Manual de Procedimentos do Laboratório de - Ainfo
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1. Biof brica m todo de propaga o massal que utiliza a micropropaga o para reproduzir plantas de interesse econ mico de forma mais r pida e homog nea conservando ou aprimorando as caracter sticas gen ticas iniciais e desejadas da planta que lhe deu origem Manual de Procedimentos do Laborat rio de Cultura de Tecidos da Embrapa Amaz nia Ocidental 11 Calo prolifera o desorganizada de c lulas a partir de segmentos de rg os das plantas irregularmente diferenciadas normalmente em resposta a inj rias qu micas ou f sicas C lula diferenciada qualquer c lula n o meristematica C lula n o diferenciada c lula meristem tica ou que foi artificialmente induzida perda da identidade tissular Clone grupo de c lulas geneticamente id nticas produzidas assexuadamente por divis es mit ticas de uma c lula isolada ou de plantas oriundas de um nico indiv duo por propaga o vegetativa Compet ncia a capacidade de uma c lula particular ou grupo de c lulas responder de maneira esperada quando fornecido o sinal de desenvolvimento apropriado Cultura de anteras cultivo in vitro de anteras isoladas do bot o floral com o objetivo de obter plantas hapl ides Desdiferencia o celular retorno de c lulas diferenciadas ao estado meristem tico n o diferenciado Determina o celular processo pelo qual o potencial de desenvolvimento de uma c lula torna se limitado a uma rota espec fica D2. ISSN 1517 3135 61 Dezembro 2008 Manual de Procedimentos do Laborat rio de Cultura de Tecidos da Embrapa Amaz nia Ocidental ISSN 1517 3135 Dezembro 2008 Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecu ria Embrapa Amaz nia Ocidental Minist rio da Agricultura Pecu ria e Abastecimento Documentos Manual de Procedimentos do Laborat rio de Cultura de Tecidos da Embrapa Amaz nia Ocidental Regina Caetano Quisen Paula Cristina da Silva Angelo Embrapa Amaz nia Ocidental Manaus AM 2008 Exemplares desta publica o podem ser adquiridos na Embrapa Amaz nia Ocidental Rodovia AM 010 km 29 Estrada Manaus Itacoatiara Caixa Postal 319 Fone 92 3303 7800 Fax 92 3303 7820 www cpaa embrapa br Comit de Publica es da Unidade Presidente Celso Paulo de Azevedo Secret ria Gleise Maria Teles de Oliveira Membros Cheila de Lima Boijink Cintia Rodrigues de Souza Jos Ricardo Pupo Gon alves Luis Antonio Kioshi Inoue Marcos Vin cius Bastos Garcia Maria Augusta Abtibol Brito Paula Cristina da Silva ngelo Paulo C sar Teixeira Regina Caetano Quisen S glia Regina dos Santos Souza Revisor de texto S glia Regina dos Santos Souza Normaliza o bibliogr fica Maria Augusta Abtibol Brito Diagrama o Gleise Maria Teles de Oliveira Capa Gleise Maria Teles de Oliveira Fotos da capa Regina Caetano Quisen 1 edi o 1 impress o 2008 300 Todos os direitos reservados A reprodu o n o autori
3. Fe mangan s Mn zinco Zn boro B cobre Cu molibd nio Mo pelo que s o denominados micronutrientes Tamb m importante a incorpora o de Cobalto Co e de lodo I ao meio Alguns meios de cultura usam os microelementos do meio B5 GAMBORG et al 1968 ou misturas mais concentradas nos meios MS MURASHIGE SKOOG 1962 e H BOURGIN NISCH 1967 Algumas c lulas tecidos e pl ntulas cultivados in vitro n o encontram condi es adequadas de ilumina o e concentra o de CO e s vezes n o apresentam teores de clorofila suficientes para realizar fotoss ntese que sustente o crescimento Essas c lulas e tecidos s o heterotr ficos e dependem de uma fonte externa de energia que deve ser incorporada ao meio de cultura os carboidratos A fonte mais comum de carbono a sacarose que pode ser total ou parcialmente hidrolisada em glucose e frutose com possibilidade de ser igualmente utilizadas em meios espec ficos Outros carboidratos que t m sido igualmente testados incluem a lactose a maltose a galactose e o amido no entanto esses compostos s o geralmente muito inferiores sacarose ou glucose como fonte de energia A sacarose normalmente usada em concentra es entre 2 3 Manual de Procedimentos do Laborat rio de Cultura de Tecidos da Embrapa Amaz nia Ocidental 27 As plantas no seu ambiente natural sintetizam as vitaminas que s o necess rias para seu crescimento e para seu desenvolviment
4. s o outro em 300 mL de agua destilada e deionizada completando o volume para 1 000 mL seguido de agita o O preparado deve ser colocado em frasco e armazenado em geladeira Manual de Procedimentos do Laborat rio de Cultura de Tecidos da Embrapa Amaz nia Ocidental 33 O estoque G Fe EDTA preparado com a dilui o de Na EDTA 2H 0 em 800 mL de gua destilada e deionizada morna Ap s dissolu o manter a agita o e adicionar lentamente o FeSO 7H 0 Ap s dissolu o completar o volume para 1 000 mL e agitar novamente Colocar em frasco escuro coberto com papel alum nio e armazenar em geladeira Dessa forma para o preparo de 1 000 mL de meio MS deve se usar 10 mL de cada solu o estoque Para as vitaminas tamb m s o preparadas solu es estoque e nesses casos por tratar se de solu es org nicas recomenda se preparo em frascos menores ou estocagem em freezer a fim de dificultar o desenvolvimento de microrganismos O estoque H preparado dissolvendo se os tr s componentes em 300 mL de gua destilada e deionizada e em seguida completando o volume para 1 000 mL agitando bem e armazenando em frasco na geladeira Da mesma maneira s o preparadas as solu es e J No caso de reguladores de crescimento deve se ficar atento solubilidade do produto As solu es s o preparadas pesando se a quantidade devida que dissolvida com posterior adi o de gua Os reguladores de crescimento s o
5. MgSO 7HLO NaHLPO HI O Nal SO NH NO NH HI PO Nh I SO Micronutrientes CoCll 6 HI O CuSO CuSO 5 HI O Fe SO H BO KI MnSO 4 H O HI MoO HI O Nal MoO 2 HI O ZnSO 7 HI O Fe SO 7 HLO Nal EDTA 2 HI O Organicos Acido f lico Acido indol ac tico Acido nicotinico Biotina Glicina Mio inositol Piridoxina hcl Tiamina hcl 0 025 0 025 3 0 0 75 13 2 0 25 2 0 27 8 37 2 1 0 100 1 0 10 0 0 025 10 0 0 25 10 0 27 8 37 2 0 5 0 1 5 0 0 05 2 0 100 0 5 0 5 440 0 170 0 1900 0 370 0 1650 0 0 025 0 025 6 2 0 83 0 25 8 6 27 8 37 2 440 0 170 0 1900 0 370 0 1650 0 0 025 0 025 6 2 0 83 22 3 0 25 8 6 27 8 37 2 0 5 2 0 100 0 5 0 1 300 0 65 0 80 0 720 0 19 0 200 0 0 001 2 5 1 5 0 75 5 0 1 25 3 0 0 25 6 2 22 3 0 25 8 6 27 8 37 2 1 0 0 1 0 2 5 0 1 0 13 2 0 1 1 0 15 0 20 0 5 0 1000 0 5 5 0 White 1963 White 1937 Originalmente 28 mg L de FeDTPA Gamborg 1977 incluiu 1 3 mg L de nicotinamida Gamborg 1968 Murashige e Skoog 1962 suplementado tamb m incluiu 1g L de hidrolisado prot ico Manual de Procedimentos do Laborat rio de Cultura de Tecidos da Embrapa Amaz nia Ocidental 31 Preparo do meio de cultura Para cada fase de desenvolvimento da cultura in vitro as formula es ou dosagens dos meios var
6. NaOH 1M ou etanol ambiente Picloram 241 5 autoclave gua Citocininas KIN 215 2 autoclave 4 65 0 215 gotas de HCI 1M 0 BAP 225 3 autoclave 4 44 0 225 gotas de HCI 1M ambiente 2 ip 203 2 4 92 0 203 gotas de HCI 1M 0 Z 219 2 filtragem 4 56 0 219 gotas de HCI 1M 0 TDZ 220 2 autoclave 4 54 0 220 lcool 70 ou DMSO 0 Outros GA 346 4 filtragem 2 89 0 346 etanol 50 ou NaOH ambiente ABA 264 3 filtragem 3 78 0 264 gua gotas de HCI 1 20 2 4 D diclofenoxiac tico AIA cido indolil 3 ac tico AIB cido indloil 3 but rico ANA cido alfa naftaleno ac tico Citocinina BAP BA benzilamino purina KIN cinetina TDZ thidiazuron 2 iP N 2 isopenteniladenina Z zeatina Outros GA cido giberelico ABA cido abc sico Armazenamento do reagente s lido Verifique sempre no r tulo dos frascos qual a temperatura de armazenamento de tudo que estiver utilizando Os reguladores de crescimento que s o termol beis devem ser esterilizados por ultrafiltra o Esse processo mais lento e mais caro que a autoclavagem mas garante a integridade dos reguladores no meio de cultura As solu es a ser esterilizadas s o passadas por um filtro com tamanho de poro de 0 22 um de di metro em um recipiente esterilizado Pequenos volumes de solu es 10 mL ou 20 mL devem ser passados atrav s de uma unidade de filtro com adaptador para seringa preso a uma desta e estocados Depois de calculada a quantidade necess
7. Suspens o celular cultura de c lulas ou agregados celulares em meio l quido sob agita o Manual de Procedimentos do Laborat rio de Cultura de Tecidos da Embrapa Amaz nia Ocidental e Tecido diferenciado qualquer tecido n o meristem tico e Tecido n o diferenciado tecido meristem tico organizado mas n o diferenciado e Tecido n o organizado calo somente e Tecido organizado qualquer outro tecido exceto calo e Totipot ncia capacidade de c lulas individuais expressarem o fen tipo da planta completa da qual foram derivadas e Varia o somaclonal modifica es gen ticas ou epigen ticas que ocorrem nos tecidos cultivados in vitro Essas varia es acontecem com maior frequ ncia quando ocorre passagem pela fase de calo ou quando h manuten o por tempo muito longo in vitro e algumas vezes quando ocorrem repicagens muito frequentes e Vitrifica o ou hiperidricidade manifesta o fisiol gica provavelmente devida ao excesso de absor o de gua em cultura de tecidos em fun o de diversos fatores tomando os brotos vitrificados e quebradi os Cultura de tecidos vegetais conceito e aplica es Entende se por cultura de tecidos vegetais o conjunto de t cnicas de cultivo in vitro de c lulas e tecidos vegetais explantes em meio nutritivo sint tico de composi o definida sob condi es adequadas de assepsia nutri o e fatores ambientais como luz temperatura O e Co para gerar
8. bancada de trabalho para avalia es parciais ou finais de experimentos in vitro Essas observa es s o realizadas com aux lio de microsc pios estereosc picos e lupas e registradas com c maras fotogr ficas acopladas a esses equipamentos Esse ambiente pode ser conjugado rea de balan as e Almoxarifado nesse compartimento que devem ser colocadas estantes ou prateleiras para guardar reagentes qu micos e materiais diversos em estoque a ser utilizados na rotina laboratorial Deve ser ambiente de acesso restrito devendo se respeitar as normas de seguran a quanto ao armazenamento dos produtos qu micos tais como temperatura e luz e Casa de vegeta o c mara de nebuliza o e telado ambientes anexos ao laborat rio destinados aclimata o de plantas produzidas in vitro Dependendo da condi o clim tica da regi o esses abrigos podem variar desde um simples telado at ambientes mais modernos equipados com sistema de nebuliza o com atomizadores mais eficientes na manuten o permanente da umidade elevada em todo o ar na instala o O laborat rio de pesquisa deve possuir no m nimo salas de prepara o de meios de cultura de inocula o de crescimento e de observa o e uma casa de vegeta o ou telado As biof bricas por sua vez dever o possuir salas de escrit rio de preparo de meio de cultura de inocula o e ou crescimento almoxarifado e casa de vegeta o ou telado Equipamentos e procedi
9. de embri es hapl ides mediante o cultivo de micr sporo As amidas L glutamina e L aspagarina s o ben ficas na obten o de embri es som ticos e a ciste na inclu da s vezes como agente redutor Subst ncias complexas s o prepara es obtidas de produtos naturais de composi es indefinidas que servem para enriquecer o meio de cultivo A composi o desses produtos de dif cil determina o e de uso restrito a algumas culturas e de complicada repeti o experimental Uma grande variedade de extratos foi bastante utilizada entre eles hidrolisados de prote nas extratos de leveduras assim como preparados vegetais tais como polpa de banana suco de laranja e de tomate De todos a gua de coco o aditivo mais utilizado para um grande n mero de esp cies in vitro frequentemente a 2 15 v v As subst ncias obtidas de tecidos vegetais podem conter componentes que s o reguladores de crescimento 28 Manual de Procedimentos do Laborat rio de Cultura de Tecidos da Embrapa Amaz nia Ocidental Os meios nutritivos podem ser utilizados na forma semi s lida ou l quida Nos meios semi s lidos a subst ncia com a o geleificante frequentemente utilizada o gar um polissacar deo extra do de algas marinhas que d consist ncia ao meio e serve de suporte s plantas Outros produtos t m sido testados e ou utilizados tais como fitagel agarose amido entre outros Os reguladores de crescimento s o fa
10. do melhoramento gen tico de plantas e de suas ferramentas mais modernas tais como a biotecnologia vegetal que tem exercido grande reflexo sobre agricultores ind stria alimentar consumidores e sobretudo no meio ambiente O dom nio de muitas t cnicas como a da cultura de tecidos de plantas assume import ncia crucial no avan o desse conhecimento A cultura de tecidos constitui excelente ferramenta para clonagem de plantas em escala comercial al m de colaborar na realiza o de estudos de transforma o gen tica e na conserva o de esp cies vegetais e permitir a intera o entre fatores abi ticos e bi ticos resultando em plantas sadias vigorosas e geneticamente superiores que podem ser multiplicadas massivamente Considerando a import ncia dessa t cnica a compreens o e o dom nio de conceitos b sicos para a aplica o da cultura in vitro esperamos com a publica o deste documento mostrar sociedade de forma simples e pr tica as rotinas determinantes para o bom desempenho e funcionamento de um laborat rio de cultura de tecidos de plantas Maria do Ros rio Lobato Rodrigues Chefe Geral Sum rio Manual de Procedimentos do Laborat rio de Cultura de Tecidos da Embrapa Amaz nia Ocidental 9 N ROG AOS caine RM PG UR SME MN PR ER aysaq aa 9 Abreviaturas e defini es teis 10 Cultura de tecidos vegetais conceito e aplica
11. e c indu o e prolifera o de gemas advent cias e Embriog nese som tica uma via de express o morfogen tica na qual o novo indiv duo o embri o som tico origina se a partir de c lulas simples n o resultantes da fus o de gametas apresentando broto e raiz conectados por um sistema vascular fechado A embriog nese tamb m pode ocorrer de forma direta ou indireta H hip teses de que a embriog nese direta ocorre in vitro somente a partir de c lulas do explante que s o predispostas predeterminadas a se transformar em embri es produzidas antes de sua transfer ncia para a cultura onde o meio e outras condi es servem apenas para incentivar o processo A embriog nese som tica indireta requer que as c lulas diferenciadas de um explante sejam induzidas a produzir calos n o diferenciados e ent o que algumas c lulas se tornem comprometidas ou predeterminadas a entrar em uma rota embriog nica 16 Manual de Procedimentos do Laborat rio de Cultura de Tecidos da Embrapa Amaz nia Ocidental Os est gios de desenvolvimento no processo de propaga o in vitro ocorrem em uma sequ ncia de passos assim resumidos e Estabelecimento da cultura ass ptica e Desenvolvimento do explante seguindo a rota escolhida para os experimentos o qual sofre interfer ncias da intera o entre gen tipo ambiente e explante e Transfer ncia das plantas para o ambiente externo Cada um desses est gios apresenta dife
12. mais exigentes que as vitaminas com rela o solubilidade As solu es devem ser armazenadas em freezer em frascos pequenos para evitar congelar e descongelar a mesma solu o v rias vezes Quase todos os reguladores s o relativamente sol veis em gua Recomenda se dissolver as auxinas cidos org nicos em base na propor o de 3 gotas da base para cada 10 mg da auxina e gua As citocininas bases org nicas devem ser dissolvidas em cido na mesma propor o usada para as auxinas No entanto as citocininas se dissolvem em base com certa facilidade Gamborg 1984 recomenda o uso do lcool et lico para a dissolu o dos reguladores de crescimento Cuidados devem ser observados no uso de lcool pois este inibidor da embriog nese in vitro Os reguladores podem ser preparados em solu es concentradas para que pequenas quantidades sejam adicionadas ao meio sem alterar as outras caracter sticas 34 Manual de Procedimentos do Laborat rio de Cultura de Tecidos da Embrapa Amaz nia Ocidental Na Tabela 3 s o detalhadas as caracter sticas de v rios reguladores de crescimento Tabela 3 Caracter sticas fatores de convers o e solventes de alguns reguladores de crescimento Auxinas AIA 175 2 filtragem 5 71 0 175 gotas de NaOH 1M 0 ou etanol ou KOH 1M AIB 203 2 autoclave 4 92 0 203 gotas de NaOH 1M 5 ANA 186 2 autoclave 5 37 0 186 gotas de NaOH 1M ambiente 2 4 D 221 0 autoclave 4 53 0 221 gotas de
13. nia Ocidental 43 000 0L 0036 000 6 005 8 000 8 008 Z 000 Z 008 9 000 9 00g s 000 S 00S t 000 r oos g 000 00 000 Z 00S L 000 L e as iduu s anbig9A o dui x J0d a uabeas ap Buu Oz Jesad oluessad0u 00g Z STL Z OgZ 9 gle 9 000 9 q 9 s osc a S28 b 00S r GLY OGL gLe 000 gc9 c osc c 948 L 00S L gcL OSZ 0 0090 0040 00g 0 00 0 008 0 005 0 005 0 005 0 0090 008 0 005 0 00g 0 00g 0 00g 0 0040 003 0 00g 0 008 0 005 0 O1J0 eJ0Qe7 ojad jaAesuodsa oe sjunbisd epiAnp Wy soseo ollnui ogs seuuissiu nb d s pepijuenb w SOPIPUSA ORS s iope nB i sunbiy jog us e eny apusjaJd anb sun o0A o JeJedeJd esed lu loijns 9 ajusbes op apepijuenb oednjos essap YU OZ Jesedaid eJed 000 r 008 009 004 00Z 000 0082 0092 00t 00Z 000 008 L 009 L 00t L 00Z L 000 L 008 0 009 0 004 0 tv 7 bw w epe s p oeg5enu suoo 000 ogs c 002 0gg Z 00t 0S 00L Z 096 L 008 L os9 L 00S L oge L 00 L 0s0 L 006 0 0S 0 009 0 ost o 00 0 00 S SLE Z 0S Z rara 000 Z 948 L OGL L GZ9 L 00S L gle L OSc L GZL L 000 L S28 0 0S 0 Gz9 0 008 0 Sz 0 0S Z 0 Sz 000 006 L 008 L OOL L 009 L 00S L 00t L 00 L 00C L OOL L 000 L 006 0 008 0 002 0 009 0 008 0 004 0 00 0 00Z 0 A 000 L 096 0 006 0 0g8 0 008 0 OgZ O 002 0 0g9 0 0090 098 0 008 0
14. pela combina o de um cartucho de osmose reversa com um de adsor o por carv o ativado um de troca i nica e uma filtra o por microporo 0 22 m produzindo gua ultrapura onde s o removidos 100 de bact rias e mat ria org nica 90 das part culas i nicas dissolvidas Entretanto esse processo n o promove a remo o de gases Os equipamentos utilizados s o de maior custo no entanto a gua produzida tem condutividade el trica menor que 1 uS baixo consumo de energia el trica n o consome gua de refrigera o e apenas a gua impura expelida atrav s do dreno e gua ultrapura a gua que se aproxima de graus teor ticos de pureza em termos de resistividade teor org nico contagens de part culas e de bact rias Esse n vel de pureza obtido fazendo o polimento da gua que foi pr purificada por permuta i nica osmose inversa ou destila o A gua de grau ultrapuro necess ria para diversas t cnicas anal ticas sens veis e tamb m em aplica es como a cultura de tecidos e a fertiliza o in vitro IVF Manual de Procedimentos do Laborat rio de Cultura de Tecidos da Embrapa Amaz nia Ocidental e Peag metro pHmetro aparelho necess rio para determina o e ajuste do pH de meios de cultura e deve ter precis o de 0 1 unidade Existem v rios modelos que apresentam diferentes formas de funcionamento nos quais basicamente devem ser respeitados alguns procedimentos Os equipamentos dev
15. uma planta A cultura in vitro de plantas uma t cnica que apresenta import ncia pr tica para as reas agr cola e florestal e tamb m para a rea cient fica b sica como a biologia de plantas onde aparece como uma das t cnicas mais polivalentes Um dos principais objetivos da cultura de tecidos prover uma alternativa de manipular plantas em n vel molecular As principais aplica es das t cnicas de cultura de tecidos vegetais podem ser sumarizadas como segue e Micropropaga o a multiplica o r pida de indiv duos vegetais Essa rapidez deve se entre outros fatores possibilidade de obter elevado n mero de explantes a partir de uma planta matriz e a velocidade da multiplica o devida ao controle tanto do meio como das condi es ambientais nas quais se conduz a multiplica o Manual de Procedimentos do Laborat rio de Cultura de Tecidos da Embrapa 14 Amaz nia Ocidental e Obten o de plantas livres de viroses por meio de t cnicas variadas tais como cultura de meristemas microenxertia e termoterapia as quais devem ser testadas por indexa o e Melhoramento gen tico vegetal por meio da cultura in vitro poss vel a obten o de indiv duos hapl ides e duplica o posterior do genoma para dar origem a linhagens haplo diploidizadas dipl ides homozig ticos b indu o de mutantes visando a determinadas caracter sticas para melhoramento c interc mbio e conserva o de germop
16. 2 0 02 20 1 100 milh es 0 000001 0 00001 0 01 10 1 200 milh es 0 0000005 0 000005 0 005 5 1 500 milh es 0 0000002 0 000002 0 002 2 1 1 bilh o 0 0000001 0 000001 0 001 1 Tabela 7 Grau de perda de compostos frequentemente utilizados para cultura de tecidos vegetais por meio de aquecimento do meio de cultura Composto Grau de degrada o ABA algum frutose subst ncia inibit ria cido giber lico leve L glutamina alto AIA 40 perda em 20 autoclave AIB 20 perda em 20 autoclave cinetina leve extrato de malte subst ncia inibit ria PBA leve piridoxina leve 2 iP leve tiamina alto em pH lt 5 5 Zeatina leve Em pa Amaz nia Ocidental Minist rio da Agricultura Pecu ria e Abastecimento GOVERNO FEDERAL
17. 70 C O l quido nunca deve entrar no corpo da pipeta Nunca virar a micropipeta ao contr rio Nunca colocar a pipeta de lado quando tiver l quido na ponteira Nunca pipetar cidos e bases fortes com as micropipetas Para adicionar reagente a meios de cultura esterilizados na c mara de fluxo utilizar ponteiras autoclavadas que n o tenham sido expostas ao ambiente fora da c mara de fluxo Seguran a em laborat rio A pr tica em laborat rio seja em n vel profissional seja em n vel de aprendizado exige que regras de seguran a sejam rigorosamente 24 Manual de Procedimentos do Laborat rio de Cultura de Tecidos da Embrapa Amaz nia Ocidental seguidas para evitar acidentes e preju zos de ordem humana ou material Os acidentes podem se tomadas as devidas precau es ser evitados ou ao menos ter suas consequ ncias minimizadas A seguir est o relacionadas algumas regras de seguran a que devem ser colocadas em pr tica para a pr pria seguran a e a de toda a equipe e Lavar as m os com detergente antes do trabalho e O laborat rio deve ser mantido sempre muito limpo manter a porta do laborat rio sempre fechada e evitar a forma o de correntes de ar e A equipe deve usar sempre o guarda p vestimenta de algod o de mangas compridas na altura dos joelhos e fechado Importante ter cuidado com as mangas durante a manipula o de lamparinas e Usar cal ados fechados de couro
18. G O MILLER R OJIMA K Nutrient requirement suspensions cultures of soybean root cells Experimental Cell Research v 50 n 1 p 151 158 1968 GEORGE E F Plant propagation by tissue culture Basingstoke Edington 1996 GRATTAPAGLIA D MACHADO M A Micropropaga o In TORRES A C Ed T cnicas e aplica es da cultura de tecidos de planta Brasilia DF ABCTP EMBRAPA CNPH 1990 p 99 169 KERBAUY G B Morfog nese compet ncia e determina o celular em cultura de c lulas e tecidos de plantas In TORRES A C Ed T cnicas e aplica es da cultura de tecidos de planta Bras lia DF ABCTP EMBRAPA CNPH 1990 p 519 532 LLOYD G MCCOWN B Use of microculture for production and improvement of Rhododendro spp HortScience v 15 n 3 p 416 1981 Abst 321 MURASHIGE T SKOOG F A A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture Physiologia Plantarum v 15 p 473 497 1962 PASQUAL M et al Cultura de tecidos tecnologia e aplica es aplica es no melhoramento gen tico de plantas Lavras s n 1997 Manual de Procedimentos do Laborat rio de Cultura de Tecidos da Embrapa Amaz nia Ocidental PIERIK R L M Cultivo in vitro de las plantas superiores Madrid Mundiprensa 1988 ROCA W M MROGINSKI L A Ed Cultivo de tejidos en la agricultura fundamentos y aplicaciones Cali CIAT 1991 543 p SCHENK R O HILDEBRANDT A C Medium a
19. a as rotinas de preparo de meios s o pHmetro agitador magn tico microondas aparelho de v cuo e balan as de precis o e anal tica As balan as devem ficar preferencialmente em local isolado e protegido da circula o de ar e rea para manipula o ass ptica local onde exclusivamente s o realizadas inocula es e transfer ncias de material vegetal Al m da s c mara s de fluxo laminar onde s o manipuladas as culturas o local deve conter estantes para estocagem tempor ria de meios de cultura j autoclavados al m de outros materiais est reis Deve ser localizada pr xima sala de incuba o de culturas mantida sempre fechada e de circula o restrita ao pessoal do laborat rio e rea para incuba o das culturas local dotado de sistema de controle de temperatura luz e umidade no qual as culturas s o mantidas at o momento de ser retiradas dos frascos Deve conter estantes met licas com l mpadas fluorescentes branca fria e ou grow luz fixadas na parte inferior da prateleira distanciadas 40 cm 50 cm entre si Al m das estantes pode conter c maras de BOD Byosistem Organized 18 Manual de Procedimentos do Laborat rio de Cultura de Tecidos da Embrapa Amaz nia Ocidental Development e mesas de agita o orbital para culturas de c lulas em suspens o Esse ambiente deve ser mantido sempre fechado e com entrada restrita e rea para observa o e avalia o das culturas ambiente pequeno contendo
20. a autoclave ambiente Nitrato de am nio 80 0 gua autoclave ambiente Nitrato de c lcio 236 2 gua autoclave ambiente Nitrato de pot ssio 101 1 gua autoclave ambiente Sulfato de am nio 13271 gua autoclave ambiente Sulfato de cobre 249 7 gua autoclave ambiente Sulfato de magn sio 246 5 gua autoclave ambiente Sulfato de mangan s monohid 169 0 gua autoclave ambiente Sulfato de mangan s tetrahidr 223 0 gua autoclave ambiente Sulfato de pot ssio 174 3 gua autoclave ambiente Sulfato de zinco 287 5 gua autoclave ambiente Sulfato f rrico 372 3 gua autoclave ambiente Sulfato ferroso 278 0 gua autoclave ambiente Compostos org nicos Solvente Esteriliza o Armazenage cido asc rbico 176 1 gua filtragem 0 C cido c trico 192 1 gua autoclave 0 C cido f lico 441 4 NaOH Imol L filtragem 0 C cido nicot nico 123 1 gua autoclave 0 C Adenina 135 10 gua autoclave Biotina 244 3 NaOH mol L autoclave 0 C Glicina 75 07 gua autoclave Inositol 180 16 gua autoclave Pantotenato de c lcio 416 5 gua autoclave 0 C Piridoxina HCl 205 6 agua autoclave 0 C Riboflavina 376 4 NaOH 0 C Sacarose 342 30 gua autoclave ambiente Tiamina HCI 337 3 gua autoclave O C Armazenamento do reagente s lido Verifique sempre no r tulo dos frascos qual a temperatura de armazenamento de tudo que estiver utilizando Manual de Procedimentos do Laborat rio de Cultura de Tecidos da Embrapa Amaz
21. ar com gua destilada at cobrir as resist ncias el tricas O tempo de autoclavagem deve ser respeitado de acordo com o material a ser esterilizado nunca ultrapassando os limites estipulados O uso da autoclave deve ser otimizado e planejado de acordo com sua capacidade pois um equipamento que consome muita energia A abertura do equipamento deve ser feita logo ap s finaliza o do ciclo da autoclavagem e assim que a press o chegue a zero come ando pela v lvula A tampa deve ser aberta somente quando todo o vapor estiver sido liberado devendo se tomar muito cuidado pois o vapor extremamente quente e em contato com a pele pode causar s rias queimaduras O uso de luvas de amianto recomendado Equipamentos de tratamento da gua A gua de laborat rio n o apenas tem uma elevada pureza em termos i nicos como tamb m livre de compostos org nicos e microrganismos Uma gua muito boa tem condutividade lt 1 0 uS cm resistividade gt 1 0 MQ cm e teor de carbono org nico total inferior a 50 ppb gua com essa qualidade pode ser usada para uma multiplicidade de aplica es que v o desde a prepara o de reagentes e solu es at prepara o de meios nutrientes para cultura de c lulas e estudos microbiol gicos A gua com grau para laborat rio pode ser produzida por destila o dupla ou por sistemas de purifica o de gua que incorporem tecnologias de purifica o m ltiplas a seguir Manual de Pro
22. cedimentos do Laborat rio de Cultura de Tecidos da Embrapa 20 Amaz nia Ocidental e Destilador aquecer ferver evaporar condensar e coletar o processo de destila o remove part culas i nicas material vol til e microrganismos A destila o baseia se na mudan a da fase l quida para a gasosa e posteriormente para a condensada As impurezas vol teis como gases CO s o dif ceis de ser removidas Recomenda se que tenha reservat rio de vidro especial pois reservat rio met lico libera o metal correspondente na gua No caso de esse equipamento estar conectado entre o deionizador e a fonte de gua esse tipo de contamina o deixa de ser problema O processo de destila o tem alto consumo de energia 1 kW litro e de gua 30 L litro baixa condutividade e resistividade 1 M cm n o elimina CO e am nia vol teis e um processo lento 5 L h e Deionizador o processo cont nuo remove impurezas dissolvidas ionizadas atrav s da passagem da gua por resinas sint ticas de troca i nica sem ocorrer remo o da mat ria org nica ou de microrganismos Deve ser instalado de forma que permita conex o alternativa com o destilador ou com a fonte de gua Quando instalado ap s o destilador o deionizador recebe a gua com baix ssimo teor de sais o que resulta em aumento da vida til de suas colunas A gua deionizada tem geralmente resistividade de 18 MQ cm e Osmose reversa a purifica o feita
23. em ser ligados alguns minutos antes de sua utiliza o Para o ajuste do aparelho devem ser utilizados os padr es de pH seguindo as instru es do fabricante manual quanto sequ ncia de procedimentos para ajuste As solu es padr es quando armazenadas em geladeira devem ser somente utilizadas temperatura ambiente O meio de cultura deve ser mantido em agita o cont nua para o ajuste do pH e o ajuste para o valor desejado deve utilizar NaOH 0 1mol L a 1 0 mol L ou HCI 0 1 mol L a 1 0 mol L e C mara de fluxo laminar equipamento que for a a passagem de ar por meio de um filtro bacteriol gico de modo que seja criado um ambiente est ril com press o positiva que evita a entrada do ar externo contaminado essencial no laborat rio pois nele realizada a manipula o ass ptica das culturas in vitro Deve ser mantida em local com bom n vel de assepsia para preservar a vida til do filtro Os fluxos devem ser limpos com lcool 70 90 ou lisoforme 5 com exce o do visor acr lico antes do in cio das atividades e ao final de cada dia de trabalho importante que a c mara n o seja colocada de frente para porta ventilador ou aparelho de ar condicionado os quais podem criar correntes de ar capazes de vencer a press o positiva gerada na c mara mesmo distando dela O tr nsito atr s do operador deve ser minimizado O operador n o deve atrapalhar o fluxo de ar gerado com movimentos repetidos de retirada e in
24. es 13 Padr es morfog nicos in vitro 14 O ambiente e a organiza o do laborat rio 16 Equipamentos e procedimentos de seguran a 18 AULOCIAVO Sposa sodio sos qual siena e sta Guaaai Geo apawaska 19 Equipamentos de tratamento da gua 19 Seguran a em laborat rio 23 O meio de cultura 25 Preparo do meio de cultura 31 Lernbret s Qerals l uu ua muu ado dado a sassa q sss 36 C lculo ssa sas tie Sau amuyusa wy apa eed ee 37 Refer ncias 39 PA Vo gt o E PR 42 Tabela 4 Caracter sticas e armazenamento de sais minerais e vitaminas utilizados nos meios de cultura 42 Tabela 5 Determina o do volume a ser aliquotado em mL a partir de solu o estoque de regulador de crescimento de T mg l mb g u tees eee yu lapsos dd ties 43 Tabela 6 Valores de concentra es e equival ncias matem ticas cuu foc usus pscrasae sayaspa qaa i ABS rice asa do 44 Tabela 7 Grau de perda de compostos frequentemente utilizados para a cultura de tecidos vegetais por meio de aquecimento do meio de cultura 44 Manual de Procedimentos do Laborat rio de Cul
25. ia em 1 litro de solu o e ppm mg L g mL e Molaridade M indica o n mero de mol culas da subst ncia em um volume da solu o Uma solu o molar preparada pesando se um mol peso molecular da subst ncia o qual dissolvido num solvente de modo a se obter 1 litro da solu o Ex Preparo de uma solu o 1 M ou mol L de KNO PMenos 101 10 g Pesar 101 10 g e completar o volume com gua destilada e deionizada para 1000 mL e Porcentagem indica qual a porcentagem do volume total que corresponde ao soluto Ex Preparo de 100 mL de uma solu o 2 de sacarose Pesar 2 g de sacarose Completar o volume com gua destilada e deionizada para 100 mL e Peso por volume p v indica qual o peso do soluto presente no volume de solu o Manual de Procedimentos do Laborat rio de Cultura de Tecidos da Embrapa 38 Amaz nia Ocidental Ex 1 Preparo de 1 000 mL de uma solu o com 101 10 g de Pesar 101 10 g de KNO Completar o volume com gua destilada e deionizada para 1 000 mL Ex 2 Preparo de 1 000 mL de KNO 10 p v ou 10 1 000 p v Pesar 10 g de nitrato de pot ssio e fazer solu o em 1 litro e Volume por volume v v Ex 1 Preparo de Tween 2 v v Pipetar 2 mL de Tween e completar a solu o para 100 mL e Parte por milh o ppm indica uma solu o com a presen a de 1 mg de soluto em 1 000 mL da solu o ou 1 g em 1 mL e assim por diante e Adi o de reguladore
26. iam conforme as necessidades da esp cie cultivada Esses meios se baseiam nas exig ncias nutricionais das plantas com algumas modifica es para atender s necessidades espec ficas in vitro O preparo do meio de cultura uma das etapas que mais demandam tempo portanto com o prop sito de otimizar a rotina no laborat rio conveniente e pr tico armazenar os componentes do meio em solu es estoque concentradas Tendo se as solu es estoque de sais vitaminas e reguladores de crescimento prontas o preparo de meios de cultura torna se bastante r pido Cada laborat rio pode adotar diferentes procedimentos para preparo dos meios nutritivos entretanto deve se tomar cuidado quando do preparo pois determinados sais n o podem ser misturados em uma mesma solu o Todas as solu es devem ser preparadas com gua destilada e deionizada sempre observando as exig ncias de solubilidade e armazenamento da subst ncia qu mica A gua da torneira n o adequada para o preparo de solu es estoque e meios de cultura dada a possiblidade de impurezas nela contidas como c tions am nio c lcio ferro magn sio s dio pot ssio nions bicarbonato nitrato sulfato e fosfato mat ria org nica s lica metais microrganismos e gases am nia Deve se prestar aten o f rmula qu mica exata dos reagentes que est o sendo utilizados para fazer as solu es verificando sempre se est pesando exatamente o mesmo
27. idas O meio de cultura O meio de cultura deve suprir tecidos e rg os cultivados in vitro com nutrientes visando a atender s condi es do explante no seu crescimento De acordo com Bown e Thorpe 1986 as composi es qu mica e f sica do meio s o fatores determinantes para a inicia o e o desenvolvimento das culturas 26 Manual de Procedimentos do Laborat rio de Cultura de Tecidos da Embrapa Amaz nia Ocidental Basicamente os meios consistem de uma mistura balanceada de macronutrientes e micronutrientes carboidratos fontes org nicas de nitrog nio vitaminas e reguladores de crescimento Esses componentes s o muitas vezes agrupados e preparados como solu es estoque v rias vezes concentradas das quais por es menores s o tomadas quando da prepara o do meio de cultura Os macronutrientes s o fornecidos ao meio de cultura na forma de sais contendo nitrog nio pot ssio f sforo c lcio enxofre e magn sio que s o requeridos em quantidades milimolares S o absorvidos pelas c lulas vegetais como c tions Ca Mg e K nitrog nio na forma de am nio NH ou nitrato NO f sforo como ons fosfato HPO e H PO e enxofre como on sulfato SO A concentra o tima de cada nutriente para alcan ar taxas de crescimento m ximas varia consideravelmente dependendo da esp cie do tipo de cultura etc Os elementos que s o requeridos em concentra es micromolares s o ferro
28. iferencia o processo de diversifica o das caracter sticas bioqu micas anat micas morfol gicas e fisiol gicas ocorrido nas c lulas que as distingue daquelas que lhes deram origem Domin ncia apical inibi o hormonal das gemas laterais axilares pelas gemas apicais Embri o som tico embri o formado a partir de c lulas som ticas seguindo os mesmos padr es de desenvolvimento do embri o zig tico Embriog nese som tica forma o de embri es som ticos que dar o origem a plantas inteiras Explante material utilizado para o in cio da cultura in vitro Pode ser um pice meristem tico um segmento de folha ou raiz ou qualquer rg o da planta que melhor se adaptar para o in cio da cultura O tipo do explante varia de uma cultura para outra Fluxo laminar padr o de fluxo de ar que se movimenta no sentido unidirecional com velocidade constante Manual de Procedimentos do Laborat rio de Cultura de Tecidos da Embrapa 12 Amaz nia Ocidental e Habitua o habilidade adquirida por uma popula o de c lulas de crescer e se dividir independentemente do suprimento ex geno de subst ncias reguladoras de crescimento e H brido som tico produto da fus o de duas c lulas som ticas geneticamente diferentes A fus o feita utilizando se protoplastos e Indu o o desencadeamento de um processo morfogen tico pela exposi o do explante a est mulos f sico qu mico ou biol gico e In vi
29. ios de laborat rios de cultura de tecidos vegetais com rela o padroniza o de normas procedimentos e orienta es metodol gicas 10 Manual de Procedimentos do Laborat rio de Cultura de Tecidos da Embrapa Amaz nia Ocidental Abreviaturas e defini es teis ABA cido absc sico BAP benzilaminopurina 2 4 D cido 2 4 diclorofenoxiac tico DMSO dimetilsulf xido EDTA etilenodiaminotetracetato GA3 acido giber lico AIA cido indol 3 ac tico AIB cido indolbut rico 2iP 6 g g dimetilaliminol purina MS Murashige e Skoog ANA cido naftalenoac tico PEG polietilenoglicol PVP polivinilpirrolidona V V Volume Volume A t cnica da cultura de tecidos vegetais envolve o uso de uma s rie de termos os quais precisam ser bem definidos para melhor entendimento do trabalho que esta sendo realizado dentre os quais destacam se Aclimata o ou aclimatiza o processo de adapta o da planta as condi es ambientais ap s sua remo o da condi o in vitro antes do transplante para local definitivo Alongamento crescimento do eixo da planta ou da c lula principalmente na dire o longitudinal pice meristem tico estrutura constitu da do meristema apical e de um ou dois prim rdios foliares Assepsia na cultura in vitro significa aus ncia de qualquer microrganismo Autotr ficas c lulas plantas ou outros organismos capazes de sintetizar carboidratos a partir de componentes inorg nicos
30. lasma d regenera o de c lulas ou de tecidos transg nicos e poliniza o in vitro visando a romper a incompatibilidade pr zig tica assim como p s zig tica pelo resgate de embri es f transposi o de barreiras de incompatibilidade por meio da fus o de protoplastos e engenharia gen tica e sele o por resist ncia a determinado agente e Produ o de metab litos secund rios a cultura de tecidos permite estudar a produ o de metab litos e maximizar a produ o e a extra o dessas subst ncias e No campo da aplica o b sica a cultura de tecidos d suporte t cnico tamb m bioqu mica fisiologia vegetal fitopatologia e citogen tica Na bioqu mica para estudo e elucida o de rotas metab licas Na fisiologia para estudos de crescimento e desenvolvimento efeito de metais pesados etc Na fitopatologia para estudos de toxinas Na citogen tica para estudos de cromossomos ou aberra es cromoss micas quebras cromoss micas Padr es morfog nicos in vitro As varia es na forma e nas fun es das c lulas resultantes de mudan as quantitativas e altera es qualitativas dos componentes celulares conduzem a um processo morfogen tico que depende sobretudo da intensidade de determina o e da compet ncia das c lulas GEORGE 1996 Dessa forma tecidos rg os ou c lulas com intensidades de determina o variadas podem adquirir novas compet ncias por meio da a o de ce
31. mentos de seguran a Para o adequado manuseio dos equipamentos imprescind vel antes do uso a leitura do manual de instru es pois ao seguir as orienta es do fabricante garante se a seguran a do usu rio e a boa conserva o de cada equipamento A seguir algumas caracter sticas comuns dos principais equipamentos s o descritas assim como os cuidados espec ficos quando do manuseio desses equipamentos Manual de Procedimentos do Laborat rio de Cultura de Tecidos da Embrapa Amaz nia Ocidental 19 Autoclave Equipamento horizontal ou vertical utilizado para a esteriliza o de meios de cultura vidrarias gua e outros materiais utilizados no ambiente ass ptico da c mara de fluxo laminar Atrav s da produ o de calor seco ou mido a autoclave vem regulada de f brica para trabalhar a uma press o de 1 05 kg cm que resulta na temperatura de 121 C O tamanho ideal da autoclave depende basicamente da rotina de trabalho de cada laborat rio Para laborat rios de pesquisa pequenos modelos menores s o mais indicados enquanto em laborat rios com maior fluxo de trabalho os equipamentos de maiores dimens es s o mais indicados A instala o da autoclave na sala de lavagem e esteriliza o deve prever a sa da de gua quente e de vapor Independentemente do modelo utilizado sempre antes de iniciar o funcionamento desses equipamentos obrigat ria a verifica o do n vel d gua Caso esteja baixo complet
32. morna Distribuir nos frascos vedar muito bem com papel alum nio e levar para a autoclave a 120 C por 15 20 minutos Passos para o preparo do meio M todo 2 Primeiramente ligar o pHmetro meia hora antes do uso e somente depois desse per odo calibr lo com solu es padr es Definida a quantidade de meio a ser preparado preencher o formul rio de meio de cultura Pesar a quantidade necess ria de gar e sacarose Colocar 40 do volume de gua deionizada em recipiente apropriado ao volume final a ser preparado Pipetar as solu es estoques e dissolver a sacarose Completar com gua a metade do volume final Ajustar o pH com aux lio de micropipeta e solu es pr prias sempre sob agita o O pH final deve ser de 5 8 Em outro recipiente colocar o gar e a outra metade do volume final gua e dissolver em microondas em pot ncia alta agitando de vez em quando Esse meio ficar pronto quando estiver transparente come ando a ferver Misturar as partes distribuir nos tubos ou frascos e vedar bem com papel alum nio ou tampa pl stica e levar para a autoclave a 121 C por 20 minutos Lembretes gerais Os qu micos s o dissolvidos em gua destilada Os sais devem ser sempre dissolvidos pela adi o um por vez A precipita o normalmente evitada pela dissolu o de fontes de nitrog nio inorg nico primeiro A precipita o pode ocorrer entre as fontes de fosfato ou de c lcio quando o pH for a
33. n vitro e O meio MS Murashige e Skoog 1962 universalmente usado especialmente para morfog nese cultura de meristemas e regenera o de plantas e caracteriza se pela elevada concentra o de sais minerais e O meio B5 foi desenvolvido por Gamborg et al 1968 e cont m quantidades mais baixas de sais minerais o que parece ser preferido pelas c lulas de determinadas esp cies e O meio SH Schenk e Hildebrant 1972 tem concentra es i nicas finais semelhantes s de Gamborg et al 1968 por m com n veis mais altos de Ca Mg e H PO e mais comumente utilizado na cultura de leguminosas e O meio Anderson 1978 1980 tem sido recomendado para lenhosas e apresenta 1 4 das concentra es de on de nitrato am nia e pot ssio do meio MS e o dobro de n veis de PO e O meio WPM Wood Plant Medium Lloyd e Mc Cown 1981 amplamente utilizado para propaga o de arbustos e rvores em laborat rios comerciais Apresenta as mesmas concentra es de NO e NH que o meio Anderson al m de mais pot ssio e alto n vel de ons sulfato As composi es dos meios citados acima utilizados em cultura de tecidos est o relacionadas na Tabela 1 30 Manual de Procedimentos do Laborat rio de Cultura de Tecidos da Embrapa Amaz nia Ocidental Tabela 1 Composi o b sica dos principais meios de cultura Macronutrientes CaCl CaCll 2 HI O Ca NO I 4 HI O KCl KHLPO KNO K2SO
34. nd techniques for induction and growth of monocotiledonous plant cell cultures Canadian Journal of Botany v 50 p 199 204 1972 THORPE T A Organogenesis in vitro structural physiological and biochemical aspects In VASIL I K Ed Perspectives in plant cell and tissue culture New York Academic Press 1980 p 71 111 WHITE P R Survival of isolated tomato roots at sub optimal and supra optimal temperatures Plant Physiology v 12 p 771 776 1937 WHITE P R Nutritional requirements of isolated plant tissues and organs Annual Review of Plant Physiology v 2 p 231 244 1951 WHITE P R The cultivation of plant and animal cells New York Ronald 1963 Manual de Procedimentos do Laborat rio de Cultura de Tecidos da Embrapa Amaz nia Ocidental Anexos Tabela 4 Caracter sticas e armazenamento de sais minerais e vitaminas utilizados nos meios de cultura Compostos inorg nicos Solvente Esteriliza o Armazenagem cido b rico 61 8 gua autoclave ambiente Cloreto de c lcio anidro 110 9 gua autoclave ambiente Cloreto de c lcio dihidratado 147 0 gua autoclave ambiente Cloreto de cobalto 237 9 gua autoclave ambiente Cloreto de n quel 237 7 gua autoclave ambiente Cloreto de s dio 58 4 gua autoclave ambiente EDTA diss dico 372 2 gua autoclave ambiente Fosfato de K monob sico 136 1 gua autoclave ambiente lodeto de pot ssio 166 0 gua autoclave ambiente Molibdato de s dio 241 9 gu
35. o No entanto quando c lulas ou tecidos de plantas s o colocados em cultura algumas vitaminas podem ser limitantes para o crescimento in vitro Esse crescimento e a sobreviv ncia podem ser aumentados pela adi o ao meio de fatores em que c lulas e tecidos vegetais se tornaram deficientes As vitaminas mais frequentemente usadas s o tiamina vitamina B cido nicot nico niacina piridoxina e vitamina B as quais fazem parte do meio MS e s o adicionadas em diferentes concentra es Alguns meios tamb m cont m pantotenato de c lcio e biotina mas essas e outras vitaminas riboflavina cido asc rbico cido f lico que podem ser adicionadas n o s o consideradas fatores que limitam o crescimento O mio inositol um hexitol ou composto c clico com grupos OH em todos os seus seis carbonos considerado estimulador de processos de crescimento in vitro e pode servir como fonte de carboidrato Os amino cidos podem ser adicionados ao meio para satisfazer a necessidade das culturas quando o nitrog nio reduzido e a suplementa o pode ser realizada pela inclus o de uma prote na hidrolisada ao meio Os amino cidos e amidas t m import ncia na amplifica o das respostas morfogen ticas os quais proporcionam maior crescimento e facilitam a diferencia o no sentido da regenera o A tirosina apresenta influ ncia na inicia o de parte a rea em cultura de calos L arginina no enraizamento e L serina na obten o
36. o de laborat rio devem ser esvaziadas nos frascos de descarte e enxaguadas com gua antes de ser enviadas para limpeza e O t cnico respons vel deve ser avisado sobre a ocorr ncia de vidrarias trincadas lascadas ou quebradas antes do descarte e Antes de manipular qualquer reagente deve se ter conhecimento de suas caracter sticas com rela o toxicidade inflamabilidade e explosividade e Deve se tomar cuidados especiais quando manipular subst ncias com potencial carcinog nico e Os reagentes e solu es devem ser claramente identificados solu es devem apresentar data de preparo validade e o nome do analista que as preparou e Em caso de acidente com reagentes todo res duo deve ser limpo assim que poss vel No caso de cidos e bases estes devem ser neutralizados antes da limpeza Se n o tiver certeza de qual procedimento adotar para descontaminar o local do acidente contatar o t cnico ou o pesquisador respons vel pelo laborat rio e Seguir corretamente o procedimento padr o do laborat rio e n o improvisar pois improvisa es podem causar acidentes usar sempre materiais e equipamentos adequados e Todas as subst ncias s o t xicas dependendo de sua concentra o Nunca confiar no aspecto de uma droga necess rio conhecer suas propriedades antes de manipul la e Receber visitas apenas fora do laborat rio pois elas n o conhecem as normas de seguran a e n o est o adequadamente vest
37. origem arrasta por suc o um volume Manual de Procedimentos do Laborat rio de Cultura de Tecidos da Embrapa Amaz nia Ocidental 23 conhecido de l quido Esse volume pode ser constante em micropipetas de volume fixo ou vari vel nos modelos com volumes dentro de uma faixa determinada As ponteiras para os mais diferentes modelos e marcas s o geralmente transparentes inferior a 2 uL a 10 uL amarelas 20 uL a 200 ul ou azuis mais de 200 uL As micropipetas s o equipamentos sens veis e dispendiosos por isso recomenda se o m ximo de cuidado no seu manuseio e a realiza o de todas as opera es lentamente Quando de sua utiliza o devem ser observados os seguintes cuidados gerais Observar se a pipeta tem trava que evita altera o do volume marcado durante o uso A pipeta deve estar destravada para que o volume desejado seja determinado Nunca for ar os volumes das micropipetas para al m ou aqu m dos limites determinados pelo fabricante Encaixar a ponteira com perfei o na pipeta antes do uso A ponteira da micropipeta deve ser mergulhada no l quido com altura m nima que garanta o enchimento de forma constante cont nua e sem entrada de bolhas de ar Observar o enchimento e se necess rio pipetar novamente As micropipetas devem ser manuseadas na vertical Deve se sempre mudar de ponteira quando pipetar um l quido diferente N o pipetar l quidos a temperaturas superiores a
38. ost o 00t 0 oge o 00 0 OSc o 00Z 0 OSL O OOL O O L 3 enbojsa 0030 SZt O ost o azro 00t 0 8SZ 8 0 oge o GeO 00 0 GLZ 0 ogc o gec o 00Z 0 GLL O OSL O GZL O OOL O 8SZ0 0 0g0 0 S o 00L 0 960 0 060 0 gG80 0 0800 8Z0 0 OZ0 0 890 0 090 0 9900 0s0 0 Svo o Ovo o S 0 0 0 0 0 GZ0 0 0Z0 0 SLO O OLO O MO OLO O OLO O 600 0 600 0 800 0 800 0 Z00 0 Z00 0 900 0 900 0 S00 0 S00 0 voo o voo o 00 0 00 0 Z00 0 Z00 0 LOO O LO O 000 L 0G6 006 098 008 OGZ 004 099 009 OGG oos ost oor OGE 00 osz ooz OSL ool qw opeJedoJd Jos e ulnjoA Ju BU ap ojuawioseso ap Jope nbe ap enbojss og n os ap ed e Ju w opeyonbije Jos e uinjoA op oe euluuj91 q S ej qe L 44 Manual de Procedimentos do Laborat rio de Cultura de Tecidos da Embrapa Amaz nia Ocidental Tabela 6 Valores de concentra es e equival ncias matem ticas ppb g L p v ppm 1 100 1 10 10000 1 200 0 5 5 50000 1 500 0 2 2 2000 1 1000 0 1 1 1000 1 2000 0 05 0 5 500 1 5000 0 02 0 2 200 1 10000 0 01 0 1 100 1 20000 0 005 0 05 50 1 50000 0 002 0 02 20 1 100000 0 001 0 01 10 10000 1 200000 0 0005 0 005 5 5000 1 500000 0 0002 0 002 2 2000 1 1 milh o 0 0001 0 001 1 1000 1 2 milh es 0 00005 0 0005 0 5 500 1 5 milh es 0 00002 0 0002 0 2 200 1 10 milh es 0 00001 0 0001 0 1 100 1 20 milh es 0 000005 0 00005 0 05 50 1 50 milh es 0 000002 0 0000
39. ou similar e N o usar rel gios pulseiras an is ou qualquer ornamento durante o trabalho no laborat rio e N o beber e n o comer no laborat rio e Nunca usar material de laborat rio para beber ou para comer e Nunca fumar no laborat rio ou em qualquer outro lugar que possa p r em risco a seguran a ou a sa de das pessoas e Caminhar com aten o e nunca correr no laborat rio e N o levar as m os boca ou aos olhos quando estiver manuseando produtos qu micos e Aventais de laborat rio luvas culos de prote o ou outras vestimentas n o devem ser usados fora do laborat rio e Em caso de acidentes manter a calma e chamar o t cnico respons vel e Objetos pessoais como bolsas blusas etc devem ser guardados em arm rios de prefer ncia em reas externas aos laborat rios e Brincadeiras s o absolutamente proibidas nos laborat rios e Usar a capela de exaust o sempre que trabalhar com solventes vol teis t xicos e rea es perigosas explosivas ou t xicas e Subst ncias inflam veis devem ser manipuladas em locais distantes de fontes de aquecimento Manual de Procedimentos do Laborat rio de Cultura de Tecidos da Embrapa Amaz nia Ocidental 25 e O uso de pipetadores requerido em qualquer circunst ncia ao utilizar pipetas e Nunca jogar reagentes ou res duos de rea es na pia procurar o frasco de descarte e Ao final de cada utiliza o as vidrarias usadas durante o trabalh
40. per odo calibr lo com solu es padr es e Definida a quantidade de meio a ser preparada preencher o formul rio de meio de cultura Exemplo para fazer 1 000 mL de meio 1 L inicialmente aferir o volume a ser preparado marcando se no Becker o volume final no caso 1 L de gua est ril e Transferir aproximadamente 700 mL seguindo o exemplo para outro recipiente para utilizar ao final e Nos aproximados 300 mL de gua destilada deionizada que restarem no Becker adicionar as solu es estoque considerando a concentra o adotada no laborat rio no caso do Laborat rio da Embrapa Amaz nia Ocidental tomar 10 mL por litro de meio a ser preparado e Adicionar a sacarose j pesada e levar a solu o ao pHmetro e No pHmetro j calibrado ajustar o pH com aux lio de micropipeta e solu es pr prias sempre sob agita o O pH final deve ser entre 5 6 5 8 ou conforme solicitado e Pesar o gar e acrescent lo solu o assim como a maior por o da gua reservada inicialmente e Levar a solu o ao microondas em pot ncia alta por aproximadamente 7 minutos agitando no tempo intermedi rio Esse meio ficar pronto quando estiver transparente come ando a ferver Cuidar para n o formar grumos Ao final do tempo no microondas retirar e completar 36 Manual de Procedimentos do Laborat rio de Cultura de Tecidos da Embrapa Amaz nia Ocidental o volume pr estabelecido no exemplo 1 000 mL com gua
41. proximado a 6 0 Depois da dissolu o dos sais e de outros ingredientes o pH ajustado As solu es estoque dos reguladores de crescimento podem ser preparadas nas concentra es de 1 mg L Observe a quantidade g do reagente que vai pesar antes de iniciar o preparo de meio Alguns reguladores s o adquiridos em pequen ssimas quantidades Em caso de d vidas procure o respons vel pelo Laborat rio Manual de Procedimentos do Laborat rio de Cultura de Tecidos da Embrapa Amaz nia Ocidental 37 e Observar com frequ ncia o funcionamento do pHmetro o timer da sala de crescimento e a condutividade el trica da gua utilizada no laborat rio e A limpeza do laborat rio deve ser realizada diariamente e semanalmente com gua sanit ria e desinfetante principalmente na sala de crescimento C lculos A seguir s o colocados alguns conceitos qu micos transforma es e principais c lculos matem ticos aplicados nas rotinas do laborat rio os quais s o necess rios antes do preparo de solu es e meios de cultura e Solu o molar M 1 mol corresponde ao peso molecular em gramas de uma subst ncia em 1 litro de solu o e Solu o milimolar mM 1 1 000 0 001 de um mol mmol de uma subst ncia em 1 litro de solu o 0 001 M e Solu o micromolar uM 1 1 000 000 0 000001 de um mol mol de uma subst ncia em 1 litro de solu o 0 000 001 M e Normal N 1 equivalente grama de uma subst nc
42. reagente descrito nas tabelas al m de conferir os pesos moleculares MW ou FW em r tulos na l ngua inglesa A Tabela 2 apresenta as quantidades de sais minerais utilizadas para o preparo das solu es estoque do meio MS aplicado no Laborat rio de Cultura de Tecidos da Embrapa Amaz nia Ocidental no qual a concentra o das solu es estoque expressa em g L e preparado numa concentra o 100 vezes maior que a concentra o final As solu es devem ser armazenadas em frascos escuros e em geladeira Manual de Procedimentos do Laborat rio de Cultura de Tecidos da Embrapa 32 Amaz nia Ocidental Tabela 2 Rela o e concentra o das solu es estoque do meio de cultura MS Macronutrientes g L 1 A NH NO 165 0 B KNO 190 0 C CaCl 2H 0 44 0 D MgSO 7H 0 37 0 E KH PO 17 0 Micronutrientes MnSO H O F 1 690 FIGO 0 620 ZnSO 7H 0 0 860 KI 0 083 Na MoO a 2H 0 0 025 CuSO 5H O 0 0025 CoCl 6H 0 0 0025 Fe EDTA G Fe EDTA Na EDTA 2 H O 3 73 FeSO 7H 0 2 78 Misturas organicas H tiamina HCl 0 01 acido nicotinico 0 05 piridoxina HCl 0 05 glicina 0 2 J mio inositol 10 0 Os estoques de macronutrientes A B C D e E devem ser dissolvidos em 500 mL de agua destilada e deionizada cada Em seguida completar os respectivos volumes para 1 000 mL e agitar bem Armazenar em frascos na geladeira O estoque de micronutrientes F preparado dissolvendo se cada um dos micronutrientes um ap
43. rentes objetivos e exig ncias em rela o composi o do meio de cultura concentra o e tipo de regulador de crescimento e a condi es ambientais como luz temperatura e fotoper odo O ambiente e a organiza o do laborat rio O ambiente ideal para instala o do laborat rio de cultura de tecidos deve assegurar o m ximo de isolamento do ambiente externo a fim de evitar contaminantes que possam inviabilizar as culturas in vitro Surge portanto a necessidade de uma instala o com caracter sticas apropriadas e com equipamentos e normas de trabalho que possibilitem a cria o de um ambiente com elevado n vel de limpeza e assepsia Reforcando a id ia de que o laborat rio deve prezar pela limpeza e limitar a circula o de pessoas visando ao controle de contamina o no ambiente algumas recomenda es s o necess rias e As paredes e pisos devem facilitar a limpeza e Os acessos devem ser limitados minimizando a entrada de sujeira poeira e contaminantes e As janelas n o s o necess rias pois dificultam o controle da luz e da temperatura mas quando existirem devem ser duplas para evitar a entrada de poeira animais e contaminantes e As paredes devem ser brancas para refletir a luz e a ilumina o abundante e A temperatura ambiente deve ser agrad vel preferencialmente com ar condicionado com exce o da sala de cultura que deve ter temperatura umidade e luminosidade controladas Manual de P
44. ria para o preparo do meio a solu o estoque filtrada pode ser adicionada ao meio autoclavado que foi deixado resfriar at atingir aproximadamente 45 C utilizando se micropipeta com ponteiras autoclavadas dentro da c mara de fluxo Grandes volumes de solu o como a esteriliza o de a cares necessitam ser passados por um filtro de di metro maior sob press o ou v cuo em vidrarias autoclavadas Manual de Procedimentos do Laborat rio de Cultura de Tecidos da Embrapa Amaz nia Ocidental 35 Tendo se as solu es estoque de sais vitaminas e reguladores de crescimento prontas o preparo de meios de cultura torna se bastante r pido Antes de preparar o meio deve se calcular a quantidade necess ria de cada solu o para o preparo do volume de meio de cultura desejado anotar os valores em formul rio pr prio o qual serve como roteiro de trabalho Tamb m devem ser anotadas nesse roteiro as quantidades a ser adicionadas de sacarose vitaminas reguladores de crescimento e o agente solidificante O volume de cada solu o deve ser retirado com pipeta para maior precis o utilizando se sempre uma pipeta para cada frasco a fim de evitar contamina o das solu es Esse preparo pode ser realizado adotando se diferentes formas de procedimentos A seguir s o descritos dois m todos Passos para o preparo do meio M todo 1 e Primeiramente ligar o peag metro pHmetro meia hora antes do uso e somente depois desse
45. rocedimentos do Laborat rio de Cultura de Tecidos da Embrapa Amaz nia Ocidental 17 De maneira geral um laborat rio de cultura de tecidos deve ter as seguintes depend ncias e Ante sala ambiente de recep o que protege o laborat rio das a es do ambiente externo o qual deve conter tapetes para limpeza dos cal ados arm rios para armazenamento de bolsas e sacolas dos usu rios do laborat rio banheiros e copa cozinha quando necess rio e rea de lavagem e esteriliza o local destinado ao descarte de meios de cultura utilizados e outros res duos lavagem de vidrarias autoclavagem de gua aos meios de cultura e a utens lios diversos Nesse ambiente s o obrigatoriamente colocados os equipamentos autoclave destilador es deionizador es geladeira e lavador de pipeta Essa sala deve estar localizada distante da sala de inocula o e de prefer ncia deve dispor de um exaustor para a elimina o de vapores desprendidos pela autoclave Tamb m deve ser dotada de pias com cubas grandes bancadas prateleiras arm rios para armazenamento tempor rio de vidrarias estufas para secagem e esteriliza o de pin as e bisturis e rea de meios de cultura local destinado ao preparo de meios de cultura e de solu es diversas Esse ambiente deve ser de tamanho suficiente para circula o de pessoas e para conter bancada com gavetas e pia arm rios prateleiras geladeiras e freezers Os equipamentos necess rios par
46. rtos sinais qu micos que ativam seletivamente determinados genes Manual de Procedimentos do Laborat rio de Cultura de Tecidos da Embrapa Amaz nia Ocidental 15 O controle da morfog nese segundo Thorpe 1980 exercido por fatores internos inerentes ao explante como gen tipo condi es fisiol gicas e correla es entre c lulas e tecidos e tamb m por fatores externos como meio de cultura reguladores de crescimento e condi es ambientais A resposta final nos mais variados tecidos a express o morfogen tica a partir de diferentes rotas organog nese e embriog nese som tica e Organog nese caracterizada pela produ o de uma estrutura unipolar em conex o vascular com o tecido vascular pr existente e ocorre com o subsequente desenvolvimento de um prim rdio de gema vegetativa ou raiz BROWN THORPE 1986 Essa express o pode acontecer de forma direta ou indireta No primeiro caso a partir do explante prim rio d se a forma o de um rg o ou meristem ide A forma indireta por sua vez ocorre a partir da desdiferencia o do explante resultando na forma o de calos que podem ser definidos como a prolifera o de massas de c lulas n o diferenciadas conduzindo forma o de meristemas morfogen ticos que originam ra zes ou brotos Existem basicamente tr s t cnicas de manipula o da organog nese em sistemas in vitro a cultura de meristemas apicais b prolifera o de gemas axilares
47. s de crescimento a aplica o pode ser feita diretamente ao meio de cultura pela pesagem e dilui o em solvente apropriado ou utilizando se volume de solu o estoque previamente preparada Nesse ltimo caso basta calcular a quantidade de volume a ser retirado na solu o e acrescentar ao meio Esse volume deve ser determinado por meio da seguinte f rmula Va x C V x G Onde V o volume da solu o estoque a ser tomado C a concentra o da solu o estoque V o volume de meio a ser preparado C a concentra o desejada no meio a ser preparado Exemplo Uma solu o estoque de BAP tem concentra o de 10 mg 100 mL e deseja se preparar 1 000 mL de meio de cultura contendo 0 5 mg L de BAP Para tal deve se determinar o V aplicando V x C V x C onde tem se Vax 100mg L 0 5 mg L x 1 000 mL V 0 5x1 000 100 V 5 mL da solu o estoque para preparar 1 litro do meio de cultura Sempre observar se as unidades aplicadas na f rmula s o as mesmas caso contr rio estas devem ser uniformizadas Manual de Procedimentos do Laborat rio de Cultura de Tecidos da Embrapa Amaz nia Ocidental Refer ncias AMMIRATO P V Handbook of plant cell culture New York Macmillan 1990 v 5 BAJAJ Y P S Biotechnology in agriculture and forestry 19 high tech and micropropagation plant Ill Berlin Springer Verlag 1992 BARROS C et al Recomenda es referentes a seguran a nos labora
48. t rios da Embrapa Recursos Gen ticos e Biotecnologia Bras lia DF Embrapa Recursos Gen ticos e Biotecnologia 2003 36 p Embrapa Recursos Gen ticos e Biotecnologia Documentos 101 BROWN D C W THORPE T A Plant regeneration by organogenesis In VASIL K Ed Cell culture and somatic cell genetics of plants Orlando Academic 1986 v 3 p 49 73 BOURGIN J P NITSCH J P Production of haploid Nicotiana from excised stamens Annales de Physiologie Vegetale v 9 p 377 382 1967 CALDAS L S HARIDASAN P FERREIRA M E Meios nutritivos In TORRES A C CALDAS L S BUSO J A Cultura de tecidos e transforma o gen tica de plantas Bras lia DF Embrapa SPI Embrapa CNPH 1998 p 87 132 39 40 Manual de Procedimentos do Laborat rio de Cultura de Tecidos da Embrapa Amaz nia Ocidental CARNEIRO V T C de et al Protoplastos cultura e aplica es In TORRES A C CALDAS L S BUSO J A Cultura de tecidos e transforma o gen tica de plantas Bras lia DF Embrapa SPI Embrapa CNPH 1998 p 413 458 CID L P B A propaga o in vitro de plantas O que isso Biotecnologia Ci ncia amp Desenvolvimento v 19 p 16 21 2001 FERNANDES M I B M de Obten o de plantas hapl ides atrav s da cultura de anteras In TORRES A C CALDAS L S Ed T cnicas e aplica o da cultura de tecidos de planta Bras lia DF ABCTP EMBRAPA CNPH 1990 p 311 332 GAMBOR
49. tores determinantes no crescimento e no padr o de desenvolvimento na maioria dos sistemas de cultura de tecidos As auxinas as citocininas e as giberelinas s o os grupos de reguladores de crescimento mais frequentemente utilizados A a o das auxinas verificada na indu o do alongamento celular e na diferencia o de ra zes em culturas in vitro entre muitas outras a es como indu o de embriog nese aumento da friabilidade de calos alongamento de entren s etc As citocininas constituem o grupo de reguladores indispens veis divis o celular quebra de domin ncia apical indu o e prolifera o de gemas axilares e diferencia o de gemas advent cias indu o de parte a rea em calos Dentre as diversas giberelinas o GA o mais frequentemente utilizado e tem efeito relacionado estimula o do crescimento de rg os como o alongamento de caule e de ra zes assim como ao desenvolvimento de embri es som ticos e ao florescimento De outros grupos de reguladores tamb m se aplicam o cido abc sico como inibidor de crescimento e indutor da matura o de embri es e o etileno regulador produzido pela pr pria planta na forma gasosa Para leitura um pouco mais completa das a es dos reguladores de crescimento deve se consultar a literatura especializada e lembrar que na maioria das situa es necess rio que ocorra um equil brio entre os reguladores fornecidos no meio de cultura e ainda en
50. tre estes e os reguladores end genos dos explantes para que a rota de desenvolvimento pretendida para os experimentos seja alcan ada Al m dos componentes b sicos outras subst ncias podem ser incorporadas aos meios de cultura com fins espec ficos conforme relacionados abaixo e Fungicidas e antibi ticos para o controle da contamina o e A adenina utilizada na forma de sulfato de adenina pode ter o efeito de uma citocinina fraca ou interagir com as citocininas do meio e Carv o ativado utilizado para a adsor o de impurezas e subst ncias t xicas como os fen is e para a redu o dos efeitos residuais das citocininas al m de utilizado para estimular o enraizamento e a matura o de embri es som ticos Manual de Procedimentos do Laborat rio de Cultura de Tecidos da Embrapa Amaz nia Ocidental 29 e Outros antioxidantes como PVP e cido asc rbico V rios meios de cultura t m sido testados e identificados pela composi o em sais minerais As vitaminas reguladores e outros suplementos org nicos variam amplamente com respeito a sua composi o e concentra o A escolha do meio de cultura depende da esp cie em quest o e do prop sito da cultura e O meio White 1951 foi utilizado durante anos como meio b sico para a cultura de grande variedade de tecidos de diferentes esp cies A mudan a de padr o ao longo de anos ap s seu estabelecimento seguiu as tentativas de otimizar o crescimento de calos i
51. tro termo aplicado para designar crescimento de c lulas tecidos ou rg os vegetais em meio de cultura em condi es ass pticas e Meio nutritivo combina o de sais minerais macro e micronutrientes carboidrato s vitaminas e reguladores de crescimento e Meristema tecido composto de c lulas n o diferenciadas envolvido com s ntese protopl smica e forma o de novas c lulas por divis o mit tica e Micropropaga o propaga o de plantas in vitro a partir de pices meristem ticos ou segmento nodal com objetivo de produ o de mudas em grande escala e Morfog nese surgimento de qualquer rg o parte a rea flor raiz a partir de c lulas ou tecidos que originalmente n o possuem essa forma ou estrutura e Organog nese forma o de brotos e ou ra zes in vitro A organog nese pode ser direta quando a regenera o ocorre a partir de rg os ou segmentos de material vegetal sem passar pela fase de calo ou indireta quando a regenera o ocorre a partir de calos e Protoplastos s o c lulas desprovidas de parede celular e Regenera o em cultura de tecidos de plantas significa uma resposta morfogen tica de um explante a um est mulo que resulta na forma o de partes a reas embri es ou planta e Repicagem transfer ncia do calo ou material vegetativo em cultivo para um novo meio nutritivo e Subcultura cultura de subdivis es de tecido j estabelecido in vitro em novo meio e
52. trodu o das m os dentro do fluxo Ligar o fluxo 10 minutos antes do uso e mant lo funcionando por pelo menos mais 5 minutos ap s o t rmino do procedimento antes de deslig lo Limpar novamente o fluxo ap s o uso As l mpadas de luz ultravioleta devem ser ligadas pelo menos 20 minutos antes de iniciar o trabalho visando a esterilizar o ambiente interno da c mara de fluxo Nesse caso ningu m deve permanecer no ambiente e as portas de acesso sala de incuba o devem ser mantidas fechadas ou a passagem da luz ultravioleta deve ser bloqueada importante refor ar os cuidados necess rios durante a utiliza o de l mpadas UV uma vez que elas podem causar queimaduras s o altamente mutag nicas e devem ser mantidas desligadas durante o trabalho na c mara As datas de manuten o da c mara de fluxo laminar e troca de filtro devem ser 21 Manual de Procedimentos do Laborat rio de Cultura de Tecidos da Embrapa 22 Amaz nia Ocidental rigorosamente registradas e seguidas O tempo de uso das l mpadas de UV tamb m deve ser registrado j que elas possuem vida til limitada Deve se trabalhar sempre perto de um bico de g s ou de lamparina acesa e usar uma m scara para evitar aspira o de aerossol ou contaminar o ambiente com expira o bem como lavar as m os antes e depois da opera o e Balan as a balan a de precis o um dos equipamentos mais caros do laborat rio juntamente com a autoclave e a capela de fl
53. tura de Tecidos da Embrapa Amaz nia Ocidental Regina Caetano Quisen Paula Cristina da Silva Angelo Introdu o A possibilidade de manipula o de c lulas tecidos e rg os in vitro est fundamentada na capacidade de as c lulas vegetais mesmo separadas da planta m e continuarem a crescer quando cultivadas em condi es apropriadas A t cnica da cultura de tecidos vegetais parte da premissa de que todas as c lulas da planta apresentam capacidade de gerar um indiv duo conhecida como hip tese da totipotencialidade das plantas formulada por Schleiden amp Schivann em 1838 VASIL et al 1979 Com a evolu o da t cnica na segunda metade do s culo passado muitos avan os relacionados ao cultivo celular t m sido obtidos desde a descoberta dos reguladores de crescimento dos trabalhos pioneiros em melhoramento at a aplica o na engenharia gen tica e na transforma o gen tica de plantas Nos ltimos anos esses estudos t m maior enfoque na organog nese embriog nese conserva o e interc mbio de germoplasma diferencia o mutag nese hibrida o produ o de metab litos secund rios fus o de protoplastos entre outros demonstrando o potencial da t cnica de cultivo in vitro para in meras esp cies e reas de pesquisa generalizando sua aplica o Nesse contexto o presente manual foi elaborado com o intuito de apresentar de forma sucinta aspectos te ricos da cultura in vitro e orientar usu r
54. uxo laminar e pouco acess vel a pequenos laborat rios apesar de imprescind vel para pesagem de quantidades m nimas de fitorreguladores Tem capacidade para pesar at 200 g e precis o de 0 1 mg A balan a anal tica utilizada para a pesagem de reagentes usados em maior quantidade Em geral tem capacidade para pesar at cerca de 4 kg e precis o de 0 1 g O manuseio de uma balan a requer muito cuidado pois s o instrumentos delicados caros e que podem se desregular Quando de sua utiliza o devem ser observados os seguintes cuidados gerais Manter a balan a limpa N o colocar os reagentes diretamente sobre o prato da balan a Os objetos a serem pesados devem estar limpos secos e temperatura ambiente A balan a deve ser mantida travada quando n o estiver sendo utilizada As balan as anal ticas devem estar travadas quando da retirada e coloca o dos objetos a serem pesados Nas balan as anal ticas os objetos devem ser colocados e retirados com a pin a e n o com as m os A balan a deve ser recalibrada informe o t cnico do laborat rio sempre que mudada de local ou ap s longo per odo de uso O operador n o deve se apoiar na mesa em que a balan a est colocada e Micropipetas devem ser usadas para medir quantidades muito pequenas de l quidos que funcionam pelo deslocamento de ar mediante um mbolo com deslocamento determinado que ao regressar ao ponto de
55. zada desta publica o no todo ou em parte constitui viola o dos direitos autorais Lei n 9 610 CIP Brasil Cataloga o na publica o Embrapa Amaz nia Ocidental Quisen Regina Caetano Manual de procedimentos do Laborat rio de Cultura de Tecidos da Embrapa Amaz nia Ocidental Regina Caetano Quisen Paula Cristina da Silva ngelo Manaus Embrapa Amaz nia Ocidental 2008 44 p Embrapa Amaz nia Ocidental Documentos 61 ISBN 1517 3135 1 Cultura de tecidos 2 Manual I Quisen Regina Caetano Il ngela Paula Cristina da Silva Ill T tulo IV S rie CDD 581 0724 O Embrapa 2008 Autores Regina Caetano Quisen Engenheira florestal D Sc em Biotecnologia Vegetal pesquisadora da Embrapa Amaz nia Ocidental Manaus AM regina quisen cpaa embrapa br Paula Cristina da Silva Angelo Bi loga D Sc em Ci ncias Biol gicas Gen tica pesquisadora da Embrapa Amaz nia Ocidental Manaus AM paula angelo cpaa embrapa br Apresenta o No decorrer do aprofundamento da gen tica de plantas como ci ncia novas metodologias foram sendo utilizadas na sele o eficiente de gen tipos visando introdu o de novas caracter sticas como aumento de produtividade de importantes culturas agr colas resist ncia a doen as e pragas e a condi es ambientais adversas que resultaram em melhor qualidade tecnol gica e nutricional do produto final Esses ganhos foram obtidos por meio
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