0208 B 57 plus Box
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1. N A 4 24 Refer ncias 1 Bunce M O Neill CM Barnardo MCNM Krausa P Browning MJ Morris PJ Welsh KI Phototyping comprehensive DNA typing for HLA A B C DRB1 DRB3 DRB4 DRB5 amp DQB1 by PCR with 144 primer mixes utilising sequence specific primers PCR SSP Tissue Antigens 1995 46 355 367 2 Bodmer JG Marsh SG Albert ED Bodmer WF Bontrop RE Charron Dupont B Erlich HA Fauchet R Bach B Mayr WR Parham P Sasazuki T Schreuder GM Strominger JL Svejgaard A Terasaki PI Nomenclature for factors of the HLA System 1996 Hum Immunol 1997 53 98 128 3 Nomenclature for factors of the HLA System Compiled by Steven G E Marsh for the WHO Nomenclature Committee for Factors of the HLA System http www anthonynolan com HIG nomenc html 4 Schaffer M Olerup O HLA AB typing by polymerase chain reaction with sequence specific primers more accurate less errors and increased resolution compared to serological typing Tissue Antigens 2001 58 299 307 5 Phillips E Mallal S Drug hypersensitivity in HIV Curr Opin Allergy Clin Immunol 2007 7 324 30 6 Waters LJ Mandalia S Gazzard B Nelson M Prospective HLA B 5701 screening and abacavir hypersensitivity a single centre experience AIDS 2007 21 2533 4 7 Mallal S Nolan D Witt C Masel G Martin AM Moore C Sayer D Castley A Mamotte C Maxwell D James Christiansen FT Association between presence of HLA B 5701 HLA DR7 and HLA DQ3 and hyp2. at estar completamente incorporado 5 Numa superf cie nivelada monte a placa do gel com 96 po os 6 Verta uma camada de gel com cerca de 5mm 7 Deixe o gel arrefecer Aten o este reagente um forte agente mutag nico leia atentamente a MSDS do produto Electroforese Submirja o gel na tina de electroforese com tamp o TAE 1X Remova os pentes com cuidado do gel Adicione 10 pl do produto de PCR em cada po o e o o N m Ligue a tina de electroforese corrente com uma voltagem m dia 115V 5 Deixe a electroforese correr por cerca de 20 minutes ou at o corante estar a 2 3 da linha 6 Ponha o gel no transiluminador 7 Fotografe o gel e identifique o 8 Use a Folha de interpreta o de resultados para interpretar os resultados 9 24 Esquema da tira HLA B 57 plus 1 0 Direc o da pipetagem 0060060606 A numera o pode diferir de placa para placa O n 1 pode ser 4 7 10 O n 2 pode ser 5 8 11 O n 3 pode ser 6 9 12 I dentifica o da Placa HLA B 57 Plus Box 1 0 Posi o HLA B 57 1d 5701 5706 5708 5710 5711 5714 te 5703 and 5707 Controlo positivo 1h Controlo negativo 10 24 JMA AAI J 00000060 geneBOX investiga o e desenvolvimento de teste diagn sticos garante que os primers presentes no kit de tipagem HLA B 57 plus apresentam as especificidades dadas nas folhas e tabelas de interpreta o de result
3. de subst ncia trabalhe apenas com protec o adequada para olhos e pele 11 Medidas a tomar no caso de derrame acidental Precau es pessoais evite o contacto directo com a subst ncia Limpeza limpe normalmente a rea afectada n o s o necess rios cuidados adicionais Protec o da pele use uma bata de laborat rio 19 24 Folha de Dados de Seguran a 1 3 Material Safety Data Sheet MSDS Produtos de tipagem SSP da geneBOX Esta folha de dados de seguran a aplic vel a todos os produtos de tipagem por PCR SSP da geneBox 1 Produtos Qu micos e Identifica o da Companhia Data de realiza o Maio 2010 Grupo do produto Produtos de tipagem SSP da geneBOX Manufactura o geneBOX R amp D Diagnostic Tests biocant centro de inova o em biotecnologia n cleo 4 lote 3 3060 197 cantanhede portugal tel fax 351 231 410 946 351 231 410 947 e mail info genebox com 2 Composi o e Informa o sobre os reagentes Componente Qu mico Nome vulgar Placa Acido Desoxiribonucleico Oligonucle tido Vermelho de Cresol Mistura de reac o Desoxiribonucle tidos Nucle tidos Tamp o NH4 Cloreto de Magn sio Mgci2 Vermelho de Cresol Glicerol Taq DNA Polimerase Taq 3 Propriedades f sico qu micas Componente Aspecto Cor Odor Placa seco no fundo do po o vermelho nenhum Mistura de reac o l quido vermelho rosa nenhum 4 Informa o Toxicol gica Qu mico Toxicidade Glicerol L
4. 0197 po eve genesox 000 DESENVOLVIMENTO E PRODU O DE TESTES DE DIAGN STICO biocant centro de inova o em biotecnologia n cleo 4 lote 3 3060 197 cantanhede portugal tel 351 231 410 946 fax 351 231 410 947 e mail info genebox com www genebox com 24 24 C digo do Produto 0208 HLA B 57 plus 1 0 Typing Kit Dispositivo para utiliza o in vitro Manual de Instru es oqo eUe geneBox 000 DESENVOLVIMENTO E PRODU O DE TESTES DE DIAGN STICO Vers o1 4 Maio 2010 0197 po euUe genesox 000 DESENVOLVIMENTO E PRODU O DE TESTES DE DIAGN STICO biocant centro de inova o em biotecnologia n cleo 4 lote 3 3060 197 cantanhede portugal tel 351 231 410 946 fax 351 231 410 947 e mail info genebox com www genebox com 2 24 0197 spe eve genesox 000 DESENVOLVIMENTO E PRODU AO biocant centro de inova o em biotecnologia n cleo 4 lote 3 3060 197 cantanhede portugal tel 351 231 410 946 fax 351 231 410 947 e mail info genebox com www genebox com 23 24 13 Hughes DA Vilar FJ Ward CC Alfirevic A Park BK Pirmohamed M Cost effectiveness analysis of HLA B 5701 genotyping in preventing abacavir hypersensitivity Pharmacogenetics 2004 14 335 42 ndice 14 Hughes AR Mosteller M Bansal AT Davies K Haneline SA Lai EH Nangle K Scott T Spreen WR Warren LL Roses AD CNA30027 Study Team CNA30032 Study Apresenta o PE a EEN NE AE EREIN E
5. 60 197 Cantanhede Portugal Organismo Notificador T V Rheinland Product Safety GmbH T V Rheinland Group Am Grauen Stein 51105 K ln Cologne Germany Organismo notificador n mero 0197 Sandra Balseiro Directora T cnica 17 24 Aviso de garantia geneBOX investiga o e desenvolvimento de teste diagn sticos responsabiliza se perante os seus clientes pelos defeitos no material e componentes dos seus produtos aplicados em condi es normais Os produtos da empresa que apresentam esta garantia devem ser substitu dos sem encargos para o cliente Esta garantia aplica se s para produtos que sejam manipulados e armazenados de acordo com as especifica es e recomenda es de utiliza o As reclama es devem ser enviadas por escrito directamente para a geneBOX e devem ser acompanhadas por uma c pia da guia de transporte ou factura do produto Este produto n o pode ser reformulado reembalado ou revendido em nenhuma forma sem o expresso consentimento da geneBOX investiga o e desenvolvimento de teste diagn sticos 16 24 Protocolo de electroforese em gel de agarose Prepara o do gel de agarose a 2 1 Dissolver 4 gramas de p agarose em 200 ml de tamp o TAE 1X 2 Dissolver completamente a agarose aquecendo a no microondas 3 Arrefe a o gel at aproximadamente 502C 4 Adicione pelo menos 20 ul de brometo de et dio 10 mg ml ou de Sybr Safe 10000x concentrado agarose Agite
6. A Cw 9273 LADA 0202 8001 0702 5703 0701 0802 1a 1b 1c le 1g 9052 DBB 020101 5701 0602 la 1b 1c 1d 1g 9398 FH18 7401 3601 5301 5703 0401 0701 la 1b 1c le 1g 5 24 Componentes do HLA B57 e Placas de tipagem de HLA B 57 48 tipagens 16 Placas 3 amostras cada conservar de 15 C a 30 2C e Mistura de reac o com Taq Polimerase 16 X 80 ul conservar de 15 C a 30 C e Selantes de Placas 48 C psulas selantes e Manual de instru es 1 Manual de Instru es com pares de primers espec ficos desidratados 6 pares de primers espec ficos um controlo positivo e 1 controlo negativo por amostra Componentes da PCR Master Mix Nucle tidos concentra o final de cada dNTP 600 uM Tamp o da PCR concentra es finais s o 3 3x NH4 2 0 mM MgCl e 0 4 u l Taq DNA polimerase pH 8 3 Glicerol concentra o final 16 6 Vermelho de cresol concentra o final de 300ug ml 6 24 Folha de Dados de Seguran a 2 3 Material Safety Data Sheet MSDS 6 Protec o pessoal Protec o das m os use luvas apropriadas resistentes a qu micos Protec o dos olhos recomenda se o uso de culos de protec o qu mica 7 Manipula o e armazenamento Manipula o evite o contacto directo com a subst ncia Armazenamento armazene temperatura aconselhada proteja do contacto com a luz Danifica o da embalagem protectora rejeitar o const
7. D50 oral 4090 mg kg ratinho LD50 oral 12600 mg kg rato LD50 oral 1480 mg kg humano 5 Estabilidade e reactividade Condi es a evitar Calor e humidade Incompatibilidades Bases e agentes oxidantes fortes 18 24 Protocolo de amplifica o por PCR Reagentes e Amostra de DNA 100 200 ng ul e PCR Master Mix e gua bi destilada est ril n o fornecida Extrac o de DNA Para a tipagem por SSP necess rio DNA extra puro Recomenda se que o isolamento de DNA seja efectuado utilizando kits de extrac o com marca o CE que garantam um r cio DO 260 280 maior do que 1 6 e uma concentra o entre 100ng 200 ng ul Alternativamente o DNA pode ser extra do utilizando sais de Brometo de Trimetilamonia DTAB CTAB ou por salting out dissolvendo o em Tamp o TE Devem ser asseguradas o mesmo n vel de DO e de concentra o N O UTILIZE SANGUE HEPARINIZADO COM ESTE M TODO Ampi EO por PCR Agite brevemente os tubos de DNA e da mistura de reac o 2 Junte e 25 ul da PCR Master Mix e 50uyl de dd H20 num tubo de 0 7 ml ou 1 5 ml Agite vigorosamente durante 15s 4 Pipete 10 ul da mistura para o controlo negativo Adicione mistura de reac o 7 pl da amostra de DNA conc 100 200 ng ul 6 Agite vigorosamente durante 15s 7 Pipete 10 pl da mistura para cada um dos restantes 7 po os 8 Repita os passos anteriores para as restantes amostras de DNA para completar a placa de tipagem 9 Sel
8. E AEE A 4 Team Association of genetic variations in HLA B region with hypersensitivity to abacavir in some but not all populations Pharmacogenomics 2004 5 203 11 Altera es e Melhoramento do produto 4 15 Gillespie GM Stewart ones G Rengasamy J Beattie T Bwayo JJ Plummer FA Kaul Controlo da Qualidade e sertmeeseeremere em eeranerneerrsess 5 R McMichael AJ Easterbrook P Dong T Jones EY Rowland Jones SL Strong TCR z a r Conservation and Altered T Cell Cross Reactivity Characterize a B 57 Restricted Valida o Linhas Celulares custear 5 Immune Response in HIV 1 Infection J Immunol 2006 Sep 15 177 6 3893 902 Componentes do HLA B 57 plus 1 0 Typing Kit 6 Protocolo de amplifica o por PCR eemenerems 7 Reagentes niahi anana ena aa EEA 7 Extrac o de DNA 7 Amplifica o por PCR es 7 Par metros do programa de PCR 8 Protocolo de electroforese em gel de agarose 9 Prepara o do gel a 2 ieeeeeeemeaeeerasa 9 ElectrofOreSe isinin ania O Esquema da placa HLA B 57 plus 1 0 ei 10 Identifica o da placa HLA B 57 plus 1 0 css 10 Folha de interpreta o dos Resultados ceeses 1 Tabela de interpreta o dos Resultados ee 11 Guia de resolu o de problemas sssssisesrrrnsrrernrrnsnsn 12 one Avisos precau es iraniana raiar 13 ih geneBox Guja t CN CO DR 14 000 DESENVOLVIMENTO E PRODU O Ga faltia aii s
9. ados do produto 1 Placa de Tipagem Armazenamento a 20 C os primers desidratados permanecem est veis durante 12 a 19 meses a partir da data de produ o ver validade do lote na embalagem Armazenamento a 42C os primers desidratados permanecem est veis durante 12 meses a partir da data de produ o temperatura ambiente os primers desidratados permanecem est veis durante 3 a 4 semanas a partir da data de recep o Quando o selante removido os primers desidratados permanecem est veis durante 2 dias no m ximo desde que n o humede am 2 Mistura de Reac o Armazenamento a 20 C a mistura de reac o permanece est vel durante 18 meses a partir da data de produ o ver validade do lote na embalagem Armazenamento a 4 C a mistura de reac o permanece est vel durante 15 dias a partir da data de recep o temperatura ambiente a mistura de reac o permanece est vel durante 3 dias a partir da data de recep o A mistura de reac o nunca deve ser deixada ou armazenada com a tampa aberta 3 DNA O DNA extra do por salting out ou por qualquer outro m todo deve ser armazenado a 4 C ou 202C Ao optar pela congela o das amostras devem ser evitadas ciclos repetidos de congela o descongela o de modo a impedir a degrada o da amostra As amostras de DNA armazenadas em dH 0 permanecem est veis durante pelo menos 4 semanas a 42C ou 2 anos a 202C As amostras de DNA arma
10. de 96 Tamb m se deve ter em aten o a temperatura de aquecimento do aparelho Se a temperatura de aquecimento n o for suficiente v o se verificar problemas de condensa o 5 Termociclador Recomenda se utiliza o de qualquer Termociclador que apresente as seguintes caracter sticas heating rate superior a 2 5 C sec cooling rate superior a 1 52C sec gama de temperatures 4 100 C uniformidade de temperaturas 0 5 C heated lid superior a 1002C 6 Validade Como especificado na embalagem Se os problemas persistirem por favor contactem com o apoio t cnico para o 351 231 410 946 14 24 Folha de interpreta o de Resultados Posso maass ms corroe la 2a 3a 5701 14 380 790 1b 2b 3b 5701 14 excepto 5708 5710 5712 225 790 1c 2c 3c 5701 14 except 5705 5706 5711 165 790 1d 2d 3d 5701 5706 5708 5710 5711 5714 165 790 le 2e 2e 5703 e 5707 155 790 1f 2f 2f 5714 185 790 lg 29 29 Controlo Positivo 790 1h 2h 2h Controlo negativo DNA1 DNA2 DNA3 Control primer pares match with non allelic sequences The internal positive control primer pairs amplify segments of the HLA DRB1 gene giving rise to 1600 base pair fragments and 796 base pair fragment In the presence of the specific band amplification the control band intensity often decreases The PCR reaction is only valid in the presence of control band or in some cases in
11. e a placa de tipagem com as respectivas tampas e ponha a num termociclador de 96 po os 1 24 Par metros do programa PCR Passo Temperatura Tempo Ciclos Denatura o 96 2C 1 min 1 Denatura o 96 2C 25 seg 21 Emparelhamento 65 C 45 seg Extens o 722C 30 seg Extens o 72 2C 10 min 1 10 No final da PCR guarde a placa a 2 8 2C 11 Detecte os produtos do PCR com uma electroforese em gel de agarose a 2 12 Use a Tabela de interpreta o de resultados para interpretar os resultados Declara o de Conformidade Nome do Produto HLA B 57 plus Numero do Produto GB 03 05 Utiliza o HLA B 57 teste de alelos e associa o a doen a Produ o geneBOX R amp D Diagnostic Tests biocant centro de inova o em biotecnologia n cleo 4 lote 3 3060 197 cantanhede portugal N s geneBOX investiga o e desenvolvimento de testes de diagn stico indubitavelmente declaramos que este produto ao qual se relaciona esta declara o de conformidade est em conformidade com os seguintes documentos normativos ISO 9001 2008 e ISO 13485 2004 Seguindo ainda as indica es da Directiva Europeia 98 79 CE sobre dispositivos m dicos de diagn stico in vitro Anexo ll lista B conformidade de acordo com o Anexo IV transposto para as leis nacionais dos estados membros da Uni o Europeia A ficha e os documentos t cnicos deste produto s o mantidos na geneBOX biocant centro de inova o em biotecnologia 30
12. ersensitivity to HIV 1 reverse transcriptase inhibitor abacavir Lancet 2002 359 727 32 8 Vilar FJ Naisbitt DJ Park BK Pirmohamed M Mechanisms of drug hypersensitivity in HIV infected patients the role of the immune system J HIV Ther 2003 8 42 7 9 Lucas A Nolan D Mallal S HLA B 5701 screening for susceptibility to abacavir hypersensitivity Antimicrob Chemother 2007 59 591 3 10 Chui CK Brumme ZL Brumme CJ Yip B Phillips EJ Montaner JS Harrigan PR A simple screening approach to reduce B 5701 associated abacavir hypersensitivity on the basis of sequence variation in HIV reverse transcriptase Clin Infect Dis 2007 44 1503 8 11 Mallal S Phillips E Carosi G Molina JM Workman C Tomazic J J gel Guedes E Rugina S Kozyrev O Cid JF Hay P Nolan D Hughes S Hughes A Ryan S Fitch N Thorbon D Benbow A PREDICT 1 Study Team HLA B 5701 screening for hypersensitivity to abacavir N Engl Med 2008 358 568 79 12 Sun HY Hung CC Lin PH Chang SF Yang CY Chang SY Chang SC Incidence of abacavir hypersensitivity and its relationship with HLA B 5701 in HIV infected patients in Taiwan J Antimicrob Chemother 2007 60 599 604 21 24 Folha de Dados de Seguran a 3 3 Material Safety Data Sheet MSDS 12 Informa o ecol gica N o existem dados dispon veis 13 Informa o sobre a elimina o de res duos Elimine o material de acordo com toda a regulamenta o aplic vel os res duos devem ser devida
13. ilas A ana Ga RS LN dll e Gus BELA T Ra 15 biocant centro de inova o em biotecnologia Aviso de Garantia s cena rsrerrenseneaer me rsnarsansenraacraa aaa 16 n cleo 4 lote 3 E 3060 197 cantanhede Declara o de Conformidade ienes 17 portugal Folha de dados de seguran a eesssccsssrreisrirnimrnrrns 18 tel 351 231 410 946 Refer ncias s sais dsoser iaraa das Hina ara bio aaia ea 21 fax 351 231 410 947 e mail info genebox com www genebox com 22 24 3 24 Alguns subtipos do gene HLA B 57 est o associados a uma progress o lenta da doen a em doentes infectados pelo HIV 1 particularmente o alelo B 5701 em caucasianos e B 5703 em africanos A presen a deste alelo B 5701 tem sido tamb m fortemente associado com a hipersensibilidade relacionada com ABACAVIR O HLA B 57 tem vindo tamb m a ser associado a infec o pelo HCV e Psor ase Este kit cont m tiras com misturas de primers desidratadas e PCR Master Mix para efectuar a identifica o do alelo HLA B5701 Altera es e melhoramento do Produto O kit HLA B 57 Single est constantemente a ser actualizado ao n vel da sua especificidade e interpreta o de modo a incluir novas associa es a doen a que venham a ser descritas Este produto pode tamb m ser melhorado de modo a aumentar o seu rendimento As altera es adi es ou modifica es de primers em rela o ao lote anterior est o detalhadas na tabela abaixo Tubo Primers motivo
14. ituinte contido na embalagem 8 Perigos Os componentes da mistura de reac o podem ser perigosos se inalados ingeridos ou absorvidos pela pele Este material pode causar irrita o da pele dos olhos e do tracto respirat rio A ingest o de grandes quantidades desta mistura pode causar dores de est mago v mitos ou diarreia 9 Medidas de Primeiros Socorros No caso de contacto com os olhos deve lavar imediatamente os olhos com gua abundante por cerca de 15 minutos Deve consultar o seu m dico No caso de contacto com a pele deve lavar imediatamente a zona afectada com gua corrente e sab o Lave a roupa contaminada antes da sua utiliza o No caso de ingest o lave a boca com gua abundante Deve contactar o seu m dico se necess rio No caso de inala o mudar a v tima para um local arejado Se se encontrar inanimado aplique respira o artificial Se apresentar dificuldades respirat rias aplique oxig nio Deve consultar o seu m dico 10 Medidas a tomar em caso de inc ndio Meios de extin o gua di xido de carbono p qu mico seco ou espuma apropriada Meios de extin o n o aconselhados n o existem restri es conhecidas Perigos espec ficos de exposi o em caso de inc ndio podem emitir fumos t xicos de di xido e mon xido de carbono nitrog nio f sforo cloreto de hidrog nio e g s hidrog nio Equipamento especial de combate ao inc ndio quando s o libertadas grandes quantidades
15. mente tratados e ou incinerados 14 Informa o sobre o transporte No transporte dos Kits devem estar a seguradas as temperaturas n o devendo ultrapassar os 252C A dura o do transporte n o deve ser superior a 3 dias de modo a garantir que todos os componentes do Kit cheguem em perfeitas condi es aos seus destinat rios 15 Contactos teis N mero Nacional de Emerg ncia 112 Centro de Informa o Anti Venenos 808 250 143 16 Outras informa es As informa es a cima dispon veis s o baseados no n vel de conhecimento actual devendo ser utilizado apenas como guia A geneBOX R amp D Diagnostic Tests n o se responsabiliza por qualquer dano causado pela manipula o inapropriada ou pelo contacto com os referidos produtos Para mais esclarecimentos por favor contactem com o apoio t cnico para o 351 231 410 946 20 24 Controlo de Qualidade Foram usadas amostras de DNA de 3 linhas celulares constantes do SSOP Panel do 13th International Histocompatibility Workshop para verificar a especificidade das misturas de primers deste kit Nome do Workshop Designa o IHW 09273 LADA IHW 09052 DBB IHW 09398 FH18 N o foram registados Falsos positivos ou falsos negativos O controlo negativo pode detectar contamina o cruzada com produtos de PCR Valida o Linhas Celulares Kit de tipagem por PCR SSP HLA B 57 plus Tipagem celular Se Linha celular Po os positivos HLA A HLA B HL
16. mento dos kits a temperaturas n o recomendadas podem levar rupturas no material e contamina o dos reagentes dos kits Os materiais pl sticos fornecidos neste kit s o resistentes gama de temperaturas de utiliza o e armazenamento recomendadas A sua utiliza o em gamas distintas de temperaturas pode causar rupturas impossibilitando a utiliza o normal do kit Verifique a concentra o e qualidade de todas as amostras de DNA antes de utilizar este kit Instru es de gerais de seguran a no laborat rio N o coma beba ou fume dentro do laborat rio Utilize sempre luvas descart veis e mude as com frequ ncia Utilize batas limpas e proteja os olhos sempre que se justifique Lave as m os antes e depois de qualquer manipula o de amostras ou reagentes Lave a rea de trabalho antes e depois de qualquer manipula o N o pipete com a boca 13 24
17. om o controlo interno normal Degrada o da amostra de DNA Reextraia a amostra de DNA de material fresco Repita a tipagem com um DNA de boa qualidade Detec o de mais de dois alelos espec ficos Amostra de DNA muito concentrada Verifique a qualidade e concentra o do DNA Dissolva o DNA em q H20 de forma a obter a concentra o exacta Repita a tipagem com um DNA de boa qualidade Contamina o com outros produtos de PCR ou outras amostras de DNA durante a prepara o do PCR Limpe a zona de trabalho Trabalhe em zonas Pr e P s PCR separadas Utilize batas distintas para a zona Pr e P s PCR Mude de luvas frequentemente Repita a tipagem com um DNA de boa qualidade Esfrega o de bandas 12 24 Degrada o da amostra de DNA Reextraia a amostra de DNA de material fresco Repita a tipagem com um DNA de boa qualidade Amostra de DNA muito concentrada Verifique a qualidade e concentra o do DNA Dissolva o DNA em q H20 de forma a obter a concentra o exacta Repita a tipagem com um DNA de boa qualidade Problemas com tamp o de electroforese Fora de prazo ou composi o errada Use um tamp o recomendado novo Avisos e precau es A amplifica o por PCR permite nos obter milh es de c pias de DNA a partir de uma pequena quantidade de amostra Infelizmente isto tamb m verdade para o DNA contaminante q
18. the presence of the specific band In the absence of the control band please repeat the typing Tabela de Interpreta o de resultados Associated with disease Treatment and clinical symptoms HLA B 5701 No association HLA B 5706 5711 14 No association HLA B 5708 5710 gt 14 No association HLA B 5714 514 Association in Africans No association in Caucasoid HLA B 5703 1 15 HLA B57 NEGATIVO 11 24 Guia de resolu o de problemas PROBLEMAS Bandas controlo e espec ficas fracas POSSIVEIS CAUSAS Concentra o da amostra de DNA baixa SUGEST ES Verifique a qualidade e concentra o do DNA Reextraia a amostra de DNA ou tente n o adicionar gua mistura de reac o Repita a tipagem com um DNA de boa qualidade Presen a de inibidores da Taq polimerase nas amostras de DNA Repurifique a amostra de DNA Repita a tipagem com um DNA de boa qualidade Os controlos internos falharam em diversos po os Presen a de inibidores da Taq polimerase nas amostras de DNA Repurifique a amostra de DNA Repita a tipagem com um DNA de boa qualidade Produtos de amplifica o secos Verifique a selagem das placas Repita a tipagem utilizando um adaptador de silicone para placas de 96 e ou adicione leo mineral Falsos negativos de uma banda espec fica c
19. ue pode comprometer performance da nossa reac o Consequentemente pr ticas laboratoriais espec ficas podem evitar a presen a de amplifica es inespec ficas Em baixo encontram se descriminadas as recomenda es da Genebox Separe fisicamente as reas de pr PCR e de p s PCR O fluxo Laboratorial deve ser sempre unidireccional da rea pr PCR para a rea p s PCR Deve sempre utilizar se equipamentos espec ficos para cada area de trabalho prepara o de amostras pr amplifica o amplifica o e p s amplifica o Todos os equipamentos utilizados na rea de p s PCR n o devem sais desta zona Utilize micropipetas luvas e batas espec ficas para cada rea Utilize preferencialmente luvas sem talco uma vez que o talco pode inibir a reac o de PCR Utilize pontas de filtro de forma a minimizar contamina es cruzadas Verifique periodicamente as micropipetas de forma a assegurar a varia o de pipetagem inferior a 5 Utilize micropipetas adaptadas a cada volume de pipetagem Verifique periodicamente os termocicladores de forma a assegurar a varia o de temperaturas inferiores a 1 Abra e feche os reagentes com cuidado Depois de utilizar armazene os restantes componentes do kit s temperaturas recomendadas devidamente fechados N o utilize o kit com a validade expirada Os componentes dos kits s o resistentes s temperaturas de armazenamento indicadas O armazena
20. zenadas em tamp o TE permanecem est veis durante pelo menos 2 anos a 42C ou 5 anos a 20 C 15 24 Guia T cnico 1 Pureza e Concentra o do DNA Para obter bons resultados com o HLA B 57 plus 1 0 Typing Kit a pureza da amostra de DNA cr tica Ter uma amostra pura significa obter uma raz o 260nm 280nm de DO superior a 1 6 e uma por o de DNA superior a 9 4 kb A elevada degrada o do DNA ou uma raz o 260nm 280nm inferior a 1 5 requer uma nova extrac o de DNA Cada amostra de DNA deve ter aproximadamente 100 a 200 ng l Concentra es elevadas de DNA provocam um decl nio consider vel na especificidade da PCR Recomenda se o uso de qualquer kit de extrac o de DNA que apresente marca o CE de modo a obter um DNA extra puro 2 Taq Polimerase O HLA B 57 plus 1 0 Typing Kit foi intensivamente testado utilizando a Taq da Reagente 5 Reagente 5 Lisboa Portugal 3 Mistura de reac o Para uma boa performance da tipagem com o HLA B 57 plus 1 0 Typing Ki obrigat ria a utiliza o da PCR Master Mix fornecida com o Kit t 4 Procedimentos de amplifica o No fim da PCR examine o grau de evapora o e de condensa o da mistura de reac o da PCR Se as perdas de volume forem superiores a 20 n o devem ser validados os resultados obtidos De forma a prevenir esta situa o devem adicionar previamente leo mineral mistura de reac o ou utilizar um adaptador de silicone para placas
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