische Viskosit t cP 1 cP 1 mPa s V kinematische Viskosit t cSt 1 cSt 10 m2 s p Dichte der jeweiligen L sung 1000 kg m Es wurde jeweils eine Kapillar
47. Druckkurve Betrachtet man die Temperaturkurven so sind fur die Prim r und die Sekundar trocknungsphasen unter Ber cksichtigung eventueller Unterschiede in der Position des Thermoelementes die Temperaturverl ufe gleich Auch die Dauer der Sublima tionsphase ist bei beiden Prototypen identisch Eine deutliche Abweichung der Temperaturverl ufe voneinander zeigt sich allerdings f r die Einfrierphase Diese spielt aber die entscheidende Rolle f r die sp teren Produkteigenschaften wie zum Beispiel Haftfestigkeit der Lyophilisate auf der PTFE Folie Deshalb ist die Einfrier phase in Abb 4 64 zur n heren Untersuchung vergr ert dargestellt 40 30 20 0 1 Druck mbar 20 Temperatur C 30 40 0 001 90 60 0 0001 Zeit min Abb 4 64 Einfrierkurven mit Plateauphasen und zugeh rigen Druckverl ufen f r identische Proben bei der gleichen Methode und unterschiedlichem Gefriertrockner Design Methode 2 1 Polymergehalt und 0 272 Wirkstoffgehalt in der L sung Die nderungen im Anlagendesign f hren zu einem ver nderten Verlauf sowohl der Abk hl als auch der Durchfrierphase Die Dauer der Plateauphase wird unter den neuen Bedingungen wesentlich verk rzt dicke Linie Wie bereits in Kapitel 4 4 1 1 untersucht resultiert eine k rzere Plateauphase in einer Zunahme der Haftfestigkeit 147 4 ERGEBNISSE UND DISKUSSION Daraus sollten f r den Prototyp 4 bei gleicher Methode h here Haftfes
48. ELLER TEIL b Probenvorbereitung 1 Der PTFE Teil des Applikators auf dem die Restmenge des Lyophilisates haftet wird vom Handgriff abgeschnitten und in einen 100 0 mL Messkolben berf hrt der etwa zur H lfte mit destilliertem Wasser gef llt ist 2 Der Messkolben wird manuell gesch ttelt 10 min stehen gelassen dann erneut gesch ttelt 3 Die L sung wird mit 20 0 mL Boratpuffer pH 9 versetzt und mit destilliertem Wasser zu 100 0 mL aufgef llt 4 Konzentrationsbestimmung am Fluorimeter 3 2 Bestimmung der Restfeuchte der Lyophilisate mit Hilfe der Karl Fischer Titration 1935 publizierte Karl Fischer eine Methode zur quantitativen Bestimmung von Wasser durch Redoxtitration Die coulometrische Karl Fischer Titration ist eine Variante der klassischen Wasserbestimmungsmethode nach Karl Fischer Die herk mmliche Methode arbeitet mit einer methanolischen L sung von lod Schwefel dioxid und einer Base als Puffersubstanz hier Imidazol Bei der Titration einer wasserhaltigen Probe laufen mehrere Reaktionen ab die sich in den folgenden Summengleichungen zusammenfassen lassen 1 CH30H SO2 RN S RNH SO3CH3 2 H20 l2 RNH SO3CH3 2RN gt RNHISO CH3 2 RNHI RN Base Imidazol 71 3 EXPERIMENTELLER TEIL Reaktion 1 ist eine Gleichgewichtsreaktion bei der Methylsulfit entsteht Reaktion 2 ist die Redoxreaktion Die Reaktionsgeschwindigkeit h ngt von der verwendeten Base ab Sie verl u
49. Entwicklung eines Mini Gefriertrockners Kontrollierte Herstellung und Charakterisierung von Tragerlyophilisaten zur Anwendung am Auge Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades Dr rer nat der Mathematisch Naturwissenschaftlichen Fakult t der Rheinischen Friedrich Wilhelms Universit t Bonn vorgelegt von Stephan Alexander Maier aus Wertheim am Main Bonn 2003 Angefertigt mit Genehmigung der Mathematisch Naturwissenschaftlichen Fakultat der Rheinischen Friedrich Wilhelms Universitat Bonn 1 Referent Professor Dr R Suverkrup 2 Referent Professor Dr M Diestelhorst Tag der Promotion 15 Juni 2004 INHALTSVERZEICHNIS 1 EINLEITUNG UND ZIELSETZUNG 2 THEORETISCHER TEIL GRUNDLAGEN UND STAND DER TECHNIK 2 1 Arzneiformen in der ophthalmologischen Therapie 2 1 1 Konventionelle Augentropfen Bewertung einer Applikationsform 2 1 2 Ophthalmic Lyophilisate Carrier System OLCS 2 2 Gefriertrocknung 2 2 1 Definition 2 2 2 Geschichtlicher Hintergrund 2 2 3 Vor und Nachteile der Gefriertrocknung 2 2 4 Einsatzgebiete der Gefriertrocknung 2 2 5 Der Gefriertrocknungsprozess 2 2 5 1 Einfrieren 2 2 5 2 Aufbau der Gefriertrocknungsanlage GT Anlage 2 2 5 3 Funktionsweise der Komponenten und deren Aufgabe bei Prim r und Sekund rtrocknung 2 2 5 4 Energie bertragung im Vakuum 2 2 5 5 Die Produkttemperatur im Gefriertrocknungsprozess 2 2 5 6 Erkennung des Endpunktes der Sublimationstrocknung 2 2 5 7
50. ION Dabei zeigte sich dass sich eine Verdreifachung der Wirkstoffkonzentration weder auff llig auf die Durchfriertemperatur Gefrierpunktserniedrigung noch auf die Dauer des Plateaus auswirkte Insgesamt verlaufen die Trocknungskurven jeweils fast iden tisch zueinander Allerdings zeigte sich bei allen drei Methoden eine Verl ngerung der Trocknungszeit von im Durchschnitt etwa 2 Minuten Im Vergleich zur Gesamt prozesszeit von 12 bis 15 Minuten stellt dies eine deutliche Verl ngerung des Trocknungszyklus dar Bei der Haupttrocknung wandert die Sublimationsfront von au en nach innen Die bereits trockenen Produktzonen sind eine Barriere f r den Wasserdampf Abtransport von der Sublimationsfront Abb 4 25 zeigt die Abh ngigkeit des mittleren Lyophilisatwiderstandes und damit der Sublimationsrate von der Konzentration einer w ssrigen KCl Losung 34 Auch Pikal beobachtet eine Erh hung des Lyophilisatwi derstandes bei einer h heren Konzentration an gel sten Substanzen 57 N O L sungskonzentration a u oll o i r E i 5 6 wie z 2 aw LU 5 O ia a Lii P mr oO lt Li 5 10 15 20 CONCENTRATION volume Abb 4 25 Abh ngigkeit des Lyophilisatwiderstandes von der L sungskonzentration 34 Selbst bei den niedrigen Feststoffkonzentrationen die zur Fertigung von OLCS eingesetzt werden haben Mengen nderungen der gel sten Substanzen deutlichen Einfluss auf die Dauer
51. IR LSD Max max MFW Min min NASA NIR OLCS PC PE Ph Eur Abbildung Analysis Of Variances Varianzanalyse Barometrische Temperaturmessung beziehungsweise circa Chargenbezeichnung Deutsches Arzneibuch das hei t Deutsche Industrienorm Einzeldosisophthiole Endtemperatur englisch et alii Evakuiergeschwindigkeit Firma Gefriertrocknungsanlage Haftfestigkeit Hydroxypropylmethylcellulose Stunden Infrarot Least Significance Difference Maximum maximal Mittlere Freie Weglange Minimum mindestens National Aeronautics and Space Administration Nahinfrarotspektroskopie Ophthalmic Lyophilisate Carrier System Personal Computer Polyethylen Europaisches Arzneibuch 183 6 ANHANG PTFE rel Rel St Abw REM S O schl sec SOQ SPSS St Abw Temp USP vgl z B Polytetrafluorethylen relativ Relative Standardabweichung Rasterelektronenmikroskopie siehe oben schlecht Sekunde so genannt Statistical Package for the Social Sciences Standardabweichung Temperatur United States Pharmacopoeia vergleiche zum Beispiel 184 7 Literaturverzeichnis 1 Arzneimittel Kompendium der Schweiz 2002 Bauer KH Fr mming KH F hrer C Lehrbuch der Pharmazeutischen Technologie 7 Auflage Stuttgart Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft mbH 2002 130 132 Brown MM Brown GC Spaeth GL Improper Topical Self Administration of Ocular Medication among Patients with Glaucoma Can
52. J Ophthalmol 1984 19 2 Br lls M Rasmuson A Heat Transfer in Vial Lyophilisation International Journal of Pharmaceutics 2002 246 1 16 Bruttini R Rovero G Baldi G Use of a pilot plant for the kinetic study of the process of Iyophilisation Farmaco Ed Prat Issue Nov 1986 41 347 357 Bruttini R Rovero G Baldi G Experimentation and Modelling of Pharma ceutical Lyophilization using a Pilot Plant Chemical Engineering Journal and the Biochemical Engineering Journal 1991 45 Abstract B hl A amp Z fel P SPSS f r Windows Version 6 1 Praxisorientierte Einf hrung in die moderne Datenanalyse Bonn Paris Addison Wesley Publishing Company 1995 Burger A Wachter H Hunnius Pharmazeutisches W rterbuch 8 Auflage Berlin de Gruyter 1998 Christ GmbH Gefriertrocknung und Vakuumkonzentration Das Christ Seminar Grundlagen der Gefriertrocknung Martin Christ Gefriertrock nungsanlagen GmbH Osterode Harz 185 11 13 15 16 17 Christiani R Techniker Kalender 1976 22 Ausgabe Konstanz Dr Ing P Christiani GmbH 1976 Cook C Cox G Freeze drying from technique to technology Laboratory Equipment Digest 1988 26 3 107 110 Daniels R Galenische Tricks fur Arzneiformen am Auge Pharm Ztg 2003 19 21 29 Deutsches Arzneibuch 9 Auflage DAB9 Stuttgart Deutscher Apotheker Verlag Diestelhorst M Grunthal S S verkr p R Dry Drops a new preservative
53. Klarheit Durchsichtigkeit und Schwebstofffreiheit 52 3 EXPERIMENTELLER TEIL F r alle nachfolgenden Versuche wurde das folgende Produkt verwendet Methocel E50LV Premium EP Colorcon Ltd England 45 Ch B OK 16012415 pH 1 ige L sung 5 5 bis 8 Substitutionsgrad Methoxygruppen 28 0 30 0 Substitutionsgrad Hydroxypropylgruppen 7 0 12 0 Viskosit t nach Ph Eur 49 mPa s Relative Molek lmasse 10000 bis 150000 g mol 8 3 1 3 Arzneistoff Fluorescein Natrium Ph Eur Farbstoff zur diagnostischen Anwendung Aussehen orangerotes feines hygroskopisches Pulver Eigenschaften leicht l slich in Wasser l slich in Ethanol praktisch unl slich in Hexan 2 ige w ssrige L sung mit gelbgr ner Fluoreszenz pH Wert 2 ige L sung 7 0 bis 9 0 Relative Molek lmasse 376 3 g mol 21 Pharmakokinetik Der Farbstoff wird bei normaler Applikation am Auge nicht resorbiert jedoch l sst sich durch Zus tze wie 0 5 Hydroxypropylmethylcellulose oder Benzalkoniumchlo rid die Permeabilit t ern hen 80 Fluorescein wird ber den Tr nen Nasen Kanal resorbiert Es wird rasch zum Glucoronid metabolisiert das ber den Urin ausgeschieden wird 53 3 EXPERIMENTELLER TEIL Indikationen und Anwendungsmoglichkeiten e Nachweis und berwachung von Hornhautulzerationen o traumatischen Ursprungs o verursacht durch Mikroben Viren oder Pilze o trophischen oder degenerativen Ursprungs e Augendruckmessung
54. Kondensator Abb 4 7 Schemazeichnung des Prototyp 4 Technische Zeichnung und Fertigung B Neff Mit dem endg ltigen Aufbau des Mini Gefriertrockners Prototyp 4 Abb 4 8 lie sich ein noch tieferes Vakuum erreichen 0 01 mbar Dadurch und weil die Kondensator fl che auf etwa ein Drittel reduziert wurde kam es nicht mehr zu Kondenswasserbil dung am Trockenrohr Die Standzeit der Anlage verl ngerte sich deutlich es traten keine Materialermudungen mehr auf Die Ver nderung des Endvakuums und der Kondensatorfl che hatte in der Folge Auswirkungen auf die bisher entwickelten Einfrier und Trocknungsmethoden Allerdings lie en sich die Unterschiede einfach kompensieren vgl Kapitel 4 4 1 4 94 4 ERGEBNISSE UND DISKUSSION Abb 4 8 Endgultiger Aufbau des Mini Gefriertrockners Prototyp 4 A Kunststofftrager mit radialer O Ringdichtung B Trocknungskammer C Kondensatorkammer aus Aluminium D Strahlungsheizung E Reservoir fur Flussigstickstoff F kapazitiver Drucksensor G Feinventile zur Einstellung des Endvakuums der Evakuiergeschwindigkeit Abb 4 9 Blick von vorne in die Trocknungs Abb 4 10 Blick durch das seitliche Sicht kammer fenster in die Trocknungskammer wahrend A Strahlungsheizung der Trocknung B Kondensatorflache mit Thermofuhler 95 4 ERGEBNISSE UND DISKUSSION 4 1 4 Kontrolle und Aufzeichnung der Prozessparameter Datenerfassungsprogramm zur Messdatenerfassung per PC Mit Hilfe des eigens
55. Kurve angese hen Zus tzlich zu den aufgezeichneten Werten lie sich das Abrei en auch durch ein deutlich vernehmbares Knacken erkennen Bei der Restkraft nach den Maxima handelt es sich um Reibungskr fte da sich die Lyophilisate nach dem Abrei en von der PTFE Folie h ufig meistens unterst tzt durch eine starke elektrostatische Aufla dung in der Aussparung der Abrei vorrichtung verhakten vgl Abb 3 9 Nur in den seltensten F llen fielen sie direkt vom Tr ger ab 120 4 ERGEBNISSE UND DISKUSSION Kraft g 0 5 1 0 Weg mm Abb 4 26 Kraft Weg Diagramme der Haftfestigkeitsuntersuchungen Interessant war das Auftreten von Minima vor dem eigentlichen Maximum bei den meisten Abrei kurven in Abb 4 26 mit einem Pfeil angedeutet Hier lie sich nicht eindeutig ermitteln ob sich das Lyophilisat bereits vollst ndig vom Tr ger abgel st hatte und es nur durch Reibungseffekte zu einer weiteren Erh hung der Haftkraft kam Um diese Fragestellung zu untersuchen wurden Haftfestigkeitsmessungen direkt nach dem Auftreten eines solchen Minimums unterbrochen Abb 4 27 Dazu wurde der Motor der Abrei einrichtung angehalten und die Messwerterfassung gestoppt Die d nne Linie beschreibt den Verlauf der auftretenden mechanischen Kr fte bis kurz nach dem Minimum Pfeil Um die leicht unter mechanischer Spannung stehenden Applikatoren aus dem AbreiBspalt zu entfernen wurde der Motor kurz in entgegengesetzter Laufrichtung gesc
56. Produktinformation Firma 3P GmbH Karben Rahm H Fortbildungskurs der Gesellschaft Schweizerischer Industrie Apotheker GISA 1979 1980 Lektion 6 37 Rohacell Handbuch R hm Kunststoffe R hm GmbH Chemische Fabrik Darmstadt Rote Liste Aulendorf W rttemberg Editio Cantor Verlag 2000 Roy ML Pikal MJ Process Control in Freeze Drying Determination of the End Point of Sublimation Drying by an Electronic Moisture Sensor Journal of Parenteral Science and Technology Issue March April 1989 43 60 66 Rucker G Neugebauer M Willems GG Instrumentelle pharmazeutische Analytik 2 Auflage Stuttgart Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft mbH 1992 102 108 Rupprecht H Physikalisch chemische Grundlagen der Gefriertrocknung in Essig D Oschmann R Lyophilisation Stuttgart Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft 1993 191 68 69 71 72 73 74 75 Sachs L Statistische Methoden Planung und Auswertung Berlin Heidelberg New York Springer Verlag 1993 312 Saeger H Taskis CB Syrop M Lee TJ Structure of Products Prepared by Freeze Drying Solutions Containing Organic Solvents Journal of Parenteral Science Technology 1985 39 4 161 179 Schelenz G Engel J Rupprecht H Sublimation During Lyophilisation Detected by Temperature Profile and X ray Technique International Jour nal of Pharmaceutics 1995 113 133 140 Schoen MP Braxton BK Gatlin LA Jefferis III RP A Si
57. RETISCHER TEIL Fazit Bereits bei der Prozessentwicklung muss die Produkttemperatur kontinuierlich in je dem Verfahrensschritt erfasst werden um die geeigneten Parametereinstellungen f r einen schnellen und effizienten Gefriertrocknungszyklus experimentell zu ermitteln Auch bei der gro technischen Produktion gibt es die verschiedensten Fehlerquellen die zu einem qualitativ unzureichenden Produkt f hren k nnen Ohne eine stichpro benartige berwachung der Produkttemperatur w hrend des gesamten Gefriertrock nungszyklus Inprozesskontrolle fehlen Daten die wichtige Hinweise ber die Fehlerursache geben k nnen 85 2 2 5 6 Erkennung des Endpunktes der Sublimationstrocknung Die Prim rtrocknung ist beendet wenn das Eis vollst ndig aus den Produkten ent fernt ist Im n chsten Schritt wird die Temperatur der Heizquelle erh ht um adsor biertes Wasser schneller zu entfernen Sekund rtrocknung Geschieht dies bevor das Eis vollst ndig entfernt wurde riskiert man Kollaps oder eutektisches Schmelzen in den Produkten die noch Restmengen an Eis enthalten Zur Prozesskontrolle ben tigt man daher eine M glichkeit den Endpunkt der Sublimationstrocknung zu erkennen e Temperaturmessung im Produkt Die Messung der Produkttemperatur ist die am h ufigsten angewendete Metho de um den Endpunkt der Prim rtrocknung zu bestimmen 57 Die Temperaturmessung erfolgt in den untersten Produktschichten bei der h chs ten Eistempera
58. Stellflache und der Kammerdruck innerhalb ihrer vorgeschriebenen Grenzen liegen Die direkte Abh ngigkeit dieser drei Werte voneinander erm glicht eine solche Kon trolle Der Nachweis ber die richtige Stellfl chentemperatur und den Kammerdruck ist erbracht wenn mindestens eine Produkttemperatur pro Stellfl che berpr ft wird Somit ist es m glich sowohl die Richtigkeit der Druckmessung zu kontrollieren als auch Abweichungen der Stellfl chen von der Solltemperatur zu erkennen bevor solche Ver nderungen die Qualit t des Endproduktes nachteilig beeinflussen Des halb ist es im Sinne der Qualit tskontrolle essentiell darzulegen dass die Produkt temperatur w hrend der Prim rtrocknung in den vorgeschriebenen Grenzen gehalten wurde Eine indirekte Absch tzung der Produkttemperatur ber den 33 2 THEORETISCHER TEIL Kammerdruck und die Stellflachentemperatur f hrt zu einem Unsicherheitsgrad bezuglich der Produktqualitat 28 2 2 5 5 3 Die Sekundartrocknung Die Haupttrocknung ist dann beendet wenn das gesamte Eis sublimiert ist Im Gut verbleiben danach zwischen 5 und 30 des urspr nglich vorhandenen Wassers Die Sekund rtrocknung dient der Reduktion der Restfeuchte im getrockneten Pro dukt Der Restwassergehalt ist haupts chlich abh ngig von den adsorptiven Eigen schaften des Lyophilisates Daneben beeinflussen w hrend der Sekund rtrocknung aber auch Lyophilisattemperatur Partialdruck des Wasserdampfes ber der Pr
59. Studien vom Tr ger abgel st haben bzw ob sie geeignet sind eine gew nschte Wirkstoffdosis zu applizieren wurde auch auf diesen Tr gern der zur ckgebliebene Anteil Fluorescein bestimmt Anhand der jeweils zugeh rigen In vitro Ergebnisse soll schlie lich gepr ft werden ob ein Zusammenhang zwischen der In vivo Applikation und dem Abrei test festgestellt werden kann 4 4 4 1 Abh ngigkeit der Restmengen von den Einfrierbedingungen In diesem Versuch wurden Lyophilisate verwendet die mit 0 272 Fluorescein Natrium und 0 5 1 0 oder 1 5 HPMC E50 in der Ausgangsl sung sowie bei vier unterschiedlichen Einfrierbedingungen hergestellt worden waren Prototyp 4 Die nach dem In vitro AbreiBtest auf der PTFE Folie zur ckgebliebene Fluorescein Natrium Menge wurde quantitativ ermittelt Es sollte berpr ft werden ob ein Zusammenhang zwischen der Einfriermethode und der Restmenge besteht Schon die makroskopische visuelle Betrachtung der Fluoresceinr ckst nde auf den PTFE Folien l sst vermuten dass ein Zusammenhang zwischen den Einfrierge schwindigkeiten und der Restmenge auf dem Applikator besteht Abb 4 75 Bei OLCS die durch vakuuminduziertes Einfrieren mit einer Evakuiergeschwindigkeit von 13 4 mbarL s hergestellt wurden scheint nach dem Abrei test die gr te Fluoresceinmenge auf dem Tr ger zur ckgeblieben zu sein 163 4 ERGEBNISSE UND DISKUSSION Schnelles Einfrieren 33 5 mbarL s Abb 4 75 V
60. Trager l sen k nnen Nach Methode 2 hergestellte Lyophilisate weisen fur die Anwendung optimale Haftfestigkeitswerte auf Methode 3 f hrt bei diesem Versuch zu Haftfestigkeiten bei denen eine vollst ndige Applikation nicht mehr gew hrleistet ist Einfriermethode mit Ventilstellung 0 530 600 Resultierende Evakuiergeschw mbarL s 13 4 33 5 Mittlere L nge der Plateauphase min Mittlere Haftfestigkeit g 14 41 32 47 Tabelle 11 Zusammenhang zwischen Evakuiergeschwindigkeit L nge der Plateauphase und Haftfestigkeit der resultierenden Lyophilisate Tabelle 11 zeigt noch einmal den Zusammenhang zwischen Evakuiergeschwindig keit L nge der Plateauphase und Haftfestigkeit der dazugeh rigen Lyophilisate Eine Erh hung der Evakuiergeschwindigkeit resultiert jeweils in einer Verk rzung der Durchfrierphase Je k rzer die Plateauphase umso gr er ist die mittlere Haftfestig keit der produzierten Lyophilisate Zur Interpretation und Erkl rung der Ergebnisse wurden rasterelektronenmikroskopi sche Aufnahmen herangezogen Methode 1 Das Einfrieren unter Atmosph rendruck f hrt zu geringen Haftfestigkeiten von durch schnittlich 7 5 g Bei dieser Einfriermethode erfolgt der W rmeentzug ausschlie lich konvektiv durch die Kondensatorfl che die sich direkt unterhalb des Probentr gers befindet Daher erreicht zuerst eine d nne Schicht an der Unterseite des Tropfens die in direktem Kontakt zur PTFE Folie steht die
61. Tripelpunkt Testgr e f r den H Test nach Kruskal und Wallis Wasser Dynamische Viskosit t cP oder mPaes Joule Boltzmann Konstante J K Konstante der Kapillare des Ubbelohde Viskosimeters cSt s Kaliumchlorid Kilovolt Wellenl nge nm Millibar Minute Stichprobenanzahl Stoffmenge mol Newton Avogadrokonstante mol 181 6 ANHANG Ni Pa Pc Qe Qges R2 Sm Tc Tp Ts lt Nickel Druck mbar Druck mbar Signifikanzniveau Irrtumswahrscheinlichkeit Pascal Kammerdruck mTorr Kammerdruck N m mbar oder Pa Dichte 1000 kg m Pi 3 1415 Schmelzw rme von Eis J mol oder J g Gesamte Warmemenge J g Geschutztes Warenzeichen Allgemeine Gaskonstante 8 314 J mol K Bestimmtheitsma Strecke m Durchflusszeit s Zeit s Temperatur C oder K Temperatur C oder K Kollapstemperatur C Gastemperatur C oder K Produkttemperatur C Stellflachentemperatur C kinematische Viskositat cSt Volumen L Ventilstellung Volt Volumen pro Zeiteinheit m sec durchsetztes Volumen m Hagenbach Korrekturfaktor s Geschwindigkeit m s Watt Gesamte Energiemenge J g Chi Quadrat Testgr e f r den y Test Anzahl der Partner mit denen das Molek l kollidiert 182 6 ANHANG 6 2 Abkurzungen Abb ANOVA BIM bzw Ca Ch B DAB d h DIN EDO Endtemp engl et al Evakuiergeschw Fa GT Anlage Haft HPMC hrs
62. allrohr entstandenen Distanz zwischen Dichtfl che und kaltem Kondensatorrohr wirkte die Raumtemperatur effizient einer Abk hlung der Dichtfl che entgegen Durch das Mitevakuieren dieses Bereiches wurde zus tzlich der W rmeentzug durch Konvektion minimiert 86 4 ERGEBNISSE UND DISKUSSION Diinnes Edel stahlrohr Spalt zum Evakuieren des vorderen Bereiches ca ow Gem ppm je ee re ne m m nn TS eee ZZ EEE ER i a Ta HT j ape Neue Dicht Evakuierter fl che Bereich Abb 4 3 Schemazeichnung des Prototyp 1b Technische Zeichnung und Umbau B Neff Mit diesem Prototyp war es nun wegen des l nger anhaltenden Vakuums m glich einige OLCS nacheinander zu trocknen Allerdings zeigten sich nach kurzer Probe zeit erneut Probleme Problematik bei der Verwendung von Prototyp 1b Das Aufheizen des Aluminiumblockes in direkter N he zum Kondensator Spaltbreite von nur wenigen Millimetern f hrte dazu dass der Fl ssigstickstoff rasch verdampf te und das Reservoir in kurzen Abst nden aufgef llt werden musste Der gesamte Aluminiumblock musste aufgeheizt werden obwohl nur ein kleiner Bereich unterhalb des gefrorenen Tropfens die W rmezufuhr ben tigte Durch dieses tr ge System dauerten Temperaturwechsel sehr lange Dazu kam dass bei laufendem Betrieb der Aluminiumzylinder immer weiter abk nhlte Die tr ge Temperatursteuerung regelte zwar permanent einer Abk hlung entgegen durch diese schubweise Energiezufu
63. amit sollte sich nach Abb 4 71 eine Druckfestigkeit von 45 55 g mm ergeben Da eine solche Variation des Polymergehaltes auf 1 5 mit einer starken Haftfestigkeitserh hung einhergeht muss die optimale niedrigere Evakuierge schwindigkeit ermittelt werden bei der eine Haftfestigkeit im Bereich von 12 bis 14 g beibehalten wird Nach Abb 4 54 Kapitel 4 4 1 3 ist bei 375 ug Polymergehalt der entsprechende Wert f r die Evakuiergeschwindigkeit 5 5 mbarL s Mit einer Ventilstellung von 470 wird diese Evakuiergeschwindigkeit erreicht Nach diesen Vorgaben wurden Klinikmuster gefertigt und vorab in vitro auf ihre Eigenschaften untersucht Der erwartete Wert f r die Druckfestigkeit liegt bei 45 55 g mm Das ermittelte Ergebnis brachte einen Wert von 51 6 g mm St Abw 5 3 g mm n 5 F r die Haftfestigkeit wird 12 g bis 14 g vorausgesagt Die In vitro Untersuchungen ergaben 12 7 g St Abw 4 9 g n 10 Erwartungsgem lie en sich diese Lyophilisate hnlich gut und vollst ndig applizie ren wie die OLCS der Studie 1 mit der dreifachen Wirkstoffkonzentration Best tigt wurde dies anhand der Restmengenbestimmung durch Fluoreszenzspektroskopie bei der sich eine durchschnittliche Restmenge an Fluorescein von 0 7 St Abw 0 6 n 21 ermitteln lie In 5 Fallen kam es durch Anwendungsfehler zu einer unvollst ndigen Abl sung Mittelwert 63 2 St Abw 51 1 n 5 161 4 ERGEBNISSE UND DISKUSSION Der erh hte Polymergehalt machte
64. aud rate 9600 bd Data bits 7 Stop bits 1 Parity Odd Flow control none Messintervall 1 sec Betriebsgerat zur Druckerfassung MKS PR 4000 S 49 Baud rate 9600 bd Data bits 7 Stop bits 1 Parity Odd Flow control none Messintervall 1 sec 97 4 ERGEBNISSE UND DISKUSSION 4 2 Charakterisierung der verwendeten Polymerlosungen Die in den Gefriertrocknungsversuchen verwendeten HPMC E50 L sungen ver schiedener Konzentrationen wurden ohne Wirkstoffzusatz auf die Dichte Viskosit t und Dosiergenauigkeit hin untersucht 4 2 1 Bestimmung der Dichte bei 20 C Im Folgenden soll untersucht werden welchen Einfluss die Polymerkonzentration im Bereich zwischen 0 5 und 1 5 auf die Dichte der w ssrigen L sung hat Masse des leeren Pyknometers 30 8633 9 Gesamtmasse g 80 7931 80 8624 80 9245 L sung Pyknometer Masse der L sung g 49 9298 49 9991 90 0612 Resultierende Dichte g cm 0 9986 1 0000 1 0012 Tabelle 2 Ergebnisse der Dichtebestimmung mit dem Pyknometer Tabelle 2 zeigt die Ergebnisse der Dichtebestimmung der verwendeten HPMC L sungen Mit steigender HPMC Konzentration ist auch ein geringf giger Anstieg der Dichte zu erkennen Da allerdings die Unterschiede nur minimal sind und alle drei Werte fast 1 0 betragen wird hier vereinfacht f r alle L sungen von einer Dichte von 1 0 g cm ausgegangen Dies entspricht dem Dichtewert des L sungsmittels Bei der volumetrischen
65. bb 4 78 Restmenge an Lyophilisat nach langsamem Einfrieren mit 1 65 mbarL s Durch die analytische Bestimmung der Restmengen mittels Fluoreszenzspektrosko pie konnten diese Ergebnisse quantifiziert werden Abb 4 79 165 4 ERGEBNISSE UND DISKUSSION 5 5 5 0 HPMC Konzentration w 125 ug 250 ug 4 0 4 375 ug Restmenge ug 0 3 10 15 20 25 30 35 Evakuiergeschwindigkeit mbarL s Abb 4 79 Restmengen an Fluorescein Natrium auf den PTFE Folien nach erfolgten Abrei tests in Abh ngigkeit von der Evakuiergeschwindigkeit beim Einfrieren Der Ausgangsgehalt an Wirkstoff betr gt 68 ug jeweils n 5 ein Fehlerbalken entspricht einer Standardabwei chung Abb 4 79 zeigt eine deutliche Abh ngigkeit der Restmengen von der Einfriermetho de Die Fluoresceinmenge nimmt zun chst mit Erh hung der Evakuiergeschwindig keit und somit auch mit einer gr er werdenden Haftfestigkeit der Lyophilisate nahe zu linear zu Die gr te Restmenge ergibt sich wie der visuelle Eindruck nahe gelegt hatte bei einer Evakuiergeschwindigkeit von 13 4 mbarL s Eine weitere Erh hung der Einfriergeschwindigkeit 33 5 mbarL s resultiert dann jedoch in einer deutlichen Reduktion der auf dem PTFE zur ckgebliebenen Fluoresceinmenge nahezu ver gleichbar mit den Ergebnissen bei langsam eingefrorenen OLCS Hier wird deutlich dass zwischen dem Einfrieren mit einer Evakuiergeschwindigkeit von 13 4 mbarL s und 33 5 mbarL s grundl
66. bleiben dass sich das Lyophilisat nicht vor der Applikation vom Tr ger l st Die Obergrenze ist erreicht wenn die Druckfestigkeit ein nicht mehr akzeptables Fremdk rpergef hl im Auge verursacht Die Ergebnisse zeigen dass es mit dem Mini Gefriertrockner m glich ist in einem bestimmten Bereich nahezu jedes gew nschte Verh ltnis von Haft und Druckfestig keit einzustellen Somit k nnen f r jede Augentropfenrezeptur die optimalen Eigenschaften eingestellt werden die eine leichte und vollst ndige Applikation der Lyophilisate gew hrleisten Da in Studie 3 das Fremdk rpergef hl als zu stark beurteilt wurde w re ein Ansatz f r eine weitere klinische Studie die Polymerkonzentration der L sung und damit die Druckfestigkeit wieder zu reduzieren z B 1 HPMC E50 mit etwa 30 g mm Druck festigkeit Dann m sste allerdings auch die Haftfestigkeit entsprechend niedriger als 12 bis 14 g gew hlt werden Bei einer minimalen akzeptablen Haftfestigkeit von 2 g bleibt gen gend Spielraum f r eine Anpassung dieser Eigenschaft 162 4 ERGEBNISSE UND DISKUSSION 4 4 4 Restmengenbestimmung auf den Tragerfolien Nachfolgend werden die Restmengen an Fluorescein Natrium auf den Tr gerfolien nach In vitro AbreiBtests ermittelt Es sollte untersucht werden ob die Ergebnisse abh ngig von Einfriermethode Wirkstoffgehalt und Polymergehalt sind Um eine Aussage dar ber zu erhalten wie sich die unterschiedlichen Lyophilisate in den klini schen
67. bstreifkraft ber 20 g lag sich nicht mehr ohne Probleme am Auge abstreifen lie en Ebenso k nnten Lyophilisate mit Werten unter 2 g nur mit Schwierigkeiten transportiert werden da geringe u ere Einwirkungen bereits zu einer Abtrennung vom Tr ger f hren k nnten Beide Erscheinungen sind unerw nscht Zudem sollte das Polymerger st der Lyophilisate so beschaffen sein dass es sich relativ leicht verformen l sst um auf diese Weise eine angenehme Applikation am Auge zu erm glichen 82 Durch klinische Studien sollen f r beide Eigenschaften Abl sbarkeit und Druckfes tigkeit geeignete rezepturubergreifende Wertebereiche f r eine gute In vivo Applizierbarkeit gefunden und mit Hilfe der beschriebenen Testmethoden quantifiziert werden Dabei erfolgt die Variation dieser Eigenschaften ber die Herstellungspara meter Polymergehalt der Rezeptur und Einfriermethode durch entsprechende Einstellung am Mini Gefriertrockner Eine in der Ophthalmologie g ngige Methode zur Bestimmung der Abflussgeschwin digkeit des Kammerwassers ist die n chtliche Applikation von insgesamt 6 Tropfen Fluoresceinl sung 68 ug pro Tropfen ber einen Zeitraum von 3 Stunden die f r Patient und Arzt aufwendig und unangenehm ist Um den Aufwand f r diese Untersuchung zu verringern sollte in einer klinischen Studie Studie 1 ermittelt werden ob durch eine einmalige Applikation eines hoch dosierten Fluoresceinlyophilisates 204 ug Wirkstoffdosis die gleich
68. ch bei der Keilbildung ringf rmig von der Folie Nur der Au enrand und das 172 4 ERGEBNISSE UND DISKUSSION Zentrum der Unterseite sind noch mit ihr verbunden Die Haftkraft nimmt ab Dieser Effekt ist unabh ngig vom Polymergehalt der Lyophilisate und f hrt bei 125 ug HPMC Gehalt sogar zu einem R ckgang der Haftfestigkeit Abb 4 54 Bei hochdosierten Lyophilisaten 204 ug steigt die Haftfestigkeit bei einer Evakuiergeschwindigkeit von 33 5 mbarL s dagegen stark an Abb 4 53 Eine Aufkonzentrierung des gel sten Wirkstoffs an der Kontaktfl che zur Folie ist eine m gliche Erkl rung Eine Untersuchung der R ckstandsmengen an Wirkstoff nach erfolgtem Abrei test f r beide beschriebenen Dosierungen untermauert dies Tabelle 20 Bei langsa mem Einfrieren unter Atmosph rendruck ist das Verh ltnis der Restmengen mit 1 7 1 deutlich kleiner als das Ausgangsverh ltnis 3 1 bzw 204 ug zu 68 ug Eine Aufkonzentrierung an der Oberfl che hat diesen reduzierten Wirkstoffgehalt an der Lyophilisatunterseite zur Folge Umgekehrt ist im Fall des vakuuminduzierten Einfrie rens mit 33 5 mbarL s ein Restmengenverh ltnis von 6 2 1 wesentlich h her als erwartet Die Konzentrierung des Wirkstoffs an der Kontaktfl che zur Tragerfolie beruht auf einem von oben nach unten hin gerichteten Kristallwachstum w hrend der Einfrierphase Beim Evakuieren mit 13 4 mbarL s ist keine Gefrierkonzentration nachweisbar Mit einem R ckstandsverh ltnis von
69. cher Test Einfaktorielle Varianzanalyse ANOVA mit nachfolgendem post hoc Test bei 3 und mehr unabhangigen Datengruppen Mittels der einfaktoriellen Varianzanalyse wird bei 3 oder mehr unabhangigen Daten gruppen berpr ft ob sich die einzelnen Datengruppen signifikant unterscheiden Bei einem Unterschied wird in einem nachfolgenden post hoc Test berpr ft welche Gruppen sich signifikant unterscheiden Dabei werden die Messgruppen durch den Fischers Least Significance Difference LSD Test paarweise miteinander verglichen 11 3 EXPERIMENTELLER TEIL Nichtparametrischer Test H Test nach Kruskal und Wallis mit nachfolgendem post hoc Test bei 3 und mehr unabhangigen Datengruppen Mit dem H Test nach Kruskal und Wallis k nnen mehr als drei unabh ngige Daten gruppen unter vollst ndiger Aussch pfung der ordinalen Information der Daten Range analysiert werden Dabei handelt es sich um das verteilungsfreie Analogon zur parametrischen ANOVA Bei einem signifikanten Unterschied der Gruppen wird durch das post hoc Verfahren berpr ft welche Gruppen sich signifikant unterschei den Hier werden die einzelnen Datengruppen paarweise durch den Games Howell pairwise comparison Test miteinander verglichen Dieser Test wird angewendet wenn keine Varianzhomogenitat vorherrscht Fur den Fall dass Varianzhomogenitat gegeben ist aber keine Normalverteilung vorliegt wird als post hoc Test wiederum Fischer s Least Significance Differenc
70. chmierten beim Kontakt mit der Tr nenfl ssigkeit und lie en sich nicht vollst ndig von der Folie abl sen Die Rest mengenanalyse dieser OLCS ergab eine nicht applizierte Fluoresceinmenge von 70 8 St Abw 7 7 n 20 gegen ber einer Restmenge von 2 1 St Abw 0 9 n 24 bei Klinikmustern mit guter Applizierbarkeit 160 4 ERGEBNISSE UND DISKUSSION Ruckstellmuster beider Studien lieferten als Anhaltswert fur die Druckfestigkeit der OLCS der Studie 1 einen Wert von 62 4 g mm St Abw 4 3 g mm n 3 fur die der Studie 2 einen Wert von nur 29 0 g mm St Abw 4 5 g mm n 3 Bei ann hernd gleicher Haftfestigkeit f hrt die Reduktion des Wirkstoffgehaltes um 67 zu einer um 53 5 verringerten Druckfestigkeit Anzunehmen ist dass dies der Grund f r die schlechte Applizierbarkeit bei 20 der 44 OLCS war Dennoch zeigt die Auswertung der erfolgreich applizierten Lyophilisate eine signifi kant bessere Bioverf gbarkeit 72 In Studie 3 mit 26 Probanden sollte berpr ft werden ob bei einfachem Fluorescein gehalt durch ein Anheben der Druckfestigkeit in den Wertebereich der Studie 1 55 65 g mm eine bessere Applizierbarkeit als in Studie 2 erreicht werden kann Da der Wirkstoffgehalt mit 68 ug vorgegeben ist der Feststoffgehalt aber als Variable genutzt werden kann die Druckfestigkeit zu erh hen wurde f r die neuen einfach dosierten Klinikmuster ein Polymergehalt von 1 5 HPMC E50 in der Ausgangsl sung gew hlt D
71. ck unterst tzt durch den schweren kapazitiven Druckmesser verursachte in regelm igen Abstan den Rissbildung im Acrylglas Dies f hrte zum Zusammenbruch des Vakuums Weitere Schwachpunkte waren die Stellen an denen das Metallrohr in die Rohacell Kiste eingeklebt war Wegen der h ufigen Wechsel zwischen Raumtemperatur und Fl ssigstickstoff Temperatur kam es durch die unterschiedliche thermische Verfor mung der beiden Materialien zu Materialerm dung Oft riss die Rohacell Kiste beim Bef llen mit Fl ssigstickstoff an den Klebestellen 92 4 ERGEBNISSE UND DISKUSSION Prototyp 4 Abb 4 7 Statt eines eingeklebten Metallrohres welches vollst ndig von Fl ssigstickstoff umgeben war wurde hier ein Messinghalbrohr als Kondensator verwendet Abb 4 9 das ber einen Kupferzylinder in Kontakt mit dem K hlmedium stand Da nun der Kondensator keine R hrenform mehr hatte wurde zus tzlich eine evakuier bare Kondensatorkammer ben tigt Aus Aluminium wurde eine nach oben offene Kammer gefertigt auf die der Vorratsbeh lter aus Rohacell aufgeklebt werden konnte Um diesen Beh lter aus einem St ck ohne Klebestellen fertigen zu k nnen wurde eine runde Form gew hlt In den Boden des Reservoirs eingeklebt stellte der Kupferzylinder die einzige w rmeleitende Verbindung zwischen Fl ssigstickstoff und dem Kondensator in der Kammer dar Durch diese Ma nahmen reduzierten sich die thermisch belasteten Klebestellen auf ein Minimum
72. cknung Im Durchschnitt nach 17 Minuten ist diese be endet erkennbar an dem steilen Anstieg der Produkttemperatur Da die Heizung erst 111 4 ERGEBNISSE UND DISKUSSION nach 5 Minuten zugeschaltet wurde betr gt auch hier die Dauer der Primartrocknung etwa 12 Minuten Unterkuhlung Gefrierpunkt Beginn Dauer der C C des Ein Plateau frierens phase BE min min po 176 16 235 0 284 BLS 0 867 EEE EEE EEE EEE EEE 0 317 0 317 0 250 0 317 0 317 0 350 Tabelle 7 Methode 2 Einfrierparameter n 8 0 01 Temperatur C Druck mbar 0 001 0 0001 0 00001 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 Zeit min Abb 4 20 Methode 2 Produkttemperatur und Druckverlaufe Langsames vakuuminduziertes Einfrieren 112 4 ERGEBNISSE UND DISKUSSION Es ist zu vermuten dass fur eine gleichformige Haftfestigkeit der Lyophilisate auf dem Applikator m glichst identische Einfrierkurven entscheidend sind Zur Verdeutli chung der guten Reproduzierbarkeit zeigt Abb 4 21 noch einmal vergr ert eine Zusammenstellung von Einfrierkurven aus Methode 2 Ventilstellung 530 40 10 30 l 20 O 10 01 S 5 0 E 001 as 10 O 2 5 E 20 0 001 amp 30 0 0001 40 50 0 00001 0 1 2 3 4 5 6 Zeit min Abb 4 21 Mehrere Einfrierkurven mit zugeh rigen Druckverl ufen nach Methode 2 Die Abbildung verdeutlicht die gute Reproduzierbarkeit des Mini Gefriertrockners Methode 3 Tabelle 8
73. d Fertigung B Neff Problematik bei der Verwendung von Prototyp 2 Der nicht mehr temperierbare Kunststofftr ger k hlte nach Abschalten der Strahlungsheizung bei Trocknungsende rasch ab so dass es auf ihm beim Heraus nehmen aus der Trocknungskammer zur Kondenswasserbildung kam Dies f hrte gelegentlich zum teilweisen Anl sen des Lyophilisates Au erdem sollte die n chste Entwicklungsstufe die Beobachtung des Gefriertrock nungsprozesses erm glichen Prototyp 3 Abb 4 5 Um die Vorg nge beim Einfrieren und Trocknen verfolgen zu k nnen wurde eine durchsichtige Trocknungskammer aus Acrylglas gefertigt Diese wurde an dem vor deren Ende des urspr nglichen Trockenrohres vakuumdicht angebracht Um den Kunststofftr ger nicht unn tig verl ngern zu m ssen wurde die Strahlungsheizung aus dem Stickstoffreservoir nach au en verlegt Dadurch verringerte sich der Verbrauch an fl ssigem Stickstoff erneut deutlich Da der Tr ger jetzt nicht mehr 90 4 ERGEBNISSE UND DISKUSSION vollst ndig vom Kondensator umgeben war und kaum noch abk hlte wurde Kondensation von Luftfeuchtigkeit beim Entnehmen verhindert Um den Abstand zwischen gefrorenem Produkt und Kondensatorflache dennoch m glichst klein zu halten wurde das Kondensatorrohr im unteren Bereich verl ngert so dass es bis unter das Gut in die neue Trockenkammer hineinragte Gleichzeitig wurde auch der Druckmesser vom hinteren Rohrsystem nach vorne verlegt um untersuchen zu
74. d Haftfestigkeit wurden hergestellt und deren Applizierbarkeit in klinischen Studien getestet Mit Hilfe der Fluorphotometrie erfolgte eine Quantifizierung der R ckst nde auf der Tr gerfolie So wurde die Vollst ndigkeit der Applikation nach der klinischen Anwendung wie auch die Restmenge des Wirkstoffs auf der Folie nach In vitro Abrei test ermittelt 2 THEORETISCHER TEIL 2 Theoretischer Teil Grundlagen und Stand der Technik 2 1 Arzneiformen in der ophthalmologischen Therapie 2 1 1 Konventionelle Augentropfen Bewertung einer Applikationsform Die Handhabbarkeit der konventionellen Darreichungsformen zur Anwendung am Auge und eine ausreichende Patientencompliance manchmal ber Jahre stellen gro e Probleme bei der Behandlung mit Ophthalmika dar Zur richtigen Anwendung von konventionellen Augentropfen muss der Kopf um mehr als 45 rekliniert werden Diese unphysiologische Haltung l st bei einigen Patienten Schwindelattacken aus 14 Auch kann eine Bewegungseinschr nkung verhindern dass eine solche Neigung erreicht wird In dieser Position fehlt dem Anwender die visuelle Applikationskontrolle z B durch einen Spiegel In der Folge misslingt h ufig das Einbringen des Tropfens in den Bindehautsack Der Tropfen l uft ber die Wange und der Wirkstoff steht am Auge nicht zur Verf gung Um die Anwendung zu kontrollieren ber hren einige Patienten die Cornea mit dem Tropfer Diese Methode ist abzulehnen da sie mit Schmerzen ei
75. d von Trockengut und Kondensator oberfl che Zur Vereinfachung der Berechnung des MFW wird angenommen dass nur eines der Gasmolek le in einem geschlossenen System in Bewegung ist Der Rest der Gas molek le bleibt in einer fixen Position so dass die Dichte des Gases konstant bleibt Au erdem wird vereinfacht davon ausgegangen dass alle Gasmolek le denselben Durchmesser d haben Das eine freibewegliche Gasmolek l hat eine Geschwindigkeit v und durchsetzt ein Volumen V pro Zeiteinheit Dabei kollidiert es mit jedem weiteren Molek l dessen Mittelpunkt sich im Abstand d von seinem eigenen Zentrum auf seiner Flugbahn befindet Abb 2 15 Abb 2 15 Kollisionen von Gaspartikeln in einem System in dem nur ein Gaspartikel frei beweglich ist Die brigen Partikel haben feste Positionen 41 2 THEORETISCHER TEIL Das durchsetzte Volumen V pro Zeiteinheit errechnet sich nach der Formel fur ein Zylindervolumen 1 29 d Durchmesser der Gasmolek le m v Geschwindigkeit des beweglichen Gasmolek ls m sec Sm Zur ckgelegte Strecke m t fur die Strecke sm ben tigte Zeit sec Mit V l sst sich nun die Anzahl der Gas Gas Kollisionen pro Zeiteinheit berechnen in die das eine freibewegliche Gasmolek l verwickelt ist Bei bekannter Gastempera tur T in diesem Fall die zum Kammerdruck nach der Dampfdruckkurve des Eises zugeh rige Temperatur und bekanntem Kammerdruck l sst sich ber das allgemei ne Gasgesetz 2
76. demnach keine signifikante Wirkung auf die Druckfestigkeit Polymergehalt Fur die Datengruppen Druckfestigkeit in Abh ngigkeit vom Polymergehalt ergibt sich keine Varianzhomogenitat p lt 0 001 Auf den drei Niveaus des Polymergehaltes unterscheiden sich die Druckfestigkeits Mittelwerte h chst signifikant H 51 819 gt X2a 0 05 5 99 p lt 0 001 Dieser h chst signifikante Unterschied besteht nach dem Games Howell Test zwischen jeder der drei Polymerkonzentrationen jeweils p lt 0 001 Der Polymergehalt hat einen sehr starken Einfluss auf die Druckfestigkeit der Lyophilisate Die statistische Auswertung belegt dass man den Einfluss der Evakuiergeschwin digkeit auf die Strukturfestigkeit der Lyophilisate vernachl ssigen kann Allein der Polymergehalt hat einen starken Einfluss Dieses Ergebnis l sst vermuten dass auch die Porengr e nur geringf gig durch die Einfrierbedingungen beeinflusst wird Dies soll im Folgenden berpr ft werden Es wurden Lyophilisate mit 375 ug HPMC E50 und 68 ug Fluorescein Natrium nach unterschiedlichen Einfriermethoden hergestellt Vertikalschnitte angefertigt und im REM auf ihre Porengr e hin untersucht Abb 4 72 bis Abb 4 74 156 4 ERGEBNISSE UND DISKUSSION Abb 4 72 bis Abb 4 74 Vertikalschnitte von Lyophilisaten aus 375 ug HPMC E50 und 68 ug Fluorescein Natrium hergestellt unter verschiedenen Einfrierbedingungen EN M ge Eh T aiat ae iig H lim Abb 4 72
77. der Strahl auf dem Weg zum Objekt nicht abgelenkt gestreut oder anderweitig gest rt wird Die zur ckgestreuten Prim r und die erzeugten Sekund r Elektronen werden durch einen Detektor erfasst Ein Videoverst rker generiert aus der ankommenden Spannung ein Schwarz Wei Bild auf einer Bildr hre Helle Punkte im Bild resultieren aus einer h heren Spannung als dunkle Punkte 64 3 EXPERIMENTELLER TEIL Da nicht leitende Proben im REM nicht sichtbar gemacht werden k nnen m ssen derartige Objekte zuerst mit einem Kleber fixiert und anschlie end mit einem leitenden berzug beschichtet besputtert werden Durchf hrung Ein Teil der Proben wurde mit einer Silbersuspension fixiert Jedoch l ste diese Suspension die Lyophilisate teilweise an so dass im weiteren Verlauf der Rasterauf nahmen UHU hart als Kleber eingesetzt wurde Um die Leitf higkeit zwischen Probe und Probenteller zu gew hrleisten wurde in diesen F llen vor der Goldbe schichtung die Oberfl che des getrockneten Klebers und des Probenhalters mit der Silbersuspension bepinselt Das Lyophilisat wurde 6 Minuten lang samt Halterung im Sputtercoater mit Gold beschichtet Mit Hilfe des REM wurden die so gefertigten Proben im Bereich von 25 facher bis 1000 facher Vergr erung detailliert betrachtet 65 3 EXPERIMENTELLER TEIL 3 2 4 Abl severhalten von der Tragerfolie Als Versuchsaufbau zur Bestimmung der Haftfestigkeit der Lyophilisate auf dem Applikato
78. des Gefriertrocknungsprozesses 119 4 ERGEBNISSE UND DISKUSSION 4 4 Einfluss von Lyophilisatzusammensetzung und Einfrierbedingungen auf die Eigenschaften von OLCS Charakterisierung der Lyophilisate Weichselbaum stellte fest dass eine einfache und vollstandige Applizierbarkeit von Tragerlyophilisaten ganz entscheidend von deren Haftfestigkeit und Strukturfestigkeit abh ngt 82 In den nachfolgenden Versuchen soll untersucht werden wie sich unterschiedliche Wirkstoff und Polymerkonzentrationen sowie verschiedene Einfrierbedingungen auf die Haft und Druckfestigkeit der Lyophilisate auswirken Zudem soll versucht wer den m gliche Unterschiede in den mechanischen Eigenschaften der Lyophilisate ber eine Analyse der Struktur mittels Rasterelektronenmikroskopie zu erkl ren 4 4 1 Aufzeichnung von Kraft Weg Diagrammen zur Ermittlung der Haftfestigkeit von Lyophilisaten auf der PTFE Folie Zur graphischen Darstellung des Krafteverlaufs bei der Haftfestigkeitspr fung wurden aus den Rohdaten Kraft Weg Diagramme erstellt Ausgewertet wurden hier die Kraft Weg Diagramme die sich bei Lyophilisaten aus 68 ug Fluorescein Natrium und 250 ug HPMC E50 einprozentige Ausgangsl sung hergestellt nach Methode 2 Ventilstellung 530 ergaben Abb 4 26 zeigt beispielhaft eine Zusammenstellung von 4 Kurven wie sie sich direkt aus den Rohdaten nach erfolgten AbreiBtests ergeben Als Haftfestigkeit wurde jeweils das Maximum der aufgezeichneten
79. diese dabei verschlossen und der Einfriervorgang beginnt Abb 3 5 Hier wurde die Trockenkammer aus Acrylglas verwendet um die Vorg nge w hrend des Einfrierens und Trocknens besser beobachten zu k nnen Abb 3 6 Bei dem wei en Zylinder in Abb 3 6 handelt es sich um die Strahlungsheizung Am glasigen und durchsichtigen Tropfen erkennt man dass er noch nicht gefroren ist Abb 3 6 Detailaufnahmen des noch fl ssigen Tropfens in der Trockenkammer Abb 3 5 Apparatur mit eingebrachtem Tropfen ist noch durchsichtig Tropfen Foto M Diestelhorst Foto M Diestelhorst 60 3 EXPERIMENTELLER TEIL Nachdem der Tropfen durchgefroren ist kann die Strahlungsheizung eingeschaltet werden Abb 3 7 Der Tropfen beginnt zu trocknen das u ere Erscheinungsbild wird matt Nach Beendigung der Trocknung wird die Trocknungskammer mit Stickstoffgas bel ftet und der Probentrager entnommen Der Applikator wird daraufhin in einem sterilen Polyethylen R hrchen verpackt und mit der Chargennummer versehen Abb 3 8 Abb 3 7 Durchgefrorener Tropfen in der Trockenkammer Tropfen erscheint matt Abb 3 8 In PE R hren verpackte Foto M Diestelhorst Lyophilisattr ger 61 3 EXPERIMENTELLER TEIL 3 2 2 Charakterisierung der verwendeten Polymerl sungen 3 2 2 1 Bestimmung der Dichte Die Dichtebestimmung der Polymerl sungen erfolgte mit der Pyknometermethode nach DAB9 13 bei 20 C Ger te Pyknometer Schott Ger t
80. durch Applanationstonometrie e Nachweis einer externen Fistel Seidel Ph nomen nach operativem Eingriff am vorderen Augapfelsegment e Untersuchung des Tr nensacks e Augenhintergrundbetrachtung Angiographie e Erfassung des Kammerwasserflusses Seidel Test e Erkennung von Fremdk rpern e Anpassung und Kontrolle von Kontaktlinsen ausgenommen sind weiche hydrophile Linsen Fluorescein f rbt die Hornhautpartien deren Epithel gesch digt ist aber noch leben de Zellen enth lt Die abgestorbenen Zellen verf rben sich nicht Die gesch digten Hornhautpartien erscheinen als gr ne Flecken w hrend in die Hornhaut eingedrun gene Fremdk rper von einem gr nen Ring umgeben sind Beim Anpassen von Kontaktlinsen erscheinen die Stellen an denen die Linse die Hornhaut nicht ber hrt unter blauem Licht in dunklem Raum nach Instillation von Fluorescein in verschwommenem Gelbgr n w hrend die Stellen an denen die Linse auf der Hornhaut aufliegt dunkelrot erscheinen 1 82 F r alle nachfolgenden Versuche wurde Fluorescein Natrium der Firma Synopharm Barsb ttel Ch B 9904B092 verwendet 21 54 3 EXPERIMENTELLER TEIL 3 2 Methoden 3 2 1 Der Herstellungsprozess Der Herstellungsprozess von OLCS umfasst 5 Schritte oS Ze YS Herstellung und Sterilisation der Applikatoren Herstellung und Sterilfiltration der wirkstoffhaltigen Polymerl sung Auftropfen der L sung auf den sterilisierten Applikator Einfrieren
81. e LSD Test angewendet 78 4 ERGEBNISSE UND DISKUSSION 4 Ergebnisse und Diskussion 4 1 Entwicklung eines Mini Gefriertrockners 4 1 1 Zielsetzung OLCS nehmen aufgrund ihrer Streifenform in der Trockenkammer nur ein kleines Volumen im Verh ltnis zu ihrer relativ gro en Auflagefl che ein Da die Gr e von handels blichen Gefriertrocknungsanlagen GT Anlagen ber die Stellfl che definiert wird ist eine gro e Anlage notwendig um mehrere OLCS gleichzeitig zu trocknen Daraus resultieren folgende Nachteile e Es dauert sehr lange bis die Trockenkammer evakuiert worden ist da das Produkt in dem gro en Gefriertrockner nur ein kleines Volumen einnimmt e In gro en GT Anlagen befinden sich gro e Kondensatoren die gek hlt wer den m ssen Trotz der beachtlichen Auflagefl che die die OLCS einnehmen werden nur minimale Eismengen sublimiert Ein kleiner Kondensator mit geringem Energieverbrauch w re konomischer e Durch die r umliche Gr e der Trocknungskammer ergeben sich fur den Wasserdampf lange Diffusionswege zum Kondensator e Es ist nicht m glich gro e Stellfl chen so gleichm ig zu temperieren dass die zur reproduzierbaren Herstellung von OLCS ben tigten Einfrier und Trocknungsbedingungen f r jedes einzelne Produkt genau eingehalten wer den k nnen So ist zum Beispiel die Einfriergeschwindigkeit von der Position des Trockengutes in der Kammer abh ngig e Die gro en Edelstahlstellfl chen sind tr
82. e Feuchtigkeit in Form von Wasserdampf ab Die thermisch ausgetriebene Feuchtigkeit wird nun durch den Gasstrom in das Reaktionsgef transportiert und die Wassermenge bestimmt Die Heizung des Transferschlauches sorgt daf r dass keine Feuchtigkeit im Schlauch kondensieren kann e Nach Abschluss der Bestimmung wird der Feuchtigkeitsgehalt des Lyophilisates unter Ber cksichtigung des zuvor bestimmten mittleren Blindwertes n 3 berechnet e Der Gasfluss wird ausgeschaltet und das Konditioniergef wiederum auf den Ofen gefahren e Nach Einfahren der Einstichnadel in das Konditioniergef wird der Gasfluss eingeschaltet und das Reaktionsmedium konditioniert e Nach erfolgter Konditionierung kann mit der n chsten Probenbestim mung weitergefahren werden s o 3 2 8 Statistische Methoden Statistische Tests sind immer dann wichtig wenn bei merklicher Streuung und begrenzter Zahl der Daten die Existenz bzw Richtung eines Unterschiedes gekl rt werden soll 67 In dieser Arbeit werden Mittelwertvergleiche eingesetzt um zu berpr fen ob Faktoren auf unterschiedlichen Niveaus einen statistisch signifikanten Einfluss auf die Ergebnisse von Versuchen haben Untersucht werden unter ande rem die Variablen Haftfestigkeit und Druckfestigkeit auf eine bestehende Abh ngig keit von den Faktoren Polymergehalt und Einfriermethode Zur Auswertung der erhobenen Daten wird die Software SPSS Version 11 5 f r Windows verwendet Die Unterschi
83. e GmbH Hofheim Taunus F llvolumen 50 0 mL Analysenwaage Mettler Toledo AG 204 Wasserbad Thermostat Lauda K2D Nr 10461 Temperatur 20 C 0 1 C Durchf hrung Das Pyknometer wurde gereinigt bis zur Gewichtskonstanz getrocknet und dann das Leergewicht auf der Analysenwaage ermittelt Darauf wurde es luftblasenfrei randvoll mit der entsprechenden temperierten Polymerl sung bef llt und sofort mit der Analysenwaage das Gesamtgewicht bestimmt 3 2 2 2 Bestimmung der Viskosit t Die Viskosit t der HPMC L sungen wurde mit dem Kapillarviskosimeter nach Ubbelohde bestimmt Gerate Kapillarviskosimeter nach DIN 51 562 Ubbelohde Viskosimeter mit hangendem Kugelniveau zur Bestimmung der kinematischen Viskositat Schott Gerate GmbH Hofheim Taunus Typ 501 20 Il App Nr 91577 K 0 1010 cSt s Wasserbad Thermostat Lauda K2D Nr 10461 Temperatur 20 C 0 1 C Durchfuhrung a Das Viskosimeter wurde mehrmals mit wenigen Millilitern der Messlosung gespult b In das weite Rohr der Kapillare wurde ca 20 mL der Polymerl sung gef llt bis der Fl ssigkeitspegel zwischen den beiden unteren Hilfslinien lag 62 3 EXPERIMENTELLER TEIL c Das bef llte Kapillarviskosimeter wurde nun zum Temperaturausgleich min destens 20 Minuten in das auf 20 C 0 1 C temperierte Wasserbad geh ngt d Die Viskosit tsmessung erfolgte an sechs Proben jeder L sung 3 2 2 3 Bestimmung der Dosiergenauigkeit Die Dosierge
84. e II verwendet mit K 0 1010 cSt s HPMC Durchflusszeit Hagenbach Kinemat Konzentration s Korrekturfaktor Viskosit t gemittelt n 6 s Tabelle 3 Ergebnisse der Viskosit tsbestimmung nach Ubbelohde gg Dynam Viskosit t 4 ERGEBNISSE UND DISKUSSION Zur berpr fung der Ergebnisse wurde der Logarithmus der dynamischen Viskosit t ImPa s gegen die HPMC Konzentration graphisch aufgetragen Die in der Spezi fikation f r diese HPMC angegebene Viskosit t von 49 mPa s 45 f r eine 2 ige L sung 18 78 wurde auch in der Abb 4 13 ber cksichtigt quadratisches Symbol 1 8 log Dynamische Viskosit t mPa s SoS 9 09 amp m O ee D O gt N O 0 0 5 1 1 5 2 2 5 HPMC Konzentration Abb 4 13 Viskositat in Abhangigkeit von der Konzentration der HPMC Losung Die Viskosit t der HPMC L sung steigt mit dem Polymergehalt exponentiell an Zur besseren Interpretation der Werte dienen vergleichsweise die Viskosit ten bei 20 C von Wasser 1 008 mPa s und wasserfreiem Glycerol 1490 mPa s 8 Die ermittelten niedrigen Viskosit ten beg nstigen die Handhabbarkeit beim Pipettie ren Dar ber hinaus besteht die M glichkeit die L sungen leicht durch einen Filter mit einem Porendurchmesser von 0 22 um sterilzufiltrieren Allerdings reagiert ein Tropfen einer niedrig viskosen L sung auf dem PTFE Tr ger recht sensibel auf u ere Einfl sse wie z B Ersch tterungen und es beste
85. e Restmengen nach erfolg reicher In vivo Applikation mit den entsprechenden Ergebnissen nach In vitro Abrei tests verglichen OLCS die sich in den klinischen Tests nicht gut applizieren lie en werden in diesem Vergleich nicht ber cksichtigt In Tabelle 21 sind die wichtigsten Ergebnisse aller drei klinischen Studien zusammengefasst ie Ti BE BE 250 11 6 ji ae Eog Haftfestigkeit 14 4 3 9 n 10 12 7 2 2 n 10 12 7 4 9 n 10 g Druckfestigkeit 62 4 4 3 n 3 29 0 4 5 n 3 51 65 5 3 N 5 g mm in vivo i in vivo i in vivo 42 97 34 73 Tabelle 20 Zusammenfassung der In vitro und In vivo Ergebnisse der Lyophilisate die in den jeweiligen klinischen Studien zur Anwendung gekommen sind Tragt man nun die ermittelten Restmengen nach In vitro Abrei tests gegen die entsprechenden Werte nach guter In vivo Applikation auf Tabelle 21 schwarze Umrandungen so ergibt sich annahernd eine Gerade Abb 4 81 169 4 ERGEBNISSE UND DISKUSSION 8 m Datenpunkte Restmengen Regressionsgerade 7 y 0 717x 0 2365 r R 0 9932 O gt S 5 gt 4 D 3 n 24 dp ab r 2 aH n 18 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 Restmenge ug in vitro Abb 4 81 Zusammenhang zwischen den Restmengen an Fluorescein Natrium auf den PTFE Folien nach In vitro AbreiBtest und In vivo Applikation bei jeweils identischer Rezeptur und Herstellungsmethode Ein Fehlerbalken entspricht einer Standardabweichung
86. e mit festem Kohlendioxid als Kondensator 79 Flosdorf und Mudd verwendeten 1935 Methanol und Trockeneis als leicht handhabbares K hlmedium 12 2 THEORETISCHER TEIL Diese Kuhlflussigkeit nutzten sie gleichzeitig zum schnellen Einfrieren der Proben 79 Im gleichen Jahr f hrten Flosdorf et al erste Untersuchungen zur Gefriertrock nung von Blutprodukten durch 77 1939 publizierte Greaves das erste gelungene Design eines Gefriertrockners mit einem nahe an der Probe gelegenen Kondensator der mechanisch gek hlt wurde Damit ersetzte er die bis dahin verwendeten mit festem Kohlendioxid gek hlten Kondensatoren 79 Gro technische Bedeutung erlangte die Gefriertrocknung dann w hrend des 2 Weltkrieges zur Herstellung von Blutplasma und Penicillin 66 Mit der Gefriertrocknung war eine Stabilisierungsmethode gefunden durch die eine breite Anwendung des hydrolyseempfindlichen Penicillins m glich wurde Das stabile Antibiotikumpulver wurde kurz vor der Anwendung gel st und anschlie end injiziert 1940 baute Greaves an der Cambridge University England veranlasst durch den Medical Research Council auf der Grundlage einer Pilotanlage eine gro technische Produktionsanlage um Tetanusantitoxin zu lyophilisieren Die Produktionsleistung dieser und hnlicher Anlagen war jedoch nicht ausreichend 1942 wurde beschlos sen eine neue und gr ere Gefriertrocknungsanlage zu errichten Ihre Kapazit t betrug 2500 Flaschen pro Woche Zwischen Feb
87. e und Haft oder Druckfestigkeit Ein geringerer Polymergehalt f hrt jedoch zu einem nicht unerheblichen Anstieg der Restfeuchte Die Einfrierbedingungen haben dagegen keinen deutlichen Einfluss Insgesamt ist die Restfeuchte der hergestellten Lyophilisate als etwas zu hoch Zu bewerten Um hinsichtlich der Stabilit t Nachteile zu vermeiden sollte die Sekund r trocknungsphase dahingehend verl ngert werden dass Restfeuchten lt 5 erhalten werden Mit dem Mini Gefriertrockner wurde eine Apparatur entwickelt die zur reproduzierba ren Herstellung von OLCS mit genau definierten Eigenschaften sehr gut geeignet ist Ziel weiterer Arbeiten mit dem Mini Gefriertrockner sollte die Rezepturfindung und Methodenentwicklung f r einen klinisch relevanten Wirkstoff sein um in klinischen Studien mit einer gr eren Anzahl OLCS die entscheidenden Vorteile dieser Applika tionsform gegen ber konventionellen Augentropfen klar herauszustellen 180 6 ANHANG 6 Anhang 6 1 bd Ce Cw COs Cr cst AHy Alp Al H20 KCI kV mbar min Na Zeichen und Symbole Signifikanzniveau Baud Spezifische W rme von Eis J g K Spezifische W rme von Wasser J g K Kohlendioxid Chrom Zentistokes Durchmesser m oder mm Wirkungsquerschnitt von H2O Gasmolek len 3 7 10 m Molare Verdampfungsw rme J mol oder J g Dampfdruckerniedrigung mbar Siedepunktserniedrigung C Gefrierpunktserniedrigung C
88. ede zwischen verschiedenen Datengruppen k nnen mittels parametri scher und nicht parametrischer synonym verteilungsfreier Testverfahren berpr ft 15 3 EXPERIMENTELLER TEIL werden wobei die parametrischen Tests sowohl eine geringe Abweichung von der Normalverteilung als auch eine hohe Varianzhomogenit t voraussetzen 7 Dagegen machen die nicht parametrischen Tests weder Annahmen bezuglich der Parameter wie z B Mittelwert und Varianz einer Verteilung noch der Art der vorliegenden Verteilung Die Wahl der anzuwendenden Testverfahren innerhalb der einzelnen Versuchsserien erfolgt in Anlehnung an das Flie schema in Abb 3 14 wobei hier die zu verglei chenden Datengruppen zuerst auf Varianzhomogenitat gepr ft werden sollen Dazu wird der Test nach Levene angewendet Bei einem Signifikanzniveau von p gt 0 05 kann von Varianzhomogenit t ausgegangen werden d h die Gruppen unterschei den sich bez glich der Varianz nicht signifikant voneinander Mit dem Kolmogorov Smirnov Test werden die Daten bei denen Varianzhomogenit t nachgewiesen wurde auf Vorliegen einer Normalverteilung gepr ft Bei einem Signi fikanzniveau von p gt 0 05 kann hier von dem Vorliegen einer Normalverteilung ausgegangen werden Erf llen alle Daten diese beiden Anforderungen werden die Gruppen mit parametri schen Tests auf signifikante Unterschiede untersucht Sobald nur ein Datum der betreffenden Versuchsreihe entweder den Normalverteilungskrite
89. egende Ver nderungen beim Einfrierprozess stattfinden m ssen Bei allen R ckstandsbestimmungen betragen die Restmengen im Mittel weniger als 6 des Ausgangsgehaltes 166 4 ERGEBNISSE UND DISKUSSION 4 4 4 2 Abh ngigkeit der Restmenge vom Wirkstoffgehalt Untersucht wurde ob die zur ckbleibende Fluoresceinmenge nach In vitro Abrei tests im Zusammenhang mit dem Wirkstoffgehalt der Lyophilisate steht Dazu werden OLCS mit 204 ug Fluorescein Natrium hergestellt bei unterschiedlichen Einfrierbedingungen auf ihre Restmenge hin untersucht und die Ergebnisse mit den entsprechenden Lyophilisaten mit 68 ug Wirkstoffgehalt verglichen Polymergehalt 250 ug beide hergestellt mit Prototyp 3 Die Ergebnisse sind in Tabelle 20 dargestellt Evakuier Restmengen Restmengen Verh ltnis geschw mittelwert ug mittelwert ug der Rest mbarL s Gehalt 204 ug Gehalt 68 ug mengen n 5 n 5 Mittelwerte Ausgangs verh ltnis 1 023 0 07 3 0 02 023 0 07 134 587 179 155 072 379 1 335 248 215 04 019 62 1 Tabelle 19 Einfluss der Wirkstoffkonzentration auf die Restmenge in ug in Abh ngigkeit von der Evakuiergeschwindigkeit Mittelwerte Standardabweichungen und Verh ltnisse zueinan der Wie zu erwarten war erh ht sich mit der Wirkstoffkonzentration der Lyophilisate auch die R ckstandsmenge auf den Folien Unter der Voraussetzung dass der Wirkstoff im gesamten Lyophilisat homogen vert
90. eilt ist sollten sich die Restmengen wie die Wirkstoffdosen zueinander verhalten das hei t das Verh ltnis sollte jeweils 3 1 betragen Nur im Fall des Evakuierens mit 13 4 mbarL s ist das Ausgangsver h ltnis des Fluoresceingehaltes nahezu gleich geblieben Aufgrund von Gefrierkon zentration kann sich dieses Verh ltnis verschieben Wie in Kapitel 4 4 1 1 beschrie ben l sst sich bei der mittleren Einfriergeschwindigkeit eine Gefrierkonzentration nicht erkennen Beim langsamen Einfrieren unter Atmosph rendruck nimmt das Verh ltnis deutlich ab Es findet sich demnach bei den hochdosierten Lyophilisaten weniger Wirkstoff als R ckstand auf der Folie als erwartet Dies ist ein Hinweis f r eine Gefrierkonzentration in Richtung Lyophilisatoberflache wie sie bereits in Kapitel 4 4 1 1 f r langsames Einfrieren beschrieben wurde Wird die hochdosierte Fluores ceinl sung dagegen schnell eingefroren wie beim vakuuminduzierten Einfrieren mit 33 5 mbarL s Evakuiergeschwindigkeit so steigt das Ausgangsverh ltnis stark an 167 4 ERGEBNISSE UND DISKUSSION Nach dem Abrei test bleibt also mehr Wirkstoff auf der PTFE Folie zur ck als dies nach der eingesetzten Fluoresceinmenge zu erwarten w re Eine zur Bodenfl che hin gerichtete Gefrierkonzentration k nnte daf r der Grund sein 4 4 4 3 Abh ngigkeit der Restmengen vom Polymergehalt Untersucht wurde ein m glicher Zusammenhang zwischen dem HPMC Gehalt der Ausgangsl sung und den Wirk
91. ein Natrium bei unterschiedlichen Einfrierbedingungen hergestellt und deren Haftfestig keit bestimmt Um den Einfluss der Wirkstoffkonzentration zu ermitteln wurden diese Ergebnisse mit denen aus Kapitel 4 4 1 1 1 HPMC E50 und 204 ug Fluorescein Natrium verglichen Tabelle 12 und Abb 4 53 zeigen die Ergebnisse dieses Versuches vgl Tabelle 10 135 4 ERGEBNISSE UND DISKUSSION Methode 1 Methode 2 Methode 3 Methode 4 V 0 V 530 V 600 V 650 15 4 14 0 13 1 Mittelwert g 099 1047 1069 10 85 St Abw g Rel St Abw Tabelle 12 Abhangigkeit der Haftfestigkeit von der Evakuiergeschwindigkeit bei einem Wirk stoffgehalt von 68 ug Fluorescein Natrium statistische Auswertung BEE BEE HE w a 8 154 140 O Bi 40 35 30 25 20 15 10 Pa nenn ee f Ze E 204 ug Fluorescein Natrium 250 ug HPMC E50 68 ug Fluorescein Natrium 250 ug HPMC E50 Haftfestigkeit g 5 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 Evakuiergeschwindigkeit mbarL s Abb 4 53 Abhangigkeit der Haftfestigkeit von der Wirkstoffkonzentration Ein Fehlerbalken entspricht einer Standardabweichung Die Lyophilisate mit verringertem Wirkstoffgehalt gepunktete Linie im Diagramm eingefroren nach Methode 1 Atmospharendruck oder Methode 2 langsames Evakuieren mit 13 4 mbarL s zeigen eine im Vergleich zu den hoher dosierten Lyophilisaten durchgezogene Linie verringerte Haftfestigkeit Die Kurven verlaufe
92. einstmoglichen Wert einstellen 2 2 5 3 2 Der Kondensator Eis hat genau wie Wasser einen Dampfdruck der auch als Sattigungs oder Gleichgewichtsdampfdruck bezeichnet wird Er ist abh ngig von der Temperatur und umso kleiner je niedriger die Eistemperatur ist Wenn der Dampfdruck der Wasser molek le im Gasraum gr er ist als der des Eises dann kondensieren Wassermole k le an der Eisoberfl che Im umgekehrten Fall gibt das Eis Wassermolek le an seine Umgebung ab und zwar so lange bis sich das System im Gleichgewicht befindet Dieser Zustand ist erreicht wenn pro Zeiteinheit genauso viele Wassermo lek le die Eisoberfl che verlassen wie wieder an ihr kondensieren Solange dieser Gleichgewichtszustand nicht erreicht ist sublimieren mehr Molek le als zeitgleich an der Produktoberfl che kondensieren und die Prim rtrocknung schreitet fort Die Aufgabe des Kondensators besteht nun darin kontinuierlich die Wassermolek le aus dem Gasraum zu kondensieren und als Eis abzuscheiden Dadurch wird 29 2 THEORETISCHER TEIL verhindert dass sich der Gleichgewichtszustand einstellen kann und der Trock nungsprozess zum Erliegen kommt Eine Vakuumpumpe ist zum Entfernen der anfallenden Menge Wassermolekule ungeeignet wie das folgende Beispiel zeigt Ein Mol Gas also auch Wasserdampf nimmt bei 0 C und etwa 1000 mbar ein Volumen von 22 4 L ein Daraus ergibt sich f r Wasser Molekulargewicht 18 g mol dass 1 9 Wasserdampf be
93. en gen und d nne Schichten Auf diese Methode wird in Kapitel 2 4 ausf hrlich eingegangen Die Verfahren der Haupt und Nachtrocknung werden nachfolgend im Zusammen hang mit dem Aufbau und der Funktionsweise der Gefriertrocknungsanlage erl utert 2 2 5 2 Aufbau der Gefriertrocknungsanlage GT Anlage Die Abb 2 10 zeigt schematisch den Aufbau einer modernen Gefriertrocknungs anlage ventil Zwischen ventil Vakuum gt u ern f r no Ki ieena fr Kondensator fur Kammer Kondensatablauf Temperierbare Stellflache Vakuumpumpe Kaltemaschine Heizthermostat Abb 2 10 Aufbau und Komponenten einer modernen Gefriertrocknungsanlage Quelle 37 Naher betrachtet werden hier nur die Hauptkomponenten Dies sind Die Trockenkammer Ein geschlossener Raum der evakuiert werden kann Hier findet die Gefriertrock nung gegebenenfalls auch das Einfrieren statt 21 2 THEORETISCHER TEIL Das Vakuumsystem Hauptbestandteil ist eine Vakuumpumpe Sie entfernt die nichtkondensierbaren Gase der Luft haupts chlich Stickstoff und Sauerstoff um die Sublimation und Diffusion von Wasserdampf zu erleichtern Der Kondensator Bei diesem handelt es sich um eine tiefgek hlte Fl che 60 bis 80 C Der subli mierte Wasserdampf diffundiert zum Kondensator und schl gt sich dort als Eis nieder Die temperierbare Stellfl che Sie hat prim r die Aufgabe die der Formulierung als W rme entzogene Sublimati onse
94. en Prototypen OLCS mit identischen Eigenschaften herzustellen ist es daher notwendig die Prozessparameter entsprechend anzupassen 4 4 2 Einfluss auf die Druckfestigkeit der Lyophilisate Weichselbaum stellte fest dass das Polymerger st der Lyophilisate so beschaffen sein sollte dass es sich leicht verformen l sst um auf diese Weise eine angenehme Applikation am Auge zu erm glichen aber sie quantifizierte die Strukturfestigkeit nicht 82 Sie pr fte die Lyophilisate nur sensorisch mit den Fingern und kam zu dem Ergebnis dass Lyophilisate mit einem hohen Polymergehalt 3 5 in der Ausgangs l sung zwar einerseits sehr stabil andererseits jedoch so hart waren dass sie nur schlecht oder gar nicht am Auge appliziert werden konnten Ziel der folgenden Versuchsreihen ist die Strukturfestigkeit der Lyophilisate in Abh ngigkeit von verschiedenen Einflussfaktoren zu bestimmen Schlie lich soll versucht werden diese Ergebnisse zu quantifizieren 149 4 ERGEBNISSE UND DISKUSSION 4 4 2 1 Einfluss der Einfriermethode auf die Druckfestigkeit In diesem Versuch soll die Druckfestigkeit von Lyophilisaten mit 375 ug HPMC E50 und 68 ug Fluorescein Natrium hergestellt bei unterschiedlichen Einfrierbedingun gen verglichen werden Die Wahl der Evakuiergeschwindigkeiten erfolgt in Anlehnung an die Haftfestigkeitsuntersuchungen des Kapitels 4 4 1 3 Abb 4 66 zeigt Druckfestigkeitsprofile wie sie sich nach Berechnung des zur ckge legten We
95. en diagnosti schen Konzentrationen in der Vorderkammer und der Cornea erreicht werden k nnen wie bei dreimaligem Tropfen des Handelspr parates Fluorescein SE 0 17 68 ug pro Tropfen Alcon im 15minutigen Abstand 38 In Hinsicht auf die OLCS Herstellung mit dem Mini Gefriertrockner Prototyp 3 sollte getestet werden ob die gew hlte Rezeptur 250 ug HPMC E50 und 204 ug Fluorescein Natrium pro OLCS und die ausgesuchte Methode Methode 2 Evakuiergeschwindigkeit 13 4 mbarL s vgl Abb 4 30 Kapitel 4 4 1 1 zur gew nschten Haftfestigkeit und somit zu einer angenehmen In vivo Applikation f hren Die In vitro Testmethode zum Abl severhalten ergab f r diese Lyophilisate eine durchschnittliche Haftfestigkeit von 14 4 g St Abw 3 9 g n 10 vgl Tabelle 10 159 4 ERGEBNISSE UND DISKUSSION Die Studie wurde mit 22 Probanden durchgef hrt In 19 F llen lie en sich die Lyophi lisate leicht applizieren und l sten sich nahezu vollst ndig vom Applikator Best tigt wurde dies anhand der Restmengenbestimmung auf der PTFE Folie durch Fluores zenzspektroskopie bei der sich eine durchschnittliche Restmenge an Fluorescein von 2 4 St Abw 1 3 n 18 ergab Bei 3 Studienteilnehmern erfolgten die Applikationen nur unvollst ndig Mittelwert der Restmengen 55 6 St Abw 17 7 n 3 Dies lie sich aber nach Angaben des studienbegleitenden Arztes auf fehlerhafte Anwendungen zur ckf hren Die Studie zeigte dass mit einem einzelne
96. en erfolgte die Eisbildung zuerst an der Tropfenunterseite und das Kristallwachstum war zur Oberfl che hin gerichtet Beim snap freezing durch rasches Evakuieren kommt es zuerst an der Oberfl che des Tropfens zur Eisbildung Da diese rasch erfolgt ist das Innere des Tropfens noch kaum abgek hlt Der gebildete starke Temperaturgradient f hrt zur Ausbildung nadelf rmiger Kristalle die schnell entlang des Gradienten zur Tropfenmitte hin wachsen Die Plateauphase ist sehr kurz Das schnelle gerichtete Durchfrieren verursacht eine Gefrierkonzentration die hier zum Zentrum der Lyophi lisatunterseite ausgerichtet ist Es resultiert eine teilweise sehr dichte geschlossene 178 5 ZUSAMMENFASSUNG Kontaktflachenstruktur zur Folie Daneben bildet sich wegen des gerichteten Durch frierens in Richtung Tropfenunterseite ein Eiskeil der teilweise zu einer Abl sung des gefrorenen Tropfens von der PTFE Folie f hrt Je nach Zusammensetzung des Lyophilisates kann einer dieser beiden Effekte berwiegen und somit die Haftfestig keit entweder deutlich verst rken gar nicht ver ndern oder sogar abschw chen Ers teres ist zum Beispiel bei hohen Wirkstoffkonzentrationen der Fall letzteres bei ge ringem Polymer und Wirkstoffgehalt Eine Erh hung der Evakuiergeschwindigkeit resultiert jeweils in einer Verk rzung der Plateauphase Bis auf wenige Ausnahmen aufgrund der Keilbildung steigt dadurch die Haftfestigkeit der Lyophilisate auf dem Tr ger
97. en vollstandig gefroren Um schnell das angestrebte Endvakuum von 0 02 mbar zu erhalten wird mit 105 3 mbarL s Ventilstellung 700 evakuiert Nach 4 5 Minuten wird die Strahlungsheizung Heizleistung etwa 8 W eingeschaltet Die Sublimationstrocknung ist im Durchschnitt 110 4 ERGEBNISSE UND DISKUSSION nach 16 5 Minuten beendet Die Dauer der Primartrocknung betragt etwa 12 Minu ten Q 3 001 a E E A 0 001 0 0001 0 00001 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 Zeit min Abb 4 19 Methode 1 Produkttemperatur und Druckverlauf Einfrieren unter Atmosph ren druck Methode 2 Tabelle 7 Abb 4 20 Mittleres Einfrieren bei Ventilstellung 530 Evakuiergeschwindigkeit 13 4 mbarL s Nach Einbringen des Probenhalters in die Trocknungskammer wird diese langsam evakuiert Die Abk hlung durch entzogene Verdampfungsw rme an der Oberfl che der Probe und der W rmeentzug ber Konvektion durch die kalte Kondensatorfl che f hren zu einem deutlich schnelleren Durchfrieren des Tropfens Nach etwa 2 5 Minuten ist der Tropfen vollst ndig gefroren Da der Kammerdruck zu diesem Zeitpunkt erst 10 mbar betr gt wird die Evakuiergeschwindigkeit nach 5 Minuten auf 105 3 mbarL s Ventilstellung 700 erh ht um schnell das angestrebte Endvakuum einzustellen Dies ist an einem deutlichen Knick in der Druckkurve zu erkennen Kurz darauf wird die Strahlungsheizung eingeschaltet Ab jetzt beginnt wiederum die Sublimationstro
98. er Prozesszeit von Gefriertrocknungszyklen Dissertation Erlangen N rnberg 1999 Kruss B Prozessparameter und ihre Auswirkungen auf die Produktqualit t in Essig D Oschmann R Lyophilisation Stuttgart Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft 1993 Kyprianidou Leodidou TC Botsaris GD Freeze Concentration of Aqueous Solutions in Myerson AS Toyokura K Crystallization as a Separations Process ACS Symposium Series 438 American Chemical Society Washington DC USA 1990 List PH Arzneiformenlehre Stuttgart Wissenschaftliche Verlagsgesell schaft mbH 1985 282 287 List PH Schmidt PC Technologie Pflanzlicher Arzneizubereitungen Stutt gart Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft mbH 1984 220 222 361 364 Lux A Maier S S verkr p R Diestelhorst M Comparative Bioavailability Study of Fluorescein 3 Eye Drops Vs A Single Lyophilisate Abstract and Poster ARVO Meeting Fort Lauderdale Florida USA Mai 2002 188 40 41 42 45 46 47 Lyophilisation fur Praktiker Seminarunterlagen APV Kurs 465 Bonn 13 14 September 2000 MacKenzie AP The Physico Chemical Basis for the Freeze Drying Proc ess Development of Biological Standards 1977 Volume 36 International Symposium on Freeze Drying of Biological Products Washington D C USA 1976 51 67 Maier S Neff B Diestelhorst M S verkr p R Rapid Freeze Drying on a Small Scale and the Dependence of the Adhesion Force Between L
99. er anderen Hand genommen wobei der Zeigefinger zur Stabilisierung auf die Tr gerfolie hinter das Lyophilisat gelegt wird Abb 2 4 Das Applikationssystem wird nun zum Auge gef hrt und der gefriergetrocknete Tropfen durch Abstreifen an der Unterlidkante in den Bindehaut sack berf hrt Dort l st er sich unter Gelbildung langsam auf und setzt so den Wirkstoff frei Abb 2 5 und Abb 2 6 Abb 2 5 Gelkissen 1 Minute nach Applikati Abb 2 6 5 Minuten nach Applikation on Foto S Dinslage Foto S Dinslage 2 THEORETISCHER TEIL 4000 3000 2000 ng ml 1000 Minuten Abb 2 7 Fluoresceinkonzentration in der Vorderkammer nach Applikation von 68 ug Fluores cein Natrium mittels konventioneller Augentropfen dunkle Linie e und als Lyophilisat helle Linie Die Vorderkammermessungen mittels Fluorphotometrie zeigen dass eine etwa 30 40fache Konzentration von Fluorescein nach einmaliger Applikation als Lyophilisat in der Vorderkammer des Auges erreicht werden kann Die Daten unterstreichen die deutlich verbesserte Pharmakokinetik nach Medikamentenapplikation als Lyophilisat am Auge 15 Die Art der Applikation macht die Haftfestigkeit der Lyophilisate und ihre Druckfestig keit zu spezifischen Qualit tsmerkmalen von OLCS Haftet das Lyophilisat zu fest wird es nur unvollst ndig abgel st Es kommt zu einer Unterdosierung des Arznei stoffs und die gew nschte Wirkung ist vermindert oder bleibt aus Ist die Haf
100. er zu gew hr leisten Bei Formulierungen die vollst ndig auskristallisieren kann es abh ngig von der Konzentration der Ausgangsl sung und der K hlrate beim Abk hlen entweder zu einer Gefrierkonzentration oder zu Ausf llungen kommen Bei verd nnten L sungen scheiden sich unterhalb von O C zun chst reine Eiskristal le ab Dabei erh ht sich die Konzentration der verbleibenden L sung entsprechend Gefrierkonzentration 19 35 57 und ihr Gefrierpunkt sinkt 36 75 Dieser Effekt wird zum Beispiel in der Lebensmittelindustrie zum schonenden Aufkonzentrieren von S ften verwendet 35 Der Gefrierkonzentrationseffekt ist umgekehrt proportio nal zur urspr nglichen Konzentration der ungefrorenen L sung das hei t 2 THEORETISCHER TEIL je verdunnter die Ausgangsl sung umso gr er wird der Konzentrierungsfaktor 19 75 Als Folge dieser Gefrierkonzentration kann sich die unmittelbare Umgebung eines Wirkstoffes so stark ver ndern dass Abbaureaktionen bereits w hrend des Einfrie rens ausgel st werden k nnen Bei w ssrigen Proteinl sungen zum Beispiel k nnen dabei rtlich hohe Salzkonzentrationen auftreten die direkt oder indirekt durch pH Verschiebung die Proteinstabilit t negativ beeinflussen Dieser Vorgang wird als K ltedenaturierung bezeichnet und kann zu Aggregation bzw Inaktivierung f hren 19 Ist die Ausgangslosung dagegen hochkonzentriert scheiden sich bei niedrigen Temperaturen zun chst Substanzkr
101. er zwischen Vial und Metallcontainer bzw Metallcontainer und Stellfl che bei niedrigem Kammerdruck signifikant wird Die Ergebnisse zeigen dass die Trocknungsrate mit besserem Vakuum immer geringer wurde 51 Auch Pikal kommt zu dieser Erkenntnis Die treibende Kraft f r den Wasserdampfab transport von der Sublimationsfront ist die Differenz zwischen dem Gleichgewichts wasserdampfdruck des Eises und dem Kammerdruck Wird der Kammerdruck erh ht so verringert sich zwar diese treibende Kraft jedoch steigt der W rmetrans portkoeffizient des Gilasvials Dadurch wird bei gleich bleibender Stellflachentemperatur mehr W rme zur Produktoberfl che transportiert Es resultiert eine h here Produkttemperatur mit einem h heren S ttigungsdampfdruck Da der Effekt des steigenden S ttigungsdampfdrucks st rker ist als die Erh hung des Kammerdrucks wird die Druckdifferenz insgesamt gr er und somit die treibende Kraft f r die Sublimation ebenfalls Mit h herem Kammerdruck wird demnach eine h here Sublimationsrate erreicht 57 Bei der Gefriertrocknung in Vials auf beheizbaren Stellfl chen gilt daher die Stellfla chentemperatur und den Kammerdruck w hrend der Prim rtrocknung m glichst hoch einzustellen In industriellen Gefriertrocknungsanlagen wird daher bei Bedarf gezielt Inertgas z B Stickstoff in die Trocknungskammer geleitet sog gas bleed system um den konvektiven Warmetransport zu verst rken 68 71 Dabei muss allerdings ein
102. ergroBerte Darstellung der PTFE Folien nach erfolgten AbreiBtests In Abhangig keit von der Einfriermethode ergeben sich unterschiedliche Ruckstandsmuster Alle abgebilde ten OLCS enthalten 375 ug HPMC E50 und 68 ug Fluorescein Natrium Die rasterelektronenmikroskopische Aufnahme Abb 4 76 zeigt nahezu auf der kompletten Kontaktflache zur Folie eine verh ltnism ig dicke Schicht nicht abgel s ten Lyophilisates Die Porenstruktur ist deutlich sichtbar Bei schnellem Einfrieren der L sung 33 5 mbarL s Evakuiergeschwindigkeit ist ein mittlerer Wert f r die Restmengen anzunehmen Die REM Aufnahme Abb 4 77 zeigt dass das Lyophilisat nur im Zentrum und am Rand mit der PTFE Folie in Kontakt stand dazwischen befindet sich ein Bereich ohne R ckst nde vgl Kapitel 4 4 1 3 Das langsame Einfrieren ann hernd unter Atmosph rendruck Evakuiergeschwindig keit 1 65 mbarL s hinterl sst mit blo em Auge kaum noch sichtbare Spuren an Fluorescein Natrium Abb 4 75 Erst im Rasterelektronenmikroskop ist eine d nne Schicht Lyophilisatr ckstand erkennbar Abb 4 78 164 4 ERGEBNISSE UND DISKUSSION Abb 4 76 bis Abb 4 78 Rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen der Lyophilisatruckstan de auf der PTFE Folie nach erfolgtem AbreiBtest 375 ug HPMC E50 68 ug Fluorescein Natrium Abb 4 76 Ruckstand bei mittlerer Einfrierge Abb 4 77 Ruckstandsmuster bei schnellem schwindigkeit mit 13 4 mbarL s Einfrieren mit 33 5 mbarL s A
103. erhalb 0 03 mbar gearbeitet werden Deshalb wird als Beispiel die MFW f r diesen Druck berechnet Nach der Dampfdruckkurve des Eises entspricht 0 03 mbar einer Eistemperatur von 52 C 54 F r die Gasphase wird deshalb hier diese Temperatur angenommen Einsetzen k 1 3807 10 J K 8 T 52 C 221 15 K d Wirkungsquerschnitt von H O Gasmolek len 3 7 10 m 43 P 0 03 mbar 3 Pa 3 N m2 1 3807 10 221 15 MEW ee m 3 7 10 3 m MFW 2 37 10 m 2 37 mm Idealerweise liegt die Distanz zwischen Produktoberflache und Kondensator also im Bereich von wenigen Millimetern Ag 2 THEORETISCHER TEIL 2 4 Vakuuminduziertes Einfrieren Beim vakuuminduzierten Einfrieren erreicht man die zum Einfrieren notwendige W rmeabgabe der w ssrigen Formulierung durch das Verdampfen eines Anteils des L sungsmiittels Dies wird durch schnelles Evakuieren der Trockenkammer erreicht Eine Energiebilanz soll darlegen wie viel Prozent des L sungsmittels verdampfen m ssen um die Formulierung bei gegebenen Prozessbedingungen durchfrieren zu lassen I Zum Einfrieren abzuf hrende Warmemenge Energiemenge bei vorgegebener Anfangs und gew nschter Endtemperatur Aufgrund des geringen Feststoffgehaltes der Formulierungen lt 2 kann dieser in erster N herung vernachl ssigt werden Zur Berechnung kann folgende Gleichung 1 herangezogen werden 54 1 Osl Wea C ro re 2 H
104. ersuchen mit besserem Vakuum zeigte sich eine deutlich h here Sublimationsrate und somit eine Verk rzung der Prozesszeit 17 2 2 5 5 Die Produkttemperatur im Gefriertrocknungsprozess Die Produkttemperatur spielt w hrend des Gefriertrocknungsprozesses eine ent scheidende Rolle Im Folgenden soll gezeigt werden warum auf eine kontinuierliche Erfassung nicht verzichtet werden sollte 2 2 5 5 1 Das Einfrieren Damit eine Formulierung einfrieren kann muss die Temperatur der gesamten fl ssi gen Phase unter die eutektische oder Kollapstemperatur abgesenkt werden Der daf r notwendige W rmeentzug wird zum Beispiel durch Abk hlen der Stellfl chen erreicht Da die Kontaktfl che zwischen der Stellplatte und dem Produkt in einem Gef h ufig nur sehr klein ist dauert es eine gewisse Zeit bis die Formulie rung diese Temperatur angenommen hat Wird die Produkttemperatur nicht erfasst muss ein experimentell ermitteltes Zeitintervall als Anhaltspunkt f r die Annahme eines vollst ndig gefrorenen Produktes dienen Dieses Zeitintervall ist abh ngig von der Art des Gef es und dessen F llvolumen und muss f r jede Formulierung neu 32 2 THEORETISCHER TEIL ermittelt werden Dagegen ist es durch Messung der Produkttemperatur auch ohne Vorversuche m glich Abk hlrate Unterk hlung und Einfrierzeitpunkt genau Zu bestimmen Diese zus tzlichen Informationen k nnen bei der Aufkl rung unter schiedlicher Eigenschaften und Stru
105. eser Block liegt auf einer schwimmend gela gerten Mutter die auf einer Spindel mit der Steigung 0 5 mm l uft Die Abrei vorrich tung senkt sich also mit 0 5 mm pro Umdrehung der Mutter auf der Spindel Sie wird ber einen Elektromotor angetrieben dessen Drehzahl abh ngig von der angelegten Spannung ist Bei der gew hlten Spannung von 12 Volt legte die Abrei vorrichtung 0 58 mm min zur ck 6 3 EXPERIMENTELLER TEIL 3 2 5 Druckfestigkeit der Lyophilisate Abb 3 10 Apparatur zur Bestimmung der Druckfestigkeit Dabei handelt es sich um dasselbe Ger t wie zur Bestimmung der Haftfestigkeit mit geringf gig ver ndertem Versuchsaufbau Abb 3 10 Der Unterschied besteht darin dass die Abrei vorrichtung entfernt wird damit der Lyophilisattrager plan auf dem Aluminiumblock zum Liegen kommt Statt der Klammer h ngt an der d nnen Metallstange jetzt ein Metallstempel mit einer Masse von 200 Gramm Abb 3 11 Abb 3 11 Detailaufnahme des Aluminiumblocks auf dem ein Lyophilisattr ger liegt dar ber der Stempel 68 3 EXPERIMENTELLER TEIL Zu Beginn der Messung wird der Spalt zwischen dem Aluminiumblock und dem Stempel auf etwa 5 bis 10 mm eingestellt so dass der Applikator bequem dazwi schen passt Dies geschieht durch Heben oder Senken des Blockes durch den Elektromotor Beim Dazwischenlegen ist darauf zu achten dass der Mittelpunkt des Lyophilisates unter der Mitte der Stempels liegt Ist das nicht der Fall so
106. esonderen Aufbau des Mini Gefriertrockners erreicht Das kleine Volu men der Trocknungskammer erm glicht ein schnelles Einstellen des angestrebten Prozessvakuums Die Kondensatorfl che ist gro gegen ber der Oberfl che des zu trocknenden Gutes Durch direkten Kontakt des Kondensators mit dem Fl ssigstick stoff lassen sich in kurzer Zeit sehr tiefe Temperaturen erreichen Der Stickstoff verbrauch ist durch den hochisolierenden Werkstoff Rohacell und das Design des Gefriertrockners gering Zudem ist dieses K hlmedium kosteng nstig umweltfreund lich und gut verf gbar Zus tzlich zu einer Minimierung der Diffusionsstrecke durch kurze Distanz zwischen Trockengut und Kondensator wird aufgrund hohen Vakuums auch der Diffusionswiderstand stark reduziert Schlie lich erm glicht die Strahlungs heizung eine gezielte und schnell variierbare Zufuhr der W rmeenergie direkt von oben auf das Produkt 177 5 ZUSAMMENFASSUNG Durch die Kombination von normalem Einfrieren aufgrund von Warmeentzug durch das gek hlte Gas in der Trockenkammer und vakuuminduziertem Einfrieren mit verschiedenen diskreten Evakuiergeschwindigkeiten wurden unterschiedliche Einfriermethoden entwickelt Diese unterscheiden sich statistisch signifikant in der L nge ihrer Plateauphasen welche das Auskristallisieren des L sungsmittels und der gel sten Stoffe indizieren Die Dauer der Plateauphase bestimmt ma geblich die Zeit die zum Eiskristallwachstum zur Verf gung ste
107. estellt Wie in Kapitel 4 3 3 beschrieben wurden dabei statistisch signifikante Unterschiede in der L nge der Plateauphasen beobachtet Bei der ersten Versuchsreihe handelte es sich um das Einfrieren unter Atmosph rendruck Methode 1 Ventil geschlossen Evakuiergeschwindigkeit 0 Die Proben der zwei anderen Versuchsreihen wurden durch Evakuieren mit unterschiedlicher Geschwindigkeit eingefroren Methode 2 Ventilstellung 530 Evakuiergeschwindig keit 13 4 mbarL s Methode 3 Ventilstellung 600 Evakuiergeschwindigkeit 33 5 mbarL s Mit der Evakuierung wurde unmittelbar nach Einbringen der Probe in die Trockenkammer begonnen In Tabelle 10 sind die Einzelwerte der Haftfestigkei ten jeder Methode sowie der Stichprobenstatistik aufgef hrt Einfriermethode Ventilstellung Ventilstellung mit 0 530 29 7 nattestighelt Ig 7 91 _StAbw 401 391 Rel St Abw 53 33 27 14 Tabelle 10 Abhangigkeit der Haftfestigkeit von der Evakuiergeschwindigkeit statistische Auswertung 250 ug HPMC E50 und 204 ug Fluorescein Natrium pro OLCS Abb 4 30 zeigt graphisch die Abh ngigkeit der Haftfestigkeit von der Evakuierge schwindigkeit Es zeigt sich dass mit einer Verk rzung der Durchfrierzeit durch zus tzliches Evakuieren mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten die Haftfestigkeit deutlich zunimmt 41 124 4 ERGEBNISSE UND DISKUSSION an Methode 3 35 30 25 Methode 2 20 15 Methode 1 Haftfestigkeit
108. ete Temperaturmessger t INFINITY INFT 1001 der Firma Newport Electronics Deckenpfronn verf gt ber eine RS 232 Schnittstelle Baud rate 9600 bd Parity Odd die eine kontinuierliche Messwertaufzeichnung per PC erlaubt 26 e Messbereich 200 C bis 900 C e Aufl sung 0 01 C e Messrate 3 Messungen pro Sekunde e Genauigkeit 0 6 C 4 1 2 2 Druckmesser Der Druckmesser zur Bestimmung des Vakuums in der Trockenkammer soll die folgenden Eigenschaften aufweisen e gasartunabhangige Messung e hohe Genauigkeit e kurze Ansprechzeit 82 4 ERGEBNISSE UND DISKUSSION Es wird ein kapazitiver Druckaufnehmer der Firma MKS verwendet Absolutdruckaufnehmer MKS Baratron Typ 626 48 Messbereich 10 bis 1 10 mbar Genauigkeit 0 25 vom Messwert Nullpunktstabilit t Nullpunktstabilitat 0 005 vom Endwert C Betriebstemperatur 0 C bis 50 C Umgebungstemperatur Das zugeh rige Betriebsger t Typ PR 4000 S verf gt ebenfalls ber eine RS 232 Schnittstelle Baud rate 9600 bd Parity Odd die eine kontinuierliche Messwerter fassung per PC erlaubt 49 4 1 2 3 Ventile Gasdosier Absperrventil EVN 116 Firma Pfeiffer Vacuum GmbH Asslar 55 e sehr gro er Regelbereich 510 mbarL s bis 1000 mbarL s e optimale Kennlinie e analoge dreistellige Positionsanzeige zur exakten Einstellung e gute Reproduzierbarkeit e extrem kleines Totvolumen e integriertes Absperrventil Schlie en ohne Ver nderung der Regels
109. ethoden zu entwickeln und deren Reproduzierbarkeit nachzuweisen Anhand der physikalisch chemischen Charakterisierung der unter verschiedenen Bedingungen gefertigten Lyophilisate wurde berpr ft ob mit dem Mini Gefriertrockner eine reproduzierbare Herstellung von OLCS m glich ist und ob die Eigenschaften der Lyophilisate gezielt ver ndert werden k nnen Die die Applizier barkeit beeinflussenden Faktoren Druck und Haftfestigkeit waren dabei von besonderem Interesse Das von Weichselbaum angewendete Prinzip zur Bestimmung der Haftfestigkeit wurde verbessert und eine pr zise Testapparatur entwickelt Mit dieser wurde der Einfluss der verschiedenen Einfriermethoden sowie der Lyophilisatzusammenset zung auf die Haftfestigkeit der Lyophilisate untersucht 1 EINLEITUNG UND ZIELSETZUNG Diese Apparatur wurde in einer modifizierten Betriebsweise zur Bestimmung der Strukturfestigkeit verwendet und dadurch die von Weichselbaum angewendete sen sorische Pr fung mit den Fingern quantifizierbar gemacht Druckfestigkeitsprofile wurden in Abh ngigkeit von verschiedenen Rezeptur und Herstellparametern aufgezeichnet und ausgewertet Mittels rasterelektronischer Aufnahmen der Lyophilisatstruktur wurde der Zusam menhang zwischen den Einfrierbedingungen und der Lyophilisatzusammensetzung sowie der Haft und Druckfestigkeit untersucht Fluoresceinhaltige Klinikmuster unterschiedlicher Zusammensetzung mit definierten Spezifikationen bez glich Druck un
110. ffe von Viren oder Bakterien 54 e Pflanzliche Zubereitungen Blumen Teepulver und Enzyme Pankreatin 50 e Nahrungsmittel wie S uglingsmilch Fertigsuppen Gem se Kartoffeln Obst Gew rze S fte oder Kaffee 50 e Technische Produkte wie zum Beispiel m glichst wenig agglomerierte Ausgangsmaterialien f r die Herstellung komplexer gesinterter kerami scher Werkstoffe 54 e Materialien wie Holz Leder oder Papier zum Beispiel zum Restaurieren oder Konservieren historischer Objekte 11 50 2 2 5 Der Gefriertrocknungsprozess Der Gefriertrocknungsprozess l sst sich in drei aufeinander folgende Verfahrens schritte gliedern Das Einfrieren die Haupttrocknung und die Nachtrocknung Da bei der Gefriertrocknung Wasser das am h ufigsten verwendete L sungsmittel ist beziehen sich darauf die nachfolgenden Betrachtungen 2 2 5 1 Einfrieren Schon das Einfrieren hat einen entscheidenden Einfluss auf den Gefriertrocknungs prozess sowie die Eigenschaften des Endproduktes Flink konnte am Beispiel des Kaffees zeigen dass die Einfrierbedingungen einen Einfluss auf die Farbe des 19 2 THEORETISCHER TEIL gefriergetrockneten Kaffees hatten Dieses Beispiel weist auf die Bedeutung des Einfriervorgangs hin 20 Der Einfrierprozess muss daher so gesteuert werden dass der fur eine bestimmte Produktqualit t ermittelte optimale Temperatur Zeit Verlauf gleichm ig und repro duzierbar ist 66 Zum Einfrieren muss eine Formul
111. ft im Falle des Imidazols sehr schnell lod reagiert nach Glei chung 2 quantitativ mit Wasser Trotz gro er Fortschritte bei der Weiterentwicklung leidet die klassische volumetrische Karl Fischer Methode darunter dass die Reagenzien nicht v llig stabil sind weshalb der Titer periodisch neu bestimmt werden muss Bei der coulometrischen Karl Fischer Titration wird das ben tigte lod direkt im vorge legten Elektrolyten auf elektrochemischen Weg erzeugt Zwischen der elektrischen Ladungsmenge und der Menge des erzeugten lods besteht eine streng quantitative Beziehung die f r die hochpr zise Dosierung des lods verwendet wird Da es sich bei der coulometrischen Karl Fischer Methode um eine Absolutbestimmung handelt muss kein Titer bestimmt werden Es muss nur sichergestellt sein dass die Reaktion welche das lod erzeugt mit 100 Stromausbeute abl uft Die Endpunktsindikation erfolgt voltametrisch in dem einer Doppel Platin Elektrode ein Wechselstrom konstanter St rke aufgepr gt wird Dadurch entsteht zwischen den Platindr hten eine Spannungsdifferenz die beim Vorhandensein geringster Mengen freien lods drastisch abnimmt Dieser Umstand wird zur Ermittlung des Endpunktes der Titration verwendet 46 Vorteile der Coulometrie e f r sehr kleine Wassergehalte geeignet e einfach zu bedienen e hohe Genauigkeit Materialien e Probengl ser 6 mL head space vials 38 25 x 21 75 mm e Septumverschl sse mit Aludeckel und Teflon Einla
112. ge e Septumverschlusszange 72 3 EXPERIMENTELLER TEIL Ger te e Analysenwaage Sartorius Research R 160 P e Metrohm Oven Sample Processor 774 mit Metrohm 756 KF Coulometer Abb 3 13 Einstellungen Ofentemperatur 120 C Heizzeit 600 s Tragergas Stickstoff getrocknet und gefiltert Gasflussrate 85 mL min Lufteinlassfilter Anschluss f r Auslassheizung Gest nge r einstellbar beheizter Transferschiauch r Stativstange Coulometer Zelle mit Generator und Indikator elektrode Probenrack mit 36 Platzen inkl Konditionierposition b 5 Magnetr hrer 728 Ofen mit Schutzmantel Steckerabdeckung Abb 3 13 Schematische Darstellung des Metrohm Oven Sample Processor 774 mit Metrohm 756 KF Coulometer 47 73 3 EXPERIMENTELLER TEIL Bestimmungsablauf 47 76 Das Prinzip der Feuchtebestimmung nach der Ofenmethode mit dem Oven Sample Processor 774 Abb 3 13 sieht folgenderma en aus Vorbereitung Die Lyophilisate werden auf der Analysenwaage in die Probengl ser eingewogen und mit einem PTFE beschichteten Septum dicht ver schlossen Die Probeneinwaagen werden am Coulometer eingegeben Die Probengef e werden auf dem Probenwechsler platziert und der Ofen wird vorgeheizt Ein leeres verschlossenes Probengef dient als Konditioniergef und wird auf der daf r vorgesehenen Position im Probenwechsler positioniert Konditionieren und Blindwertbestimmu
113. ge Massen und k nnen nur langsam aufgew rmt werden Zudem wird die W rmezufuhr nur unterhalb des gefrore nen Tropfens ben tigt nicht unter dem ganzen Applikator Die Energieverwer tung ist uneffizient 79 4 ERGEBNISSE UND DISKUSSION e Die PTFE Folie isoliert und erschwert somit die Warmeubertragung Unterst tzt wird dieser Effekt dadurch dass die Folie nicht plan auf den Edelstahlfl chen aufliegt Die Gaspolster erschweren zus tzlich die W rme bertragung Nur durch Konvektion ist hier eine effiziente und schnelle W rme bertragung zu gew hrleisten Folglich ist Restgas als Warmeubertra gungsmedium erforderlich und der Kammerdruck wird auf ber 1 mbar einge stellt Dies behindert jedoch die Wasserdampfdiffusion zum Kondensator Diese Punkte resultieren in einem unverh ltnism ig hohen Energieverbrauch und langen Prozesszeiten W rme bertragung durch Konvektion bei geringem Vakuum f hrt zu Temperatur und Druckschwankungen innerhalb der Trocknungskammer Der Gefriertrocknungszyklus ist schlecht reproduzierbar die Produktqualit t schwankt Haftfestigkeit Ziel der Entwicklung ist eine Gefriertrocknungsanlage speziell zur Herstellung von OLCS Bei der bisher blichen chargenorientierten Gefriertrocknung wird typischer weise der Inhalt von bis zu mehreren tausend Beh ltnissen in einer Gro anlage gleichzeitig getrocknet Die Trocknung kleiner Mengen ist damit zwar m glich aber unter Ber cksichtigung der Inve
114. gen Durchfrieren der Einzeltropfen verwenden da diese im Schnitt nur einen Durchmesser von 3 4 mm hatten Abb 2 16 zeigt einen gefriergetrockneten Tropfen nach Einfrieren unter Atmosph rendruck In Abb 2 17 ist ein Lyophilisat nach vakuuminduziertem Einfrieren abge bildet Eine vergleichende Bestimmung des Tropfendurchmessers wurde durchge f hrt und daraus das Volumen einer entsprechenden Kugel berechnet Aus der Volumendifferenz l sst sich auf den Wasserverlust beim vakuuminduzierten Einfrieren schlie en 49 2 THEORETISCHER TEIL Abb 2 16 Oberflache eines bei Atmospha Abb 2 17 Vertikalschnitt eines vakuumindu rendruck eingefrorenen Lyophilisates ziert eingefrorenen Lyophilisates Durchmes Durchmesser d1 4 0 mm ser d2 3 7 mm Durchmesser bei normalem Einfrieren d1 4 0 mm Durchmesser bei vakuuminduziertem Einfrieren d2 3 7 mm Volumen einer Kugel mit Durchmesser d1 33 5 mm Volumen einer Kugel mit Durchmesser d2 26 5 mm Volumendifferenz 7 mm 21 Nach Oetjen muss man in der Praxis beim vakuuminduzierten Einfrieren mit etwa 15 20 Wasserverlust rechnen F r das vakuuminduzierte Einfrieren der OLCS wurde diese Aussage experimentell best tigt 54 90 3 EXPERIMENTELLER TEIL 3 Experimenteller Teil 3 1 Materialien Das Applikationssystem OLCS besteht aus vier Teilen a Hydrophobe Tr gerfolie auf welcher das wirkstoffhaltige Polymerlyophilisat haftet b Handgriff aus Autok
115. gen Durchfrieren der Proben erkennbar an dem steilen Abfall der aufgezeichneten Temperaturkurven nach dem Plateau wurde dann in den F llen geringer Evakuiergeschwindigkeit Ventilstellung lt 600 diese auf 105 3 mbarL s Ventilstellung 700 erh ht um m glichst schnell das endg ltige Prozessvakuum zu erreichen Dies ist an einem deutlichen Knick in der aufgezeichneten Druckkurve zu erkennen Abb 4 18 Ventilstellung 530 Ventilstellung Unterk hlung Gefrierpunkt Beginn Dauer der C C des Ein Plateau frierens phase FEN Er er eben i a Oo EZ e Tabelle 5 Einfrierbedingungen in Abh ngigkeit von der Ventilstellung Ausgangsl sung mit 0 816 Fluorescein Natrium und 1 0 HPMC E50 108 4 ERGEBNISSE UND DISKUSSION 10 Ventilstellung V 600 1 Ventilstellung V 530 Atmosph rendruck 0 1 V zu 0 Ventilstellung V 470 gt u 0 01 2 0 001 Q r E 0 0001 5 i A 0 00001 0 000001 0 1 2 3 4 5 6 7 Zeit min Abb 4 18 Temperatur und Druckverl ufe verschiedener Einfriermethoden Ausgangsl sung mit 0 816 Fluorescein Natrium und 1 0 HPMC E50 Eine kurze Plateauphase bedeutet dass die Kristallisation entsprechend schnell erfolgt Es sollte eine heterogene Eisstruktur mit im Durchschnitt kleineren Kristallen entstehen als dies bei einer langen Plateauphase z B beim Einfrieren unter Atmo sph rendruck der Fall ist 66 Wie bereits erw hnt
116. gen k nnen diese Kristalle nadelf rmig werden also sehr schmal und l nger als die eben angesprochenen Zylinder Abb 4 42 links 131 4 ERGEBNISSE UND DISKUSSION Abb 4 42 Schematische Darstellung verschiedener Strukturen gefriergetrockneter Hydrogele die bei verschiedenen Temperaturen eingefroren wurden Die Einfriergeschwindigkeit nimmt von links nach rechts stark ab 31 Bei einem halbkugelf rmigen Tropfen entsteht unter den Bedingungen des vakuum induzierten Einfrierens ein von der Tropfenoberfl che zur Tropfenmitte hin ausge richteter Temperaturgradient Im Kontaktbereich des Tropfens mit der PTFE Folie bilden sich lange d nne Eiskristalle parallel zur Folie Abb 4 43 Abb 4 44 und Abb 4 45 Da sich die gel sten Bestandteile beim Gefrieren um die L sungsmittel Kristalle anordnen kommt es teilweise zu einer sehr dichten geschlossenen Kontakt fl chenstruktur Abb 4 46 und Abb 4 47 hnlich wie man sie an der Oberfl che von gefriergetrockneten L sungen die in einem K ltebad eingefroren wurden beobachten kann Abb 4 48 Diese geschlossenen Bereiche der Kontaktfl che erkl ren den starken Anstieg der Haftfestigkeit unter schnellen Einfrierbedingungen 42 Tropfenf rmiges Lyophilisat PTFE Tr gerfolie Abb 4 43 Schematische Darstellung der Richtung des bevorzugten Eiskristallwachstums beim vakuuminduzierten Einfrieren 132 4 ERGEBNISSE UND DISKUSSION Abb 4 44 bis 4 47 REM Aufnahmen von
117. ges aus der Messzeit ergeben Kraft g Ventilstellung 600 33 5 mbarL s Ventilstellung 530 13 4 mbarL s Ventilstellung 400 1 65 mbarL s Weg mm Abb 4 66 Abh ngigkeit der Druckfestigkeit von der Einfriermethode Einfach dosierte OLCS mit 375 ug Polymergehalt dargestellt je n 3 Je weiter eine Kurve nach rechts verschoben ist desto geringer ist die Druckfestig keit Obwohl nur relativ gering lassen sich Festigkeitsunterschiede in Abh ngigkeit von der Einfriergeschwindigkeit erkennen Eine h here Evakuiergeschwindigkeit scheint zu einer h heren Druckfestigkeit zu f hren Die Reproduzierbarkeit innerhalb der einzelnen Methoden ist sehr gut 150 4 ERGEBNISSE UND DISKUSSION 4 4 2 2 Einfluss des Polymergehaltes auf die Druckfestigkeit Es wird die Druckfestigkeit von Lyophilisaten mit 68 ug Fluorescein Natrium und 125 ug 250 ug bzw 375 ug HPMC untersucht Die Lyophilisate werden nach identi schen Einfrierbedingungen Evakuieren mit 33 5 mbarl s Ventilstellung 600 hergestellt Im nachfolgenden Diagramm Abb 4 67 sind die entsprechenden Druckfestigkeits profile graphisch dargestellt Kraft g 250 ug HPMC 375 ug HPMC 125 ug HPMC 0 25 0 5 1 0 1 5 2 0 Weg mm Abb 4 67 Abh ngigkeit der Druckfestigkeit vom eingesetzten Polymergehalt Erwartungsgem nimmt die Druckfestigkeit mit steigendem Polymergehalt stark zu Dieser Effekt ist wesentlich ausgepr gter als der Einfluss der
118. geschwindigkeit eingefroren wurden Methode 3 250 ug HPMC E50 204 ug Fluorescein Natrium Abb 4 49 u ere Form des Lyophili Abb 4 50 Detailaufnahme der Produktober sattropfens fl che 134 4 ERGEBNISSE UND DISKUSSION Abb 4 51 Bodenstruktur am Rand ohne Abb 4 52 Bodenstruktur in der Mitte mit Gefrierkonzentration Gefrierkonzentration des gelosten Wirkstoffs Wie beim Einfrieren unter Atmospharendruck kommt es auch beim schnellen vaku uminduzierten Einfrieren aufgrund des gerichteten Eiskristallwachstums zu einer Gefrierkonzentration Hier allerdings konzentrieren sich die gel sten Stoffe in der Mitte der Kontaktflache zur Folie also im Zentrum der Lyophilisatunterseite Abb 4 51 Abb 4 52 4 4 1 2 Einfluss des Wirkstoffgehaltes auf die Haftfestigkeit Bereits zu Beginn des Kapitels 4 4 wurde erw hnt dass Lyophilisate unterschiedli cher Wirkstoffkonzentration mit dem Mini Gefriertrockner hergestellt und in klinischen Pr fungen getestet werden sollten Der vorige Abschnitt hat gezeigt dass der gel s te Wirkstoff je nach Einfrierbedingungen bevorzugt an verschiedenen Stellen des Lyophilisates auskristallisieren kann Daher k nnte sich die Wirkstoffkonzentration teilweise auch auf die Haftfestigkeit auswirken Um zu pr fen wie die Arzneistoffdosis die Haftfestigkeit der Lyophilisate beeinflusst wurde der folgende Versuch durchgef hrt Es wurden Lyophilisate aus Tropfen mit 1 HPMC E50 und 68 ug Fluoresc
119. gnifikanten Unterschied f r jede der drei Polymerkonzentrationen auf allen vier Niveaus f r die Evakuiergeschwindigkeit jeweils p lt 0 002 Der Polymergehalt hat demnach einen sehr starken Einfluss auf die Haftfestigkeit der Lyophilisate Sowohl die Evakuiergeschwindigkeit als auch der Polymergehalt zeigen einen deutli chen Einfluss auf die Haftfestigkeit der Lyophilisate Da der Effekt der Evakuierge schwindigkeit mit steigender Polymerkonzentration zunimmt sollte es durch Kombi nation beider Faktoren m glich sein einen definierten Wert f r die Haftfestigkeit gezielt einzustellen In Kapitel 4 4 3 werden dahingehende Versuche beschrieben Bereits die Ergebnisse in Kapitel 4 4 1 2 zeigten f r OLCS mit 68 ug Fluorescein Natrium oberhalb einer Evakuiergeschwindigkeit von 13 4 mbarL s keine weitere deutliche Erh hung der Haftfestigkeit Dieses Ergebnis lie sich jetzt an drei weiteren Versuchsreihen best tigen vgl Abb 4 54 Anhand von rasterelektronenmikroskopischen Aufnahmen der schnell eingefrorenen Proben 33 5 mbarL s mit 375 ug Polymergehalt soll untersucht werden ob ein Hinweis f r das Stagnieren der Haftfestigkeit zu finden ist Dazu wurden Querschnittsaufnahmen gemacht 141 4 ERGEBNISSE UND DISKUSSION Abb 4 55 und Abb 4 56 REM Aufnahmen von OLCS die unter schnellem Evakuieren mit 33 5 mbarL s Evakuiergeschwindigkeit eingefroren wurden Methode 3 375 ug HPMC E50 68 ug Fluorescein Natrium Abb 4 55 a
120. gs und Endtemperatur C werden in ihre absoluten Werte K berf hrt und der zugehorige Dampfdruck ermittelt 81 T gt 20 C T 10 C 293 K P gt 23 38 mbar 263 K gt P 2 597 mbar Allgemeine Gaskonstante R 8 314 J moleK Einsetzen der Werte in Gleichung 4 ergibt 2 log an 2 303 8 314 263 293 mbar J K AH 2997 __ mbar mol K 293 263 K 6 i os Ea 30 mol Zur Berechnung der Verdampfungswarme pro Gramm L sungsmittel ben tigt man dessen Molmasse Molmasse von Wasser 18 g mol mol Ne J mo _ 9607 J 18 mol g 1 Dies ist die gemittelte Verdampfungsw rme die bei Wasser zwischen 20 C und 10 C aufzubringen ist um 1 g in die Gasphase zu berf hren 48 2 THEORETISCHER TEIL Um bei den gegebenen Bedingungen ein Gramm der L sung einzufrieren m ssen 459 7 J W rmeenergie abgef hrt werden Beim vakuuminduzierten Verdampfen wer den allerdings 2607 J pro Gramm verbraucht Im Folgenden wird berechnet wie viel Prozent x des L sungsmittels verdampfen bis die L sung eingefroren ist a 459 7 100 2607 22 17 7 g Die Methode des vakuuminduzierten Einfrierens wird normalerweise technisch nicht verwendet da zum einen nur die Produktoberfl che 3 4 mm eingefroren wird zum anderen kommt es dabei zu einer Volumenreduktion des Ausgangsmaterials 29 54 Im Falle der OLCS lie sich diese Methode allerdings zum vollst ndi
121. haltet Nach Entnahme der Applikatoren wurde die Haftung der Lyophilisate auf dem Tr ger berpr ft Nun wurden die Applikatoren wiederum in die AbreiBvorrichtung eingespannt und die Messung erneut gestartet Abb 4 27 121 4 ERGEBNISSE UND DISKUSSION Abrei kraft g Weg Abb 4 27 Kraft Weg Diagramm mit Unterbrechung nach einem Minimum Pfeil und Wieder aufnahme der Messung Die sich nun ergebende Kurve dicke Linie in Abb 4 27 zeigt einen steilen geraden Kraftanstieg ohne nennenswerte Unregelm igkeiten bis zum Maximalwert Hier trennt sich das Lyophilisat vollst ndig von der PTFE Folie ab Danach f llt die Kurve in bekannter Weise ab 10 9 AbreiBkraft g O1 Weg Abb 4 28 Kraft Weg Diagramm normaler Verlauf ohne Unterbrechung 122 4 ERGEBNISSE UND DISKUSSION Abb 4 28 zeigt im Vergleich noch einmal den Kurvenverlauf an einem Lyophilisattr ger der gleichen Herstellungsweise ohne Versuchsunterbrechung Als Ergebnis ist festzuhalten dass die Lyophilisate nach Unterbrechung des Versu ches noch immer fest auf der PTFE Folie hafteten Sie zeigten eine nahezu vollst n dige elastische R ckformung da sich direkt nach der Entnahme aus der Abrei vor richtung die urspr ngliche u ere Form ann hernd wieder herstellte Die plastische Verformung war nur gering Durch Brechen innerer schwacher Strukturen kommt es zum Auftreten der oben beschriebenen Minima ohne dass die Haftfestigkeit nen
122. hmilzt und die Sublimationsrate unterhalb des Punktes liegt an dem die Kapazit t des Kondensators berschritten wird 2 2 5 4 Energie bertragung im Vakuum F r die bertragung der Sublimationsw rme von der Energiequelle zur Produktober fl che gibt es verschiedene M glichkeiten Sie sind abh ngig vom Kammerdruck dem Material und der Form des Produktgef es sowie der Art der Energiequelle 29 2 THEORETISCHER TEIL Bei der haufig angewendeten Gefriertrocknung in Glasvials auf beheizbaren Stellfla chen kann die Warmeubertragung durch Gaskonvektion zwischen dem Vial und seiner Umgebung durch W rmestrahlung und durch Warmeleitung bei direktem Kontakt zwischen Stellflache und Vial stattfinden Abb 2 13 57 66 68 W rmestrahlung Wasserdampf Trockengut Sublimationszone T lt Kollapstemperatur Eiskern 30 C Konvektion Kontakt W rme bertragung N TM INIMrelpiatte n EN Abb 2 13 M glichkeiten der W rme bertragung in der Haupttrocknung 66 i Warmeleitung und Konvektion stehen hier im Vordergrund wobei der Warmeleitung aufgrund der kleinen Kontaktflache ein geringerer Effekt beigemessen wird Durch den konkaven Vialboden befindet sich zwischen Stellflache und Behaltnis ein Gas polster uber welches nur konvektiver Warmetransport stattfinden kann Abb 2 13 70 Bei einem Kammerdruck unterhalb 0 1 mbar sinkt die Sublimationsrate stark ab Dies berrascht zu
123. hr ergab sich allerdings ein unkontrollierbarer treppenf rmiger Anstieg der Produkttemperatur Die Schwankungen der 8 4 ERGEBNISSE UND DISKUSSION Stellflachentemperatur wurden umso gr er je l nger die Anlage in Betrieb war Zudem kondensierte Luftfeuchtigkeit an dem Edelstahlgeh use so dass man beim Entnehmen des trockenen Lyophilisates darauf achten musste dass dieses nicht durch herabfallenden Reif angel st wurde Um m glichst effizient Sublimationsw rme auf das gefrorene Produkt zu bertragen wurde ein Vakuum eingestellt bei dem bevorzugt W rme bertragung durch Konvektion stattfindet 0 5 bis 1 mbar Konvektion bei diesen extremen Temperatur unterschieden in der unmittelbaren Umgebung des Produktes f hrte zu sehr unregelm igen und somit nicht reproduzierbaren Trocknungsverl ufen Tabelle 1 W rmeleitung spielte wegen der isolierenden Eigenschaft der PTFE Folie nur eine untergeordnete Rolle Temp Trop fen zu Beginn Zeit bis K hlrate Endtemp Trocknungszeit C 0 C s K min Produkt C min Aussehen Lyophilisat innen leicht angetaut 16 0 48 20 36 12 5 feinporig gl nzend Tabelle 1 Kenndaten einiger Trocknungsverl ufe mit Prototyp 1b Endvakuum 0 5 mbar Ventilstellung 500 Stellfl chentemperatur 70 C Durch direkten Kontakt zwischen dem Aluminiumblock und dem darauf liegenden Thermof hler wurde der Messdraht aufgeheizt und transportierte so zus tzliche Energie ber W
124. ht und somit die Struktur des Lyophilisates nach der Gefriertrocknung Beim langsamen Einfrieren unter Atmospharendruck oder 1 65 mbarL s Evakuierge schwindigkeit ist die Plateauphase sehr lang Die ersten Kristalle bilden sich schnell an der Unterseite des Tropfens danach schreitet das Kristallwachstum langsam nach oben fort Es kommt zur Gefrierkonzentration und dadurch zu sehr dichten Strukturen an der Oberfl che Die kleinen Kristalle im Kontaktbereich zur Folie resul tieren nach dem Trocknen in filigranen Porenwanden die das Lyophilisat nur schwach haften lassen Beim Einfrieren mit mittlerer Geschwindigkeit Evakuieren mit 10 0 bis 13 4 mbarL s kommt es zu einer gleichm igen Abk hlung des Trop fens Beim anschlie enden Durchfrieren zeigt sich keine Gefrierkonzentration Nach dem Trocknen resultieren sehr homogene hexagonale bis runde Poren mit dicken W nden die deutlich fester auf der PTFE Folie haften Die Haftfestigkeitsuntersuchungen die Aufkl rung der Lyophilisatstrukturen durch REM sowie die visuelle und quantitative Auswertung der Restmengen Fluorescein auf den PTFE Folien nach In vitro Abrei tests zeigen dass es bei einer Erh hung der Evakuiergeschwindigkeit einen Punkt gibt ab dem sich die Eigenschaften der Lyophilisate deutlich ndern Grund daf r ist die Richtungsumkehr des Eiskristall wachstums bei Erh hung der Evakuiergeschwindigkeit von 13 4 mbarL s auf 33 5 mbarL s Bei den beiden bisher beschriebenen Method
125. ht die Gefahr dass der halbkugelf rmige Tropfen verl uft In diesem Fall vergr ert sich die Kontaktfl che zwischen Polymerl sung und Tr gerfolie wodurch das Lyophilisat nach dem Gefriertrocknungsprozess nur schwer oder gar nicht vom Tr ger abge streift werden kann Bei identischer Herstellung f hrt dies zu starken Streuungen bez glich der Haftfestigkeit 100 4 ERGEBNISSE UND DISKUSSION 4 2 3 Bestimmung der Dosiergenauigkeit der verwendeten Pipette Um die Gleichf rmigkeit der Dosierung bei den Einzeltropfen zu berpr fen wurden von jeder L sung zweimal die Massen von je 30 Einzeltropfen Volumen 25 uL bestimmt HPMC Konzentration Messung Mittelwert mg Standardabweichung mg Rel Standardabweichung os om om pe oo Tabelle 4 Ergebnisse der Bestimmung der Pipettendosiergenauigkeit In Tabelle 4 lasst sich eine geringfugige Tendenz dazu erkennen dass die Tropfen masse mit steigendem Polymergehalt minimal zunimmt Dies bestatigt nochmals die Ergebnisse der Dichtebestimmung Allerdings betragt der mittlere Massenunter schied zwischen einem Tropfen der 0 5 igen HPMC L sung und der 1 5 igen weniger als 1 und kann deshalb hier vernachlassigt werden Deutlicher fallt dagegen der Unterschied zum erwarteten Durchschnittsgewicht aus Statt des erwarteten Sollwertes von 25 mg hatten die Tropfen im Mittel nur eine Masse von 24 2 mg Das bedeutet die verwendete Dosierpipette f hrt zu einer Unterdo
126. hwerend hinzu dass der erh hte Augeninnendruck keine Schmerzen oder ande re erkennbare Beschwerden hervorruft und somit die Notwendigkeit der Therapie grunds tzlich in Frage gestellt wird 15 Die Compliance ist somit ins Zentrum der therapeutischen berlegung ger ckt und es wird versucht die oben beschriebenen Probleme zu l sen Ein Ansatz ist die Entwicklung von Einzeldosisophthiolen EDO Sie minimieren die Kontaminationsproblematik sowie Unvertr glichkeitsreaktionen durch Fehlen von Konservierungsmitteln Die Sollbruchstellen solcher Einzeldosisbeh ltnisse sind 2 THEORETISCHER TEIL jedoch oft scharfkantig und somit gefahrlich fur Patienten die die Cornea mit dem Auslass beruhren Abb 2 1 Zudem kann die Entstehung einer Luftblase beim ffnen das freie Austropfen der L sung behindern Zum Einbringen eines Tropfens in den Bindehautsack ist h ufig starker Druck auf das EDO erforderlich ltere und schwache Patienten k nnen diesen nicht immer aufbringen Der Name Einzeldosisbeh ltnis ist irref hrend Die F llmenge solcher Ophthiolen betr gt 0 5 mL verwendet wird aber nur 1 Tropfen also maximal etwa 50 uL Das bedeutet dass nur 1 10 der Augentropfenl sung zur Anwendung kommt Der Rest wird verworfen Da sich in den Ophthiolen keine wahre Einzeldosis befindet besteht immer noch die M glichkeit einer Unter oder berdosierung Abb 2 1a und b Sollbruchstelle von Einzeldosisophthiolen Rechts stark vergr ert
127. i 1000 mbar ein Volumen von 1 24 L einnimmt Nach dem allgemeinen Gasgesetz P V n R T gilt f r eine konstante Stoffmenge n und die Temperatur T P V konstant F r 1 g Wasserdampf unter Atmospharendruck errechnet sich P V zu 1000 mbar 1 24 L 100000 Pa 0 00124 m 124 J Betrachtet man nun die Trockenkammer mit einem Prozessdruck von 1 0 mbar so errechnet sich das Volumen von 1 g Wasserdampf zu V 124J 100 Pa 1 24 m 1240 L Ein Gramm Wasserdampf nimmt bei 1 0 mbar also etwa ein Volumen von 1240 Litern ein 54 66 Somit ist es praktisch unm glich die bei g ngigen Prozess dr cken anfallenden Wasserdampfvolumina mit den normalerweise verwendeten Vakuumpumpen zu entfernen Das Prinzip der Wasserdampfkondensation an gek hlten Kondensatorfl chen ist einfach und kosteng nstig im Vergleich zu einer 26 2 THEORETISCHER TEIL mechanischen Pumpe die derart gro e Dampfmengen entfernen k nnte Aber selbst wenn die Leistung der Pumpe ausreicht gelangt zu viel Wasserdampf in die h ufig verwendeten Drehschieberpumpen und kondensiert im Ol Dadurch verschlechtern sich seine Schmiereigenschaften und die Pumpe wird auf Dauer zerst rt 2 2 5 3 2 1 Die Kondensatortemperatur Eis erzeugt Uber seiner Oberfl che den der Eistemperatur zugeh rigen S ttigungs dampfdruck Zum Beispiel hat das gefrorene Produkt bei einer Temperatur von 20 C einen S ttigungsdampfdruck von 1 04 mbar Hat Eis am Kondensator
128. ich in hnlicher Weise auch beim Evakuieren mit 13 4 mbarL s finden l sst Abb 4 40 Die Lyophilisatoberflache beim vakuuminduzierten Einfrieren mit 33 5 mbarL s ist dagegen sehr offenporig Abb 4 50 Einfrieren unter Atmosph rendruck sowie mit 13 4 mbarL s f hrt zu Lyophilisaten die nach dem Entfernen von der PTFE Folie eine plane Auflagefl che zeigen Abb 4 62 und Abb 4 61 Unter vakuuminduziertem Einfrieren mit 33 5 mbarL s entsteht eine keilformige Auflageflache mit einem Winkel von etwa 166 Abb 4 55 Dies l sst sich durch ein Kristallwachstum von der Oberfl che aus nach innen erkl ren Das radiale Kristallwachstum zum Zentrum der Bodenfl che l sst sich anhand raster elektronenmikroskopischer Aufnahmen belegen Den deutlichsten Hinweis geben die langen d nnen Kan le die parallel zur Tr gerfolie sternf rmig zur Mitte der Auflage fl che hin verlaufen Abb 4 44 Abb 4 45 und Abb 4 46 Im Gegensatz zu diesem horizontalen Eiswachstum zeigen die unter den beiden anderen Bedingungen hergestellten Lyophilisate Bodenstrukturen die auf ein vertikal nach oben gerichtetes Kristallwachstum deuten Die Ausbildung der keilf rmigen Bodenstruktur beim schnellen vakuuminduzierten Einfrieren ist auch der Grund daf r dass bei den Lyophilisaten mit einfachem Wirk stoffgehalt 68 ug zwischen 13 4 mbarL s und 33 5 mbarL s eine deutlich geringere Zunahme der Haftfestigkeit zu verzeichnen ist Abb 4 54 Die Lyophilisate l sen si
129. ie Wichtigkeit der Warmequelle beim Gefriertrocknen n her betrachtet werden Damit Eis sublimiert ist eine Energiemenge von etwa 2800 Joule pro Gramm als Sublimationsw rme aufzubringen 29 50 54 57 58 Mit dieser W rmemenge k nn te die achtfache Masse fl ssigen Wassers von 20 C zum Sieden erhitzt werden 50 Diese Energie wird dem gefrorenen Produkt beim Sublimationsprozess in Form von W rme entzogen Dadurch k hlt das Eis von der Sublimationsfront her ab und sein S ttigungsdampfdruck verringert sich entsprechend Das geschieht so lange bis der Wert des Kammerdrucks erreicht ist Ohne zus tzliche Energiezufuhr um den Prozess zu unterst tzen kommt die Sublimation hier zum Stillstand 37 Um der Abk hlung des Eises entgegen zu wirken und dessen Temperatur von Beginn der Prim rtrocknung an m glichst konstant zu halten wird der Sublimations front durch W rme bertragung von der Stellfl che die ben tigte Sublimationsenergie 28 2 THEORETISCHER TEIL zugef hrt Dadurch bildet sich im Produkt ein Temperaturgradient aus Die h chste Temperatur herrscht am Boden des Produktcontainers die tiefste an der Sublimationsfront Ziel ist es einen ausreichenden Temperaturgradienten zu erreichen um an der Sub limationsfront genau soviel W rmeenergie zur Verf gung zu stellen dass sich das Produkt w hrend der Prim rtrocknung nur geringf gig oder gar nicht erw rmt Die zugef hrte W rmeenergie wird dann allen durch den Subli
130. ierung so weit abgek hlt werden dass entweder Wasser und Feststoff vollst ndig auskristallisiert sind oder Zonen von kristallinem Eis sich mit festen amorphen Zonen abwechseln 54 Ob eine Formulie rung vollst ndig auskristallisiert h ngt von deren Zusammensetzung den Eigen schaften der einzelnen Komponenten sowie von der Abk hlgeschwindigkeit und der Endtemperatur ab In der Praxis kommt es beim Einfrieren von Fl ssigkeiten zur Unterk hlung 29 50 52 54 57 66 Aufgrund fehlender Kristallisationskeime wird der Kristallisationspro zess verz gert und Fl ssigkeiten k nnen bis weit unter den Gefrierpunkt abk hlen Der Grad der Unterk hlung ist abh ngig von den gel sten Stoffen der Einfrierme thode Temperatur Zeit Verlauf dem Beh ltnis und der Anwesenheit von partikul ren Verunreinigungen die als Kristallisationskeime f r die Eisbildung dienen k nnen Die Unterk hlung beeinflusst die Gesamttrocknungszeit die Struktur des sp teren Lyophilisates und die Zeit die ben tigt wird um dieses zu rehydratisieren 22 Normalerweise ist eine gem igte Unterk hlung von 10 bis 15 C erw nscht F r gew hnlich zeigen die in der Pharmazie h ufig vorkommenden sterilen und partikel freien L sungen eine st rkere Unterk hlung Wichtig ist dass die Unterk hlung so wohl innerhalb eines Beh ltnisses als auch innerhalb einer Charge einheitlich ist 57 In der Praxis ist das allerdings vor allem bei gro en Anlagen nur schw
131. ion der Geschwindigkeit mit der die Kammer evakuiert wird l sst sich eine L sung somit unterschiedlich schnell abk hlen Dieser Effekt kann im Mini Gefriertrockner nicht getrennt vom konvektiven W rmeentzug des Kondensators genutzt werden Dadurch ergeben sich je nach Evakuiergeschwindigkeit Einfrierbedingungen die interessan te Auswirkungen auf die Eigenschaften des Endproduktes zeigen Wird kein Vakuum angelegt so erfolgt der W rmeentzug allein durch Konvektion Da sich ein Teil des Kondensators unterhalb des Produktes befindet k hlt die L sung in Kondensatorn he am schnellsten ab und erreicht zuerst die Kristallisationstempera tur Dies f hrt dazu dass sich die ersten Eiskristalle an der Unterseite des L sungs tropfens bilden und in Richtung des herrschenden Temperaturgradienten senkrecht nach oben in die Fl ssigkeit wachsen Wird dagegen von Beginn an evakuiert so behindert dies den konvektiven W rme entzug von der Unterseite der L sung Dieser Effekt wird mit steigender Evakuierge schwindigkeit st rker weil immer weniger Gasmolek le f r Konvektion zur Verf gung stehen Die K hlung von unten wird weitestgehend unterbunden Kontr r verh lt sich gleichzeitig der Einfluss den das Evakuieren auf die fl ssige L sung hat Mit einer Erh hung der Evakuiergeschwindigkeit wird die Abk hlung der L sung an der Grenz fl che Fl ssigkeit Gasraum ausgepr gter Die ersten Eiskristalle bilden sich an der Fl ssigkeitsobe
132. ird die Kammer langsam bis zu einem Enddruck von etwa 0 1 mbar evakuiert Sobald das Vakuum 0 5 mbar unterschreitet setzt merklich die Sublimation ein 68 Durch die ben tigte Sublimationsenergie kommt es zu einem deutlich erkennbaren Absinken der Produkttemperatur Da eine Abk hlung des Produktes unter das gew nschte Temperaturintervall von 28 C 3 C weitestgehend vermieden werden soll wird ab dem Unterschreiten von 0 5 mbar mit der Zufuhr der Sublimationsw rme ber die Stellfl che begonnen Dazu wird diese langsam auf die experimentell ermittelte Temperatur von 10 C 2 C erw rmt Nachdem sowohl das Endvakuum als auch die endg ltige Stellfla chentemperatur erreicht sind stellt sich die Produkttemperatur im vorgeschriebenen Intervall ein Jetzt werden Kammerdruck und Stellfl chentemperatur konstant gehal ten Unter diesen Bedingungen bleibt die Produkttemperatur im vorgeschriebenen Intervall bis zu dem Zeitpunkt an dem die Eisfront den Punkt der Temperaturmes sung passiert hat Nach einer Prozesszeit von etwa 4 5 Stunden beginnt sich die Temperatur des Lyophilisates zu erh hen Die Prim rtrocknung gilt als beendet wenn sich die Produkttemperatur f r etwa zwei Stunden an die Stellfl chentempera tur angen hert hat Sekund rtrocknung Der Restfeuchtegehalt des Lyophilisates kann entweder durch eine Erh hung der Stellflachentemperatur oder durch Reduktion des Wasserdampfpartialdruckes in der Trockenkammer das hei
133. is typischerweise um 40 C 37 57 Das zu trocknende Gut muss letztlich vollst ndig durchgefroren sein da es sonst w hrend der Trocknung von den Fl ssigkeitsnestern ausgehend zu Schaumbildung kommen kann Dieser Effekt wird als Frothing engl fur sch umen bezeichnet 29 Zum Frothing kommt es ebenfalls wenn das Material nach vollstandigem Durchfrieren rtlich wieder antaut 36 Ein wichtiges Kriterium beim Einfrieren ist die Einfriergeschwindigkeit die mit Mitteln der K ltetechnik gesteuert wird 53 F r die sp tere Beschaffenheit des Gefriertro ckengutes insbesondere seiner Porositat sind Kristallgr e und Kristallform des Eises entscheidend Diese werden wie folgt durch die Einfrierbedingungen bestimmt Beim sehr langsamen Abk hlen kommt es zu einer deutlichen Unterk hlung der L sung 40 Setzt dann spontan die Kristallbildung ein friert das Produkt sehr rasch durch Als Folge bilden sich nur kleine Kristalle 66 Auch bei einer sehr hohen Abk hlrate kommt es aufgrund einer ungleichm igen Unterk hlung des Produktes zu einer raschen Kristallisation Es entstehen wiederum viele Kristallkeime die zu kleinen Kristallen heranwachsen 66 Diese Eiskristalle zeigen keine hexagonale Struktur sondern sind unregelm ig und heterogen 50 Zus tzlich f hrt die ungleichm ige Unterk hlung mit Temperaturgradienten dazu dass sich die Kristalle nicht nur in eine Richtung ausbilden sondern sie in Fo
134. istalle ab Ausf llung Dabei sinkt die L sungs konzentration und die Gefriertemperatur steigt In beiden beschriebenen F llen kann es durch unterschiedliche L slichkeiten von beispielsweise Puffersalzen zu signifikanten pH Wert nderungen kommen Beim Abk hlen eines Puffersystems aus Zitronens ure und Dinatriumphosphat zum Beispiel kristallisiert zuerst das Natriumsalz aus was einen starken Abfall des pH Wertes von pH 6 auf etwa pH 3 5 nach sich zieht 19 Dieses Puffersystem w r de daher Probleme bereiten wenn es zusammen mit einer Substanz verwendet wird die sich bei niedrigen pH Werten rasch zersetzt wie zum Beispiel Benzylpenicillin 57 Im Zuge einer weiteren Abk hlung erreicht eine vollst ndig auskristallisierende For mulierung die eutektische Temperatur Hier hat die verbleibende L sung in beiden F llen unabh ngig von der Konzentration der Ausgangsl sung die gleiche definier te Konzentration und gefriert als Ganzes Dabei trennt sich das System in Eis und Feststoffkristalle und bildet ein Kristallgemisch 66 68 Dies muss aber bei komplexen L sungen oder Suspensionen nicht der Fall sein Beim Einfrieren und der damit verbundenen Gefrierkonzentration kann sich aufgrund einer Ubers ttigung eine viskose L sung oder Suspension bilden Dort k nnen Diffu sionsvorg nge die f r die Kristallisation von N ten sind nur sehr langsam ablaufen Deshalb kristallisiert dieses System obwohl es thermodynamisch instabil is
135. ition des Temperatursen sors im Gefriertrockengut 69 a verschiedene Messpositionen am Boden des Glasvials b verschiedene Messpositionen 8 mm ber dem Boden des Glasvials Erw hnenswert ist zudem die Tatsache dass sich trotz einer um den Faktor 5 l nge ren Durchfrierzeit Plateauphase bei Methode 1 im Vergleich zu Methode 3 vgl Abb 4 18 keine Verk rzung der Prim rtrocknungsphase ergibt Wie in Kapitel 2 2 5 1 beschrieben hat die Einfriergeschwindigkeit Auswirkungen auf die Porengr e des Lyophilisates Schnelles Einfrieren erzeugt kleine Eiskristalle und somit kleine Poren die f r den noch zu sublimierenden Wasserdampf einen Widerstand darstellen Dies f hrt zu einer Verl ngerung der Trocknungszeit gegen ber Proben die langsamer eingefroren wurden Scheinbar sind hier bei allen drei 116 4 ERGEBNISSE UND DISKUSSION Methoden die Durchfriergeschwindigkeiten absolut gesehen noch so hoch dass sich nach dem Gefriertrocknen kein wesentlicher Unterschied in der Porengr e ergibt Zumindest ist kein Einfluss auf die Sublimationsrate erkennbar Unter Ber cksichtigung des Einflusses den die Lage des Thermoelementes auf die gemessene Produkttemperatur haben kann sind sowohl die Einfrier als auch die Trocknungskurven f r jede der drei Methoden gut reproduzierbar Unterschiede in den Haft bzw Druckfestigkeiten der Lyophilisate hergestellt nach der gleichen Methode k nnen demnach nicht auf unterschiedliche Einfrie
136. izierten Dosis aus 18 Hier sind also sowohl Unterdosierung als auch sys temische Wirkungen nicht auszuschlie en zumal das gro e Fl ssigkeitsvolumen einen vermehrten Tr nenfluss zur Folge hat Viskosit tserh hende Hilfsstoffe sollen die Filmbildung und Haftf higkeit verbessern und Reizwirkungen verhindern Eine Intensivierung und Verl ngerung der Wirkung ist aber vor allem auf die Verlangsa mung des Abflusses der applizierten Tropfen ber die Tr nenkan le zur ckzuf hren 18 Die Sicherheit der Augentropfenanwendung wurde in einer Studie durch Brown et al an 150 Glaukompatienten untersucht 27 aller Patienten berwiegend Langzeit anwender misslang der Versuch den Tropfen in das Auge einzubringen Vier von f nf Patienten ber hrten den Auslass der Augentropfflasche mit den Wimpern den Fingern den Augenlidern oder der Bindehaut und kontaminierten so den Tropfer HygienemaBnahmen durch Waschen der Hande vor der Anwendung betrieben nur 9 der Probanden 3 Die Compliance scheitert haufig an der schwierigen Handhabbarkeit von Augentrop fen aber auch an den Beschwerden die das Tropfen selbst hervorruft wie z B Brennen Jucken Stechen und das Gef hl einen Fremdk rper im Auge zu sp ren Auch die systemischen Nebenwirkungen die der Patient oftmals nicht mit seiner Augenmedikation in Verbindung bringt sollen bei einer Langzeitanwendung z B bei einer Glaukomtherapie ertragen werden Gerade bei Glaukompatienten kommt ersc
137. k nnen ob es aufgrund der Sublimation in der Trocken kammer vor dem Kondensator zu einem merklichen Druckanstieg kommt Dies war allerdings nicht der Fall Strahlungsheizung Kapazitiver Druckmesser N lh TE I m f ol 0 IL UNO BENENNEN E a a a i og in Tr Bir va me i er da ar I wi een u in ut a x 3 E se Durchsichtige 4 Trocknungskammer aus Acrylglas S Verl ngertes Kon ae a densatorrohr 7 j a Pr rp Abb 4 5 Schemazeichnung des Prototyp 3 Technische Zeichnung und Fertigung B Neff 91 4 ERGEBNISSE UND DISKUSSION Problematik bei der Verwendung von Prototyp 3 Mit diesem Anlagendesign lie sich schnell und reproduzierbar sowohl Einfrieren als auch Gefriertrocknen Auch in Sachen Handhabbarkeit stellte es bisher das Optimum dar obwohl sich aufgrund der Verl ngerung des Kondensatorrohres an der Untersei te der Acrylglaskammer Kondenswasser bildete Abb 4 6 Pfeil Flissigstickstoff Reservoir Kapazitiver Druckmesser Kunststofftrager mit O Ring Strahlungsheizung Durchf hrung Thermoelement Trockenkammer aus Acrylglas Abb 4 6 Prototyp 3 w hrend eines Gefriertrocknungsprozesses Foto M Diestelhorst Allerdings waren die Standzeiten der Anlage inakzeptabel Sowohl die thermische Belastung durch Strahlungsheizung und Kondensator als auch die mechanische Belastung durch st ndigen Wechsel von Vakuum und Atmosph rendru
138. ktion und Bradykardie auftreten 12 Ziel moderner Ophthalmika ist es die systemischen Wirkungen zu vermindern und die lokale Wirksamkeit zu optimieren Des Weiteren wird eine Senkung der Applikati onsfrequenz Vermeidung einer Sehbeeintr chtigung sowie eine Verbesserung der Applizierbarkeit angestrebt 12 Mit dem Ophthalmic Lyophilisate Carrier System OLCS einem Lyophilisat auf einem Tr ger wurde eine Arzneiform entwickelt die diesen Anspr chen an eine moderne Applikationsform zur Anwendung am Auge weitgehend gerecht wird Dies konnte bereits durch die Arbeiten von Grunthal 25 und Weichselbaum 82 belegt werden Schwierigkeiten bereitete allerdings die reproduzierbare Herstellung der Applikationsform mit den gew nschten physikalisch chemischen Eigenschaften Besonderes Augenmerk muss dabei auf die Haftfestigkeit des por sen Lyophili sattropfens auf dem flexiblen Tr gerstreifen gerichtet werden Das Lyophilisat muss einerseits so fest mit dem Tr ger verbunden sein dass es bei der Handhabung w h rend des Transportes oder bei der Anwendung nicht abf llt Andererseits darf es nicht so fest haften dass eine vollst ndige Abl sung bei der Applikation nicht mehr gew hrleistet werden kann 1 EINLEITUNG UND ZIELSETZUNG Ziel dieser Dissertation ist die Weiterf hrung der von Grunthal 1996 und Weichsel baum 2002 durchgef hrten Arbeiten wobei der Schwerpunkt auf dem Herstel lungsprozess liegt Die Chargengr e wurde v
139. kturen des trockenen Produktes helfen 2 2 5 5 2 Die Prim rtrocknung Bei der Prim rtrocknung wird die Stellfl chentemperatur so gew hlt dass die Subli mationsrate ausreichend hoch ist aber die Produkttemperatur immer noch deutlich unterhalb der eutektischen oder Kollapstemperatur liegt Da die W rmezufuhr durch die Stellflache von unten erfolgt und die Eisoberfl che durch Entzug der Sublimati onsenergie permanent gek hlt wird bildet sich ein Temperaturgradient aus Die Temperaturmessung sollte also m glichst am Gef boden dem Punkt der h chsten Eistemperatur erfolgen Liegt dort die Temperatur w hrend der Prim rtrocknung unterhalb der eutektischen oder Kollapstemperatur kann von einem vollst ndig gefrorenen Produkt ausgegangen werden Im Idealfall ist die Produkttemperatur direkt abh ngig von der Siellflachentemperatur und dem Kammerdruck Will man also eine vorgegebene Produkttemperatur beibehalten so ist es nicht m glich den Druck oder die Temperatur ohne eine kompensierende Ver nderung des jeweils anderen Parameters zu variieren Die Erfassung der Produkttemperatur w hrend der Prim rtrocknung hat zwei wichti ge Funktionen Zum einen den Nachweis dass die Produkttemperatur w hrend der gesamten Prim rtrocknung unterhalb der eutektischen oder Kollapstemperatur liegt Zum anderen die kaum weniger wichtige Funktion nachzuweisen dass f r ein bestimmtes Intervall der Produkttemperatur auch die Temperatur jeder einzelnen
140. l 2 2 5 3 3 eine Produkttemperatur von 28 C 3 C festlegen In diesem Temperaturintervall kann bei ausreichend hoher Sublimationsrate von einem vollst ndig gefrorenen Produkt ausgegangen werden Kammerdruck und Stellflachentemperatur Um bei Festlegung eines Kammerdrucks die Produkttemperatur im gew hlten Inter vall zu halten muss die Stellflachentemperatur auf einen festgelegten experimentell zu ermittelnden Wert eingestellt werden Die Wahl des Kammerdrucks ist in gewis sen Grenzen willk rlich Die Obergrenze ist durch den S ttigungsdampfdruck des Eises bei Produkttemperatur 28 C mit ca 0 5 mbar vorgegeben Prinzipiell jeder Kammerdruck unterhalb 0 5 mbar f hrt zu einer Sublimation des Eises Die Unter grenze wird unter anderem durch die Wasserdampfkapazit t des Kondensators fest gelegt Wird der Kammerdruck sehr tief gew hlt so ist eine sehr hohe Stellfl chen temperatur notwendig um die Produkttemperatur im festgelegten Intervall zu halten Beides erh ht die Sublimationsrate stark Kann der Kondensator die entstehenden Wasserdampfmengen nicht schnell genug aus der Trockenkammer entfernen so kommt es zu einem unkontrollierten Anstieg des Kammerdrucks der bei gleich bleibender Stellfl chentemperatur zu einem unkontrollierten Anstieg der Produkttemperatur f hrt Uberschreitet diese die Kollapstemperatur von 23 C so resultiert daraus unweigerlich eine Qualit tsminderung des Produktes Daneben stellt die Poren
141. l ein gasartabhangiges Warmeleitfahigkeitsmanometer Pirani R hre auf Stickstoff kalibriert als auch ein kapazitives gasartunabh ngiges Manometer verwendet so wird die Anwesenheit von Wasserdampf durch eine Diskrepanz der Messwerte zwischen beiden Ger ten detektiert Zu Beginn der Sublimationstrocknung entstehen gro e Mengen Wasserdampf und die Pirani R hre zeigt gegen ber dem kapazitiven Druckmes ser erh hte Werte an da Wasserdampf die doppelte spezifische Warmeleitfahig keit von Stickstoff hat Am Ende der Prim rtrocknung ist kaum noch Wasser dampf in der Trocknungskammer vorhanden die Messwerte n hern sich einander an So kann das Ende der Sublimationstrocknung ohne W rmef hler im Trockengut festgestellt werden 33 e Gefriertrocknungswaagen Durch die Verwendung von Mikro Waagen die mit in die Trockenkammer einge bracht werden kann zum Beispiel ein Vial w hrend des Gefriertrocknungszyklus in definierten Intervallen angehoben gewogen und der Gewichtsverlust als Funk tion der Trocknungszeit aufgenommen werden Dadurch ist eine eindeutige 36 2 THEORETISCHER TEIL Abgrenzung zwischen Sublimations und Desorptionsphase im Trocknungsverlauf moglich 39 e Druckanstiegstest barometrische Temperaturmessung BTM Trennt man die Trockenkammer wahrend der Sublimationsphase fur eine kurze Zeit mit einem Ventil vom Kondensator ab steigt der Druck in der Kammer an und zwar so lange bis der Wasserdampfpartialdruck
142. lavierklebeband zur besseren Handhabbarkeit der Tragerfolie c Hydrophiles Polymerger st welches durch Lyophilisation hergestellt wird und in das der Arzneistoff molekulardispers oder suspendiert eingebettet ist d Ein oder mehrere Wirkstoffe 3 1 1 Tr gerfolie Die hydrophobe PTFE Folie dient einerseits als Tr ger f r das wirkstoffhaltige Poly merlyophilisat andererseits erm glicht sie es das Lyophilisat sicher zum Auge zu f hren und durch Abstreifen am Unterlid in den Bindehautsack zu applizieren Die Folie darf bei diesem Vorgang keine Verletzungen hervorrufen und muss ausrei chend stabil sein um nicht mit dem Lyophilisat umzuklappen wodurch eine Applikation unm glich wird Polytetrafluorethylen PTFE Teflon ist in einem Temperaturbereich von 200 C bis 250 C einsetzbar und dadurch gut zu autoklavieren Es ist chemisch inert physio logisch unbedenklich alterungsbest ndig untoxisch nimmt keine Feuchtigkeit auf lt 0 01 und quillt weder in w ssrigen noch in organischen L sungsmitteln 60 Aufgrund der hydrophoben antiadh siven Eigenschaften resultieren gro e Kontaktwinkel mit hydrophilen Fl ssigkeiten 25 In der Pharmazie wird es zur Beschichtung von Elastomerstopfen f r Infusionsfla schen verwendet Wegen seiner physikalisch chemischen Eigenschaften und 51 3 EXPERIMENTELLER TEIL Biokompatibilitat findet es in hochreiner Form auch in der medizinischen Implantat technik Verwendung PTFE ha
143. ldosis appliziert ein Lyophilisat mit defi niertem Gehalt volumendosiert 14 Somit werden Uber und Unterdosierung ausgeschlossen Die Gleichformigkeit der Dosierung ist gegen ber handels blichen Augentropfenpr paraten deutlich verbessert 82 Bessere Bioverf gbarkeit aufgrund verl ngerter Wirkstofffreisetzung durch Gelbildung des Lyophilisates Abb 2 5 und Abb 2 7 Es konnte gezeigt werden dass die Bioverf gbarkeit von Fluorescein nach Applikation als Lyophilisat bis zu 34mal h her war als bei Applikation von Augentropfen gleicher Dosierung 16 Weniger systemische Nebenwirkungen Durch die Bildung des Gelkissens aus dem der Wirkstoff langsam kontinuierlich freigesetzt wird kommt es kaum zum Abtransport Uberschussiger Fl ssigkeit und damit des Wirkstoffs Uber den Tranen Nasen Kanal Einfache Anwendung besonders f r Brillentr ger und ltere Menschen Im Gegensatz zu konventionellen Augentropfen ist zur Applikation der OLCS das Reklinieren des Kopfes nicht notwendig Abb 2 4 14 2 THEORETISCHER TEIL Abb 2 3 Detailaufnahme Fluorescein OLCS Abb 2 4 Applikation eines Fluorescein Foto S Dinslage OLCS Foto S Dinslage Zur Applikation wird das Unterlid des Auges in das das Lyophilisat eingebracht wer den soll mit Zeige und Mittelfinger der einen Hand leicht nach unten gezogen um das Lid vom Augapfel zu l sen und den Bindehautsack zug nglich zu machen Dann wird das OLCS zwischen Daumen und Zeigefinger d
144. letzung der Hornhaut durch den Tropfer verhindert 18 2 1 2 Ophthalmic Lyophilisate Carrier System OLCS Beim Ophthalmic Lyophilisate Carrier System handelt es sich um einen gefrierge trockneten Tropfen einer Augentropfenzubereitung Lyophilisat auf einer hydropho ben Tr gerfolie Abb 2 2 und Abb 2 3 Hydrophobe Tragerfolie Handeriff Gefriergetrockneter wer Tropfen u Hydrophobe Tragerfolie Abb 2 2 Aufbau eines OLCS Aufsicht und Seitenansicht Das Lyophilisat besteht aus einer Polymermatrix in der nur der Wirkstoff ohne wei tere Hilfsstoffe in dispergierter oder suspendierter Form vorliegt Die Polymermatrix bernimmt zum einen die Aufgabe der Ger stsubstanz da der Wirkstoff allein mengenm ig nicht zur Ausbildung einer mechanisch stabilen Lyophilisatstruktur ausreicht Andererseits bildet das Polymer beim Kontakt mit der Tr nenfl ssigkeit ein Gelkissen welches zu einer verl ngerten Wirkstofffreisetzung f hren kann Zur besseren Handhabung ist die Tr gerfolie mit einem Handgriff versehen 2 THEORETISCHER TEIL Die neue Applikationsform hat diverse Vorteile gegen ber konventionellen Augentropfen Da es sich um eine wasserfreie Arzneiform handelt mussen weder pH Wert noch Osmolalitat eingestellt werden kann auf Konservierungsmittel verzichtet werden gibt es keine Stabilit tsprobleme der eingesetzten Wirkstoffe im Vergleich zu flussigen Augentropfen Es wird eine genau bemessene Einze
145. lzpunktes beginnen die Molekule in einem flussigkeitsahnlichen Film zu flieBen 83 Wird der Druck ber dieser Grenzschicht nun erniedrigt verlassen Wassermolekule die ausreichend Energie und einen geeigneten Impulsvektor besitzen diese Schicht und diffundieren in die Kammer Einmal in der Gasphase k nnen diese Wassermo lek le mit den noch vorhandenen Gasmolek len kollidieren und abgelenkt werden Im ung nstigsten Fall kehren sie zur Grenzfl che zur ck und kondensieren dort wieder Die H ufigkeit dieser Kollisionen ist abh ngig von der Anzahl Gasmolek le in der Kammer also vom Kammerdruck Je weiter zudem der Kondensator von der Sublimationsfront entfernt ist desto mehr Kollisionen finden statt und umso schwieri ger ist es f r ein Wassermolek l zum Kondensator zu diffundieren Die Sublimati onsrate ist geringer Da diese die Dauer des Trocknungsprozesses ma geblich bestimmt f hrt das zu l ngeren Prozesszeiten Generell gilt dass der Kammerdruck signifikant niedriger sein sollte als der Dampfdruck des Eises bei der Zieltemperatur des gefrorenen Produktes Bei einer festgelegten Produkttemperatur f hrt jeder Kammerdruck gr er als 0 mbar zu einer Verringerung der treibenden Kraft f r die Sublimation und somit zu einer Verl ngerung der Prim rtrocknungsphase 57 Um die Wasserdampfdiffusion zum Kondensator zu erleichtern sollte die Vakuum pumpe den Kammerdruck w hrend der Prim r und Sekund rtrocknung auf einen kl
146. mationsprozess verbraucht Eine weitere Erh hung der Stellfl chentemperatur resultiert in einer Zunahme der Produkttemperatur und somit in einem h heren S ttigungsdampfdruck der Formulie rung Nail beschreibt dass jede Steigerung der Eistemperatur um 50 C ungef hr zu einem 75 igen Anstieg des Sattigungsdampfdrucks f hrt 52 Bei gleich bleibendem Kammerdruck bedeutet dies eine gr ere Sublimationsrate 17 57 Damit verk rzt sich auch die Prozesszeit Pikal zeigte dass eine Erh hung der Produkttemperatur um nur 1 C die Prim rtrocknungsphase um 13 verk rzt 56 eine Erh hung der Produkttemperatur um 5 C kann die Trocknung sogar um den Faktor 2 verk rzen 34 58 Ein Ziel der Prozessentwicklung wird also sein die Stellfl chentemperatur so einzustellen dass die Temperatur am Boden des Produktes immer m glichst Knapp aber trotzdem sicher unterhalb der eutektischen oder Kollapstemperatur liegt 57 68 Normalerweise betr gt die Sicherheitsspanne zwischen 2 und 5 C 57 Kann der Kondensator die dann anfallende gr ere Wasserdampfmenge allerdings nicht mehr schnell genug entfernen so f hrt die Erh hung des S ttigungsdampf drucks der Formulierung zu einer Erh hung des Wasserdampfpartialdrucks in der Kammer Damit wird die Druckdifferenz kleiner und die Sublimationsrate sinkt Die Prozesszeit verl ngert sich Es gibt somit eine optimale m glichst hohe Stellfl chentemperatur bei der das gefro rene Produkt nicht sc
147. mit h heren Evakuiergeschwindigkeiten ein nahezu linearer Kurvenverlauf zeigt Abb 4 66 linke Kurve E Abb 4 68 Langsames Einfrieren Abb 4 69 Schnellere Evakuiergeschwindig 1 65 mbarL s f hrt zur Bildung einer spitzen keiten wie hier 13 4 mbarL s erzeugen eine Oberfl chenstruktur halbkugelf rmige Oberfl che 152 Kraft g 4 ERGEBNISSE UND DISKUSSION Eine zusatzliche Fehlerquelle stellt zu Beginn der Messung die PTFE Folie dar Sie ist zum Teil leicht gew lbt und kann nicht immer vollst ndig plan auf den Aluminium block gelegt werden Um diese Fehlerquellen auszuschalten und eine wahre Aussage ber die innere Strukturfestigkeit der Lyophilisate zu bekommen wird der w hrend des ersten viertel Millimeters aufgezeichnete Teil der Druckprofile nicht mit zur Berechnung herange zogen Bei einem Polymergehalt von 125 ug sind die Lyophilisate so weich dass sie bereits lange vor Erreichen der 20 Gramm Grenze vgl Methode Kapitel 3 2 5 komplett zusammengedr ckt sind erkennbar an dem pl tzlich einsetzenden starken Anstieg der Druckwerte nach dem linearen Teil Abb 4 67 Auch dieser Kurventeil w rde das Ergebnis verf lschen Deshalb werden auch die Werte gt 1 mm nicht bei der Berechnung ber cksichtigt F r die so erhaltenen Kurvenst cke wird nun durch Anlegen einer Geraden an jedes einzelne Kurvenst ck und Berechnung der Geradengleichung die Steigung als Ma fur die Druckfestigkeit ermittelt Dies ist i
148. mperaturen von etwa 20 C und Unterdruck 1905 berichteten Benedict und Manning von der Trocknung organischen Materials bei reduziertem Druck erzeugt durch eine chemische Pumpe 29 Diese Art der Trocknung war allerdings sehr uneffizient denn es dauerte etwa zwei Wochen um den Restfeuchtegehalt einer Gelatinezubereitung auf 20 zu reduzie ren Um 1909 f hrte Shackell Trocknungsversuche mit einem Versuchsaufbau hn lich dem von Benedict und Manning durch Allerdings benutzte er bereits eine me chanische Vakuumpumpe 29 Interessant ist dass die von Shackell beschriebene Trocknungsanlage bereits aus den gleichen Hauptkomponenten aufgebaut war wie sie heute noch in modernen Gefriertrocknungsanlagen verwendet werden Dies sind eine Trocknungskammer eine Kondensatorkammer und ein Vakuumsystem 1929 zeigten Sawyer Lloyd und Kitchen dass sich Gelbfieberviren erfolgreich gefriertrocknen lassen 54 1932 konstruierte Gersh mit Hilfe der von Gaede erfun denen Diffusionspumpe schlie lich eine erste leistungsf hige Vakuumanlage zum Gefriertrocknen von histologischen Pr paraten 54 Der erste Hinweis auf die Gefriertrocknung in der Patentliteratur geht auf den franz sischen Erfinder Tival aus dem Jahre 1927 zur ck 79 Dieses Patent geht allerdings bez glich der Methodik nicht ins Detail Eine ausf hrliche Beschreibung der Vakuum trocknung eines gefrorenen Gutes beinhaltet das Patent von Elser 1934 Er benutz te eine K hlfall
149. mulation Model for the Primary Drying Phase of the Freeze Drying Cycle International Journal of Pharmaceutics 1995 114 159 170 Snowman JW Lyophilization under Barrier Technology in Groves Mu Murty R Aseptic Pharmaceutical Manufacturing II Applications for the 1990s Buffalo Grove IL USA Interpharm Press Inc 1995 Steinfeld PA Maier S S verkr p R Diestelhorst M Comparative Bioavail ability Study of Identical Doses of Fluorescein From A New Delivery System Abstract and Poster ARVO Meeting Fort Lauderdale Florida USA Mai 2002 Steward P Liquid Nitrogen Why is Progress Slow Economic and Envi ronmental Factors Pharmaceutical Technology Europe M rz 1997 15 22 Strasser G Steinkogler FJ Thaler A Der Augenspiegel Erste Erfahrun gen mit einer Applikationshilfe f r Augentropfen Firmeninformation Chibret Pharmazeutische GmbH M nchen 1985 Stricker H Physikalische Pharmazie 3 Auflage Stuttgart Wissenschaftli che Verlagsgesellschaft mbH 1987 192 77 78 79 80 82 83 84 Surborg KH Junkersdorf A Der Karl Fischer Ofen in der Arzneistoffanaly tik Krankenhauspharmazie 2001 22 Jahrgang 6 271 273 Trappler E Lyophilization in Groves MJ Murty R Aseptic Pharmaceutical Manufacturing II Applications for the 1990s Buffalo Grove IL USA Interpharm Press Inc 1995 USP 24 The United States Pharmacopoeia 24 Edition Official Mono graphs 731
150. n Lyophilisat eine Dreifachdosis Fluorescein Natrium applizierbar ist Gegen ber einer dreimaligen Augentropfenapplikation zeigt das OLCS eine signifikant bessere Bioverf gbarkeit bis zu elfmal h here Konzentrationen in der Cornea bei gleicher Arzneistoffdosis 38 In Studie 2 sollte die einmalige Gabe der handels blichen Augentropfen Fluorescein SE 0 17 Alcon mit der neuen Darreichungsform im Hinblick auf Applizierbarkeit und Bioverf gbarkeit verglichen werden Dabei wurde die gleiche Wirkstoffdosis von 68 ug zum gleichen Zeitpunkt einmalig in das Auge eingebracht 72 Die OLCS Klinikmuster mit 250 ug HPMC E50 und 68 ug Fluorescein Natrium wurden mit dem Prototyp 4 des Mini Gefriertrockners hergestellt Weil sich die Lyophilisate der ersten Studie gut von der PTFE Folie abl sen lie en sollten f r die Herstellung dieser OLCS Klinikmuster zum Einfrieren hnliche Bedingungen ange wendet werden Da Versuche mit dem Prototyp 4 gezeigt hatten dass sich bei iden tischen Versuchsbedingungen die Haftfestigkeiten gegen ber Prototyp 3 erh hen vgl Kapitel 4 4 1 4 wurde jetzt eine leicht reduzierte Evakuiergeschwindigkeit von 11 6 mbarL s eingestellt Es ergab sich f r diese Lyophilisate in vitro eine Haftfestig keit von 12 7 g St Abw 2 2 g n 10 gut vergleichbar mit den Werten der ersten Studie Im Laufe der Studie 2 mit 20 Probanden zeigte sich dass 45 5 20 von 44 der Lyophilisate schlecht zu applizieren waren Sie vers
151. n chst da ja bisher davon ausgegangen wurde dass ein besseres Vakuum den Trocknungsprozess beschleunigt Es berwiegt hier jedoch f r den Ge samtprozess dass die Warmezufuhr zum Produkt durch Konvektion bei derart nied rigen Drucken vernachlassigbar klein wird 66 Immer weniger Gasmolekule stehen fur den konvektiven Warmetransport zu Verfugung Im Bereich von 0 01 mbar kommt dieser sogar zum Erliegen 66 Bei diesem Druck erfolgt W rme bertragung haupt s chlich durch W rmestrahlung Diese ist bei den g ngigen Stellplattentemperaturen allerdings so minimal dass sie einen geringen Effekt hat 30 2 THEORETISCHER TEIL Brulls und Rasmuson beschreiben in einem theoretischen Modell f r die Gefriertrocknung in Vials unter anderem den Einfluss der W rmestrahlung bei verschiedenen Kammerdr cken und zeigen den Einfluss des Drucks auf den gesam ten W rme bertragungskoeffizienten 4 Sie zeigen dass der relative Einfluss der W rmestrahlung mit steigendem Kammerdruck logarithmisch abnimmt w hrend der W rme bertragungskoeffizient des Gesamtsystems proportional mit dem Kammer druck ansteigt In diesem Modell dominiert W rmestrahlung bei sehr niedrigem Druck 0 05 mbar Konvektion dagegen ab etwa 0 16 mbar aufw rts Nail untersuchte die Trocknungsrate in Abh ngigkeit vom Kammerdruck bei Glasvials in einem Metallcontainer auf einer beheizbaren Stellfl che Er gibt an dass die Behinderung des W rmetransportes durch die Gaspolst
152. n in diesem Bereich nahezu parallel Abb 4 53 Da bei reduziertem Wirkstoffgehalt weniger Material als Strukturbildner zu Verf gung steht wird das Ger st filigraner die Haftfestigkeit geringer 136 4 ERGEBNISSE UND DISKUSSION Beim schellen Einfrieren durch Anlegen eines Vakuums mit 33 5 mbarL s Methode 3 ndern sich die Kurvenverl ufe allerdings deutlich zueinander Im Gegensatz zu dem starken Anstieg der Haftfestigkeit bei Lyophilisaten mit 204 ug Fluorescein Natrium kommt es im Fall der niedrigen Konzentration zu keinem weiteren Anstieg der Haftkraft Selbst bei einer weiteren Erh hung der Evakuiergeschwindigkeit auf 60 8 mbarL s Methode 4 Ventilstellung 650 ndert sich die Haftfestigkeit nicht mehr Diese Methode f hrte jedoch w hrend des Einfriervorgangs bei etwa 50 der Proben zu einem Sch umen Frothing durch gel ste Gase die sich beim Evakuie ren ausdehnen wodurch die Proben beim Durchfriervorgang zerst rt wurden Beim Einfrieren mit 33 5 mbarL s Evakuiergeschwindigkeit wird durch die Aufkonzentrierung der h heren Wirkstoffmenge am Lyophilisatboden bei 204 ug Fluorescein Natrium OLCS die Haftkraft stark erh ht Eine Wirkstoffkonzen trierung bei einfach dosierten OLCS 67 weniger Fluorescein Natrium durch schnelles gerichtetes Einfrieren an der Kontaktfl che mit dem PTFE reicht nicht aus die Haftfestigkeit messbar zu erh hen 4 4 1 3 Einfluss des Polymergehaltes auf die Haftfestigkeit Im vorigen
153. n Abb 4 70 an 3 Kurven beispielhaft demonstriert Somit ergibt sich als Einheit der Druckfestigkeit g mm 0 25 0 5 Weg mm 0 75 1 0 Abb 4 70 Durch Anlegen einer Geraden und Berechnung der Geradengleichung wird die Stei gung der Kurvenst cke ermittelt 153 4 ERGEBNISSE UND DISKUSSION Fur jeweils n 5 Druckprofile von einfach dosierten Lyophilisaten mit 3 verschiedenen Polymerkonzentrationen 125 ug 250 ug und 375 ug HPMC E50 hergestellt nach je 4 unterschiedlichen Einfriermethoden Evakuiergeschwindigkeiten von 1 65 mbarL s 10 mbarL s 13 5 mbarL s und 33 5 mbarL s werden auf diese Weise die Druckfestigkeitswerte berechnet Die Ergebnisse sind nachfolgend sowohl tabellarisch Tabelle 17 als auch graphisch in einem Diagramm Abb 4 71 zusammengestellt Evakuier Polymergehalt im Mittelwert der St Abw der geschwindigkeit OLCS Druckfestigkeit Druckfestigkeit mbarL s ug g mm g mm Tabelle 16 Druckfestigkeitswerte in Abh ngigkeit von Polymergehalt und Evakuiergeschwin digkeit statistische Auswertung jeweils n 5 154 4 ERGEBNISSE UND DISKUSSION Lyophilisate aus 68 ug Fluorescein Natrium und 70 4 375 ug HPMC 65 250 ug HPMC u 125 ug HPMC Druckfestigkeit g mm 0 5 10 15 20 25 30 35 Evakuiergeschwindigkeit mbarL s Abb 4 71 Abh ngigkeit der Druckfestigkeit von Polymergehalt und Evakuiergeschwindigkeit der jeweiligen Einfriermethode jeweils n 5 ein Fehlerbalken ent
154. nauigkeit der verwendeten Pipette wurde berpr ft und untersucht ob die Dichteunterschiede der verschieden konzentrierten HPMC L sungen Einfluss auf die Dosierung haben Ger te e Dosierpipette Eppendorf Multipette plus Eppendorf Nethler Hinz GmbH Hamburg versehen mit Combitip Biopur 2 5 mL Sollwerteinstellung 25 uL Eppendorf Nethler Hinz GmbH Hamburg e Analysenwaage Mettler Toledo AG 204 Durchfuhrung Die Dosierpipette wurde auf ein Einzeldosisvolumen von 25 uL eingestellt und mit der entsprechenden Polymerlosung durchgespult Dann wurde erneut die Polymerlo sung aufgezogen und jeweils 30mal die Masse eines Einzeltropfens auf der Analysenwaage bestimmt Der Versuch wurde zweimal durchgef hrt 3 2 3 Charakterisierung der Lyophilisate mittels Rasterelektronenmikroskopie REM Vorbereitung der Lyophilisate Zur Anfertigung der Vertikalschnitte wurden die entsprechenden Lyophilisate in eine mit fl ssigem Stickstoff gef llte Petrischale berf hrt Nach kurzer Durchfrierzeit von 1 bis 2 Minuten wurden die Proben mit einer neuen Rasierklinge im fl ssigen Stick stoff m glichst halbiert Danach wurden die H lften umgehend mit einer Pinzette aus dem K ltebad entnommen in eine Kunststoffr hre berf hrt und luftdicht verschlos sen um sie vor kondensierender Luftfeuchtigkeit zu sch tzen Zur Untersuchung der Bodenstruktur der Lyophilisate wurden diese vorsichtig durch Dehnung der PTFE Folie von dieser abgel s
155. nem Verletzungsri siko und mikrobieller Verunreinigung der Augentropfflasche samt L sung einhergeht lige Augentropfen oder solche mit erh hter Viskosit t werden h ufig versehentlich beim Lidschlussreflex mit den Wimpern am Flaschenauslass abgestreift und gelan gen ebenfalls nicht an den Wirkort Zudem wird dabei die ffnung des Tropfers mikrobiologisch kontaminiert und die Haltbarkeit der L sung gegebenenfalls herabgesetzt Unerw nscht ist auch der Abfluss der Augentropfen ber den Tr nen Nasen Kanal zur Nasenschleimhaut Dieses sehr gut durchblutete Organ stellt eine gute Resorpti onsfl che dar Somit m ssen systemische Nebenwirkungen erwartet werden die aufgrund einer Umgehung des First Pass Effektes verst rkt auftreten k nnen Dies kann durch ein kurzzeitiges Abdr cken des Kanals mit dem Zeigefinger direkt nach der Applikation zwar weitgehend vermindert werden jedoch ist diese Methode nur wenigen Patienten bekannt 2 THEORETISCHER TEIL Appliziert werden mit einem Augentropfen zwischen 20 und 50 uL Flussigkeit je nach Fertigarzneimittel Das Volumen der sich kontinuierlich erneuernden Tranen flussigkeit betr gt beim Erwachsenen allerdings nur 7 bis 10 uL pro Auge 32 Daher flie en bis zu 80 der applizierten Wirkstoffmenge mit dem n chsten Lidschluss ber die Wange oder den nasolakrimalen Kanal ab 15 Die Arzneistoffmenge die das Kammerwasser erreicht ist sehr gering und macht h chstens einige Prozente der appl
156. nenswert beeintr chtigt wird Die Adh sion des Lyophilisates zur PTFE Folie scheint in diesen F llen st rker zu sein als die innere Koh sion des Lyophilisatgerustes 4 4 1 1 Einfluss der Einfriermethode auf die Haftfestigkeit In der Literatur wird h ufig beschrieben dass der mittlere Porendurchmesser eines Lyophilisates ma geblich von der Einfriergeschwindigkeit abh ngig ist Abb 4 29 66 Wie in Kapitel 4 3 2 gezeigt wurde friert eine Probe beim zus tzlichen Anlegen eines Vakuums schneller durch als unter Atmosph rendruck die Kristallisation erfolgt entsprechend schneller Die Eiskristalle haben somit weniger Zeit zu wachsen und sollten im Durchschnitt kleiner bleiben Dies f hrt nach dem Gefriertrocknen zu kleineren Poren Daher wurde ein Einfluss der Evakuiergeschwindigkeit auf die Haftfestigkeiten der Lyophilisate auf der PTFE Folie erwartet Mittlerer Porendurchmesser 0 5 10 15 20 25 Einfriergeschwindigkeit PK min Abb 4 29 Abh ngigkeit der mittleren Porendurchmesser gefriergetrockneter Dextrinl sungen von der Einfriergeschwindigkeit 66 123 4 ERGEBNISSE UND DISKUSSION In diesem Versuch wurde der Einfluss der Evakuiergeschwindigkeit also unter schiedlicher Einfrierbedingungen auf die Haftfestigkeit untersucht Es wurden Lyophilisate aus einer L sung von 1 HPMC E50 und 0 816 Fluorescein Natrium dreifache Dosierung 204 ug pro OLCS nach drei verschiedenen Einfriermethoden jeweils n 10 herg
157. nergie nachzuliefern Au erdem kann hier das Produkt direkt eingefroren werden wenn eine Kaltemaschine im Anlagendesign integriert ist 2 2 5 3 Funktionsweise der Komponenten und deren Aufgabe bei Prim r und Sekund rtrocknung 2 2 5 3 1 Das Vakuumsystem Nach dem Phasendiagramm des Wassers Abb 2 11 findet Sublimation erst unter halb des Tripelpunktes statt d h unterhalb eines Druckes von 6 13 mbar und unterhalb 0 0098 C Erst darunter ist der Phasen bergang von fest zu gasf rmig m glich Zu beachten ist allerdings dass der Wert 6 13 mbar den reinen Wasserdampfdruck ber Eis und nicht den Gesamtdruck Absolutdruck darstellt 71 Deshalb ist Gefriertrocknung auch bei Atmosph rendruck m glich 79 Als Voraussetzung daf r muss die Luft jedoch sehr trocken sein um einen Wasserdampfpartialdruck kleiner 6 13 mbar zu erreichen Eine Verringerung des Gesamtdruckes hat somit keinen direkten Einfluss auf die Sublimation tr gt aber deutlich zur Beschleunigung des Prozesses bei wie im Folgenden erl utert werden soll 22 2 THEORETISCHER TEIL mbar AT Dia e miele Einfrieren Ap fest fl ssig pm L sung Eis D Wasser g I 20 E 6 l oO 6 13 TUCK TT TTP I i i C N a i gas E a Wasserdampf u i i I i i I l d i 0 0098 100 Temperatur C AT Gefrierpunktserniedrigung Ap Dampfdruckerniedrigung AT Siedepunktserh hung AT Tripel
158. ng Das Konditioniergef wird auf den Ofen gefahren und der Lift auf die Sp lposition gesenkt Dabei wird das Septum des Konditioniergef es von der Einstichnadel durchsto en Nun wird der Gasfluss eingeschaltet um das ganze Schlauchsystem zu sp len und reproduzierbare konstante Verh ltnisse zu schaffen Die Messzelle wird nun mit dem Coulometer solange konditioniert bis das Reaktionsmedium gen gend trocken ist Nach Ausschalten des Gasflusses wird jeweils eine Blindprobe von n 3 in den Ofen gefahren der Gasfluss wiederum eingeschaltet und eine Blindwertbestimmung gestartet um die Umgebungseinfl sse w hrend der Heizperiode zu ermitteln Der Blindwert beinhaltet Feuch tigkeit die dem Probengef anhaftet sowie eine latent vorhandene systemdrift deren Ursache in einer minimalen Restfeuchtigkeit des Tr gergases und eventuellen Undichtigkeiten im Schlauchsystem zu suchen ist Nach erfolgter Blindwertbestimmung wird das Reaktionsmedium wieder Konditioniert 74 3 EXPERIMENTELLER TEIL Probenbestimmung e Wenn das Reaktionsmedium fertig konditioniert ist wird der Gasfluss unterbrochen eine Probe auf den Ofen gefahren und mit Hilfe der Einstichnadel in den Ofenblock eingef hrt e Der Gasfluss wird wieder eingeschaltet und die Probenbestimmung am Coulometer gestartet Die Extraktionszeit von 600 s gew hrleistet eine minimale Bestimmungs und damit auch Heizdauer e Die im Ofenblock erhitzte Probe gibt dabei ihr
159. o duktoberfl che und chemische Interaktionen zwischen der Formulierung und dem Wasserdampf das Restfeuchtegleichgewicht Der Restfeuchtegehalt eines Lyophilisates kann reduziert werden durch e eine Erh hung der Produkttemperatur ber die Stellflachentemperatur bei konstantem Partialdruck des Wasserdampfes in der Kammer oder e eine Reduktion des Partialdruckes des Wasserdampfes ber der Lyophili satoberflache bei konstanter Produkttemperatur durch eine entsprechend niedrigere Kondensatortemperatur Die Trocknungsrate bei der Sekund rtrocknung steigt deutlich mit einer Erh hung der Produkttemperatur Obwohl hohe Temperaturen w hrend der Sekund rtrock nung normalerweise vermieden werden um einen Abbau oder Aktivit tsverlust des Produktes w hrend des Prozesses zu minimieren f hrt die Einstellung einer hohen Stellflachentemperatur um einen gew nschten Restfeuchtegehalt zu erreichen nicht zwingend zu einer st rkeren Zersetzung als die Verwendung einer niedrigen Tempe ratur welche in einer deutlich l ngeren thermischen Belastung resultiert 57 Die Restfeuchte ist soweit zu erniedrigen dass das Wachstum von Mikroorganismen und chemische Reaktionen vollst ndig unterbunden werden Der Endpunkt der Sekund rtrocknung das hei t das Ende des Gefriertrocknungs zyklus wird beispielsweise dadurch bestimmt dass die Produkttemperatur sich f r ein bestimmtes Zeitintervall an die Stellflachentemperatur annahert 34 2 THEO
160. oberfl che aufgestreut 3 Die agglomeratfreie Suspension wird nun 2 Stunden kalt ger hrt bis eine klare L sung entstanden ist Verdunstetes Wasser wird erg nzt 4 Die abgewogene Menge Fluorescein Natrium wird zugesetzt und umger hrt 5 Die hergestellte L sung wird unter der Laminar Airflow Werkbank in ein steri les Weithalsglas sterilfiltriert Dazu wird ein Membranfilter der Porenweite 0 22 um verwendet 6 Das Gef wird mit einem Schraubdeckel dicht verschlossen und etikettiert 7 Der Bubble Point Test zur berpr fung der Integrit t des Filters wird durchge f hrt 3 2 1 2 Herstellung der Applikatoren Bei der Herstellung der Applikatoren wurden desinfizierte Vinyl Einmalhandschuhe getragen Vorversuche zeigten dass nach Ber hrung der PTFE Folie mit der Finger Kuppe ein aufgebrachter Wassertropfen deutlich st rker spreitete als bei unber hrter Folie Auch Weichselbaum beobachtete dass Ablagerungen auf der Oberfl che den Kontaktwinkel der L sung auf dem Tr ger ver ndern k nnen was sp ter zu Haftproblemen auf der Folie f hren kann 82 Zuerst wurden aus den DIN A4 gro en B gen PTFE Folie Streifen von 15 mm L nge und 10 mm Breite geschnitten Diese Streifen wurden dann auf 2 3 mm L nge mit der schmalen Seite auf die selbstklebende Seite eines 40 mm langen Streifens Auto klavierband Breite 12 mm geklebt Dann wurde ein zweiter Streifen gleicher Gr e wiederum mit der selbstklebenden Seite dar ber geklebt
161. ockner im Vergleich zu den 6 Stunden bei Rahm 61 C 60 40 Einfrieren Haupttrocknung Nachtrocknung j Erstarren eutektische Temperatur Temperatur ud BB o 60 don 0 6 12 18 24h Zeit Abb 4 15 Verlauf der Produkttemperatur bei der Gefriertrocknung nach Rahm 61 4 3 2 Entwicklung verschiedener Einfriermethoden Im Folgenden sollte untersucht werden ob sich unterschiedliche Einfrierbedingungen durch gezielte Ver nderung der Prozessparameter einstellen lassen Durch die Kombination von normalem Einfrieren aufgrund von W rmeentzug durch das von der Kondensatorfl che gek hlte Gas in der Trockenkammer und vakuumin duziertem Einfrieren vgl Kapitel 2 4 mit verschiedenen diskreten Evakuierge schwindigkeiten wurden unterschiedliche Einfriermethoden entwickelt Dabei ist die langsamste Einfriergeschwindigkeit durch die Geometrie und Anordnung des Kondensators vorbestimmt Die durch Kontakt mit dem Fl ssigstick stoff Reservoir gek hlte Kondensatorfl che entzieht dem Gas in der Trockenkammer 105 4 ERGEBNISSE UND DISKUSSION kontinuierlich Warmeenergie und k hlt dadurch indirekt die Probe bis es schlie lich unter Atmosph rendruck zur Kristallisation kommt Durch zus tzliches Evakuieren der Trockenkammer von Beginn an mit unterschied lichen Geschwindigkeiten lie en sich verschiedene schnellere Durchfriergeschwin digkeiten erreichen 41 Die Evakuiergeschwindigkeit
162. on maximal 5 Lyophilisaten pro Herstellungsprozess bei Grunthal durch Weichselbaum auf bis zu 40 Tr gerstreifen erh ht Unregelm ige und ungen gend kontrollierte Einfrierbedingungen sowie unterschiedliche Gefrier trocknungsbedingungen innerhalb einer Versuchsreihe resultierten jedoch in einer verh ltnism ig breiten Streuung der Haftfestigkeitswerte der Lyophilisate In klini schen Studien konnten diese Lyophilisate nur unvollst ndig appliziert werden und zeigten dadurch gegen ber gleich dosierten konventionellen Augentropfen eine schlechtere bzw keine deutlich verbesserte Bioverf gbarkeit Daher wurde im Zuge der vorliegenden Arbeit entgegen dem Trend zu immer gr e ren Ger ten mit inhomogenen Bedingungen im Trockenraum ein Mini Gefriertrockner entwickelt in dem nur ein einzelner Lyophilisattr ger unter genauer definierten Bedingungen eingefroren und getrocknet werden konnte Um mit diesem Mini Gefriertrockner eine ausreichende Menge Lyophilisate in akzep tabler Zeit fertigen zu k nnen wurden das Design und die Einfriermethodik angepasst und die Prozesszeit wesentlich verk rzt Die Temperatur im Produkt sowie die Bedingungen in der Trockenkammer wurden sowohl beim Einfrieren als auch bei der Trocknung kontinuierlich erfasst Die Daten wurden aufgezeichnet und graphisch dargestellt Im Mini Gefriertrockner k nnen die Prozessbedingungen exakt eingestellt und kontrolliert werden Dadurch war es m g lich definierte Einfrierm
163. punkt Dampfdruck ber Eis C 0 mbar 6 11 Abb 2 11 Zustandsdiagramm des Wassers und einer wassrigen Losung sowie Prozess schritte bei der Gefriertrocknung nicht maBstablich 66 23 2 THEORETISCHER TEIL Die Grenzfl che Eis Gas bildet eine ungeordnete Oberflachenschicht die auch als Ubergangsregion bezeichnet wird Abb 2 12 Gas Water Molecule Molecule Gas ice interface Abb 2 12 Schematische Darstellung der ungeordneten Oberflachenschicht Quelle 29 Dabei handelt es sich um ein System von Wassermolek len ohne definierte Struktur hnlich dem fl ssigen Zustand Diese Schicht ist nur wenige Molek le dick Bei die sem Film handelt es sich um einen nat rlichen Zustand von festem Eis gebildet durch einen Prozess der als Oberfl chenschmelzen bezeichnet wird Er birgt einige strukturelle Eigenschaften des Eises unterhalb der Schicht hat aber die Mobilit t einer Fl ssigkeit 83 Nahert man sich vom Kristallinneren der Oberfl che wird das Molek lger st unge ordnet da die u ersten Wassermolek le in die unstrukturierte Umgebung der Gas phase hineinreichen Diese Oberfl chenmolek le erfahren die geringsten chemi schen Bindungskr fte im Kristallger st Daher bewegen sie sich st rker als die eingebundenen Molek le im Eisinneren wenn sich die Temperatur erh ht Bei einer ausreichend hohen Temperatur jedoch immer noch unterhalb des normalen 24 2 THEORETISCHER TEIL schme
164. r bzw Gefriertrock nungsbedingungen zur ckgehen Tabelle 9 fasst noch einmal die wichtigsten Werte der Plateauphasendauer zusammen Methode 1 Methode 2 Methode 3 Ventilstellung O Ventilstellung 530 Ventilstellung 600 095 O25 0 67 ex ning ooa ar 367 ar 217 Mittelwert min 1 04 0 019 StAbw min 0 06 004 002 Rel St Abw 11 47 Tabelle 9 Statistischer Vergleich der Lange der Plateauphasen der Methoden 1 bis 3 Da die Lange der Plateauphase als der entscheidende Faktor der verschiedenen Einfriermethoden bezuglich der Haftfestigkeit angesehen wird soll anhand einer sta tistischen Auswertung berpr ft werden ob sich die 3 Methoden jeweils signifikant unterscheiden Der Test nach Levene auf Varianzhomogenitat ergibt dass sich die Varianzen der drei untersuchten Datengruppen signifikant unterscheiden p 0 003 Daher wird zur Pr fung auf einen statistisch signifikanten Unterschied der Einfrierbedingungen der Kruskal Wallis Test durchgef hrt Dieser zeigt dass sich die Mittelwerte der drei Methoden auf dem Signifikanzniveau a 0 05 h chst signifikant unterscheiden mit H 20 696 gt x 2 0 05 5 99 p lt 0 001 Der post hoc durchgef hrte Games Howell Test bei nicht gegebener Varianzhomo genit t indiziert ergibt zwischen jeder der drei Einfrierbedingungen einen h chst signifikanten Unterschied p lt 0 001 Somit sind Voraussetzungen gegeben die einen Einfluss der Einfrierme
165. r nderung des zu trocknenden Gutes e Minimale Aktivit tsverluste bei biologischem Material e Schonende Trocknung von empfindlichen thermolabilen Stoffen e Verl ngerung der Haltbarkeit e Die por se Struktur erm glicht schnelle und vollst ndige Rehydratation e Genaue saubere Dosierung im Endbehaltnis e Sterile Herstellung ist m glich Daf r m ssen aber auch einige Nachteile in Kauf genommen werden e Hohe Kapitalkosten durch einen gro en apparativen Aufwand 59 e Lange Prozesszeit bis zu mehreren Tagen 59 e Hoher Energieeinsatz zum Beispiel zur Aufrechterhaltung des Vakuums oder zur K hlung der Kondensatorflachen w hrend des gesamten Prozesses e Feuchtigkeitsempfindliche Produkte e Die gro e hochpor se Oberfl che der Lyophilisate beg nstigt Oxidations prozesse und Verklumpung durch Feuchtigkeit 2 THEORETISCHER TEIL 2 2 4 Einsatzgebiete der Gefriertrocknung Lyophilisiert werden zum Beispiel e Materialien f r Blut Samen und Gewebebanken wie Blutplasma Plas mafraktionen Haut Hornhaut Ei und Samenzellen Bakterienst mme 50 e Chemische Verbindungen In vitro und In vivo Diagnostika 50 e Biotechnologische Produkte vor allem auf Proteinbasis 57 e Arzneiformen wie parenterale Pulver in Trockenampullen oder Fl schchen Dazu z hlen Eiwei und Hormonpr parate zum Beispiel Polyestradi olphosphat zur intramuskul ren Injektion Lyophilisat und L sungsmittel oder auch Lebendimpfsto
166. r diente die in Abb 3 9 dargestellte Konstruktion AAGE MIT PECHANEC ANSCHLUSS 084 Abb 3 9 Technische Zeichnung der Apparatur zur Bestimmung der Haftfestigkeit Das Foto zeigt detailliert die eigentliche Abrei vorrichtung Technische Zeichnung Entwurf und Herstellung B Neff Ger te Feinwaage Sartorius L 2200S d 0 01 g Sartorius GmbH G ttingen Serielle Schnittstelle Baud rate 1200 Parity bit Odd Einstellung Datenausgabe auf Printbefehl ohne Stillstand dynamische Messung m glich PC fordert den momentanen Messwert an 66 3 EXPERIMENTELLER TEIL PC Notebook MBC 17NB Sanyo Electric Co Ltd Japan Serielle Schnittstelle RS 232 Datenerfassung Programm zur Erfassung von W ge daten im Sekundentakt Ausgabeformat ASCII Datei dat Bei der verwendeten Konstruktion handelt es sich um ein Holzgestell auf dem die elektronische Feinwaage steht deren Werte sich ber den PC kontinuierlich auf zeichnen lassen In die Untertisch Ose der Waage wird das zum Haken gebogene Ende einer Metallstange Durchmesser 1 mm eingeh ngt an deren anderem Ende eine kleine Klammer angebracht ist In diese Klammer wird der Handgriff des Appli kators eingespannt so dass der PTFE Streifen mit dem Lyophilisat senkrecht nach unten h ngt Der PTFE Streifen Dicke 100 um wird nun oberhalb des Lyophili sattropfens vorsichtig zwischen einem 200 um gro en Spalt der Abrei vorrichtung auf einem Aluminiumblock gef delt Di
167. r und resultierende Form der Auflageflache 144 4 ERGEBNISSE UND DISKUSSION Abb 4 61 Muster der Substanzreste auf der Abb 4 62 Das Lyophilisat hat nur in PTFE Folie nach dem Abrei en des Lyophili der Mitte und am Rand Kontakt zu sates der Folie gehabt somit lasst sich auch erklaren warum die Haftfestigkeit trotz einer Erhohung der Evakulergeschwindigkeit abnehmen kann Dies zeigt sich bei der Versuchsreihe mit 125 ug HPMC E50 vgl Tabelle 13 und Abb 4 54 4 4 1 4 Sonstige Erkenntnisse zur Haftfestigkeit Veranderung des Anlagendesigns Wahrend der Arbeiten mit dem Mini Gefriertrockner wurde das Anlagendesign immer wieder geringfugig verandert um sowohl die Herstellungsbedingungen als auch die Handhabung im taglichen Betrieb zu optimieren vgl Kapitel 2 Im folgenden Versuch wird untersucht welche Auswirkungen eine solche Veranderung auf die Produkteigenschaften haben kann Der Unterschied von Prototyp 3 zu Prototyp 4 liegt darin dass jetzt nicht mehr die gesamte Kondensatorflache Messingrohr von 25 cm Lange und 25 mm Durchmes ser in Kontakt mit dem K hlmedium steht sondern es wird ein etwa 15 cm langes Messinghalbrohr durch W rmeentzug gek hlt Dieses Halbrohr steht ber einem auf der Oberseite ge ffneten hohlen Kupferzylinder von etwa 1 5 cm Durchmesser in direktem Kontakt mit dem Fl ssigstickstoff vgl Abb 4 7 Zudem wird die anf llige Trockenkammer aus Acrylglas ersetzt durch eine Messingkammer 14
168. rfl che und wachsen ins Tropfeninnere darunter Ab einer bestimmten Evakuiergeschwindigkeit kommt es demnach zu einer Umkehr der Einfrierrichtung Diese Richtungsumkehr des Eiskristallwachstums hat entschei denden Einfluss auf die Eigenschaften der sp teren Lyophilisate Das Intervall der Evakuiergeschwindigkeit in dem diese Umkehr vermutet wird liegt f r den Mini Gefriertrockner zwischen 13 4 mbarL s und 33 5 mbarL s Daf r sprechen 171 4 ERGEBNISSE UND DISKUSSION verschiedene Beobachtungen deren gemeinsame Interpretation diesen Schluss zulassen Bodenstruktur Beim Einfrieren unter Atmospharendruck und beim langsamen Evakuieren mit 13 4 mbarL s ergibt sich eine offene por se Bodenstruktur Abb 4 31 und Abb 4 39 Evakuieren mit 33 5 mbarL s f hrt dagegen zu einer teilweise dicht geschlossenen Bodenflache in deren Zentrum auskristallisierter Wirkstoff nachweisbar ist Abb 4 46 Abb 4 47 und Abb 4 51 Diese Gefrierkonzentration deutet darauf hin dass das Eiskristallwachstum zum Boden hin ausgerichtet war Abb 4 52 Die Methode mit 13 4 mbarL s lasst keine Gefrierkonzentration erkennen Abb 4 37 Einfrieren unter Atmosph rendruck erzeugt dagegen eine deutliche Aufkonzentrierung gel sten Wirkstoffs an der Ober fl che Abb 4 33 Die langsam von unten nach oben wachsenden Eiskristalle schieben den Wirkstoff bis an die Oberfl che vor sich her Dadurch ergibt sich eine geschlossene Oberfl chenstruktur Abb 4 34 die s
169. rien oder der homogenen Varianz nicht hinreichend gen gt werden die gesamten Daten mit verteilungsfreien Tests analysiert Bei allen Tests wird auf die Nullhypothese Mittelwertunterschiede zwischen den untersuchten Stichproben sind rein zuf llig es ist kein statistisch signifikanter Effekt des Faktors der Faktoren auf die abh ngige Variable nachzuweisen gepr ft Ab einer Irrtumswahrscheinlichkeit von p lt 0 05 wird die Nullhypothese verworfen und die Alternativhypothese Mittelwertunterschiede d h ein Effekt des Faktors der Faktoren auf die abh ngige Variable sind statistisch signifikant nachweisbar angenommen Da in der vorliegenden Arbeit nur Versuche mit 3 und mehr unabh ngigen Datengruppen statistisch untersucht werden soll im Folgenden lediglich auf die entsprechenden Testmethoden n her eingegangen werden 76 3 EXPERIMENTELLER TEIL Empirische Daten i Mormal nein verteilung J Varianzho nein mogenitat I Menge der Gruppen Nicht para metrisch Menge der Gruppen ee n hie H Testnach tudent ET a a he ee Mithey susie Wallis Post hoc Test Post hoc Test Abb 3 14 Entscheidungsschema fur die Auswahl des geeigneten Mittelwertvergleichs bei der Analyse der erhobenen Daten Quelle H Hollert Skriptum zu Statistik im Hauptpraktikum Alterna tivmethoden in der Okotoxikologie WS 2002 03 Universit t Heidelberg Parametris
170. ristalle Dies ergibt nach der Prim rtrocknung gro e gleich f rmige Poren Daraus resultiert allerdings eine kleinere innere Oberfl che und somit eine verringerte Sekund rtrocknungsrate Bei gleicher Dauer der Nachtrocknung k nnte daraus die wiederum erh hte Restfeuchte resultieren Bei der hohen Evakuiergeschwindigkeit von 33 5 mbarL s f hrt der schnelle und starke W rmeentzug an der Tropfenoberfl che durch Verdampfung des L sungsmit tels dort schnell zur Eisbildung Da der innere Teil des Tropfens noch nicht so stark abgek hlt ist kommt es zur Ausbildung eines deutlichen Temperaturgradienten Es 175 4 ERGEBNISSE UND DISKUSSION entstehen kleine nadelf rmige Kristalle die nach erfolgter Sublimation eine gro e innere Oberfl che zur cklassen Zus tzlich ist ein Merkmal des schnellen Einfrierens eine offene gro porige Oberfl chenstruktur Beides erleichtert die Sekund rtrock nung und K nnte tendenziell zu einer Abnahme der Restfeuchte f hren Zusammenfassend l sst sich sagen dass die Restfeuchte der OLCS insgesamt h her ist als dies erwartet wurde Die Lyophilisate mit einem Polymergehalt von 125 ug enthalten eine mittlere Restfeuchte von 10 12 Die durchschnittliche Restfeuchte der Lyophilisate mit 250 ug und 375 ug Polymergehalt liegt mit 6 8 deutlich niedriger Um bei den letzt genannten Lyophilisaten Restfeuchten lt 5 zu erreichen und so mikrobielles Wachstum sowie chemische Reaktionen zu unterbin den
171. rm von 18 2 THEORETISCHER TEIL Nadeln oder dendritischen Gebilden in das Produkt hineinwachsen 86 Die Entste hung amorpher glasartiger Bereiche wird gefordert und die Gefrierkonzentration unterdruckt In beiden Fallen ist zu Beginn der Trocknung die Sublimationsrate noch hoch Spater aber stellt der bereits getrocknete feinporige Teil des Trockengutes mit wenigen durchlassige Poren und Kanalen fur den sublimierenden Wasserdampf einen immer gr eren Widerstand dar Die Prozesszeit verl ngert sich Ein solches Lyophilisat hat aufgrund der gro en inneren Oberfl che allerdings eine hohe L sungsgeschwindig keit 37 Bei mittleren Abk hlraten entstehen weitgehend homogene Eisstrukturen mit gro en hexagonalen Kristallen Das dadurch w hrend der Trocknung entstehende gro pori ge Lyophilisat stellt f r den sublimierenden Wasserdampf nur einen geringen Widerstand dar Somit k nnen kurze Prozesszeiten erzielt werden 66 Es ist festzuhalten dass die Geschwindigkeit des Einfrierens erheblichen Einfluss auf die Qualit t des Endproduktes nehmen kann In Abh ngigkeit vom Produkt oder dessen Zusammensetzung f hren verschiedene Einfriergeschwindigkeiten zu unter schiedlichen Gef gen welche die Qualit t des getrockneten Kuchens bestimmen Deshalb muss f r jedes Produkt nicht nur die optimale Einfriertemperatur sondern auch die g nstigste Einfriergeschwindigkeit ermittelt werden 2 2 2 5 1 1 Einfriermethoden Je nach Art de
172. rmeleitung direkt in den gefrorenen Tropfen Dies f hrte mehrfach zu einem Antauen des Produktes Prototyp 2 Abb 4 4 Beim zweiten Prototyp wurden grundlegende Ver nderungen vorgenommen Das Stickstoffreservoir war nun nicht mehr aus Edelstahl sondern es wurde ein Kasten aus dem hochisolierenden Werkstoff Rohacell gefertigt Rohacell hat bei 20 C eine W rmeleitzahl von nur 0 030 W mK 62 88 4 ERGEBNISSE UND DISKUSSION Demgegen ber stehen Warmeleitzahlen von 15 W mK fur Edelstahl VA 1 4301 und zum Beispiel etwa 395 W mK f r Kupfer 10 In diesen Rohacell Kasten wurde das als Trocknungskammer und Kondensator dienende Metallrohr eingeklebt Dadurch sollte die Kondenswasser bzw Reifbildung vermieden und zus tzlich der Stickstoff verbrauch reduziert werden Au erdem bestand somit kein direkter metallischer Kontakt mehr zwischen der Dichtfl che und dem kalten Kondensatorrohr Die gute Isolationswirkung des Rohacell verhinderte eine Abk hlung der Dichtfl che und die damit verbundenen Probleme Das Trockenrohr war jetzt als T St ck geformt wobei der senkrechte Teil als Auf nahme f r eine Strahlungsheizung vorgesehen war Abb 4 4 Dieser senkrechte Teil reichte bis ber das Stickstoff Reservoir hinaus und erm glichte das Einbringen und Justieren einer Gl hwendel knapp oberhalb des gefrorenen Tropfens Somit war eine gezielte Zufuhr von Sublimationsw rme punktuell nur auf das gefrorene Gut m glich Eine solche
173. rmethode betr gt die Dauer der Plateauphase 1 08 Minuten Das ist die Zeit in der die Eiskristalle wachsen k nnen F r einen langsamen Einfrierprozess spricht der schwache aber kontinuierliche Abfall der Temperatur w hrend der Plateauphase 68 Nachdem die Kristallisation im unteren Bereich des Tropfens eingesetzt hat erkennbar durch den steilen Temperaturanstieg der durch die freiwerdende Kristalli sationsw rme bedingt ist wird die Eismatrix langsam dicker und die Eistemperatur sinkt langsam ab bis schlie lich die ganze Probe durchgefroren ist Danach f llt die Temperaturkurve steil ab 50 107 4 ERGEBNISSE UND DISKUSSION Beim Einfrieren unter gleichzeitigem Evakuieren verkurzt sich die Dauer dieses Pla teaus umso st rker je h her die Evakuiergeschwindigkeit gew hlt wurde Tabelle 5 Bei einer Ventilstellung von 600 durchgezogene d nne schwarze Kurve in Abb 4 18 betr gt sie nur noch 0 22 Minuten Der zus tzliche schnelle W rmeentzug an der Grenzfl che L sung Gas in Form von Verdampfungs und Sublimations w rme bewirkt einen schnellen Entzug der Kristallisationsw rme Der Evakuiergeschwindigkeit sind allerdings Grenzen gesetzt Durch in der L sung eingeschlossenes Gas welches beim Vermindern des Kammerdruckes expandiert kommt es bei schnellem Evakuieren zur Ausbildung von Gasblasen in der Probe die dann w hrend des Durchfrierens platzen und die Matrix zerst ren sog Frothing 29 Nach dem vollst ndi
174. ruar 1943 und September 1945 wurden dort eine halbe Million Flaschen mit Blutplasma zur Behandlung von Kriegsopfern getrocknet 79 Nach Kriegsende war die Gefriertrocknung eine allgemein anerkannte Methode zur Konservierung von Arzneimitteln und biologischen Produkten In den f nfziger Jahren dominierten in der Forschung auf dem Gebiet der Gefrier trocknung die pharmazeutischen Anwendungen In den 60ern waren es Nahrungs mittel die den Ansto zur Forschung und Entwicklung gaben Zum Beispiel nutzte die NASA gefriergetrocknete Nahrungsmittel in der Raumfahrt 50 Die Verwendung von gefriergetrockneten Produkten durch Extrembergsteiger und Polarforscher f hrte schlie lich dazu dass diese inzwischen auch im Handel erh ltlich sind Heutzutage hat die Gefriertrocknung ihre gr te Bedeutung in der Pharmaindustrie Darunter fallen die Gefriertrocknung von chemischen Verbindungen Parenteralia Impfstoffen In vivo und In vitro Diagnostika sowie biotechnologischen Produkten et cetera Gefriergetrocknete Produkte machen etwa 8 10 der Gesamtkosten des Gesundheitswesens aus das waren 1999 mehr als 8 Milliarden US Dollar 29 2 THEORETISCHER TEIL Mengenm ig den gr ten Anteil hat jedoch die Lebensmittelindustrie zum Beispiel mit der Herstellung von l slichem Kaffee 54 2 2 3 Vor und Nachteile der Gefriertrocknung Die Gefriertrocknung ist eine Technik die viele verschiedene Vorteile mit sich bringt e Minimale Strukturve
175. s Journal of the Parenteral Drug Association 1980 34 5 358 368 Nail SL Schwegmanl JJ Kamp V Analytical Tools for Characterization of Frozen Systems in the Development of Freeze Dried Pharmaceuticals American Pharmaceutical Review 2000 3 4 17 25 Oetjen GW Gefriertrocknung in der biologisch pharmazeutischen For schung und Industrie DKV Tagungsbericht 1996 23 Jahrgang Band 3 Leipzig 20 22 November 1996 Oetjen GW Gefriertrocknen Weinheim VCH Verlagsgesellschaft mbH 1997 Pfeiffer Vacuum Gebrauchsinformation Gasdosier Absperrventil EVN 116 Pfeiffer Vacuum GmbH Asslar Pikal MJ Use of Laboratory Data in Freeze Drying Process Design Heat and Mass Transfer Coefficients and the Computer Simulation of Freeze Drying Journal of Parenteral Science and Technology 1985 39 3 115 138 190 98 59 63 64 65 Pikal MJ Freeze Drying in Swarbrick J Boylan JC Encyclopedia of Pharmaceutical Technology Volume 6 New York Marcel Dekker Inc 1992 275 303 Pikal MJ Heat and Mass Transfer in Low Pressure Gases Applications to Freeze Drying in Amidon G Lee P Topp L Transport Process in Phar maceutical Systems New York Marcel Dekker Inc 1999 611 686 Pikal MJ Shah S Senior D Lang JE Physical Chemistry of Freeze Drying Measurement of Sublimation Rates for Frozen Aqueous Solutions by a Microbalance Technique Journal of Pharmaceutical Science 1983 72 6 635 650 PTFE
176. s Produktes und sp terem Verwendungszweck gibt es verschiedene M glichkeiten eine Ausgangsl sung einzufrieren Das Einfrieren kleiner Volumina in der Endverpackung wie zum Beispiel Injectabilia in Vials erfolgt h ufig auf den temperierbaren Siellflachen innerhalb des Gefriertrockners Diese Fl chen werden von einem kalten Fluid durchstr mt und so langsam abgek hlt Durch Prozesssteuerung lassen sich reproduzierbare Tempera tur Zeit Verl ufe einstellen Bei der Herstellung gefriergetrockneter schnelll slicher Oralia Zofran Zydis in kontinuierlicher Arbeitsweise wird die Arzneistoffsuspension direkt in die Blisterver packung dosiert Die Blister durchlaufen dann einen Gefriertunnel in den von oben fl ssiger Stickstoff eingespr ht wird Dieser verdampft sofort und erzeugt eine Atmo sph re von kaltem Gas Bei diesen Bedingungen friert die Suspension in etwa 4 Minuten durch 39 2 THEORETISCHER TEIL Sollen gr ere Volumina eingefroren werden w chst mit zunehmender H he des Fl ssigkeitsstandes in einem Gef die Schichtdicke des zu produzierenden Lyophi lisates Dies f hrt neben einer verl ngerten Einfrierzeit auch zu einer deutlichen Ver langerung der Trocknungszeit Daher wurden neben dem g ngigen Verfahren des Einfrierens und Trocknens in gro fl chigen Schalen f r Ausgangs oder Zwischen produkte Einfriermethoden fur gro volumige fl ssige Zubereitungen im Endbehaltnis entwickelt Bereits 1944 benutzte Grea
177. s der festen Phase entfernt wird Dies geschieht zuerst durch Sublimation Prim rtrocknung darauf folgt die Desorption restlicher Wassermengen die an der Oberfl che des Ger stes haften Sekund rtrocknung Der dabei erreichte Restfeuchtegehalt sollte kein biologisches Wachstum und keine chemischen Reaktionen mehr unterst tzen Die getrockneten Produkte werden als Lyophilisate von Iyophil griechisch l sungsfreundlich bezeichnet 2 THEORETISCHER TEIL 2 2 2 Geschichtlicher Hintergrund Die Historie des Gefriertrocknens l sst sich bis zu der Hochkultur der Inkas zur ck datieren Sie konservierten Kartoffeln indem sie diese einfroren Anschlie end wur den sie der W rme der Sonne und der kalten zirkulierenden Andenluft ausgesetzt Gleiches wird heute noch von den peruanischen Nachkommen der Inka praktiziert Somit erhalten sie ein haltbares trockenes Produkt mit nahezu allen N hrstoffen der urspr nglichen Kartoffel Interessanterweise ist diese Technik in ihren Grundz gen identisch mit der von Meryman 1959 beschriebenen Sublimationsgefriertrocknung ohne Vakuum Meryman ersetzte den kalten Wind durch einen gew hnlichen Ventila tor Mit diesem leitete er Luft durch ein Trockenmittel und anschlie end ber die zu trocknende Probe 44 Bereits 1890 beschrieb Richard Altmann in seinem Buch Die Elementarorganismen und ihre Beziehung zu den Zellen das Einfrieren und Trocknen frischer Organst cke 29 Dies gelang ihm bei Te
178. schwindigkeit regulieren mit der die Kammer auf das maximal m gliche Endvakuum evakuiert wurde Das zweite Ventil erm glichte sowohl das Einstellen des Arbeitsvakuums durch kon trolliertes Bel ften mit dem Inertgas Stickstoff als auch das vollst ndige Bel ften der Trockenkammer zu Prozessende Als temperierbare Stellflache wurde ein Alumini umzylinder verwendet bei dem ein Teil der Rundung abgeflacht war Abb 4 2 In diesen flachen Teil war eine Vertiefung zur Aufnahme des Lyophilisattragers einge fr st Der Abstand des gefrorenen Produktes zum Kondensator betrug dadurch nur wenige Millimeter war also im Bereich der mittleren freien Wegstrecke der Gasmole k le Mit eingebrachter Stellfl che wurde das freie Volumen in der Kammer so klein dass sie sich innerhalb weniger Sekunden evakuieren lie In den Aluminiumzylinder wurden eine Heizpatrone und ein Temperaturf hler einge klebt Eine Thermostatsteuerung erm glichte das Einstellen und Konstanthalten der gew nschten Stellflachentemperatur Ein zweiter Thermof hler wurde in der Vertie fung entlang gef hrt und konnte horizontal in den Tropfen eingebracht werden 84 4 ERGEBNISSE UND DISKUSSION Er erlaubte die Erfassung der Produkttemperatur wahrend des Gefriertrocknungspro zesses Abb 4 2 Der Aluminiumzylinder war auf einer Seite mit einem Kunststoffstopfen verschraubt Dieser sollte die Trockenkammer durch einen integrierten O Ring radial vakuumdicht verschlieBen
179. sierung von etwa 3 2 Die relativen Standardabweichungen zwischen 1 8 und 4 2 sprechen f r eine gute Gleichf rmigkeit der Dosierung Man kann daher davon ausgehen dass innerhalb einer Versuchsreihe Unterschiede des Gehaltes nicht auf eine Ungenauigkeit bei der Dosierung zur ckzuf hren sind 101 4 ERGEBNISSE UND DISKUSSION 4 3 Gefriertrocknung In der Literatur wird vielfach erw hnt dass die Einfrierbedingungen die Struktur eines Lyophilisates ma geblich beeinflussen k nnen 29 34 50 54 57 66 Da die Lyophilisate im Falle der OLCS in direktem Kontakt mit der Tr gerfolie stehen sollte eine Ver nderung der Porenstruktur direkten Einfluss auf die Haftfestigkeit haben Um den Einfluss verschiedener Einfrierbedingungen auf die Haftfestigkeit der Lyophi lisate untersuchen zu k nnen ist es jedoch notwendig die Temperaturverlaufe im Produkt genau zu erfassen und wenn m glich zu quantifizieren um sie mit den Haftfestigkeiten zu korrelieren Im Mini Gefriertrockner war es m glich die Temperatur im Einzeltropfen zu messen Es sollten definierte Einfriermethoden entwickelt und deren Reproduzierbarkeit berpr ft werden 4 3 1 Verlauf der Einfrier und Trocknungskurven Im folgenden Versuch wurde der Temperaturverlauf in einem Tropfen Polymerl sung 1 HPMC E50 mit dem Datenerfassungsprogramm ComGraph V1 0 ermittelt vgl Kapitel 4 1 4 und interpretiert Anhand von Abb 4 14 soll der generelle Verlauf von Einfrier
180. sollte die Sekund rtrocknungszeit in zuk nftigen Versuchen etwas verl ngert werden 176 5 ZUSAMMENFASSUNG 5 Zusammenfassung Um eine angenehme und vollstandige Applikation zu gewahrleisten mussen die Ophthalmic Lyophilisate Carrier Systems OLCS genau definierte mechanische Eigenschaften aufweisen Nur dann sind sie voll funktionsfahig und es lassen sich inre deutlichen Vorteile gegenuber konventionellen Augentropfen zeigen Diese defi nierten Eigenschaften bezuglich Haft und Druckfestigkeit der Lyophilisate lassen sich nur mit kontrollierten fur jedes einzelne OLCS reproduzierbaren Herstellungs bedingungen erreichen Gebr uchliche Gefriertrocknungsanlagen bzw Einfrierme thoden bei denen der Durchsatz gro er St ckzahlen im Vordergrund steht sind ungeeignet solch homogene Bedingungen f r jedes einzelne Objekt zu erzeugen Deshalb wurde im Zuge dieser Arbeit ein Mini Gefriertrockner entwickelt der die reproduzierbare Einstellung homogener Einfrier und Trocknungsbedingungen f r jedes OLCS erm glichte Dies konnte durch w hrend der einzelnen Herstellungspro zesse aufgezeichnete Temperatur und Druckkurven gezeigt werden Durch Optimie rung lie sich die Dauer der Prim rtrocknungsphase auf 12 Minuten reduzieren Abh ngig von der Geschwindigkeit der verwendeten Einfriermethode resultierten daraus maximale Prozesszeiten um 20 Minuten Die energieeffiziente schnelle und reproduzierbare Herstellung von OLCS wurde durch den b
181. spricht einer Standardabwei chung Statistisch soll nun berpr ft werden inwieweit die beiden Faktoren Polymergehalt und Evakuiergeschwindigkeit einen signifikanten Einfluss auf die Druckfestigkeit der Lyophilisate haben Varianzhomogenitat der Stichproben liegt nicht vor p lt 0 001 daher wird fur jeden Faktor getrennt ein nicht parametrischer Test durchgef hrt Evakuiergeschwindigkeit F r die Datenserie Abh ngigkeit der Druckfestigkeit von der Evakuiergeschwindig keit wird die Annahme homogener Varianzen mit p 0 415 nicht verletzt Es liegt keine Normalverteilung vor p 0 043 somit ist wiederum der Kruskal Wallis Test indiziert 155 4 ERGEBNISSE UND DISKUSSION Dieser zeigt auf den vier Niveaus fur die Evakuiergeschwindigkeit keinen Unter schied der Druckfestigkeitsmittelwerte Signifikanzniveau 0 05 H 0 355 gt X 0 05 7 81 p 0 949 Der post hoc durchgef hrte bei Varianzhomogenitat indizierte Fischer s Least Significance Difference LSD Test ergibt fur die vier Niveaus folgendes SS p 0 630 p 0 838 p 0 708 Evakuiergeschw mbarL s Tabelle 17 p Werte fur die Evakuiergeschwindigkeiten auf allen drei Niveaus des Polymerge haltes Keine statistisch signifikanten Unterschiede Fur die Druckfestigkeit der Lyophilisate auf den vier Niveaus der Evakuiergeschwin digkeit lasst sich kein statistisch signifikanter Unterschied erkennen Die Evakuierge schwindigkeit hat
182. stitions und Betriebskosten unwirtschaftlich Deshalb soll hier zun chst jeweils nur ein einzelnes OLCS getrocknet werden Dieser Mini Gefriertrockner soll einfach zu handhaben sein sowie eine energieeffi ziente und vor allem schnelle Herstellung von OLCS erlauben Die in der Literatur f r halbkugelf rmige Partikel mit etwa 3 mm Durchmesser beschriebene Trockenzeit von 1 bis 3 Stunden soll deutlich unterschritten werden 23 Daneben muss der Mini Gefriertrockner gut reproduzierbare Gefriertrocknungszyklen erm glichen um eine definierte konstante Qualit t der OLCS zu gew hrleisten 80 4 ERGEBNISSE UND DISKUSSION List nennt folgende Punkte bei einer Gefriertrocknungsanlage als konstruktiv vorteilhaft 36 1 Gro e Temperaturdifferenz und damit gro e Dampfdruckdifferenz zwischen Gut und Eis am Kondensator 2 Kurze Entfernung zwischen Produkt und Kondensator 3 Gro e Kondensatoroberfl che A Gutes Vakuum Die energieeffiziente schnelle und reproduzierbare Herstellung von OLCS soll daher durch die Kombination folgender Ma nahmen erreicht werden e Extrem kleines Volumen der Trocknungskammer erm glicht ein schnelles Erreichen des angestrebten Prozessvakuums Die W nde der Trockenkam mer stellen zugleich den Kondensator dar Daher ist die Kondensatorfl che gro gegen ber der Trocknungsflache des Gutes e K hlung der Kondensatorfl chen durch direkten Kontakt mit dem K hlmedi um Aufgrund niedriger Kosten Umwel
183. stoffrestmengen auf der PTFE Folie nach Haftfestig keitsuntersuchungen Dazu dienten die Werte aus Kapitel 4 4 4 1 Die Ergebnisse sind graphisch in Abb 4 80 dargestellt Dabei ergibt sich kein nennenswerter Unterschied im Restgehalt in Abh ngigkeit von der Polymerkonzentration Da sich allerdings die Haftfestigkeiten bei Erh hung der Polymerkonzentration stark nderten in Abb 4 80 fur 13 4 mbarL s Evakuierge schwindigkeit durch die entsprechenden Mittelwerte der Haftfestigkeiten angedeutet kann somit auch ein direkter Zusammenhang zwischen der Haftfestigkeit und der Restmenge ausgeschlossen werden 5 5 Evakuiergeschwindigkeiten seesi 13 4 mbarL s 504 J o 10 0 mbarL s as 4 0 A 33 5 mbarL s Hafti4 6 g 4 0 n Haftl29 9 g Restmenge ug 0 4 0 6 0 8 1 0 1 2 1 4 1 6 HPMC Konzentration in der Ausgangsl sung Abb 4 80 Zusammenhang zwischen der HPMC Konzentration und der Restmengen an Fluorescein Natrium Die Lyophilisate hatten einen Gehalt von je 68 ug und wurden mit unterschiedlichen Einfriergeschwindigkeiten hergestellt jeweils n 5 ein Fehlerbalken entspricht einer Standardabweichung 168 4 ERGEBNISSE UND DISKUSSION 4 4 4 4 Vergleichbarkeit von In vivo und In vitro Ergebnissen Um eine Aussage treffen zu k nnen inwieweit der Abrei test geeignet ist die In vivo Applizierbarkeit zu simulieren wurden f r die drei im Rahmen dieser Arbeit durchgef hrten klinischen Studien vgl Kapitel 4 4 3 di
184. struktur des bereits getrockneten Lyophilisates f r den sublimierenden Wasserdampf einen betr chtlichen Widerstand dar und kann bei zu hohen Sublimationsraten zu einer Zerst rung der Produktstruktur f hren F r dieses Beispiel wird ein Vakuum von 0 1 mbar festgelegt Daraus resultiert f r die Stellflachentemperatur ein experimentell ermitteltes Intervall von 10 C 2 38 2 THEORETISCHER TEIL Beschreibung des Gefriertrocknungszyklus Uber die Prozessparameter Primartrocknung Der Zusammenhang zwischen Kammerdruck Stellplatten und Produkttemperatur sowie der Sublimationsrate wird im Folgenden an einem hypothetischen Beispiel erl utert 29 Eine Formulierung wurde in der Gefriertrocknungsanlage bei Atmosph rendruck eingefroren Das gefrorene Produkt auf der Stellflache und die Stellfl che selbst sowie das Gas in der Trockenkammer haben eine Temperatur von 28 C Abb 2 14 Ohne W rme bertragung geht die Sublimationsrate gegen null Einige Wassermolek le verlassen zwar die Eisoberfl che und diffundieren zum Kondensa tor aber dieser Anteil ist verschwindend klein und Gefriertrocknung unter diesen Bedingungen praktisch unm glich Temperature C Pressure mTorr Time hrs Abb 2 14 Kontrollierter Gefriertrocknungsprozess Prim rtrocknung einer Beispielformulie rung 29 Pc Kammerdruck Tc Kollapstemperatur Tp Produkttemperatur Ts Stellfl chentemperatur 39 2 THEORETISCHER TEIL Nun w
185. t 63 3 EXPERIMENTELLER TEIL Die Lyophilisate wurden mit dem Rasterelektronenmikroskop untersucht um sowohl die inneren als auch oberfl chlichen Strukturen sichtbar zu machen welche im Wesentlichen die Eigenschaften Haftfestigkeit und Druckfestigkeit mitbestimmen Ger te Sputter Sputter Coater S 150 B Edwards High Vacuum Internation West Sussex Gro britannien Eingestellte Stromst rke 15 mA Sputterzeit 3x 2 Minuten Probentr ger Gereinigte Aluminiumniete Durchmesser 0 8 cm Rasterelektronenmikroskop Hitachi S 2460 N Scanning Electrone Microscope Tokio Japan Arbeitsabstand 25 mm Anodenspannung 15 kV Bildauswertung digital Programm Digital Image Processing System V2 5 2 1 Point electronic GmbH Messger t Das REM erm glicht eine vergr erte Aufnahme und Abbildung von Objekten mit Hilfe von Elektronenstrahlen Dies wird m glich durch die in umgekehrter Proportio nalit t zu ihrer Beschleunigungsspannung hier 15 kV stehende verglichen mit sichtbarem Licht bis zu 10 mal kleinere Wellenl nge der Elektronenstrahlen Dem nach entspricht eine h here Beschleunigungsspannung einer k rzeren Wellenl nge und einer besseren Bildaufl sung Der Aufbau eines REM besteht aus folgenden Einheiten Durch eine beheizte Wolframkathode wird ein fokussierter Elektronenstrahl erzeugt welcher die zu untersuchende Probe Zeile f r Zeile abtastet Raster Dies geschieht bei einem Arbeitsvakuum von 10 bis 10 mbar damit
186. t 4 4 4 3 Abh ngigkeit der Restmengen vom Polymergehalt 4 4 4 4 Vergleichbarkeit von In vivo und In vitro Ergebnissen 4 4 5 Effekte durch Variation der Einfrierbedingungen im Mini Gefriertrockner Zusammenfassung und Diskussion 4 4 6 Restfeuchtebestimmung der Lyophilisate nach Karl Fischer 5 6 6 1 6 2 ZUSAMMENFASSUNG ANHANG Zeichen und Symbole Abk rzungen 102 102 105 110 118 120 120 123 135 137 145 149 150 151 152 199 163 163 167 168 169 170 174 177 181 181 183 INHALTSVERZEICHNIS 7 LITERATURVERZEICHNIS 185 1 EINLEITUNG UND ZIELSETZUNG 1 Einleitung und Zielsetzung Die wichtigste pharmazeutische Darreichungsform zur Anwendung am Auge des Menschen sind w ssrige Augentropfen mit weitem Abstand gefolgt von Augensal ben Augengelen und Inserten 12 Allerdings handelt es sich bei Augentropfen im Grunde genommen um eine unzureichende Darreichungsform deren vielf ltiger Ein satz heutzutage nur durch einen Mangel an Alternativen gerechtfertigt werden kann 82 So erreichen oft nur weniger als 5 der applizierten Arzneistoffmenge den gew nschten Wirkort Der Rest der verabreichten Dosis wird zum gr ten Teil 50 bis nahezu 100 systemisch verf gbar und kann erhebliche unerw nschte Wirkungen ausl sen Aus Studien ist bekannt dass zum Beispiel unter Timolol Therapie bei 20 der Patienten unerw nschte systemische Wirkungen des Betablo ckers Bronchokonstri
187. t nicht aus sondern erstarrt kinetisch als unterk hlte Fl ssigkeit ohne vollst ndige Phasen trennung der Komponenten 33 Man spricht hier vom so genannten Glasubergang weil die gel sten Bestandteile dabei in einen glasartigen starren Zustand bergehen Dieser Glaszustand ist gekennzeichnet durch eine extrem hohe Viskosit t so dass 17 2 THEORETISCHER TEIL die Teilchenbewegung vernachlassigbar klein wird und infolge dessen Reaktionen zwischen den Einzelkomponenten verhindert werden 19 Die Glasubergangstempe ratur auch als Kollapstemperatur bezeichnet 66 entspricht der eutektischen Tempe ratur f r vollst ndig kristallisierende Formulierungen Sie kennzeichnet die Tempera tur ab der normalerweise von einem vollst ndig gefrorenen Produkt ausgegangen werden kann Widerstandsmessungen an dem gefrorenen Gut lassen jedoch darauf schlie en dass auch unterhalb dieser Temperaturen feinste Fl ssigkeitstropfen im Eis erhalten bleiben Erst wenn die Temperatur um etwa 20 C unter die des eutektischen Punktes oder der Kollapstemperatur gesenkt worden ist erstarren diese Fl ssig keitsnester Auch von der Abk hlgeschwindigkeit h ngt das Vorhandensein solcher Fl ssigkeitsspuren ab Hieraus ergibt sich die Forderung nach m glichst schnellem Einfrieren 36 53 und nach einer Endtemperatur die wesentlich unterhalb der eutek tischen bzw Kollapstemperatur liegt 36 Die Endtemperatur des Eises beim Einfrieren liegt in der Prax
188. t eine niedrigere Kondensatortemperatur verringert wer den Die Produkttemperatur f r die Sekund rtrocknung wurde f r dieses Beispiel auf 20 C festgelegt um eine Stabilit tsbeeinflussung durch zu hohe Temperaturen zu vermeiden Der Kammerdruck wurde bei etwa 0 1 mbar belassen Da die Produkt temperatur am Ende der Prim rtrocknung ann hernd 10 C betr gt siehe Abb 2 14 muss die Stellfl chentemperatur nur um weitere 10 C erh ht werden um dem Produkt die notwendige Energie zuzuf hren die zur Entfernung des adsorbierten Wassers bis zu einer gew nschten Restfeuchte ben tigt wird Aufgrund der schlechteren W rmeleitung der trockenen por sen Struktur erreicht das Produkt erst zu einem etwas sp teren Zeitpunkt die angestrebte Temperatur von 20 C Auf dieser Temperatur wird es 5 Stunden belassen bis sich der gew nschte Restfeuchtegehalt eingestellt hat Nach insgesamt etwa 12 Stunden ist der Gefriertrocknungszyklus beendet 40 2 THEORETISCHER TEIL 2 3 Die mittlere freie Weglange MFW Unter der mittleren freien Wegl nge versteht man den Weg den ein Gasmolek l im Mittel zur cklegt ohne mit einem weiteren Molek l im Gasraum zu kollidieren 29 Die Anzahl solcher Kollisionen eines Wassermolek ls auf dem Weg von der Subli mationsfront zum Kondensator bestimmt ma geblich die Trockenzeit vgl Kapitel 2 2 5 3 1 Daher sollte die mittlere freie Wegl nge idealerweise von gleicher Gr enordnung sein wie der Abstan
189. t eine wei e Eigenfarbe und f hlt sich wachsartig an Folien k nnen aus Dispersionen bzw durch Sch len von gesinterten oder ungesinterten Vollst ben hergestellt werden Bei den von Weichselbaum durchgef hrten Untersuchungen an 18 verschiedenen PTFE Folien auf ihre Verwendbarkeit als Tr gerfolie erwies sich die ungesinterte PTFE Folie der Firma 3P GmbH als am besten geeignet 82 Deshalb wird f r alle nachfolgenden Versuche diese PTFE Folie verwendet ungesinterte PTFE Folie urspr nglicher Verwendungszweck Qualit t zur Isolation in der Elektrotechnik Dicke 100 um Dichte 1 6 g cm Firma 3P GmbH Performance Plastic Products Karben 60 3 1 2 Hydrophiles Polymer Hydroxypropylmethylcellulose Ph Eur _ HPMC Hypromellose Methocel BERZEHERSSS Die eingesetzte Hydroxypropylmethylcellulose dient als Ger stbildner f r das Lyophi lisat in das der Arzneistoff molekulardispers oder suspendiert eingebettet ist Es handelt sich um einen gemischten nichtionogenen Ether der Cellulose Die Herstel lung erfolgt durch Einwirken von Methylchlorid und Propylenoxid auf Alkalicellulose 8 HPMC ist als Hilfsstoff f r Arzneiformen zur Anwendung am Auge zugelassen und neben Methylcellulose der meistverwendete viskosit tserh hende Zusatz zur Kontaktzeitverl ngerung am Auge 18 12 Vor allem nach Sterilfiltration welche problemlos bis zu einer Konzentration von 1 5 m glich ist erf llt die L sung die Anforderungen an
190. tellung e Dichtheit 1 10 mbarL s 4 1 2 4 Vakuumpumpe Drehschieberpumpe trivac Typ Nr D8A Firma Leybold Heraeus K ln Nennsaugverm gen 12 8 m h Erreichbarer Druck 0 00025 mbar 4 1 2 5 K hlmedium In konventionellen Gefriertrocknungsanlagen treten etwa 80 der Serviceprobleme im mechanischen K hlsystem auf 73 Deshalb und aufgrund der im Folgenden genannten Vorteile wurde Fl ssigstickstoff als K hlmedium gew hlt 83 4 ERGEBNISSE UND DISKUSSION e Inerte Fl ssigkeit Gas und somit umweltfreundlich e Erlaubt das Arbeiten bei sehr niedrigen Temperaturen denn Stickstoff hat einen Siedepunkt von 196 C e Kann direkt oder indirekt zur K hlung verwendet werden e Es ist kosteng nstig weniger als 10 Cent Liter 4 1 3 Entwicklungsgang der Prototypen Im Folgenden wird die technische Entwicklung des Mini Gefriertrockners von der ersten Versuchsapparatur Prototyp 1a bis zum endg ltigen Aufbau Prototyp 4 beschrieben Prototyp 1a Abb 4 1 In einen Edelstahlkasten als Fl ssigstickstoff Reservoir wurde ein Edelstahlrohr von 25 mm Durchmesser eingeschwei t Das Innenvolumen dieses Rohres stellt die Tro ckenkammer dar Die innere Mantelflache des Rohres umgeben von flussigem Stickstoff fungiert als Kondensator An einem Ende des Trockenrohres wurde ein Rohrleitungssystem mit dem barometrischen Drucksensor und zwei Nadelfeinventi len angeschlossen Mit einem Feinventil lie sich die Ge
191. tfestigkeit dagegen nicht ausreichend so kann sich das Lyophilisat bereits bei der Lagerung oder beim Transport von der Tr gerfolie abl sen und das System verliert seine Integrit t Dann kann das Lyophilisat nicht mehr unter hygienisch einwandfreien Bedingungen appliziert werden Auch die Druckfestigkeit der Lyophilisate spielt eine entscheidende Rolle f r die Applizierbarkeit Um den gefriergetrockneten Tropfen an der Unterlidkante abzustrei fen muss ein gewisser Druck auf das Lyophilisatger st ausge bt werden Dies geschieht durch den Zeigefinger der das Lyophilisat leicht an den Bindehautsack bzw die Bindehaut andr ckt Abb 2 8 Ist das Ger st zu weich so wird das halbku gelf rmige Lyophilisat dabei stark zusammengedr ckt Dadurch wird es deutlich fla cher und die Abstreifflache des gefriergetrockneten Tropfens Abb 2 8 dicker wei er Pfeil reicht unter Umst nden nicht mehr aus um die zur Applikation notwendigen 10 2 THEORETISCHER TEIL Scherkr fte aufzubringen Ist das Ger st dagegen zu hart k nnte es bei der Applika tion zu Schmerzen oder sogar Verletzungen am Auge kommen Um also OLCS gut applizieren zu k nnen m ssen diese Eigenschaften richtig eingestellt werden Abb 2 8 Applikation eines Pilocarpin OLCS 2 2 Gefriertrocknung 2 2 1 Definition Gefriertrocknung ist ein Prozess bei dem das zu trocknende Material eingefroren und anschlie end die Fl ssigkeit zum Beispiel ein L sungsmittel au
192. tfreundlichkeit und guter Verf gbarkeit bietet sich hier Fl ssigstickstoff an 73 e Keine temperierte Stellflache mehr stattdessen direkte Heizung des Trocken gutes durch Infrarotstrahlung von oben Diese Ma nahme wurde erst ab dem 2 Prototyp technisch umgesetzt e Minimierung des Diffusionswiderstandes durch Trocknung bei hohem Vakuum unterhalb 0 03 mbar e Minimierung der Diffusionsstrecke durch m glichst kurze Distanz zwischen Trockengut und Kondensator Um einen Anhaltspunkt f r die optimale Gr enordnung der Distanz zwischen Tro ckengut und Kondensator zu bekommen wird f r den angestrebten Vakuumbereich die mittlere freie Wegl nge berechnet vgl Kapitel 2 3 81 4 ERGEBNISSE UND DISKUSSION 4 1 2 Auswahl der Komponenten 4 1 2 1 Temperaturmessung Endpunktdetektion Um w hrend der Prozessentwicklung die Produkttemperatur im Einzeltropfen Durchmesser etwa 3 4 mm bestimmen zu k nnen sollte der Temperaturmesser so klein wie m glich sein und eine exakte Temperaturmessung in einem Bereich von 200 C bis 100 C erm glichen Verwendet wurden schlie lich Mantelthermoele mente mit dem Thermopaar Ni Cr Ni der Firma Jumo mit einem Durchmesser der Messspitze von nur 0 5 mm und folgenden Eigenschaften 30 e geeignet f r Temperaturen von 200 C bis 1150 C e biegsame d nnwandige Metallleitung kleiner Biegeradius m glich e kurze Ansprechzeiten ab 0 15 sec e hohe Messgenauigkeit Das verwend
193. thoden auf die Haftfestigkeit der entsprechenden Lyophilisate erwarten lassen 117 4 ERGEBNISSE UND DISKUSSION 4 3 4 Einfluss der Wirkstoffkonzentration auf den Trocknungsverlauf Im Zuge dieser Arbeit sollten Fluorescein Natrium Lyophilisate unterschiedlicher Wirkstoffkonzentrationen hergestellt und am Menschen getestet werden In diesem Versuch sollte gepr ft werden ob eine Ver nderung der Arzneistoffdosis bei ansons ten identischen Versuchsbedingungen eine Auswirkung auf den Temperaturverlauf im Tropfen und somit auf den Gefriertrocknungsprozess hat Bruttini et al beschreiben dass eine Erh hung der Wirkstoffkonzentration in w ssrigen L sungen zu einer Reduktion der Sublimationsrate f hrt Da die Sublimationsrate den geschwindigkeitsbestimmenden Faktor der Prim rtrocknung darstellt w rde dies in einer Verl ngerung der Trocknungszeit resultieren 5 6 Die Trocknungskurven von Tropfen mit 1 HPMC E50 und 68 ug bzw 204 ug dreifache Einzeldosis Fluorescein Natrium wurden aufgezeichnet und superponiert Abb 4 24 60 204 ug Fluorescein 40 68 ug Fluorescein NO Temperatur C O o 40 0 5 10 15 20 Zeit min Abb 4 24 Einfluss der Wirkstoffkonzentration auf den Verlauf des Gefriertrocknungszyklus Die Doppelpfeile kennzeichnen die Temperaturverl ufe bei identischen Einfrier und Trock nungsbedingungen und zwei unterschiedlichen Fluoresceinkonzentrationen 118 4 ERGEBNISSE UND DISKUSS
194. tigkeiten resul tieren Um dies zu untersuchen werden Proben sowohl mit 13 4 mbarL s als auch 33 5 mbarL s Evakuiergeschwindigkeit in beiden Prototypen hergestellt Die Ergeb nisse der anschlie enden Abrei tests sind in Tabelle 16 und Abb 4 65 dargestellt F r die mit dem Prototyp 4 hergestellten OLCS ergibt sich im Mittel eine Erh hung der Haftfestigkeit um ca 30 40 gegen ber den mit dem alten Anlagendesign hergestellten Proben Abb 4 65 F r beide Einfriermethoden zeigt sich mit der neuen Anlage auch eine deutliche Verbesserung der Reproduzierbarkeit der Haftfestigkeiten vgl Rel St Abw in Tabelle 16 Prototyp 3 Prototyp 4 Ventilstellung V 600 V 530 V 600 V 530 13 0 10 3 ee En Br 14 5 13 1 11 6 12 2 14 0 12 1 13 4 14 6 14 4 13 9 15 3 ea w ER D EEE EEE EEE EZ Tabelle 15 Rohdaten der Haftfestigkeitsuntersuchungen f r Prototyp 3 und 4 bei mittlerem und schnellem Einfrieren Polymergehalt 250 ug Wirkstoffgehalt 68 ug 148 es e o 4 ERGEBNISSE UND DISKUSSION 20 20 x 15 15 D D 2 x ie 0 v v 2 a T x T 5 5 Prototyp 3 Prototyp 4 V 600 V 530 V 600 V 530 n 14 n 14 n 8 n 15 Abb 4 65 Ver nderung der Haftfestigkeit bei unterschiedlichem Anlagendesign und sonst identischen Versuchsbedingungen Ein modifiziertes Anlagendesign kann zu Ver nderungen der Prozesse f hren Dar aus k nnen deutliche Unterschiede in den OLCS Eigenschaften resultieren Um mit verschieden
195. tur Da die Sublimationsfront von oben nach unten fortschreitet zeigt der Temperaturf hler einen scharfen Anstieg der Produkttemperatur sobald sich die Eisfront an ihm vorbeibewegt hat Ist der Temperaturf hler am Boden des Produktes zentriert eingebracht so ist der Temperaturanstieg ann hernd mit dem Ende der Prim rtrocknung gleichzusetzen Pikal beschreibt dass mit dem Anstieg der Produkttemperatur der gleichzeitig bestimmte Wasserverlust pro Zeit einheit stark absinkt aber nicht sofort auf Null f llt 57 Dies weist auf das schnelle Entfernen nicht gefrorenen Wassers in der Anfangsphase der Sekund r trocknung hin kann aber zumindest teilweise auch die Sublimation von kleinen 35 2 THEORETISCHER TEIL Restmengen Eis anzeigen welche nicht in direktem thermischen Kontakt zum Temperaturf hler stehen e Messung der Kondensatortemperatur Die Erfassung des Temperaturverlaufes am Kondensator soll eine weitere M glichkeit darstellen den Endpunkt der Prim rtrocknung zu ermitteln Solange w hrend der Prim rtrocknung gr ere Mengen des sublimierten Wasserdampfes am Kondensator abgeschieden werden kommt es aufgrund der freiwerdenden Kondensationsw rme zu einem Temperaturanstieg am Kondensator 84 Gegen Ende der Sublimationstrocknung wird die kondensierende Wasserdampfmenge immer geringer was zu einem Abfall der Kondensatortemperatur f hrt e Komparative Druckmessung Wird zur Druckmessung in der Trocknungskammer sowoh
196. tur des Produktes abh ngt ist sie bei niedrigem Polymergehalt geringer und somit im Resultat die Restfeuchte gr er Um den m glichen Einfluss der Evakuiergeschwindigkeit auf die Restfeuchte zu diskutieren soll hier auf die Einfrierbedingungen und die daraus resultierenden Strukturen eingegangen werden Da die Restfeuchtedifferenzen innerhalb einer Versuchsreihe gleichen Polymergehaltes sehr gering sind und die Werte stark streuen sollen im Folgenden nur Vorschl ge gemacht werden wodurch sich ein entsprechender Kurvenverlauf ergeben k nnte Die sich durch das langsame Einfrieren von unten nach oben ergebende Gefrierkon zentration bei einer Evakuiergeschwindigkeit von 1 65 mbarL s f hrt zur Ausbildung einer dichten und porenarmen Oberfl che Diese behindert bei der Sekund rtrock nung die Desorption und k nnte zu der leicht erh hten Restfeuchte f hren Mit zunehmender Evakuiergeschwindigkeit 5 5 mbarL s und 10 0 mbarL s nimmt der Effekt der Gefrierkonzentration an der Oberfl che ab und die Struktur wird offener Der Abtransport von Wassermolek len wird erleichtert die Restfeuchte sinkt Bei einer weiteren Erh hung der Evakuiergeschwindigkeit auf 13 4 mbarL s wird durch den gleichzeitigen W rmeentzug von unten durch die kalte Kondensatorfl che und von oben durch verdampfendes L sungsmittel eine gleichm ige Abk hlung des Tropfens erreicht Das Fehlen eines Temperaturgradienten f hrt zur Ausbildung gro er gleichm iger K
197. und Gefriertrocknen Verpackung Ger te Autoklav Typ VST 40 60 Nr 91 410 max Temp 132 C max Druck 2 2 bar Apparatebau Zirbus Osterode Harz Hand Folienschwei ger t Polystar 244 Trockenschrank Typ FT 420 Nr 7104640 WC Heraeus Hanau Temperatur 60 C Laminar Airflow Werkbank Clean Air Typ MSC FSS 6 2 KL II B Dosierpipette Eppendorf Multipette plus Eppendorf Nethler Hinz GmbH Hamburg versehen mit Combitip Biopur 2 5 mL Sollwerteinstellung 25 uL Eppendorf Nethler Hinz GmbH Hamburg Waage Sartorius Typ BP 210S d 0 1 mg Sartorius GmbH G ttingen Materialien Autoklavierband Autoclave Tape 3M Medical Products Division St Paul USA Autoklavierfolie Melafol 1502 Melag Breite 150 mm Zellstofftupfer Pur Zellin 4 x 5 cm Hartmann Wasser f r Injektionszwecke 5 mL Ampullen Bayer AG Leverkusen oder Ciba Geigy GmbH Wehr 55 3 EXPERIMENTELLER TEIL 3 2 1 1 Herstellung der wirkstoffhaltigen Polymerl sung Berechnung der Wirkstoffmenge Die Lyophilisate sollen in Anlehnung an das Fertigarzneimittel Fluorescein SE Augentropfen der Firma Alcon Thilo dosiert werden Diese Augentropfen enthalten 1 7 mg Fluorescein Natrium in 1 mL L sung 1 Tropfen wird mit 40 uL angegeben 63 Somit liegt die Einzeldosis bei 68 ug Das Tropfenvolumen sollte m glichst klein sein F r die Lyophilisate wurde es auf 25 uL eingestellt Daraus ergibt sich eine Wirkstoffkonzentration
198. und Trocknungskurven genauer erl utert werden 102 4 ERGEBNISSE UND DISKUSSION Temperatur C Druck mbar 0 001 0 0001 0 00001 Zeit min Abb 4 14 Produkttemperatur und Kammerdruck wahrend des Gefriertrocknungszyklus Das Vakuum wurde direkt nach Einbringen der Probe angelegt Ventilstellung V 600 Phase I Einfrieren Zu Beginn hat die Probe Raumtemperatur Das eingebettete Thermoelement misst in diesem Fall etwas ber 20 C Nach dem Einbringen des Produkthalters in die Tro ckenkammer beginnt durch die tiefkalte Kondensatorfl che hier zus tzlich unter Zuhilfenahme von Vakuum die Abk hlung der Probe Da es sich bei der Probe um eine sterilfiltrierte L sung handelt unterk hlt die L sung bis etwa 16 C Mit der Bil dung der ersten Kristallisationskeime wird Gitterenergie frei und es kommt zu einem sprunghaften Temperaturanstieg Es folgt eine Plateauphase die auf die Freisetzung von Kristallisationsenergie hindeutet da trotz konstantem W rmeentzug durch die Umgebung keine Temperaturver nderung erfolgt 66 Die Plateautemperatur ist abh ngig von der Konzentration gel ster Stoffe in der einzufrierenden L sung Da die im Folgenden verwendeten L sungen nur geringe Feststoffkonzentrationen ent halten lt 2 ist ihre Gefrierpunktserniedrigung gering Die L sungen frieren 1 bis 4 C unterhalb des Gefrierpunktes von Wasser ein 103 4 ERGEBNISSE UND DISKUSSION Nachdem die L sung vollst
199. ung durch einen Spalt zwischen Loch im PTFE und F hler gezogen wird b f r die Anwendung Bei der Herstellung von Klinikmustern wird auf die Verwendung des Thermofuhlers verzichtet Der Applikator wird unver ndert auf einen Probentr ger ohne Thermo element berf hrt Bei der OLCS Herstellung sowohl f r die Methodenentwicklung als auch zur Verwendung als Klinikmuster wird anschlie end wie folgt verfahren Vor dem Aufbringen des Tropfens wird noch ein Strahlungsschild aus 0 1 mm dickem poliertem Edelstahl mit einer Aussparung f r den Tropfen auf den Probentr ger aufgesetzt Abb 3 3 um diesen und die PTFE Folie vor der direkten Infrarot Strahlung von oben zu sch tzen Dieser Strahlungschild ist im Weiteren zur besseren bersicht weggelassen 59 3 EXPERIMENTELLER TEIL Abb 3 3 Probenhalter mit PTFE Folie und Strahlungsschild aus Edelstahl In der Mitte der Schildaussparung befindet sich der Abb 3 4 Aufbringen der L sung mit der Thermof hler Foto M Diestelhorst Dosierpipette Foto M Diestelhorst Mit der Dosierpipette werden dann genau 25 uL der sterilen L sung auf die Spitze des Thermoelementes bzw in die Mitte der Folie aufgetropft Abb 3 4 Dabei ist zum einen darauf zu achten dass sich der F hler m glichst zentral im Tropfen befindet zum anderen sollte der Tropfen m glichst halbkugelf rmig sein und nicht verlaufen Anschlie end wird der Probentr ger vorsichtig in die Trockenkammer eingebracht
200. ves eine solche Methode um d nne Eisschichten mit kleinen Eiskristallen zu erzeugen 24 Dazu wird heute meist ein Kuhlbad aus Alkohol COs oder fl ssigem Stickstoff Abb 2 9 verwendet Um zu vermeiden dass Eiskristalle senkrecht zur Gef wand wachsen und sich somit Porenw nde senkrecht zur Sublimationsrichtung des Wasserdampfes bilden vgl Abb 4 48 werden die Flaschen im Bad gedreht Dabei unterscheidet man schnelles senkrechtes Drehen so genanntes spin freezing und langsames fast waagerechtes Rotieren das shell freezing In beiden F llen ist das Ziel gro e F llh hen im Trockengef auf 15 20 mm Schichtdicken zu reduzieren 36 54 A TARS Nnn er DIII Abb 2 9 Einfriermethoden f r gr ere Volumina Links Shell Freezing Ein Kolben wird unter einem Winkel so in das Kuhlbad getaucht dass er bis zu seinem Hals mit der Kuhlflussigkeit bedeckt ist Ein Motor dreht den Kolben so dass das Produkt an der Kolbenwand anfriert Rechts Spin Freezing Eine oder mehrere Flaschen werden an einer Vorrichtung befestigt und in das Kuhlbad eingetaucht Die Vorrichtung dreht die Flasche n so schnell um ihre Achse n dass die Flussigkeit sich gleichmaBig auf den zylindrischen Teil der Flasche n verteilt 54 20 2 THEORETISCHER TEIL Daneben gibt es das Verfahren des vakuuminduzierten Einfrierens snap freezing 27 29 33 36 54 79 Es eignet sich besonders f r sehr geringe Flussigkeitsm
201. wurde Uber ein Nadelfeinventil mit Analoganzeige reguliert In Abb 4 16 ist der vom Hersteller angegebene Zusammenhang zwischen der Ventilstellung und dem Gasfluss fur Luft bei 1 bar Differenzdruck f r den bei unterschiedlichen Einfrierbedingungen genutzten Bereich dargestellt 55 Diese Werte wurden als Evakuiergeschwindigkeiten bernommen 60 O1 gt Evakuiergeschwindigkeit NO ce O O O Gasfluss f r Luft bei 1bar Differenzdruck mbarL s 0 290 310 330 350 370 390 410 430 450 470 490 510 530 550 570 590 610 630 650 Ventilstellung Analoganzeige Abb 4 16 Zusammenhang zwischen Ventilstellung und Evakuiergeschwindigkeit Verschiedene Druckprofile je n 2 mit zugeh riger Ventilstellung und der sich daraus ergebenden Gasflussrate sind in Abb 4 17 wiedergegeben 106 4 ERGEBNISSE UND DISKUSSION 10 2 1 ho E at ay A 0 1 0 01 0 0 5 1 1 5 2 2 5 3 Zeit min Abb 4 17 Druckverlauf in Abh ngigkeit von der Zeit bei verschiedenen Evakuiergeschwindig keiten Abb 4 18 zeigt vier unterschiedliche Einfrierkurven mit dazugeh rigem Verlauf des Kammerdrucks die in diesem Versuch ermittelt wurden Die durchgezogene dicke Kurve beschreibt das Einfrierverhalten unter Atmosph rendruck Das Vakuum wurde hier erst nach dem vollst ndigen Durchfrieren der Probe angelegt Die zugeh rige Druckkurve beginnt daher erst nach dem Plateau der Produkttemperatur Bei dieser Einfrie
202. yophilisates and Hydrophobic Carriers Upon Freezing Conditions Abstract und Poster EUFEPS 3 World Congress on Drug Absorption and Drug Delivery Kopenhagen D nemark 2001 Maier S Neff B Diestelhorst M S verkr p R Optimization of Manufactur ing Conditions and Excipients for an Ophthalmic Lyophilisate Carrier System OLCS Abstract und Poster ADRITELF APV APGI 4 World Meeting Florenz Italien April 2002 Menges G Werkstoffkunde Kunststoffe 4 Auflage Hauser Verlag Meryman HT Sublimation freeze drying without vacuum Science 1959 130 628 629 Methocel Product Specifications and Certificate of Analysis Colorcon Limited Dartford Kent England 2000 Metrohm 756 KF Coulometer Gebrauchsanweisung Metrohm AG Herisau Schweiz Metrohm 774 Oven Sample Processor Gebrauchsanweisung Metrohm AG Herisau Schweiz 189 48 49 51 52 54 55 56 MKS Instruments Produktinformation und Datenblatt Kapazitatsmanome ter MKS Baratron Serie 600 M nchen MKS Instruments Benutzerhandbuch MKS Typ PR 4000 S Einkanal Betriebsger t f r Baratron Druckaufnehmer Kompaktdruckregler oder Gasflussregler monitore M nchen Mai 1997 Murgatroyd K The Freeze Drying Process in Cameron P Good Pharma ceutical Freeze Drying Practice Buffalo Grove IL USA Interpharm Press Inc 1997 Nail SL The Effect of Pressure on Heat Transfer in the Freeze Drying of Parenteral Solution
203. z angeregt werden Das emittierte Fluo reszenzlicht wird als Fluoreszenzspektrum registriert und analytisch ausgewertet Um Fluoreszenz herbeizuf hren muss das Elektronensystem zun chst durch Lichtabsorption angeregt werden Das Absorptionsspektrum bezeichnet man in der Fluorimetrie als Anregungsspektrum Misst man dagegen die Intensit t des ausge strahlten Fluoreszenzlichtes in Abh ngigkeit von der Wellenl nge so erh lt man das Fluoreszenzspektrum ein Emissionsspektrum Bei konstanter Anregungsintensitat ist unter konstanten Messbedingungen die Inten sit t des Fluoreszenzlichtes der Konzentration der Substanz proportional Der Aufbau eines Fluorimeters ist in Abb 3 12 gezeigt 65 Anregungs ot Absorptions Monochromator Monochromator Absorptionsspektrum Emissions Monochromator Emissions Empf nger Emissionsspektrum Abb 3 12 Schematischer Aufbau eines Fluoreszenzspektrometers 65 Durchf hrung a Kalibrationskurven Aus der Fluorescein Natrium Stamml sung wurde eine Verd nnungsreihe herge stellt Damit wurden im Bereich von 1 ng mL bis 5 ng mL und 5 ng mL bis 100 ng mL zwei Kalibrationsreihen vermessen und ber lineare Regression die Geradenglei chungen ermittelt Durch Einsetzen der Emissionsintensit ten der Proben in die Gleichungen wurden unter Ber cksichtigung der Verd nnung die Restgehalte Fluorescein Natrium auf den PTFE Folien in Mikrogramm berechnet 70 3 EXPERIMENT
204. zu einer gleichm Bigen Abk hlung des Tropfens Die REM Aufnahmen zeigen keine Gefrierkonzentra tion Abb 4 37 Die nahezu geschlossene Oberfl chenstruktur Abb 4 40 im Vergleich zu der offenen Struktur der Tropfenunterseite Abb 4 39 l sst jedoch vermuten dass auch hier die Probe von unten nach oben durchfriert Aufgrund der gleichm igen Abk hlung entstehen sehr homogene hexagonale bis runde Poren mit dicken W nden Abb 4 39 Abb 4 41 zeigt schematisch die Porenstruktur auf der Lyophilisatunterseite wie sie sich beim Simulieren eines Eiswachstums bei gleichm iger Abk hlung ohne Temperaturgradienten ergibt Rupprecht beschreibt die Bildung weitgehend homogener Eisstrukturen bei mittlerer Abk hlgeschwindigkeit 66 Diese geordnete regelm ige Matrix haftet so stark an der PTFE Folie dass es 129 4 ERGEBNISSE UND DISKUSSION beim Abl sen zu einem Bruch in der inneren Struktur kommt erkennbar an den Resten des Lyophilisates auf der Folie Abb 4 38 Abb 4 37 bis Abb 4 40 REM Aufnahmen von OLCS die unter langsamem Evakuieren mit 13 4 mbarL s Evakuiergeschwindigkeit eingefroren wurden Methode 2 250 ug HPMC E50 204 ug Fluorescein Natrium fe ae Abb 4 37 AuBere Form des Lyophilisates Abb 4 38 Lyophilisatruckstand auf der PTFE Folie Abb 4 39 Detailaufnahme der Bodenstruktur Abb 4 40 Detailaufnahme der Produktober flache 130 4 ERGEBNISSE UND DISKUSSION Abb 4 41 Schematische
205. zumindest f r einen Polymergehalt von 375 ug ein signifikanter Unterschied in der Haftfestigkeit zwischen allen vier Niveaus der Evakuiergeschwindigkeit bestehen k nnte Daher wird f r diese Versuchsserie eine getrennte statistische Auswertung durchgef hrt Levene s Test zeigt keine Varianzhomogenitat der Stichproben p 0 030 Der Unterschied zwischen den vier Niveaus ist h chst signifikant Kruskal Wallis Test H 17 583 gt Ye 0 05 7 81 p 0 001 Der Games Howell Test ergibt f r die Versuchsserie mit 375 ug Polymergehalt folgendes Evakuiergeschw mbarL s Tabelle 14 p Werte f r die Evakuiergeschwindigkeiten unter ausschlie licher Ber cksichti gung eines Polymergehaltes von 375 ug statistisch signifikante Unterschiede 140 4 ERGEBNISSE UND DISKUSSION Im Fall der Versuchsserie mit 375 ug Polymergehalt hat jede der 4 Evakuierge schwindigkeiten einen statistisch signifikanten Einfluss auf die Haftfestigkeit der Lyophilisate Das Ausma des Effektes der Evakuiergeschwindigkeit wird geringer wenn die Polymerkonzentration sinkt vgl Abb 4 54 Polymergehalt Fur die Datenreihen Haftfestigkeit in Abh ngigkeit vom Polymergehalt ergibt sich keine Varianzhomogenitat p lt 0 001 Die Mittelwerte der Haftfestigkeit auf den drei Niveaus des Polymergehaltes unter scheiden sich h chst signifikant H 29 730 gt X 0 05 5 99 p lt 0 001 Schlie lich zeigt der Games Howell Test einen h chst si

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