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PROGENSA PCA3 Assay Package Insert

1. P Reagente sonda PSA 1 fiala Sonde di DNA non infettive chemiluminescenii liofilizzate in soluzione tamponata con succinato contenente lt 5 di agente strutturante e lt 5 di lauril solfato di litio PROGENSA PCA3 Assay 5 501377IT Rev D Reagenti e materiali forniti PROGENSA PSA Scatola a temperatura ambiente Conservare tra 15 C e 30 C dal momento del ricevimento fino alla data di scadenza indicata Simbolo Componente Quantit AR Soluzione di ricostituzione per amplificazione PSA 1x9 3 ml Soluzione acquosa contenente conservanti lt 1 di parabenzoati ER Soluzione di ricostituzione dell enzima PCA3 PSA 1x3 3 ml Soluzione tamponata con HEPES contenente un surfattante Triton X 100 al 10 e glicerolo al 20 PR Soluzione di ricostituzione della sonda PCA3 PSA 1x 12 4 ml Soluzione tamponata con succinato contenente lt 5 di lauril solfato di litio S PCA3 PSA Reagente di selezione 1x31 ml Soluzione tamponata con borato contenente surfattante Triton X 100 all 1 TCR Reagente di cattura del target PSA 1 x 22 ml Acido nucleico non infettivo in soluzione tamponata HEPES contenente una fase solida Fogli sigillanti 1 confezione Collari per ricostituzione 1 confezione PROGENSA PSA Kit di calibratori e controlli Conservare tra 2 C e 8 C dal momento del ricevimento fino alla data di scadenza indicata Simbolo Componente Quantit CAL Calibratore 1 PSA 1
2. 10 Accendere la pompa di aspirazione e scollegare il collettore di aspirazione in corrispondenza del primo connettore fra l aspiratore e il flacone di cattura Assicurarsi che il vacuometro sia conforme alle specifiche delle prove di rilevamento delle perdite Possono essere necessari 15 secondi per ottenere questa lettura Ricollegare il collettore e assicurarsi che il vacuometro soddisfi le specifiche di livello del vuoto Lasciare accesa la pompa di aspirazione fino a quando tutti i passaggi di cattura del target sono completati e il collettore di aspirazione asciutto Consultare la scheda delle specifiche di aspirazione del Sistema Target Capture situata sul retro del Manuale d uso del Sistema Target Capture o contattare Assistenza tecnica Gen Probe per ulteriori informazioni 11 Collegare saldamente il collettore di aspirazione alla prima serie di puntali Abbassare i puntali nella prima TTU fino a quando non entrino a contatto con la sommit del liquido Mantenere il contatto dei puntali con la sommit del liquido mentre si muovono verso il basso finch non entrino brevemente a contatto con il fondo delle provette Picchiettare delicatamente i puntali contro il fondo delle provette fino ad espellere tutto il liquido residuo Non tenere i puntali a contatto prolungato con il fondo delle provette n picchiettare i puntali rapidamente poich ci potrebbe causare un eccessiva formazione di schiuma nel contenitore di cattura sotto vuo
3. consultare la Tabella 5 per istruzioni Tabella 5 Condizioni del Referto dei rapporti del PROGENSA PCA3 Assay Risultato PCA3 Risultato PSA PCA3 Score Ulteriori Codice di Codice di elencato analisi Azione Commento analisi analisi In intervallo In intervallo Nessuna ulteriore azione il risultato nessun codice nessun codice ROAS SCONE NO refertabile Non valido Non valido E S Rianalizzare entrambi gli analiti vedere a b e h oppure i A B E H oppure Ripetizione dell analisi mn Diluire il campione nel diluente apposito Vaie i RO a a S vedere Diluizione di campioni alti fuori a b e h oppure i F intervallo rianalizzare entrambi gli analiti Alto fuori intervallo Non valido n s Diluire il campione nel diluente apposito f A B E H oppure rianalizzare entrambi gli analiti Alto fuori intervallo Alto fuori intervallo 7 s Diluire il campione nel diluente apposito f F rianalizzare entrambi gli analiti Basso fuori Il campione non ha RNA sufficiente per Non valido A ina b e h r i intervallo ae No l analisi accurata Occorre raccogliere un a b e h oppure i G nuovo campione dal paziente 1 Basso fuori Il campione non ha RNA sufficiente per In intervallo i al A A codi intervallo z No l analisi accurata Occorre raccogliere un nessun codice G nuovo campione dal paziente Alto fuori int Il Basso fuori Il campione non ha RNA sufficiente
4. 2 Prima dell analisi lasciare che i campioni raggiungano la temperatura ambiente Non mettere i campioni nel vortex campioni vanno miscelati mediante capovolgimento occasionale e delicato durante il periodo di riscaldamento Vedere le Note procedurali per informazioni sul precipitato che non torna in soluzione e sulla manipolazione dei campioni congelati G Pre amplificazione L ambiente di pre amplificazione deve trovarsi a temperature comprese fra 15 C e 30 C Analizzare in parallelo entrambe le rastrelliere Se si usa l SB100 Dry Heat Bath Vortexer consultare la Scheda applicativa dell SB100 Se si usa lo strumento PROGENSA PCA3 Assay 19 501377IT Rev D Procedura di analisi TECAN Freedom EVO 100 4 consultare la Scheda applicativa del TECAN Freedom EVO per ulteriori istruzioni 1 Miscelare accuratamente il reagente Target Capture TCR mediante inversione o con movimento rotatorio Usando il pipettatore a ripetizione aggiungere 100 ul di TCR specifico dell analita alla provetta di reazione appropriata 2 Forare il tappo del flacone del calibratore con il micropipettatore e aggiungere 400 ul del calibratore alla provetta di reazione appropriatamente etichettata Usando lo stesso puntale di pipetta prelevare aggiunte di replicato dal flacone attraverso il tappo forato Usare nuovi puntali di pipetta per ciascun flacone di calibratore Ripetere per l aggiunta di controlli e campioni Coprire e salvare eventuali campioni
5. altra estremit del collare di ricostituzione nell apertura del flacone Figura 2 Passaggio 2 d Capovolgere lentamente la bottiglia con il flacone collegato Lasciar drenare la soluzione dal flacone alla fiala di vetro Figura 2 Passaggio 3 Attendere che il reagente liofilizzato vada in soluzione quindi agitare ruotando delicatamente la soluzione nel flacone di vetro per miscelarla Nel roteare il flacone evitare la formazione di schiuma Figura 2 Passaggio 4 e Capovolgere il gruppo e inclinarlo ad un angolo di 45 per ridurre al minimo la formazione di schiuma Figura 2 Passaggio 5 Lasciare che tutto il liquido ritorni nella bottiglia di plastica f Rimuovere il collare di ricostituzione e la fiala di vetro Figura 2 Passaggio 6 g Richiudere il flacone di plastica Figura 2 Passaggio 7 Annotare le iniziali dell operatore e la data di ricostituzione su tutte le fiale di reagente ricostituito Assicurarsi di annotare l analita PCA3 o PSA sui flaconi del reagente sonda h Gettare via sia il collare di ricostituzione che la fiala di vetro Figura 2 Passaggio 8 2 reagenti sonda di amplificazione ed enzimatici precedentemente ricostituiti devono essere portati a temperatura ambiente da 15 C a 30 C prima di iniziare il dosaggio Se si raggruppano reagenti avanzati consultare Requisiti di conservazione e manipolazione Se il reagente di amplificazione ricostituito contiene precipitato che non rientra in soluz
6. cin PROGENSA GEN PROBE ASENA PROGENSA PCA3 Assay Per uso diagnostico in vitro Solo per esportazione dagli USA Informazioni generali eee eee 2 USO Previsto aetna ghee hoe eee elia lara 2 Sommario e spiegazione della prova 2 Principi della procedura LL 2 Reagenti e materiali forniti 4 Materiali sciiti 8 Avvertenze e precauzioni 10 Requisiti di conservazione e manipolazione 13 Raccolta trasporto e conservazione dei campioni 15 Procedura di analisi 0 0 17 Note procedurali eee 23 Procedure di controllo della qualit 26 Interpretazione dei risultati 27 Limiti erp ii dea 32 Caratteristiche dell esecuzione del test 33 Bibliografia ricuriala alii Wee ee ee eee 39 1 501377IT Rev D Informazioni generali Uso previsto II PROGENSA PCA Assay una prova di amplificazione dell acido nucleico NAAT in vitro che rileva l acido ribonucleico messaggero RNA del gene 3 del cancro alla prostata PCA3 in campioni di urina maschile per generare un punteggio definito PCA3 Score Il PCA3 Score concepito per l uso insieme ad algoritmi diagnostici standard di cura come ausilio nella diagnosi del cancro alla prostata Sommario e spiegazione della prova L uso de
7. 27939 2 5E 06 R 0 9991 O Diluente del campione 2 0E 06 1 5E 06 1 0E 06 y 0 9663x 27393 5 0E 06 R 0 9973 A Urina 0 0E 06 0 0E 00 5 0E 05 1 0E 06 1 5E 06 2 0E 06 2 5E 06 3 0E 06 c ml PSA previsti Figura 4 Linearit del PROGENSA PCA3 Assay per gli analiti PCA3 e PSA PROGENSA PCA3 Assay 36 501377IT Rev D Caratteristiche dell esecuzione del test 5 Precisione La precisione del PROGENSA PCA3 Assay stata valutata secondo CLSI EP5 A2 2004 9 La ripetibilit la precisione in condizioni di variabilit minima e la riproducibilit la precisione in condizioni di variabilit massima Per la ripetibilit stato preparato un pannello di analisi a 3 elementi composto da un trascritto di RNA in vitro diluito Un operatore presso un laboratorio ha analizzato il pannello in 20 sedute di 5 replicati nell arco di 20 giorni usando un singolo lotto di calibratori e controlli un singolo lotto di reagenti e una singola apparecchiatura La Tabella 10 mostra la precisione della ripetibilit del PROGENSA PCA3 Assay a diversi livelli di concentrazione di analisi Tabella 10 Ripetibilit del PROGENSA PCA3 Assay Analita Pannello Media Ripetibilit Ripetibilit Elemento c ml DS CV 1 1228 145 12 PCA3 2 12 020 809 7 3 61 108 2489 4 1 48 091 3715 8 PSA 2 484 457 41 026 8 3 2 001 430 131 554 7 Per la riproducibilit stato preparato un pannello di analisi a
8. Blase S Bodrug C Clark S Brentano J Mathis J Pham T Meyer M Cass P Hodge M L Macairan L S Marks and H Rittenhouse 2006 APTIMA PCA3 Molecular Urine Test Development of a Method to Aid in the Diagnosis of Prostate Cancer Clin Chem 52 1089 95 4 CLSI 1995 CLSI document GP10 A Assessment of the Clinical Accuracy of Laboratory Tests Using Receiver Operating Characteristic ROC Plots CLSI Wayne PA 5 CLSI 2004 CLSI document EP17 A Protocols for Determination of Limits of Detection and Limits of Quantitation CLSI Wayne PA 6 CLSI 2005 CLSI document EP7 A2 Interference Testing in Clinical Chemistry CLSI Wayne PA CLSI 2005 CLSI document EP15 A2 User Verification of Performance for Precision and Trueness CLSI Wayne PA 8 CLSI 2003 CLSI document EP6 A Evaluation of the Linearity of Quantitative Measurement Procedures A Statistical Approach CLSI Wayne PA 9 CLSI 2004 CLSI document EP5 A2 Evaluation of Precision Performance of Quantitative Measurement Methods CLSI Wayne PA based Molecular Urine Analysis for the Diagnosis of Prostate Cancer European Sviluppato fabbricato e distribuito da tsal CE Gen Probe Incorporated San Diego CA 92121 USA Informazioni per contattarci negli U S A e nel resto del mondo Servizio clienti 1 858 410 8002 customerservice gen probe com Assistenza tecnica 1 858 410 8511 technicalsupport gen probe com Numero verde per chi chiama da U S A
9. Conservare tra 2 C e 8 C dal momento del ricevimento fino alla data di scadenza indicata Simbolo Componente Quantit A PCA3 Reagente di amplificazione 1 fiala Acidi nucleici non infettivi liofilizzati in soluzione tamponata HEPES contenente lt 10 di agente strutturante E Reagente enzimatico PCA3 PSA 1 fiala Trascrittasi inversa e polimerasi dell RNA liofilizzate in soluzione tamponata HEPES contenente lt 10 di reagente strutturante P Reagente sonda PCA3 1 fiala Sonde di DNA non infettive chemiluminescenti liofilizzate in soluzione tamponata con succinato contenente lt 5 di agente strutturante e lt 5 di lauril solfato di litio PROGENSA PCA3 Scatola a temperatura ambiente Conservare tra 15 C e 30 C dal momento del ricevimento fino alla data di scadenza indicata Simbolo Componente Quantit AR Soluzione di ricostituzione per amplificazione PCA3 1x9 3 ml Soluzione acquosa contenente conservanti lt 1 di parabenzoati ER Soluzione di ricostituzione dell enzima PCA3 PSA 1x3 3 ml Soluzione tamponata con HEPES contenente un surfattante Triton X 100 al 10 e glicerolo al 20 PR Soluzione di ricostituzione della sonda PCA3 PSA 1x 12 4 ml Soluzione tamponata con succinato contenente lt 5 di lauril solfato di litio S PCA3 PSA Reagente di selezione 1x31 ml Soluzione tamponata con borato contenente surfattante Triton X 100 all 1 TCR Reagente di cattura del target PCA3 1
10. la diluizione del campione e la ripetizione dell analisi possono generare un PCA3 Score invece di un intervallo di PCA3 Score vedere Ripetizione dell analisi Diluizione di campioni alti fuori intervallo 2 Interpretazione dei codici di stato e di analisi La colonna dello stato nel Referto dei dati grezzi sulla seduta e nel Referto dei rapporti mostra le informazioni in formato s a codici di stato specifici della seduta s vengono indicati prima alla sinistra dei due punti mentre i codici di analisi specifici dell analita a vengono indicati dopo i alla destra dei due punti codici specifici dell analita sono indicati in lettere minuscole per i risultati PCA3 e in lettere maiuscole per i risultati PSA Ciascun referto contiene descrizioni dei codici di stato e analisi che appaiono in quel referto Per esempio i codici potrebbero indicare se un risultato relativo a un campione o un replicato valido o fuori intervallo Consultare la Guida di riferimento rapido o il Manuale d uso del PROGENSA PCA3 Assay Software per un elenco completo dei codici di stato e di analisi e per ulteriori dettagli Se un PCA3 Score riportato nel Referto dei rapporti e nelle colonne dello stato del PCA3 o del PSA non compare nessun codice di stato o di analisi ci significa che entrambi gli analiti analizzati sono validi e rientrano nell intervallo Il risultato dei campioni refertabile e non sono necessarie ulterior
11. 95 PROGENSA PCA3 Assay 33 501377IT Rev D Caratteristiche dell esecuzione del test 2 Studi sulla stabilit dei campioni a Stabilit nell urina intera urina di primo getto stata raccolta da 10 soggetti e conservata a temperature comprese fra 2 C e 8 C o a 30 C prima del trattamento mediante aggiunta di mezzo di trasporto dell urina UTM A temperature comprese fra 2 C e 8 C dopo 4 ore si osservata in alcuni campioni una significativa degradazione dell RNA di PCA3 e PSA Di conseguenza l urina intera deve essere analizzata entro 4 ore A 30 C si osservata una significativa degradazione in meno di 1 ora Di conseguenza l urina intera deve essere sempre refrigerata o tenuta in ghiaccio prima del trattamento b Stabilit nell urina trattata dodici campioni sono stati incubati a 4 C o a 30 C per un massimo di 38 giorni A 4 C gli RNA di PCA3 e PSA si sono mantenuti stabili per 21 giorni a 30 C per 5 giorni campioni conservati a 20 C e a 70 C hanno dimostrato la stabilit dell RNA di PCA3 e PSA per un massimo di 90 giorni c Stabilit a seguito di congelamento e scongelamento dei campioni sono stati fatti passare per 6 volte da 37 C a 70 C e viceversa Non si osservata una diminuzione dei livelli delle copie di RNA di PCA3 o PSA B Risultati analitici 1 Sensibilit analitica Un pannello di sensibilit analitica composto da un trascritto di RNA in vitro dil
12. avanzati e conservarli ad una temperatura di 8 C o inferiore vedere Raccolta trasporto e conservazione dei campioni per ulteriori informazioni nel caso fosse necessario ripetere l analisi 3 Coprire le TTU con i fogli sigillanti e agitare delicatamente a mano la rastrelliera Non metterla sul vortex Incubare la rastrelliera a 62 C 1 C in un bagno di acqua per 30 5 minuti 4 Estrarre la rastrelliera dal bagno di acqua e asciugare il fondo delle provette su un materiale assorbente 5 Assicurarsi che i fogli sigillanti siano bene alloggiati Se necessario sostituirli con altri fogli sigillanti nuovi e sigillare bene le TTU 6 Agitare la rastrelliera per 60 secondi mettendola sul miscelatore vortex per unit multiprovetta vedere Note procedurali Iniziare l agitazione su vortex entro 2 minuti dalla rimozione della rastrelliera dal bagno di acqua 7 Senza rimuovere i fogli sigillanti incubare la rastrelliera a temperatura ambiente per 30 5 minuti 8 Mettere la rastrelliera sulla base magnetica del TCS per 5 10 minuti con la linguetta frontale rivolta in avanti Caricare la rastrelliera per TTC con i TTC 9 Eseguire il priming delle linee della pompa della stazione di dispensazione pompando la soluzione di lavaggio attraverso il collettore di dispensazione Pompare attraverso il sistema liquido sufficiente per eliminare le bolle d aria dalla linea e per erogare da tutti e 10 i beccucci un flusso costante di liquido
13. e Canada Servizio clienti 1 800 523 5001 Assistenza tecnica 1 888 484 4747 www gen probe com EMERGO EUROPE Molenstraat 15 2513 BH LAia Paesi Bassi GEN PROBE GEN PROBE e design APTIMA DTS LEADER PROGENSA e SB100 sono marchi commerciali di Gen Probe Incorporated eppendorf stilizzato e REPEATER sono marchi commerciali di Eppendorf AG RAININ un marchio commerciale di Rainin Instrument LLC TECAN e FREEDOM EVO sono marchi commerciali di Tecan Group AG Qualsiasi altro nome di marchio che potrebbe apparire in questo foglietto illustrativo appartiene al suo rispettivo titolare 2006 2013 Gen Probe Incorporated 501377IT Rev D 2013 02 PROGENSA PCA3 Assay 39 501377IT Rev D
14. i PCA3 Score per i campioni abbinati saranno indicati in un nuovo Referto dei rapporti C Interpretazione dei referti 1 PCA3 Score Nota Sono refertabili solo i PCA3 Score e gli intervalli dei PCA3 Score indicati nel Referto dei rapporti risultati che appaiono nel Sommario delle eccezioni potrebbero richiedere ulteriore azione e non sono refertabili Il PCA3 Score viene calcolato come il rapporto fra le copie di RNA PCA e le copie di RNA PSA moltiplicato per 1000 punteggi PCA3 Score possono essere calcolati solo usando risultati derivanti da sedute e campioni validi Le sedute e i campioni non validi devono essere rianalizzati per quell analita vedere Ripetizione dell analisi per ulteriori informazioni Se il PCA3 Score riportato si trova al di sotto del valore soglia il risultato va interpretato come NEGATIVO Se il PCA3 Score al di sopra del valore soglia o equivale ad esso il risultato va interpretato come POSITIVO Sar il direttore del laboratorio a stabilire il valore soglia vedere Caratteristiche dell esecuzione del test per ulteriori informazioni In certe condizioni viene fornito un intervallo di PCA3 Score gt PCA3 Score calcolato o lt Score calcolato Se il lt PCA3 Score calcolato al di sotto del valore soglia il risultato va interpretato come NEGATIVO Se il gt PCA3 Score calcolato al di sopra del valore soglia il risultato va interpretato come POSITIVO Se si richiede un valore numerico
15. l Lisinopril 0 74 umol I Terazosina 7 8 umol l Amlodipina 245 umoll Finasteride 15 mg l Atenololo 37 6 umol I Tamsulosina 1 2 ug l Sulfasalazina 754 umol I Metformina 310 mol l Esomeprazolo 120 mg l Sildenafil 12 9 pmol l Allopurinolo 294 umol I Serenoa repens 1600 mg l Difenidramina 19 6 umol I Selenio 0 275 mg l Acetaminofene 1324 umol I Acido acetilsalicilico 3 62 mmol l Costituenti dell urina Ibuprofene 2425 umoll Sostanza Ponce Te azine della prova Furosemide 181 umol l Acido urico 1 4 mmol l Ciproflossacina 30 2 umol I Emoglobina 2 g l Levaquin 48 6 umol I Leucociti 4 56 x 10 cellule I Dossiciclina 67 5 mol l Eritrociti 3 06 x 10 cellule I Fluoxetina idroclorito 11 2 umol Albumina 50 g l Flutamide 1500 mg l Bilirubina non coniugata 342 g l Dutasteride 1 5 mg l IgG 60 g l 3 Accuratezza L accuratezza del PROGENSA PCA3 Assay stata valutata secondo CLSI EP15 A2 2005 7 Trascritti dell RNA di PCA3 e PSA sono stati quantificati mediante spettrofotometria UV Vis e aggiunti a normale urina femminile trattata con nessun RNA di PCA3 o PSA rilevabile quindi le concentrazioni sono state misurate nel PROGENSA PCA3 Assay Il recupero percentuale stato calcolato come un rapporto fra c ml misurati e c ml aggiunti moltiplicato per 100 PROGENSA PCA3 Assay 35 501377IT Rev D Caratteristiche dell esecuzione del test Tabella 9 Recupero delle copie del PROGENSA PCA3 Assay Analita Concentrazione no
16. per o re ci intervallo No l analisi accurata Occorre raccogliere un f G nuovo campione dal paziente Basso fuori Basso fuori Il campione non ha RNA sufficiente per intervallo intervallo No l analisi accurata Occorre raccogliere un 9 G nuovo campione dal paziente Per un elenco completo dei codici di analisi consultare il Manuale dell operatore del PROGENSA PCA3 Assay Software Pertiene solo a campioni non validi all interno di una seduta valida Se i campioni erano non validi perch la seduta era non valida i risultati verranno indicati nel Sommario delle eccezioni vedere Interpretazione dei risultati nel Sommario delle eccezioni per ulteriori informazioni PROGENSA PCA3 Assay 501377IT Rev D Interpretazione dei risultati D Ripetizione dell analisi 1 Linee guida per la ripetizione dell analisi a Sebbene non sia obbligatorio che entrambi gli analiti vengano analizzati nella stessa seduta i risultati relativi a entrambi gli analiti devono provenire dallo stesso flacone di campione per ottenere un PCA3 Score refertabile b Tutte le sedute non valide vanno ripetute e tutti i campioni non validi derivanti da sedute valide vanno rianalizzati c Rianalizzare i campioni usando una nuova serie di calibratori e controlli d Un adeguata conservazione dei campioni avanzati prima della ripetizione dell analisi essenziale vedere Raccolta trasporto e conservazione dei campioni per ulteriori infor
17. per la calibrazione e per la determinazione della validit della seduta D Verifica delle informazioni sulle concentrazioni Verificare con l amministratore di sistema del PROGENSA PCA3 Assay Software che siano state immesse le informazioni sulle concentrazioni per i lotti dei kit di calibratori e controlli PROGENSA PCA3 e PSA analizzati Per ulteriori informazioni consultare la Guida di riferimento rapido per il PROGENSA PCA3 Assay Guida di riferimento rapido o il Manuale d uso dell amministratore di sistema del PROGENSA PCA3 Assay Software Nota Si richiede l immissione delle informazioni sulle concentrazioni prima dell uso iniziale di ciascun nuovo lotto di kit di calibratori e controlli Le sedute successive che impiegano calibratori e controlli derivanti dallo stesso lotto di kit non richiedono ulteriore azione E Approntamento del Worklist Editor Generare una lista di lavoro per la seduta del dosaggio usando il GEN PROBE Worklist Editor su un computer situato nell area di pre amplificazione Per l uso del Worklist Editor consultare la Guida di riferimento rapido o il Manuale d uso del GEN PROBE Worklist Editor Se si usa lo strumento TECAN Freedom EVO 100 4 consultare anche la Scheda applicativa del TECAN Freedom EVO per ulteriori istruzioni F Preparazione dei campioni 1 Prima dell analisi lasciare che calibratori e controlli raggiungano la temperatura ambiente Miscelare i flaconi capovolgendoli delicatamente
18. x 22 ml Acido nucleico non infettivo in soluzione tamponata HEPES contenente una fase solida Fogli sigillanti 1 confezione Collari per ricostituzione 1 confezione PROGENSA PCA3 Assay 4 501377IT Rev D Reagenti e materiali forniti PROGENSA PCAS3 Kit di calibratori e controlli Conservare tra 2 C e 8 C dal momento del ricevimento fino alla data di scadenza indicata Simbolo Componente Quantita CAL Calibratore 1 PCA3 1x 2 0 ml Soluzione tamponata con fosfato contenente lt 5 di lauril solfato di litio CAL Calibratori PCA3 2 5 4x 1 7 ml Acido nucleico di PCA3 non infettivo in soluzione tamponata con fosfato contenente lt 5 di lauril solfato di litio PC Controlli positivi PCA3 2x 1 7 ml Acido nucleico di PCA3 non infettivo in soluzione tamponata con fosfato contenente lt 5 di lauril solfato di litio Scheda informativa sulla concentrazione di PCA3 1 foglio PROGENSA PSA 100 Reaction Kit PROGENSA PSA Scatola refrigerata Conservare tra 2 C e 8 C dal momento del ricevimento fino alla data di scadenza indicata Simbolo Componente Quantit A Reagente di amplificazione del PSA 1 fiala Acidi nucleici non infettivi liofilizzati in soluzione tamponata HEPES contenente lt 10 di agente strutturante E Reagente enzimatico PCA3 PSA 1 fiala Trascrittasi inversa e polimerasi dell RNA liofilizzate in soluzione tamponata HEPES contenente lt 10 di reagente strutturante
19. 14 844 7 5 2 6 0 4 6 36 72 372 7 4 6 0 1 0 7 36 430 26 26 0 11 0 1 8 36 62 274 13 8 8 3 0 5 1 34 52 739 9 6 6 7 4 2 2 34 218 789 10 6 7 7 4 0 3 32 1 073 920 11 4 6 9 8 0 4 34 37 185 9 5 7 3 0 1 PaA 5 32 386 504 10 4 8 6 3 4 6 34 1 518 748 12 5 8 4 3 7 7 32 11 007 14 8 9 0 6 0 8 34 1 694 404 11 7 7 0 1 6 Tabella 12 Riproducibilit del PROGENSA PCA3 Assay analisi del PCA3 Score Pannello Punteggio elkani oy ia Gy a D cy ira Elemento medio CV totale to di una diverse diversi apparec diversi sed ta sedute operatori chiature lotti 1 34 5 27 26 5 23 8 0 2 34 32 14 9 10 12 0 2 3 32 30 12 7 5 17 7 6 7 32 39 28 24 2 8 11 7 8 34 37 21 14 12 0 0 9 Gli elementi del pannello da 4 a 6 contenevano solo trascritto di RNA di PCA3 o PSA e pertanto non sono stati inclusi in questa analisi PROGENSA PCA3 Assay 38 501377IT Rev D Bibliografia Bibliografia 1 Bussemakers M J G A Van Bokhoven G W Verhaegh F P Smit H F M Karthaus J A Schalken F M J Debruyne N Ru and W B Isaacs 1999 DD3 A New Prostate Specific Gene Highly Overexpressed in Prostate Cancer Cancer Res 59 5975 5979 2 Hessels D J Mt Klein Gunnewiek I van Oort H F M Karthaus G J L van Leenders B van Balken L A Kiemeney J A Witjes and J A Schalken 2003 DD3 9 Urology 44 8 16 3 Groskopf J S M Aubin I L Deras A
20. A Il rilevamento viene ottenuto mediante HPA usando sonde di acido nucleico con filamento unico e marcatura chemiluminescente che sono complementari all amplicone Per ciascun amplicone di target vengono usate sonde separate Le sonde di acido nucleico marcate si ibridizzano specificamente con l amplicone Il reagente di selezione distingue le sonde ibridizzate da quelle non ibridizzate inattivando il marcatore sulle sonde non ibridizzate Durante il rilevamento il segnale chemioluminescente emesso dalla sonda ibridizzata viene misurato in un luminometro ed espresso in unit di luce relativa RLU Gli RNA di PCA3 e PSA vengono quantificati in provette di reazione separate e viene determinato il PCA3 Score calibratori contenenti quantit note di trascritti di RNA di PCA3 o PSA vengono inclusi in ogni seduta di dosaggio e usati per generare una curva standard controlli di PCA3 e PSA vengono anch essi inclusi per verificare l accuratezza dei risultati interpolati in base alla curva standard PROGENSA PCA3 Assay 3 501377IT Rev D Reagenti e materiali forniti Reagenti e materiali forniti Reagenti e materiali forniti nel PROGENSA PCA3 PSA Assay Kit per il PROGENSA PCA3 Assay sono indicati sotto Accanto al nome di ciascun reagente indicato anche il rispettivo simbolo identificativo PROGENSA PCA3 Assay Kit 2 x 100 reazioni N di catalogo 302355 8 scatole PROGENSA PCA3 100 Reaction Kit PROGENSA PCA3 Scatola refrigerata
21. AN Freedom EVO 100 4 occorre dedicare un micropipettatore al trasferimento dei campioni Tutti i pipettatori vanno puliti regolarmente come descritto nelle Note procedurali T Quando si usano pipettatori a ripetizione per l aggiunta dei reagenti non toccare la provetta di reazione con il puntale del pipettatore onde evitare il carryover da una provetta all altra U Per ottenere risultati accurati del dosaggio occorre una miscelazione adeguata Per dettagli completi vedere Note procedurali PROGENSA PCA3 Assay 11 501377IT Rev D Avvertenze e precauzioni V Ai procedimenti di pre amplificazione amplificazione e post amplificazione vanno dedicati bagni di acqua separati W Alcuni reagenti di questo kit presentano etichette con simboli di rischio e sicurezza in osservanza della Direttiva europea 1999 45 CE e vanno manipolati di conseguenza Schede sulla sicurezza dei materiali possono essere visualizzate presso il sito www gen probe com e sono disponibili dietro richiesta PROGENSA PCA3 Assay 12 501377IT Rev D Requisiti di conservazione e manipolazione Requisiti di conservazione e manipolazione A Per informazioni sulla conservazione dei reagenti consultare la Tabella 1 Tabella 1 Conservazione dei reagenti Aperti Ricostituiti Conservazione dei prodotti non Stabilita fino alla data di Reagente Liquido Spett scadenza Reagenti di amplificazione 2 C 8 C fino alla
22. NSA PCA3 Assay 15 501377IT Rev D Raccolta trasporto e conservazione dei campioni 5 Per trattare i campioni di urina chiuderli bene e capovolgerli 5 volte per rimettere le cellule in sospensione Togliere il tappo della provetta di trasporto del campione di urina e poi con la pipetta di trasferimento monouso fornita trasferire nella provetta 2 5 ml di urina raccolta Il giusto volume di urina sar stato aggiunto quando il livello del liquido si trover fra le righe di riempimento nere stampate sull etichetta della provetta di trasporto del campione di urina 6 Richiudere bene il tappo sulla provetta di trasporto del campione di urina e capovolgere 5 volte il campione per miscelarlo Questo sar ora il campione di urina trattato B Trasporto e conservazione dei campioni prima dell analisi 1 campioni di urina trattati devono essere trasportati al laboratorio nella provetta di trasporto del campione di urina La spedizione dei campioni pu avvenire in condizioni ambientali non controllate senza controllo della temperatura o in fase di congelamento Devono essere prese disposizioni per il trasporto per assicurare che i campioni vengano ricevuti presso il laboratorio di analisi entro 5 giorni dalla raccolta Una volta ricevuto il campione il laboratorio deve verificarne la data di raccolta riportata sulla provetta Se i campioni sono stati spediti in condizioni ambientali non controllate e sono stati ricevuti dopo pi di 5 giorn
23. OBE 104555 Kit Auto Detect APTIMA 301048 2 pipettatori eppendorf Repeater Plus 105725 Puntali per pipettatori a ripetizione 2 5 ml 5 0 ml 25 0 ml Uno dei seguenti articoli 2 miscelatori vortex per unit multiprovetta 102160F 3 bagni di acqua circolante 104586F 62 C 1 C 42 C 1 C 62 C 1 3 distanziatori per bagni di acqua 104627 OPPURE 2 SB100 Dry Heat Bath Vortexer 105524F Ulteriori strumenti SB100 potrebbero essere richiesti a seconda della produttivit desiderata Micropipettatore 1000 ul RAININ PR1000 901715 Puntali 1000 ul P1000 105049 Pipettatore eppendorf da 20 a 200 ul 105726 Puntali pipetta da 20 200 ul Candeggina dal 5 al 7 da 0 7 M a 1 0 M soluzione di ipoclorito di sodio Contenitore di plastica con coperchio grande Contenitori standard per la raccolta di urina senza conservanti Unit a dieci provette TTU TU0022 Vassoi con dieci puntali TTC 104578 Standard di calibrazione SysCheck 301078 Materiali opzionali N di cat PROGENSA PCA3 100 Reaction Kit 302354 PROGENSA PSA 100 Reaction Kit 302357 PROGENSA PCA3 Calibrators and Controls Kit 302353 PROGENSA PSA Calibrators and Controls Kit 302356 PROGENSA PCA3 Assay 8 501377IT Rev D N di cat PROGENSA PCA3 PSA Proficiency Panels 302350 PROGENSA PCA3 Specimen Diluent Kit 302351 Kit di liquidi per dosaggio APTIMA 302002C Puntali monouso per pipetta con filtro 1 ml 10612513 Tecan TECAN Freedom EVO 100 4 900932 Grup
24. a determinato mediante ultrasuono trans rettale 44 25 cc 39 da 5 a 225 d 34 180 529 positivi alla biopsia per il cancro alla prostata La Figura 3 mostra la correlazione del PCA3 Score con la probabilit di una biopsia positiva Con l aumentare del PCA3 Score aumentata nei soggetti l occorrenza di una biopsia positiva per il cancro 80 70 60 50 fe a amp 40 on 3 2 30 20 10 0 PCA3 Score lt 5 5 9 10 19 20 34 35 49 50 100 gt 100 N soggetti 58 85 104 97 57 86 42 Figura 3 Correlazione di PCA3 Score con la probabilit di biopsia positiva stata eseguita l analisi delle Caratteristiche Operative del Ricevente ROC usando la biopsia della prostata come metodo di riferimento secondo CLSI GP10 A 1995 4 Per il PROGENSA PCA3 Assay l area sotto la curva AUC stata 0 685 intervallo di confidenza del 95 da 0 637 a 0 733 La Tabella 6 mostra la sensibilit e la specificit diagnostiche a diversi valori soglia di PCA3 Score Ciascun laboratorio dovrebbe stabilire il proprio valore soglia per la sensibilit o la specificit diagnostiche vedere Interpretazione dei risultati Tabella 6 Sensibilit e specificit diagnostiche del PROGENSA PCA3 Assay a diversi valori soglia del PCA3 Score Valore soglia del PCA3 Score 5 10 15 25 35 50 95 Sensibilita 96 85 77 63 53 41 17 Specificita 14 33 47 61 74 84
25. a deve essere ripetuta per quell analita vedere Interpretazione dei risultati Se la seduta valida per l altro analita quei risultati possono essere usati nell analisi dei dati con la seduta valida ripetuta del primo analita B Validit dei campioni Nell ambito di una seduta valida i risultati dei singoli campioni possono essere considerati INVALID non validi e saranno indicati nel Referto dei dati grezzi sulla seduta vedere Interpretazione dei risultati Sebbene replicati individuali per un campione possano essere validi un campione sar invalidato se la differenza interpolata c ml fra i replicati supera il 600 Deve essere ripetuta l analisi del campione per quell analita PROGENSA PCA3 Assay 26 501377IT Rev D Interpretazione dei risultati Interpretazione dei risultati A Tipi di referti 1 Referto dei dati grezzi sulla seduta Il Referto dei dati grezzi sulla seduta offre informazioni sulla validit della seduta PASS superata o FAIL non superata vedere Procedure di controllo della qualit e sulle singole provette di reazione analizzate con il PROGENSA PCA3 Assay Se una seduta non valida FAIL non superata tutte le provette di quella seduta saranno etichettate come tali Tuttavia provette singole possono essere considerate non valide all interno di una seduta valida PASS superata Per sedute consecutive nelle quali vengono analizzati nella stessa seduta entrambi gli analiti PCA3 e PSA
26. amento manuale Un campione pu essere etichettato come non valido sebbene le provette individuali replicati possono essere etichettate come valide il risultato combinato dei replicati che determina la validit del campione e una grande differenza fra replicati rende non valido un campione vedere Procedure di controllo della qualit per ulteriori informazioni Tabella 4 Condizioni del Sommario delle eccezioni del PROGENSA PCA3 Assay Risultato PCA3 Risultato PSA PCA3 Score Ulteriori Codice di Codice di elencato analisi Azione Commento analisi analisi in int Il N lido Rianalizzare il PSA vedere Ripetizione MASO qua AB n Ha e Si dell analisi e abbinare manualmente i nessun codice A B E H oppure risultati Basso fuori Non valid Rianalizzare il PSA vedere Ripetizione AB Vo 2 S dell analisi e abbinare manualmente i A B E H oppure I risultati Non valido In intervallo S a b e h oppure i nessun codice Rianalizzare il PCA3 vedere Ripetizione dell analisi e abbinare manualmente i risultati 1 Abbinare manualmente per ottenere il lt PCA3 Score calcolato OPPURE 2 Diluire il campione nel diluente apposito In intervallo Alto fuori intervallo lt PCA3 Score Facoltativo vedere Diluizione di campioni alti fuori nessun codice F calcolato intervallo rianalizzare il PSA e abbinare manualmente i risultati se si richiede un PCAS Score 1 Abbinare m
27. anualmente per ottenere il gt PCA3 Score calcolato OPPURE Alto fuori intervallo In intervallo gt PCA3 Score Facoltativo 2 Diluire il campione nel diluente nessun codice calcolato apposito rianalizzare il PCA3 e abbinare manualmente i risultati se si richiede un PCA3 Score Sure ee In intervallo lt PCA3 Score N Abbinare manualmente per ottenere il intervalo nessun codice calcolato 2 lt PCA3 Score calcolato PROGENSA PCA3 Assay 29 501377IT Rev D Interpretazione dei risultati Tabella 4 Condizioni del Sommario delle eccezioni del PROGENSA PCA3 Assay continua Basso fuori intervallo 9 Alto fuori intervallo F lt PCA3 Score calcolato No Abbinare manualmente per ottenere il lt PCA3 Score calcolato Per un elenco completo dei codici di analisi consultare il PROGENSA PCA3 Assay Software Operator s Manual Manuale dell operatore del PROGENSA PCA3 Assay Software Pertiene solo a campioni non validi all interno di una seduta valida Per valori fuori intervallo il PCA3 Score calcolato viene calcolato usando il livello copia per il pi vicino calibratore positivo 4 Interpretazione dei risultati nel Referto dei rapporti Se un campione viene indicato nel Referto dei campioni con un PCAS Score il risultato un PCAS Score refertabile e non sono necessarie ulteriori azioni Se non viene indicato un PCA3 Score ovvero nella colonna del PCA3 Score presente la dicitura
28. ato sia stato miscelato accuratamente e che sia stato preparato un volume sufficiente a fornire abbastanza reagente per un intera seduta di dosaggio PROGENSA PCA3 Assay 14 501377IT Rev D Raccolta trasporto e conservazione dei campioni Raccolta trasporto e conservazione dei campioni II PROGENSA PCA Assay concepito per la quantificazione dell RNA di PCA3 e PSA nell urina di primo getto raccolta dopo un DRE consistente in tre pressioni per ciascun lobo Lurina viene trattata usando il PROGENSA PCA3 Urine Specimen Transport Kit La stabilit dell RNA di PCA3 e PSA nell urina e nell urina trattata stata stabilita monitorando i livelli delle copie di RNA nei campioni di urina raccolti seguendo le istruzioni indicate sotto A Istruzioni per la raccolta e il trattamento dei campioni di urina 1 Si consiglia di chiedere al paziente di bere una grande quantit d acqua circa 500 ml per essere certi di ottenere una quantit di urina sufficiente per la raccolta Subito prima della raccolta di urina eseguire un esame digito rettale DRE come descritto sotto Applicare pressione sulla prostata abbastanza da comprimere la superficie di circa 1 cm dalla base all apice e dalla linea laterale a quella mediana per ciascun lobo come illustrato nella Figura 1 Eseguire esattamente tre pressioni per ciascun lobo Questa operazione non va intesa come un massaggio prostatico Base Lobo sinistro 3 Lobo destro Apice F
29. clic su NEW RUN nuova seduta e selezionare il protocollo e le concentrazioni appropriati per il dosaggio Fare clic su NEXT avanti per iniziare la seduta Nota La seduta deve essere completata entro 2 ore dal termine dell incubazione della fase di selezione a 62 5 Preparare un liquido di disattivazione miscelando in un contenitore di plastica con coperchio grande volumi uguali di soluzione di ipoclorito di sodio in concentrazioni dal 5 al 7 da 0 7 M a 1 0 M e tampone per liquido di disattivazione Etichettare e scrivere la data di scadenza sul contenitore di plastica Il liquido di disattivazione stabile per 4 settimane a temperatura ambiente PROGENSA PCA3 Assay 22 501377IT Rev D Procedura di analisi 6 Al termine della seduta il software del dosaggio genera due referti sulla seduta un referto dei dati grezzi sulla seduta e un referto dei rapporti se le sedute sono consecutive vedere Procedure di controllo della qualit e Interpretazione dei risultati Al termine della seduta togliere le TTU usate dal luminometro e disporle nel contenitore con il liquido di disattivazione Lasciare le TTU nel contenitore per almeno 15 minuti prima dello smaltimento Metodi adeguati di manipolazione e smaltimento vanno stabiliti dal direttore del laboratorio Note procedurali A Preparazione dei campioni 1 Se i campioni contengono precipitati in sospensione riscaldarli a 37 C per un massimo di 5 minuti e capovolg
30. d 8 elementi composto da campioni raggruppati da 1 a 3 e da trascritto di RNA da 4 a 8 in vitro diluito Tre operatori hanno analizzato il pannello in 18 sedute nell arco di 3 giorni usando un unico lotto di calibratori e controlli 3 lotti di reagenti e 3 serie di apparecchiature Le Tabelle 11 e 12 riepilogano la precisione totale nella stessa seduta e la precisione fra sedute operatori apparecchiature e lotti diversi del PROGENSA PCA3 Assay per c ml di analita e per PCA3 Score La variabilit nell ambito di una seduta e quella fra operatori diversi e sedute diverse sono state in ordine discendente i fattori che hanno contribuito in maniera maggiore alla varianza complessiva del dosaggio Il lotto di reagenti e l apparecchiatura hanno dimostrato di contribuire poco alla varianza complessiva del dosaggio Questi risultati dimostrano che il PROGENSA PCA3 Assay ha prestazioni riproducibili e che la fonte primaria della variazione l errore casuale nell ambito di una seduta PROGENSA PCA3 Assay 37 501377IT Rev D Caratteristiche dell esecuzione del test Tabella 11 Riproducibilita del PROGENSA PCA3 Assay analisi di copia ml CV CV fra anana ameno n Mwao CV nellebi diverso diversi ET giver seduta sedute operatori chiature lotti 1 36 248 27 24 7 15 11 0 2 36 7021 11 6 9 9 0 0 3 36 31 469 8 6 5 9 0 4 4 36 1469 15 13 7 6 0 1 PCA3 5 36
31. data di scadenza 30 giorni a 2 C 8 C Reagenti sonda 2 C 8 C fino alla data di scadenza 30 giorni a 2 C 8 C Reagente enzimatico 2 C 8 C fino alla data di scadenza 30 giorni a 2 C 8 C Reagenti Target Capture 15 C 30 C fino alla data di scadenza 30 giorni a 15 C 30 C Soluzione di ricostituzione amplificazione 2 C 30 fino alla data di scadenza N P monouso Soluzione ricostituzione 2 C 30 fino alla data di scadenza N P monouso sonda IIS dl ricostituzione 2 C 30 C fino alla data di scadenza N P monouso Reagente di selezione 2 C 30 C fino alla data di scadenza 30 giorni a 15 C 30 C Calibratori 2 C 8 C fino alla data di scadenza N P seduta singola Controlli 2 C 8 C fino alla data di scadenza N P seduta singola Reagente oleoso 15 C 30 C fino alla data di scadenza 30 giorni a 15 C 30 C Soluzione di lavaggio 15 C 30 fino alla data di scadenza 30 giorni a 15 C 30 C Tampone per fuldo d 15 C 30 C fino alla data di scadenza 28 giorni a 15 C 30 C disattivazione Si pu usare di nuovo per altre sedute di dosaggio fino a quattro volte purch la quantit totale di tempo in cui resta a temperatura ambiente non sia superiore alle 24 ore B Non conservare il reagente Target Capture a temperature inferiori a 15 C C Il reagente sonda e il reagente sonda ricostituito sono fotosensibili Proteggere questi reagenti da una prolu
32. del reagente enzimatico ricostituito a ciascuna delle miscele di reazione Tutte le reazioni dovrebbero ora essere di colore arancio 7 Coprire immediatamente le provette con un nuovo foglio sigillante rimuoverle dal bagno di acqua e miscelare rapidamente le reazioni agitando delicatamente la rastrelliera con la mano Nota Ridurre al minimo il periodo di tempo in cui la rastrelliera si trova fuori dal bagno di acqua onde evitare il raffreddamento delle provette PROGENSA PCA3 Assay 21 501377IT Rev D Procedura di analisi 8 Incubare la rastrelliera a 42 C 1 C per 60 5 minuti I Post amplificazione Il pipettatore a ripetizione usato nell ibridizzazione e nella selezione va dedicato esclusivamente a questi passaggi vedere Avvertenze e precauzioni L ambiente di post amplificazione incluso il rilevamento deve essere a 15 C 30 C Se si usa l SB100 Dry Heat Bath Vortexer consultare la Scheda applicativa dell SB100 1 Ibridazione a Togliere la rastrelliera dal bagno di acqua di pre amplificazione e trasferirla nella zona di post amplificazione Aggiungere 100 pl del reagente sonda specifico dell analita ricostituito usando il pipettatore a ripetizione Tutte le miscele di reazione dovrebbero ora essere di colore giallo b Coprire le provette con un foglio sigillante e agitarle per 10 secondi o fino ad ottenere un colore uniforme sul miscelatore vortex per unit multiprovetta c Incubare la rastrelli
33. enti e plastificati Disporre nel sistema di cattura del target TCS un numero sufficiente di vassoi con dieci puntali Assicurarsi che il flacone di lavaggio del TCS sia pieno di soluzione di lavaggio e che l aspiratore sia collegato alla pompa di aspirazione Consultare il Manuale d uso del sistema di cattura del target Ricostituzione e preparazione dei reagenti Prima di iniziare il trasferimento dei campioni occorre eseguire la ricostituzione dei reagenti ik Per ricostituire i reagenti di amplificazione enzimatico e sonda unire il contenuto dei flaconi di reagente liofilizzato alla soluzione di ricostituzione Se le soluzioni di ricostituzione sono state refrigerate prima dell uso lasciare che raggiungano la temperatura ambiente Figura 2 Processo di ricostituzione a Abbinare l appropriata soluzione di ricostituzione al suo reagente liofilizzato Verificare che i flaconi abbiano etichette dello stesso colore per assicurarsi che siano abbinati correttamente b Aprire il flacone del reagente liofilizzato e inserire con fermezza l estremit indentata del collare di ricostituzione nell apertura del flacone Figura 2 Passaggio 1 PROGENSA PCA3 Assay 17 501377IT Rev D Procedura di analisi c Aprire il flacone della soluzione di ricostituzione corrispondente e disporne il tappo su una superficie di lavoro pulita e coperta Tenendo il flacone della soluzione sul banco inserire con fermezza l
34. era in un bagno di acqua a 62 C 1 C per 20 5 minuti d Togliere la rastrelliera dal bagno di acqua e incubarla a temperatura ambiente per 5 1 minuti 2 Selezione a Usando il pipettatore a ripetizione aggiungere a ciascuna provetta 250 ul di reagente di selezione Tutte le reazioni dovrebbero ora essere di colore rosa b Coprire le provette con un foglio sigillante agitare su vortex per 10 secondi o fino ad ottenere un colore uniforme e incubare la rastrelliera in un bagno di acqua a 62 C 1 C per 10 1 minuti c Togliere la rastrelliera dal bagno di acqua Incubarla a temperatura ambiente per 15 3 minuti J Rilevamento Per l uso del LEADER HC Luminometer consultare il Manuale d uso del LEADER HC Luminometer Per l uso del PROGENSA PCA3 Assay Software consultare la Guida di riferimento rapido o il Manuale d uso e il Manuale dell amministratore di sistema del PROGENSA PCA3 Assay Software 1 Preparare il LEADER HC Luminometer mettendo una TTU vuota nella posizione di vassoio numero 1 ed eseguendo una volta il protocollo di WASH lavaggio 2 Assicurarsi di avere a disposizione volumi sufficienti di Auto Detect 1 e 2 per completare le reazioni 3 Caricare le TTU nel luminometro usando come guida il diagramma nel luminometro Se si analizzano entrambi gli analiti seduta consecutiva caricare prima tutte le TTU PCA3 seguite immediatamente da tutte le TTU PSA 4 Eseguire l accesso al computer Fare
35. erli poi delicatamente Nel caso in cui il precipitato non rientri in soluzione assicurarsi che non impedisca l erogazione del campione campioni congelati vanno scongelati a temperatura ambiente da 15 C a 30 si pu usare un bagno di acqua con capovolgimento occasionale durante lo scongelamento per prevenire la formazione di un tappo non solubile Miscelare i flaconi capovolgendoli delicatamente quando il ghiaccio all interno del flacone si sciolto abbastanza da staccarsi e si pu muovere liberamente Continuare il riscaldamento finch il campione non risulta completamente scongelato e miscelare di nuovo i flaconi capovolgendoli delicatamente a Se si forma un tappo e i campioni verranno pipettati con lo strumento TECAN Freedom EVO 100 4 ricongelare il campione ripetere le istruzioni di scongelamento e assicurarsi che non si formi un tappo Se non si riesce a eliminare il tappo il campione deve essere pipettato a mano b Se si forma un tappo e i campioni vengono pipettati a mano con un micropipettatore non occorre fare altro che assicurarsi che il tappo non impedisca l erogazione del campione B Pipettazione di controlli calibratori e campioni 1 Il volume del calibratore del controllo o del campione aggiunti alla TTU dovrebbe essere di 400 ul Si consiglia l ispezione visiva del volume pipettato nella TTU per assicurare un corretto trasferimento di volume Per ottenere risultati accurati occorre un volume appropriat
36. i azioni Se un codice di stato o di analisi appare nel Sommario delle eccezioni o nel Referto dei rapporti potrebbe essere necessario ripetere l analisi vedere Interpretazione dei risultati nel Sommario delle eccezioni e Interpretazione dei PROGENSA PCA3 Assay 28 501377IT Rev D Interpretazione dei risultati risultati nel Referto dei rapporti Se i risultati relativi all analita provengono da sedute separate e presentano uno o pi codici di analisi trovare la combinazione per entrambi gli analiti nella Tabella 4 o nella Tabella 5 per determinare se necessaria un azione ulteriore Nota La presenza di un codice di stato o di analisi non significa automaticamente che occorre ripetere l analisi Interpretazione dei risultati nel Sommario delle eccezioni Il Sommario delle eccezioni potrebbe non elencare alcuna eccezione In questi casi non occorrono ulteriori azioni Se il Sommario delle eccezioni elenca uno o pi campioni per le sedute consecutive nelle quali sono valide le sedute per entrambi gli analiti consultare la Tabella 4 per istruzioni in merito Per sedute di singoli analiti consultare nterpretazione dei codici di stato e di analisi In sedute consecutive nelle quali risulta non valida la seduta di un analita ripetere la seduta non valida vedere Ripetizione dell analisi per ulteriori informazioni e trattare i risultati come se fossero state eseguite singole sedute degli analiti Occorrer eseguire l abbin
37. i dalla raccolta dovranno essere rifiutati e occorrer richiedere nuovi campioni Il laboratorio pu conservare i campioni ad una temperatura compresa fra 2 C e 8 C per un massimo di 14 giorni Dopodich il campione dovr essere smaltito Se sono necessari periodi pi lunghi consultare la Tabella 2 in cui sono riportati i tempi di conservazione consentiti a diverse temperature Tabella 2 Durata di conservazione dei campioni di urina trattati Temperatura di conservazione Tempi Conservazione e spedizione dei campioni trattati fino a 5 giorni Dopo la ricezione presso il laboratorio di analisi da2 Ca8 C fino a 14 giorni da 35 C a 15 C fino a 11 mesi a 65 C o temperatura inferiore fino a 36 mesi Tempo consentito per la spedizione in condizioni ambientali non controllate o in fase di congelamento Tempo consentito dopo la conservazione in fase di congelamento 2 campioni di urina trattati possono essere sottoposti al massimo a 5 cicli di congelamento scongelamento C Conservazione dei campioni dopo l analisi 1 campioni analizzati devono essere conservati su una rastrelliera in posizione verticale 2 Le provette di trasporto dei campioni di urina se non vengono richiuse con un tappo intatto vanno coperte con una nuova barriera pulita di plastica o alluminio 3 Se i campioni analizzati devono essere congelati o spediti rimuovere i tappi perforabili e sostituirli con nuovi tap
38. igura 1 Giusta direzione della pressione applicata alla prostata Dopo il DRE chiedere al paziente di raccogliere l urina di primo getto circa 20 30 ml del getto di urina iniziale in una coppetta per raccolta adeguatamente etichettata Deve essere il campione di urina del primo getto successivo al DRE Usare una coppetta per raccolta priva di qualsiasi conservante Se un paziente non riesce a interrompere il flusso di urina e fornisce una quantit di urina superiore ai primi 20 30 ml richiesti conservare l intero volume fornito Se il paziente non in grado di fornire il volume di urina richiesto si tenga presente che per eseguire il PROGENSA PCA3 Assay sono necessari almeno 2 5 ml di urina In caso contrario il campione va rifiutato Nota Volumi di urina molto grandi possono abbassare le concentrazioni degli analiti PCA3 e PSA e pi raramente possono rendere il campione non valido Per questo motivo il paziente dovrebbe evitare di riempire la coppetta per la raccolta dell urina campioni di urina non trattati se non vengono trattati immediatamente devono essere mantenuti ad una temperatura compresa fra 2 C e 8 C oppure conservati sotto ghiaccio Il campione di urina raffreddato e non trattato va trasferito nella provetta di trasporto del campione di urina entro 4 ore dalla raccolta In caso contrario il campione va rifiutato e occorre raccogliere un nuovo campione Non congelare i campioni di urina non trattati PROGE
39. ione a temperatura ambiente riscaldarlo a 62 C 1 C per 1 2 minuti nell area di pre amplificazione Se il reagente sonda ricostituito contiene precipitato che non rientra in soluzione a temperatura ambiente riscaldarlo a 62 C 1 C per 1 2 minuti nell area di post amplificazione Dopo questi procedimenti di riscaldamento i reagenti ricostituiti possono essere usati anche se resta del precipitato residuo Dopo la risospensione miscelare i flaconi capovolgendoli delicatamente C Preparazione delle rastrelliere Il pipettatore a ripetizione usato nella cattura del target nel trasferimento dei campioni e nell amplificazione deve essere dedicato per l uso solo in questi passaggi vedere Avvertenze e precauzioni 1 Approntare una rastrelliera per l analita PCA3 ed un altra rastrelliera per l analita PSA Nota Se il numero di campioni abbastanza basso entrambi gli analiti possono essere analizzati in un unica rastrelliera Se si usa lo strumento TECAN Freedom EVO 100 4 per ciascun analita va usata una rastrelliera separata Non si possono analizzare pi di due rastrelliere complete 20 TTU alla volta 2 Nella e rastrelliera e per unit a dieci provette TTU disporre abbastanza TTU da poter alloggiare i calibratori i controlli ed i campioni per ciascun analita 3 Etichettare le TTU con gli ID campione La Tabella 3 descrive l aggiunta di calibratori controlli e campioni Avviare i calibratori PSA su una nu
40. kit PROGENSA PCA3 Assay non scambiare mescolare o combinare reagenti del dosaggio PCA3 provenienti da kit con numeri di lotto diversi ci significa che per ciascun analita i reagenti per dosaggio nella scatola refrigerata e in quella a temperatura ambiente devono provenire dallo stesso lotto reagenti del dosaggio possono essere usati con kit di calibratori e controlli provenienti da lotti diversi kit di liquidi per dosaggio APTIMA sono interscambiabili kit di reagenti PCA3 e PSA non devono obbligatoriamente essere abbinati luno con l altro Q Conservare tutti i reagenti del dosaggio alle temperature specificate L uso di reagenti conservati in modo erroneo pu influire sulle prestazioni del dosaggio Vedere Requisiti di conservazione e manipolazione e Note procedurali per istruzioni specifiche R Per la disattivazione del dosaggio vedere Procedura di analisi la concentrazione minima dell ipoclorito di sodio deve essere del 2 5 0 35 M dopo la diluizione 1 1 con il tampone di disattivazione Pertanto la soluzione di ipoclorito di sodio di partenza deve avere una concentrazione compresa tra il 5 e il 7 da 0 7 M a 1 0 M per raggiungere la concentrazione finale richiesta per la disattivazione S Usare puntali con tappi idrofobi A questo dosaggio vanno dedicati almeno due pipettatori a ripetizione uno da usare per le fasi di pre amplificazione e uno per le fasi di post amplificazione A meno che non si usi lo strumento TEC
41. la contaminazione incrociata i bagni di acqua vanno dedicati ad un procedimento specifico nell ambito del dosaggio Decontaminazione 1 Superfici e pipettatori Le superfici dei banchi del laboratorio e i pipettatori devono essere decontaminati regolarmente con una soluzione di ipoclorito di sodio dal 2 5 al 3 5 da 0 35 M a 0 5 M Lasciare la candeggina a contatto con le superfici per almeno 1 minuto quindi risciacquare con acqua Non lasciare asciugare la soluzione di ipoclorito di sodio Le soluzioni a base di cloro possono intaccare apparecchiature e metallo Risciacquare accuratamente con acqua le apparecchiature onde evitare che vengano intaccate Collettore di aspirazione del TCS Dopo ogni uso a Allontanare il collettore di dispensazione b Disporre un nuovo vassoio con dieci puntali TTC nell apposita rastrelliera Accendere la pompa di aspirazione Collegare il collettore di aspirazione ai puntali nel TTC Aspirare l eventuale soluzione di lavaggio restante nella vaschetta di condizionamento della stazione di dispensazione c Versare nella vaschetta di condizionamento almeno 100 ml di soluzione di ipoclorito di sodio in concentrazioni comprese fra 0 5 e 0 7 da 0 07 Ma 0 1 M o se si preferisce fra 2 5 e 3 5 da 0 35 M a 0 5 M Aspirare tutta la soluzione attraverso il collettore di aspirazione d Versare nella vaschetta di condizionamento almeno 100 ml di acqua deionizzata Aspirare tutta l acqua attravers
42. la seduta di un analita pu essere non valida mentre quella dell altro analita valida In fondo al Referto dei dati grezzi sulla seduta si trova il Sommario delle eccezioni Per le sedute consecutive in cui le sedute per entrambi gli analiti sono valide i campioni elencati nel Sommario delle eccezioni potrebbero richiedere la ripetizione dell analisi di un analita Sebbene nel Sommario delle eccezioni sia indicato un risultato di PCA3 Score questo risultato non considerato refertabile fino a quando non stato eseguito l abbinamento manuale ed il risultato non indicato nel Referto dei rapporti Se stato analizzato solo un analita o se la seduta per un analita non valida tutti i campioni analizzati verranno elencati nel Sommario delle eccezioni 2 Referto dei rapporti Il software del dosaggio genera automaticamente un Referto dei rapporti per una seduta consecutiva nella quale le sedute di entrambi gli analiti sono valide Il software calcola e riporta il PCA3 Score dei campioni nel Referto dei rapporti campioni indicati nel Referto dei rapporti o non richiedono ulteriore analisi oppure entrambi gli analiti devono essere risottoposti ad analisi campioni non indicati nel Referto dei rapporti saranno reperibili nella sezione Sommario delle eccezioni del Referto dei dati grezzi sulla seduta Un Referto dei rapporti pu essere generato anche dopo l abbinamento manuale vedere Abbinamento manuale per ulteriori informazio
43. lla prostata c Specificit tissutale RNA totale stato estratto dai tessuti di due donatori distinti di sesso maschile in base al tipo di tessuto stato aggiunto diluente ai campioni 10 ng per reazione ed stata eseguita l analisi con il PROGENSA PCA3 Assay Il tessuto della prostata stato l unico tipo di tessuto rilevato sopra il limite di rilevamento dell RNA di PCA8 fra i tipi di tessuto indicati nella Tabella 7 PROGENSA PCA3 Assay 34 501377IT Rev D Caratteristiche dell esecuzione del test Tabella 7 Tipi di tessuto maschile analizzati per il rilevamento dell RNA di PCA3 Tipo di tessuto Vescica normale Rene Vescica tumorale Pene Midollo osseo Prostata Dotto deferente Vescicola seminale Epididimo Testicolo d Sostanze interferenti le sostanze indicate nella Tabella 8 sono state aggiunte ad aliquote di urina maschile trattata raggruppata campioni sono stati analizzati con il PROGENSA PCA3 Assay secondo CLSI EP7 A2 2005 6 Alle concentrazioni indicate non stata osservata nessuna interferenza con il dosaggio Tabella 8 Sostanze analizzate per l interferenza con il PROGENSA PCA3 Assay Agenti terapeutici Agenti terapeutici continua Concentrazione Concentrazione sortanza della prova Sostanza della prova Acetaminofene Codeina 5 34 umol I Uroxatral 30 mg l Atorvastatina 25 mg l Doxazosina 1 33 mol
44. lla prova dell antigene sierico specifico della prostata PSA per lo screening del cancro alla prostata ha portato alla diagnosi bioptica di tumori pi piccoli e precedentemente non rilevati 1 creando cos un nuovo dilemma diagnostico solo una frazione di uomini che presentano aumentati livelli di PSA sierico hanno un cancro alla prostata rilevabile Gli uomini con almeno una biopsia negativa spesso presentano livelli persistentemente aumentati di PSA sierico dovuti principalmente a prostate ingrossate e ad iperplasia prostatica benigna IPB Eppure una proporzione significativa di uomini con livelli leggermente aumentati di PSA sierico 2 5 4 0 ug l presentano o svilupperanno un cancro alla prostata clinicamente significativo 1 Sebbene la biopsia resti il gold standard per il rilevamento del cancro alla prostata prove pi accurate con una migliore specificit sono necessarie per aiutare a guidare la decisione di eseguire una biopsia della prostata Il PCA3 noto anche come PCA3 o DD3 un RNA non codificante specifico della prostata che viene iperespresso in elevate quantit nelle cellule cancerose della prostata con un livello mediano di 66 volte superiore alla norma rispetto al tessuto benigno adiacente 2 In contrasto l espressione del gene PSA simile nelle cellule cancerose e in quelle benigne i livelli di RNA del PSA possono quindi essere usati per standardizzare la quantit di acido ribo
45. mazioni e Un abbinamento manuale degli analiti PCA3 e PSA potrebbe essere necessario per determinare il PCA3 Score vedere Abbinamento manuale per ulteriori informazioni 2 Diluizione di campioni alti fuori intervallo a Se la concentrazione di un campione estrapola sopra il Calibratore 5 all interno di una seduta valida il risultato alto fuori intervallo e viene etichettato con un codice di analisi f o F nei referti della seduta La concentrazione sara espressa come gt Concentrazione Calibratore 5 b Capovolgere il campione di urina trattato per miscelarlo prima della diluizione del campione stesso La diluizione consigliata ma non obbligatoria di 1 10 usando il PROGENSA PCA3 Specimen Diluent Kit In un apposita fiala aggiungere 1800 ul di diluente per campione e 200 pl di campione chiudere la provetta e capovolgerla cinque volte per miscelarla completamente Il fattore di diluizione sar 10 nella lista di lavoro della seduta Se devono essere rianalizzati entrambi gli analiti raddoppiare i volumi usare 3600 ul di diluente del campione e 400 ul di campione Consultare il foglietto illustrativo del PROGENSA PCA3 Specimen Diluent Kit Analizzare il campione diluito con il dosaggio c Se dopo la ripetizione dell analisi il risultato del campione di nuovo alto fuori intervallo si richiede un ulteriore diluizione fino a quando il risultato del campione non interpola all interno dell inter
46. ngata esposizione alla luce durante il magazzinaggio e la preparazione all uso D Non congelare i reagenti E Non usare i reagenti n i liquidi dopo la data di scadenza F I calibratori ed i controlli PROGENSA PCA3 e PSA sono flaconi da utilizzare per un unica seduta e vanno smaltiti dopo l uso G Cambiamenti nell aspetto fisico del reagente fornito possono indicare instabilit o deterioramento di questi materiali Se si notano cambiamenti nell aspetto fisico dei reagenti una volta che siano stati rimessi in sospensione per es evidenti cambiamenti nel colore o nella torbidit del reagente indicativi di contaminazione microbica contattare l Assistenza tecnica Gen Probe prima dell uso H Eliminare il reagente ricostituito dopo 30 giorni o entro la data di scadenza a seconda di quale data cada per prima PROGENSA PCA3 Assay 13 501377IT Rev D Requisiti di conservazione e manipolazione I Avanzi di reagenti aperti o ricostituiti possono essere usati in dosaggi successivi se sono stati conservati adeguatamente dopo l uso iniziale Il reagente avanzato pu essere unito a reagenti appena preparati o ad altri reagenti avanzati dello stesso lotto Non scambiare mescolare o combinare reagenti provenienti da kit con numeri di lotto diversi vedere Avvertenze e precauzioni Nessun componente del reagente raggruppato pu superare i limiti di conservazione dei reagenti aperti o ricostituiti Assicurarsi che il reagente raggrupp
47. ni 3 Referto di QC Il Referto di QC indica i criteri di validit Ie concentrazioni assegnate e interpolate ed i recuperi di calibratori e controlli relativi alla seduta del dosaggio Il referto indica anche i parametri che definiscono la curva di calibrazione di risposta al dosaggio logistica a quattro parametri 3 Per ulteriori informazioni consultare il Manuale d uso del PROGENSA PCA3 Assay Software B Abbinamento 1 Abbinamento automatico Nelle sedute consecutive in cui sono valide le sedute di entrambi gli analiti il software abbina automaticamente i risultati individuali relativi agli analiti PCA3 e PSA per i campioni e determina il PCA3 Score se calcolabile risultati sono indicati nel Referto dei rapporti o nel Sommario delle eccezioni del Referto dei dati grezzi sulla seduta 2 Abbinamento manuale Quando gli analiti PCA3 e PSA vengono analizzati in diverse sedute il software non in grado di determinare automaticamente il PCA3 Score L abbinamento PROGENSA PCA3 Assay 27 501377IT Rev D Interpretazione dei risultati manuale dei risultati relativi agli analiti necessario per determinare il PCA3 Score o l intervallo del PCA3 Score consultare la Guida di riferimento rapido o il Manuale d uso del PROGENSA PCA3 Assay Software l abbinamento manuale pu essere richiesto anche per i risultati che sono indicati nel Sommario delle eccezioni del Referto dei dati grezzi sulla seduta Dopo l abbinamento manuale
48. ni di urina Poich il sistema di trasporto impiegato per il PROGENSA PCA3 Assay non permette la valutazione microscopica dell adeguatezza dei campioni di urina necessario addestrare i medici sulle appropriate tecniche di raccolta dei campioni Vedere Raccolta trasporto e conservazione dei campioni Per istruzioni dettagliate consultare il foglietto illustrativo contenuto nel PROGENSA PCA3 Urine Specimen Transport Kit F I risultati del PROGENSA PCA3 Assay devono essere interpretati contestualmente ad altri dati di laboratorio e ai dati clinici a disposizione del medico I risultati della prova possono essere influenzati da un erronea raccolta dei campioni da errori tecnici o da scambi di campioni PROGENSA PCA3 Assay 32 501377IT Rev D Caratteristiche dell esecuzione del test Caratteristiche dell esecuzione del test A Risultati clinici 1 Sensibilit e specificit diagnostiche Le caratteristiche di prestazione per il PROGENSA PCA3 Assay sono state stabilite utilizzando campioni provenienti da soggetti iscritti presso quattro centri clinici nord americani geograficamente diversificati La popolazione dei soggetti consisteva in 529 uomini per i quali era programmata la biopsia della prostata dati demografici dei soggetti sono indicati sotto a Et media DS 64 8 anni valore mediano 63 intervallo dai 32 agli 89 b Livello medio di PSA sierico 7 9 21 9 ug l 5 6 da 0 3 a 484 c Volume medio della prostat
49. nucleico RNA specifico della prostata nei campioni per le prove molecolari stata dimostrata l attuabilit di analisi molecolari quantitative basate su PCA3 partendo da sedimenti di urina 2 e da urina intera 3 Il PROGENSA PCA3 Assay utilizza urina intera raccolta a seguito di esame digito rettale DRE consistente in tre pressioni per ciascun lobo Il DRE libera le cellule della prostata attraverso il sistema di dotti di quest ultima nel tratto urinario dove possono essere raccolte nell urina di primo getto L urina viene trattata mediante l aggiunta del Mezzo di trasporto dell urina UTM che provoca la lisi delle cellule e stabilizza RNA Gli RNA di PCA3 e PSA vengono quantificati e il PCA3 Score viene determinato in base al rapporto dell RNA di PCA3 e PSA Oltre a standardizzare il segnale del PCA3 la misurazione del RNA del PSA serve anche a confermare che il prodotto di RNA specifico della prostata sufficiente a generare un risultato valido Un PCA3 Score superiore correlato ad una pi alta probabilit di una biopsia della prostata positiva Principi della procedura II PROGENSA PCA3 Assay composto da due prove quantitative di amplificazione degli acidi nucleici II PROGENSA PCA3 Assay combina le tecnologie di cattura del target dell amplificazione mediata dalla trascrizione TMA e del dosaggio con protezione dell ibridizzazione HPA per rispettivamente sveltire il trattamento dei campioni di urina am
50. o Assicurarsi che il puntale della pipetta sia alloggiato correttamente sul pipettatore e che l impostazione del volume sia corretta Si raccomanda di controllare visivamente l impostazione del volume al termine di ciascuna TTU ogni 10 provette Rilasciare lentamente e a velocit costante lo stantuffo della pipetta quando si aspira il campione per evitare che si formino schiuma e bolle C Reagenti 1 Durante la conservazione la soluzione di ricostituzione del reagente sonda potrebbe creare precipitato Riscaldare la soluzione a 62 C 1 C per 1 2 minuti Al termine di questa fase di riscaldamento la soluzione di ricostituzione della sonda pu essere utilizzata anche se resta un precipitato residuo Dopo la risospensione miscelare capovolgendo con attenzione la fiala Quando si pipettano reagenti diversi dall enzima mirare leggermente verso il lato del fondo della provetta di reazione dove il fondo si curva verso l alto per incontrare i lati Quando si pipetta il reagente enzimatico mirare direttamente verso il centro della provetta di reazione Confermare visivamente che i reagenti vengano distribuiti correttamente senza una quantit eccessiva di reagente sui lati delle provette e con un adeguato viraggio del colore PROGENSA PCA3 Assay 23 501377IT Rev D Procedura di analisi D Temperatura 1 2 Le fasi di cattura del target di amplificazione di ibridizzazione e di selezione dipendono dalla tempera
51. o il collettore di aspirazione PROGENSA PCA3 Assay 24 501377IT Rev D Procedura di analisi e Espellere i puntali nel loro TTC originario f Lasciare accesa la pompa di aspirazione finch il tubo del collettore non risulta asciutto per prevenire il riflusso circa 3 minuti g Decontaminare le superfici del collettore di aspirazione come descritto in Unit TCS 3 Contenitore degli scarti del TCS Pulire la bottiglia degli scarti almeno una volta alla settimana o quando risulta piena al 25 a seconda del caso che si verifichi per primo a Spegnere la pompa di aspirazione e lasciare equalizzare la pressione di aspirazione b Rilasciare i raccordi di scollegamento rapido fra la bottiglia degli scarti e il flacone di traboccamento e tra la bottiglia degli scarti e il collettore di aspirazione c Rimuovere la bottiglia degli scarti dal contenitore di cattura sotto vuoto d Rimuovere il tappo e aggiungere con cautela 400 ml di soluzione di ipoclorito di sodio in concentrazioni comprese fra 5 e 7 da 0 7 M a 1 0 M alla bottiglia degli scarti da 4 Nota Questo procedimento pu essere eseguito all interno di una cappa aspirante per evitare di liberare fumi nel laboratorio e Chiudere la bottiglia degli scarti e agitarne delicatamente il contenuto con un movimento rotatorio fino a miscelarlo completamente f Lasciare ferma la bottiglia degli scarti per almeno 15 minuti e poi smaltirne il contenuto scarti g Ri
52. o prima della data di scadenza indicata nel kit di raccolta e che siano trasportati e conservati seguendo le istruzioni del foglietto illustrativo della confezione sono validi per l analisi anche se la data di scadenza della provetta di raccolta passata PROGENSA PCA3 Assay 10 501377IT Rev D Avvertenze e precauzioni L Conservare tutti i campioni alle temperature specificate Luso di campioni conservati in modo erroneo pu influire sulle prestazioni del dosaggio Vedere Raccolta trasporto e conservazione dei campioni per istruzioni specifiche M campioni di urina potrebbero essere infettivi Nell eseguire questo dosaggio adottare le precauzioni universali Metodi adeguati di manipolazione e smaltimento vanno stabiliti dal direttore del laboratorio Questa procedura va svolta solo da personale adeguatamente qualificato e competente nell uso del PROGENSA PCA3 Assay e adeguatamente addestrato nella manipolazione di materiali infettivi N Evitare la contaminazione crociata durante i procedimenti di manipolazione dei campioni campioni di urina possono contenere livelli elevati di RNA target Assicurarsi che i contenitori dei campioni non vengano in contatto tra di loro ed eliminare i materiali usati senza farli passare sopra i contenitori aperti Se i guanti entrano in contatto con un campione cambiarli per evitare la contaminazione incrociata Pertinenti al dosaggio O Non usare il kit dopo la data di scadenza P Per il
53. ome descritto sopra nella sezione Decontaminazione 4 Come in qualsiasi sistema di reazione il talco eccessivo in alcuni guanti pu causare la contaminazione di provette aperte Si raccomanda agli operatori di indossare guanti privi di talco PROGENSA PCA3 Assay 25 501377IT Rev D adel Ul acme ELOR GLER MEULE Procedure di controllo della qualit A Validit della seduta 1 Calibratori e controlli vanno analizzati con tutti i dosaggi e sulla stessa rastrelliera come campioni di analisi Perch una seduta possa essere considerata valida vanno soddisfatti i seguenti criteri Valore RLU medio del calibratore 2 gt valore soglia RLU Dove il valore soglia RLU RLU medio del calibratore 1 1 645 deviazioni standard dei replicati RLU del calibratore 1 1 645 deviazioni standard dei replicati RLU del calibratore 2 Recupero medio interpolato del calibratore 5 100 30 Recupero medio interpolato del controllo A 100 60 Recupero medio interpolato del controllo B 100 35 2 Il software PCA3 valuta automaticamente i risultati rispetto ai criteri indicati sopra e referta lo Stato seduta come PASS superata se i criteri di validit sono soddisfatti e come FAIL non superata se i criteri di validit non vengono soddisfatti 3 Se lo Stato seduta FAIL non superata tutti i risultati della prova nella stessa seduta sono non validi per quell analita e non vanno refertati 4 Se una seduta non valida ess
54. ova TTU Nota calibratori vanno eseguiti in tre replicati ed i controlli in due replicati ciascuno e devono essere eseguiti sulla stessa rastrelliera dei campioni campioni vanno eseguiti in replicato Non lasciare tubi di reazione vuoti fra calibratori controlli e campioni Se si usa lo strumento TECAN Freedom EVO 100 4 consultare la Scheda applicativa del TECAN Freedom EVO 100 4 per il PROGENSA PCA3 Assay Scheda applicativa del TECAN Freedom EVO per ulteriori istruzioni PROGENSA PCA3 Assay 18 501377IT Rev D Procedura di analisi Tabella 3 Esempio di approntamento di rastrelliera Rastrelliera Campione Concentrazione Concentrazione Posizione Descrizione PCAS target PSA target copie ml copie ml da1a3 Calibratore 1 0 0 da 4a 6 Calibratore 2 250 7500 da7a9 Calibratore 3 2500 75 000 da 10a 12 Calibratore 4 25 000 750 000 da 13a 15 Calibratore 5 125 000 3 000 000 da 16a 17 Controllo A 1250 37 500 da 18a 19 Controllo B 62 500 1 500 000 da 20an Campione clinico sconosciuto sconosciuto Calibratori e controlli positivi di PCA3 e PSA hanno valori assegnati quindi i valori effettivi di copie ml per i calibratori da 2 a 5 e per i controlli A e B saranno leggermente diversi dalle concentrazioni target indicate nella tabella e varieranno da un lotto all altro Le informazioni sulla concentrazione vengono fornite su una scheda contenuta nella confezione delle fiale di calibratore e controllo e sono usati
55. pi non perforabili sulle provette di trasporto del campione Qualora sia necessario inviare i campioni presso altri laboratori di analisi necessario mantenerli alle temperature consigliate Evitare schizzi e contaminazione incrociata Nota La spedizione dei campioni deve essere effettuata in conformit ai regolamenti applicabili relativi al trasporto nazionale e internazionale PROGENSA PCA3 Assay 16 501377IT Rev D Procedura di analisi Procedura di analisi A Preparazione dell area di lavoro 1 Regolare un bagno di acqua su 62 C 1 C per la pre amplificazione un secondo bagno di acqua su 42 C 1 C per l amplificazione ed un terzo su 62 C 1 C per la post amplificazione Assicurarsi che i bagni di acqua contengano una quantit d acqua sufficiente vedere Note procedurali Se si usa l SB100 Dry Heat Bath Vortexer consultare la Scheda applicativa dell SB100 Dry Heat Bath Vortexer per il PROGENSA PCA3 Assay Scheda applicativa dell SB100 Prima di iniziare il dosaggio pulire le superfici di lavoro e i pipettatori con una soluzione di ipoclorito di sodio al 2 5 3 5 da 0 35 M a 0 5 M Lasciare la soluzione di ipoclorito di sodio a contatto con le superfici e i pipettatori per almeno 1 minuto quindi risciacquare con acqua Non lasciare asciugare la soluzione di ipoclorito di sodio Coprire la superficie del banco sul quale verr eseguita l analisi con teli da banco di laboratorio puliti assorb
56. plificare RNA target e rilevare l amplicone PROGENSA PCA3 Assay 2 501377IT Rev D Informazioni generali Quando il PROGENSA PCA3 Assay viene eseguito in laboratorio le molecole di RNA target vengono isolate dai campioni di urina mediante cattura del target Gli oligonucleotidi oligonucleotidi di cattura che sono complementari alle regioni specifiche della sequenza dei target vengono ibridizzati ai target presenti nel campione di urina Per ciascun target viene usato un oligonucleotide di cattura separato Il target ibridizzato viene quindi catturato su microparticelle magnetiche che vengono separate dal campione di urina in un campo magnetico Processi di lavaggio vengono utilizzati per rimuovere i componenti estranei dalla provetta di reazione procedimenti di separazione magnetica e lavaggio vengono eseguiti con un sistema di target capture L amplificazione del target si verifica mediante TMA che un metodo di amplificazione degli acidi nucleici basato su trascrizione che utilizza due enzimi la trascrittasi inversa del virus della leucemia murina di Moloney MMLV e la polimerasi dell RNA T7 Per ciascun target viene usata una serie univoca di primer La trascrittasi inversa viene usata per generare una copia di acido desossiribonucleico DNA contenente una sequenza promotrice per la polimerasi del RNA T7 della sequenza target La polimerasi dell RNA T7 produce copie multiple di amplicone di RNA dal modello della copia di DN
57. po piastra del piano PCA3 DTS 800 902021 Serbatoio del reagente modulo diviso in quattro da 40 ml 104765 Serbatoio del reagente diviso modulo diviso in quattro da 19 ml x 2 901172 Provette di trasporto 302521 Tappi di ricambio perforabili 302520 Tappi di ricambio non perforabili 103036A PROGENSA PCA3 Assay 9 501377IT Rev D Avvertenze e precauzioni Avvertenze e precauzioni A B Per uso diagnostico in vitro Solo per esportazione dagli USA Pertinenti al laboratorio C Usare solo contenitori da laboratorio monouso forniti o indicati in modo specifico come monouso Adottare le consuete precauzioni di laboratorio Non mangiare bere o fumare nelle aree di lavoro Quando si maneggiano campioni di urina e reagenti del kit indossare guanti monouso senza talco occhiali protettivi e camici da laboratorio Lavarsi accuratamente le mani dopo aver maneggiato campioni di urina e reagenti del kit Avvertenza irritanti corrosivi Evitare il contatto dell Auto Detect 1 e dell Auto Detect 2 con la pelle gli occhi e le mucose Se questi liquidi vengono a contatto con la pelle o con gli occhi risciacquare con acqua le zone colpite Se questi liquidi si rovesciano diluire il liquido rovesciato con acqua prima di asciugarlo con un panno Le superfici di lavoro i pipettatori e le altre apparecchiature devono essere decontaminati regolarmente con una soluzione di ipoclorito di sodio al 2 5 3 5 da 0 35 M a 0 5 M vede
58. re Note procedurali Per ridurre al minimo la contaminazione da ampliconi nel dosaggio si raccomanda caldamente di disporre di un area separata per la post amplificazione Quest area dedicata dovrebbe essere lontana dall area di pre amplificazione dove hanno luogo la preparazione del reagente la cattura del target e l amplificazione Per contribuire ad evitare la contaminazione da ampliconi del laboratorio disporre le aree secondo un flusso di lavoro unidirezionale dalla preparazione dei reagenti fino alla post amplificazione Campioni apparecchiature e reagenti non devono essere riportati nell area in cui stata eseguita una fase procedurale precedente Il personale non deve ritornare nelle aree di lavoro precedenti senza adottare adeguate misure di salvaguardia contro la contaminazione Pertinenti ai campioni Dopo l aggiunta dell urina il livello del liquido nella provetta di trasporto del campione di urina deve rientrare inizialmente fra le due righe nere indicatrici marcate sull etichetta della provetta In caso contrario il campione va rifiutato Mantenere le corrette condizioni di conservazione durante la spedizione del campione per assicurarne l integrit La stabilit del campione in condizioni di spedizione diverse da quelle raccomandate non stata determinata Le date di scadenza indicate sui kit di raccolta si riferiscono al centro di raccolta e non al laboratorio di analisi campioni raccolti in qualsiasi moment
59. sciacquare la bottiglia degli scarti con acqua per eliminare eventuali scarti restanti al suo interno h Chiudere la bottiglia degli scarti vuota e metterla nel contenitore di cattura sotto vuoto Collegare i raccordi di scollegamento rapido al dispositivo TCS Smaltire con cautela entrambi i guanti 4 Unit TCS Pulire le superfici dell unit TCS il collettore di aspirazione e i puntali di espulsione del tampone di lavaggio con salviette di carta inumidite di soluzione di ipoclorito di sodio dal 2 5 al 3 5 da 0 35 M a 0 5 M Dopo il passaggio con soluzione di ipoclorito di sodio risciacquare con acqua e poi asciugare completamente le superfici con salviette di carta 5 Rastrelliere Immergere le rastrelliere in una soluzione di ipoclorito di sodio dal 2 5 al 3 5 da 0 35 M a 0 5 M assicurandosi che siano coperte dalla soluzione Tenere le rastrelliere immerse per 10 minuti Un esposizione pi prolungata danneggia le rastrelliere Risciacquare accuratamente le rastrelliere con acqua e asciugarle completamente con salviette di carta I Contaminazione del dosaggio 1 Se non si presta abbastanza attenzione durante la procedura del dosaggio potrebbe verificarsi l introduzione di materiali contaminanti 2 Le TTU vanno decontaminate nel liquido di disattivazione come descritto nella Procedura di analisi Non riutilizzare le TTU 3 Eseguire una regolare decontaminazione delle apparecchiature e delle superfici di lavoro c
60. ta Concentrazione Recupero c ml misurata c ml 750 808 108 7500 7618 102 PCA3 18 750 18 722 100 75 000 70 287 94 20 000 23 684 118 250 000 278 373 111 PSA 500 000 599 941 120 1 750 000 1 960 775 112 4 Linearit e intervallo L intervallo lineare del PROGENSA PCA3 Assay stato determinato secondo CLSI EP6 A 2003 8 in base all analisi di regressione lineare minimi quadrati Due gruppi di serie di diluizioni sono stati preparati partendo da campioni contenenti alte concentrazioni di RNA di PCA3 e PSA Un gruppo stato diluito in urina femminile trattata ed un gruppo in diluente del campione Le diluizioni coprivano l intero intervallo del dosaggio compreso fra i calibratori positivi pi bassi e pi alti per ciascun analita Per entrambi gli analiti PCA3 e PSA i risultati misurati dal dosaggio hanno mostrato una relazione proporzionale diretta fra le diluizioni analizzate ed i valori di c ml di analita refertati Non si riscontrato un significativo effetto matrice del diluente Vedere Figura 4 1 4E 05 1 2E 05 g 5 2 E De lt oO a E o 2 0E 04 4 0 0E 00 1 0E 05 4 8 0E 04 4 6 0E 04 4 4 0E 04 Analita PCA3 y 0 9932x 613 87 R 0 9998 O Diluente del campione y 0 9523x 79 762 R2 0 9999 A Urina 0 0E 00 3 0E 04 6 0E 04 9 0E 04 1 2E 05 c ml PCA3 previsti c ml PSA misurati Analita PSA 3 0E 06 y 1 0875x
61. to PROGENSA PCA3 Assay 20 501377IT Rev D Procedura di analisi 12 Al termine dell aspirazione espellere i puntali nel rispettivo vassoio originale portapuntali Ripetere i passaggi di aspirazione per le TTU restanti usando per ogni provetta di reazione un puntale dedicato 13 Disporre il collettore di dispensazione sopra ciascuna TTU e usando la pompa della stazione di dispensazione erogare 1 0 ml di soluzione di lavaggio in ciascuna provetta della TTU 14 Coprire le provette con un foglio sigillante e rimuovere la rastrelliera dal TCS Agitare una volta sul miscelatore vortex per unit multiprovetta Per ulteriori informazioni vedere Note procedurali 15 Disporre la rastrelliera sulla base magnetica del TCS per 5 10 minuti 16 Aspirare tutto il liquido come descritto nei Fasi 11 e 12 17 Dopo l aspirazione finale togliere la rastrelliera dalla base magnetica del TCS e ispezionare visivamente le provette per assicurarsi che tutto il liquido sia stato aspirato e che tutte le provette contengano pellet di microparticelle magnetiche Se si vede del liquido disporre di nuovo la rastrelliera sulla base del TCS per 2 minuti e ripetere l aspirazione per quella TTU usando gli stessi puntali usati in precedenza per ciascuna provetta di reazione Se una volta completata l aspirazione visibile QUALSIASI pellet di particelle magnetiche la provetta pu essere accettata Se non visibile alcun pellet il campione va risottopos
62. to ad analisi Se lo stesso campione non contiene un pellet di particelle magnetiche a questo stadio di una seduta successiva questo potrebbe indicare un problema specifico del campione In questo caso si consiglia di fare una seconda raccolta del campione di urina H Amplificazione Nota L aggiunta di enzima ad una rastrelliera di reazione Fasi 6 e 7 qui sotto va eseguita entro 90 secondi al massimo Eseguire i Fasi 6 e 7 su una rastrelliera prima di ripeterli sulla seconda Se si usa l SB100 Dry Heat Bath Vortexer consultare la Scheda applicativa dell SB100 Se si usa lo strumento TECAN Freedom EVO 100 4 consultare la Scheda applicativa del TECAN Freedom EVO per ulteriori istruzioni 1 Usando il pipettatore a ripetizione aggiungere a ciascuna provetta di reazione 75 ul di reagente di amplificazione ricostituito specifico per l analita Tutte le miscele di reazione nella rastrelliera devono essere ora di colore rosso Usando il pipettatore a ripetizione aggiungere 200 pl di reagente oleoso Coprire le provette con un foglio sigillante e agitarle su un miscelatore vortex per unit multiprovetta 4 Incubare la rastrelliera nel bagno di acqua di pre amplificazione a 62 C 1 C per 10 5 minuti Trasferire la rastrelliera in un bagno di acqua a 42 C 1 C per 5 2 minuti Con la rastrelliera nel bagno di acqua togliere delicatamente il foglio sigillante e poi usando il pipettatore a ripetizione aggiungere 25 pl
63. tura Di conseguenza essenziale che i bagni di acqua vengano mantenuti entro gli intervalli di temperature specificati per essi Per temperatura ambiente si intende un range di temperatura da 15 C a 30 C Tempi Le reazioni di cattura del target di amplificazione di ibridizzazione e di selezione dipendono dai tempi Attenersi ai tempi specifici indicati nella Procedura di analisi Agitazione su vortex Un adeguata agitazione su vortex importante per ottenere buone prestazioni con il PROGENSA PCA3 Assay Per agitare le reazioni impostare la velocit del miscelatore vortex per unit multiprovetta sul valore minimo fissare la rastrelliera e accendere l alimentazione Aumentare lentamente la velocit fino a quando il liquido non arriva a met della provetta Agitare per 10 secondi la quantit di tempo indicata o fino a quando il colore non risulti uniforme Prima di spegnere il miscelatore vortex per unit multiprovetta e rimuovere la rastrelliera impostare la velocit sul valore minimo Le miscele di reazione non devono mai entrare a contatto con i fogli sigillanti Bagni di acqua 1 Il livello di acqua nei bagni deve essere mantenuto a una profondit compresa tra 3 8 cm e 5 0 cm tra 1 5 poll e 2 0 poll in base alla misura presa partendo dalla cassetta di metallo di supporto posta sul fondo del bagno di acqua fino alla superficie dell acqua Questo assicura un adeguato trasferimento del calore Per evitare
64. uito stato usato per valutare la sensibilit del dosaggio Un operatore ha analizzato il pannello in dodici sedute di cinque replicati usando un unico lotto di reagenti Il limite del rilevamento e il limite della valutazione quantitativa sono stati calcolati secondo CLSI EP17 A 2004 5 Il limite del rilevamento dell analita PCA3 stato di 80 c ml e dell analita PSA stato di 1438 c ml Il limite della valutazione quantitativa di entrambi gli analiti stato il Calibratore 2 2 Specificit analitica a Trascritto non accoppiato il PROGENSA PCA3 Assay stato concepito per rilevare solo RNA di PCA3 accoppiato esone 4 esone 3 specifico del cancro alla prostata 2 Il dosaggio non ha rilevato 1 milione di c ml di RNA di PCA3 non accoppiato significativamente al di sopra del background b Specificit alla prostata dell RNA di PCA3 nell urina campioni derivanti da soggetti che avevano subito una prostatectomia radicale n 97 sono stati analizzati con il PROGENSA PCA3 Assay e i livelli di RNA di PCA3 sono stati confrontati con quelli di soggetti pre biopsia n 464 Il livello mediano di c ml di RNA di PCA8 risultato al di sotto del limite di rilevamento del dosaggio per i campioni derivanti da soggetti post prostatectomia mentre il livello mediano di c ml di RNA di PCA3 per i campioni derivanti da soggetti pre biopsia risultato pari a 7243 c ml questi dati confermano che l RNA di PCA3 nell urina proviene da
65. vallo dei calibratori permissibile un ulteriore diluizione della diluizione iniziale 1 10 purch la diluizione iniziale sia stata conservata correttamente vedere Raccolta trasporto e conservazione dei campioni per ulteriori informazioni PROGENSA PCA3 Assay 31 501377IT Rev D Limiti A Il PROGENSA PCA3 Assay non va usato per pazienti che stanno assumendo farmaci che sono noti influire sui livelli di PSA sierico come il finasteride Proscar Propecia il dutasteride Avodart e la terapia antiandrogena Lupron L effetto di questi farmaci sull espressione del gene PCA3 non ancora stato valutato B Certe procedure terapeutiche e diagnostiche come la prostatectomia le radiazioni la biopsia della prostata ed altre potrebbero influire sulla vitalit del tessuto prostatico e di conseguenza influire sul PCA3 Score L effetto di queste procedure sulle prestazioni del dosaggio non ancora stato valutato campioni per l analisi PCA3 vanno raccolti quando il clinico ritiene che il tessuto prostatico si sia ripreso da tali procedure C L uso del PROGENSA PCA3 Assay va limitato al personale che stato addestrato nella relativa procedura La mancata osservanza alle istruzioni fornite in questo foglietto illustrativo pu determinare risultati erronei D Ciascun laboratorio deve convalidare in modo indipendente un processo di trasferimento al LIS E Risultati affidabili dipendono da un appropriata raccolta dei campio
66. x2 0ml Soluzione tamponata con fosfato contenente lt 5 di lauril solfato di litio CAL Calibratori 2 5 PSA 4x 1 7 ml Acido nucleico di PSA non infettivo in soluzione tamponata con fosfato contenente lt 5 di lauril solfato di litio PC Controlli positivi PSA 2x 1 7 ml Acido nucleico di PSA non infettivo in soluzione tamponata con fosfato contenente lt 5 di lauril solfato di litio Scheda informativa sulla concentrazione di PSA 1 foglio PROGENSA PCA3 Assay 6 501377IT Rev D Reagenti e materiali forniti Liquidi per APTIMA Assay Conservare tra 15 C e 30 C 2 scatole dal momento del ricevimento fino alla data di scadenza indicata Simbolo Componente Quantit WwW Soluzione di lavaggio 1 x 402 ml Soluzione tamponata HEPES contenente lt 2 di dodecilsolfato di sodio DF Tampone per fluido di disattivazione 1 x 402 ml Soluzione tamponata con bicarbonato O Reagente oleoso 1 x 24 6 ml Olio di silicone Nota Tutti i materiali inclusi nel kit PROGENSA PCA3 Assay possono anche essere acquistati separatamente vedere la sezione Materiali per dettagli in merito PROGENSA PCA3 Assay 7 501377IT Rev D Materiali Nota Per i materiali disponibili presso Gen Probe sono indicati i rispettivi numeri di catalogo Materiali richiesti ma disponibili separatamente N di cat PROGENSA PCA3 Urine Specimen Transport Kit 302352 LEADER HC Luminometer 104747 Sistema di cattura del target TCS GEN PR

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