estudios de aislamiento y fraccionamiento de un complejo
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1. Ensayo de inmunodifusi n con los diferentes extractos de Pasteurella multocida cepa 365 Anticuerpo Antisuero Antisuero Antisuero Vacuna comercial E C 47 C E C 66 C Antigeno VECOL 2 5 P V 2 5 P V Extracto 2 5 P V 47 C Extracto 2 5 P V 66 C Extracto 0 4 P V 47C Vacuna comercial para septicemia Fracci n 1 de la columna Fracci n 2 de la columna Fracci n 3 de la columna Fracci n 4 de la columna 5 a Fracci n 5 de la columna formaci n de l neas precipitinas Ausencia de l neas precipitinas REVISTA COLOMBIANA DE QUIMICA BOGOTA COLOMBIA VOLUMEN 21 Nos 1 2 DE 1992 A Extracto concentrado por miscn l 6 Extracta Liofilizado Abs 280 min va Ro En Muestra Gr fica 1 Cromatograf a del E C NaCl al 25 p v a 47 C Ensayos de Inmunodifusi n Los resultados se muestran en la tabla 2 Los antisueros obtenidos con los extractos realizados con NaCl 2 5 P V a 47 C y 66 C presentaron varias l neas de precipitaci n cuando se enfrentaron con sus respectivos extractos y con el extracto realizado a la otra temperatura reacci n cruzada lo cual indic la posible presencia de m s de un compuesto antig nico y al menos uno de ellos fue similar en los dos extractos Cuando se utiliz como ant geno el extracto NaC1 0 4 P V a 47 C frente a los antisueros de 47 C y 66 C se observaron tambi n varias l neas de precipitaci n ocasio2. cultivo 11 centrifugar a 5000 rp 45 4C residuo sobrenadante suspender en NaCl 2 5 P V se descarta est ril 80 mL L cultivo Termostatar a T de extracci n 20 47 y 66 C agitar 1h centrifugar a 5000 rpm 45 4C sobrenadante Dializar 48 h 4 C tres cambios diarios contra soluci n NaCl 0 85 PJV est ril centrifugar a 5000 rpm 45 4C Filtrar membrana 0 22 um est ril prueba de esterilidad en agar sangre y nutriente proteinas 12 EXTRACTO CRUDO y carbohidratos 13 Liotilizaci n o AMICON P M 10 Sephacryl S 200 5 fracciones Determinar prote nas 12 y carbohidratos 13 Esquema 1 Extracci n del complejo glicoprot ico de pasteurella multocida REVISTA COLOMBIANA DE QUIMICA BOGOTA COLOMBIA VOLUMEN 21 Nos 1 2 DE 1992 Obtenci n de Sueros Hiperinmunes Conejos blancos adultos fueron inoculados subcutaneamente con vacuna contra septicemia hemorr gica VECOL o con ant genos preparados con los extractos realizados a47 y 66 C y con NaCl 2 5 P V Los ant genos se adsorbieron en gel de hidr xido de aluminio 10 V V pH 7 2 ajustado con glicina 0 2M pH 10 4 Se realizaron 4 inoculaciones de 1 0 mL del ant geno a los respectivos ratones a intervalos de 2 semanas Dos semanas despu s de la ltima inoculaci n fueron sangrados en blanco como se reporta en Garvey 16 Los t tulos de los sueros fueron obtenidos por aglutinaci n en placa Ensayos de inmunodifusi n Se emple la t
3. A BOGOTA COLOMBIA VOLUMEN 21 Nos 1 2 DE 1992 Baba T Cell mediated inmunoprotection chickents against pasteurella multocida Res Vet s c 1984 36 225 230 Rebers A P Heddleston K L Rhoades K R Isolation from pasturella multocida of lipopolisaccharide antigen with inmunizing and toxic properties J Bac 1967 93 7 14 Cort s G Rojas M Estudios de aislamiento y purificaci n de un complejo glicoprote co de P multocida T sis de Qu mico Farmace tico UniversidadNacional de Colombia Bogot 1990 Baker F S Breach M R Manual de T cnicas Bacteriol gicas 2 Ed Acribia Madrid Espa a 1970 302 305 Bryan Bryan Bacteriolog a Principios y Pr ctica Compa ia Editorial Continental S A Mexico 1982 88 90 Sierra Y Acosta R Estandarizaci n y optimizaci n de un medio de cultivo industrial para fermentaci n acetobut lica por m todos estad sticos Tesis qu mico farmace tico Universidad Nacional de Colombia Bogot 19883 Lowry O H Rosembrough N J Farr L A Rondall R J J Bioch 1961 193 265 270 Bubois M Gilles K A Hamilton J K Rebers A P Smith F Analitycal chem 1956 28 350 356 Kodama A M Matsumoto M Snow L M Am J Vet res 1981 42 1838 1841 Syuto B Matsumoto M Infec Imm 1982 37 1218 1226 Garvey F S Methods in Inmunology 3 Ed W A Benjamin Masachusetts U S A 1977 Oucht
4. E 1992 Fraccionamiento de los extractos crudos El E C NaCl 2 5 P Vjde acuerdo con el esquema I y concentrado a trav s de AMICON PM 10 mostr un perfil de eluci n muy semejante a los obtenidos en estudios anteriores por Syuto et al 15 donde se observaron 5 fracciones claramente definidas como se muestra en la gr fica 1 parte A Estas fracciones fueron caracterizadas por inmunodifusi n y electroforesis Para el E C NaCl 2 5 P V que fue previamente liofilizado el perfil obtenido mostr 3 fracciones de prote nas de las cuales la ltima present mayor absorbancia a 280 nm gr fica 1 parte B este perfil difiri con el extracto que no fue liofilizado sino concentrado por AMICON Los resultados anteriores y la disminuci n del contenido de prote nas en un 50 durante el proceso de liofilizaci nnos indic que posiblemente en este segundo proceso se produjo desnaturalizaci n y o degradaci n de prote nas Con respecto al E C NaCl 0 4 P V 47 C el perfil obtenido mostr gran cantidad de fracciones no definidas con muy poca resoluci n y muy diferentes a los perfiles encontrados en estudios anteriores debido a que conten a muchas de las prote nas citoplasm lticas Sueros Hiperinmunes Los t tulos de todos los sueros obtenidos utilizando los ant genos mencionados en Materiales y M todos presentaron un valor de 1 400 despu s de las 4 inoculaciones Con estos sueros se realizaron los ensayos de inmunodifusi n Tabla 2
5. REVISTA COLOMBIANA DE QUIMICA BOGOTA COLOMBIA VOLUMEN 21 Nos 1 2 DE 1992 ESTUDIOS DE AISLAMIENTO Y FRACCIONAMIENTO DE UN COMPLEJO GLICOPROTEICO DE PASTEURELLA MULTOCIDA Yolanda de Navarro Gerardino Cort s A Milver Rojas y Oscar Robin Departamento de Qu mica Facultad de Ciencias Universidad Nacional de Colombia A A 14490 Santaf de Bogot Keywords P multocida Hemorrhagic Septicemia Shipping fever glycoproteins Inmunodifusi n RESUMEN Mediante la extracci n con soluci n de NaCl 2 5 p v a 47 C se obtuvo un complejo glicoproteico de Pasteurella multocida que fue parcialmente purificado mediante filtraci n por gel usando Sephacryl S 200 Las fracciones 1 2 y 3 presentaron l neas de precipitinas en inmunodifusi n contra sueros hiperinmunes de conejos inoculados con extracto salino 2 5 P V a 47 C y 66 C Por electroforesis SDS PAGE se determinaron bandas de prote nas con pesos moleculares entre 98 800 y 17 700 daltons La fracci n 1 y el extracto salino crudo a 47 C se utilizaron como ant genos adsorbidos en gel de A1 OH y con ellos se efectuaron ensayos de protecci n en ratones teniendo como referencia la vacuna comercial contra Septicemia Hemorr gica producida por VECOL S A Mediante el m todo estad stico de Reed Muench se estableci el indice de protecci n y se encontr que todos los ant genos fueron considerados protectores siendo la fracci n 1 la de mayor ndice de protecci
6. a 6 7 0 44 7 5 3 6 NH No es posible hallarlo con los datos obtenidos DLS0 Dosis letal 50 SOL50 Error t pico LC DLSO0 L mite de confianza IP Indice de protecci n AGRADECIMIENTOS Expresamos nuestros agradecimientos a la Universidad Nacional de Colombia a la Empresa Colombiana de productos veterinarios VECOL S A y al Instituto de Biotecnolog a por la colaboraci n prestada para la realizaci n de este trabajo BIBLIOGRAFIA 1 Collins C Grange Isolation and identification of microorganismos of medical and veterinary importance Academic Press New York U S A 1985 43 51 2 Acha P N Szyfres B Zoonosis y Enfermedades Transmisibles Comunes al Hombre y a los Animales 2 edici n Organizaci n Panamericana de la Salud O M S Washington D C U S A 1986 142 147 3 Pe a N Las Enfermedades de los Animales en Colombia Instituto Colombiano Agropecuario Bogot D E Colombia 1980 4 Dua S K Maheswaran S K Studies on pasteurella multocida VI nature of sistemate inmunity and analysis of the correlation betwen Lavels of inmunity induced by vaious fowl cholera vaccines and protection agains challenge Av Dis 1978 748 764 5 Carter G R Annau E Isolation of capsular polisacharides from colonial variants of pasteurella multocida A M J Vet Res 1953 14 475 478 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 REVISTA COLOMBIANA DE QUIMIC
7. ante inoculaci n en ratas y cultivo de sangre del coraz n de los animales enfermos 23 Se emplearon para el desaf o diluciones desde 10 hasta 10 de la cosecha de P multocida virulentada y 10 ratones para cada diluci n Se utilizaron tambi n 5 ratones control no vacunados para cada diluci n de acuerdo con el reporte t cnico de VECOL 23 Los ratones fueron observados 2 veces por d a durante 12 d as y se determin el n mero de animales muertos por cada vacuna Los animales que permanecieron enfermos a los 12 d as fueron considerados muertos RESULTADOS Y DISCUSION Caracterizaci n de las Bacterias y pruebas de pureza Los cultivos de P multocida se caracterizaron por su forma bacilar un tama o entre 0 3 1 3 fm de di metro y 1 0 2 0 ym de largo tinci n Gram negativa la tinci n con azul de metileno revel claramente la bipolaridad y la tinci n con tinta china permiti observar la presencia de c psulas Estas caracter sticas determinadas coincidieron con las reportadas por Krieg 24 y Baker 9 para P multocida Extracci n del complejo Glicoproteico Se determin la temperatura de 47 C como la de mayor rendimiento en la extracci n de prote nas respecto al peso seco de c lulas presentan do un contenido de 474 7 1g mL de prote nas y 68 5 pg mL de carbohidratos La relaci n carbohidrato prote na fue de 0 14 tabla 1 la cual permaneci constante en las diferentes extracciones ala temperatura respectiva En este ens
8. ayo se observ adem s que el contenido de carbohidratos es mayor al aumentar la temperatura de extracci n posiblemente por hidr lisis de los azucares presentes Esto no ocurri en el caso de prote nas que comenzaron aser desnaturalizadas a una temperatura de 66 C Cuandose utiliz como extractante NaCl 0 4 P V el contenido de prote nas fue de 4 791 g mL que corresponde a 23 1 P P respecto al peso seco de c lulas y de carbohidratos 600 pg mL que corresponde a 2 9 P P respecto al peso seco de c lulas resultados muy superiores a los obtenidos cuando se utiliz como extractante NaCl 2 5 P V La relaci n carbohidrato prote na en la extrac ci n con NaCl 0 4 P V fue de 0 13 En este ensayo la extracci n con soluci n salina hipot nica incrementada por la acci n f sica del proceso de congelaci n y descongelaci n condujo a una lisis bacterial como se reporta en Morilla 18 la cual fue verificada por no presentar crecimiento en medio de cultivo de agar sangrea 37 C durante 48 horas Esta lisis permiti la extracci n de todo el contenido proteico citoplasm tico lo que no ocurri en la extracci n con soluci n salina hipert nica donde posiblemente se extraen prote nas que pueden atravesar los poros de la membrana bacterial en este caso no hubo lisis bacterial puesto que present crecimiento en el cultivo con agar sangre a 37 C por 48 horas REVISTA COLOMBIANA DE QUIMICA BOGOTA COLOMBIA VOLUMEN 21 Nos I 2D
9. ciones de la cromatograf a tienen actividades antig nicas siendo la fracci n 1 la que tiene mayor n mero de esta prote nas reportadas Determinaci n de la relaci n carbohidrato prote na Las fracciones 1 2 y 3 fueron evaluadas en su contenido de prote nas carbohidratos porcentaje P P de prote nas con respecto al extracto crudo y la relaci n carbohidrato prote na Los resultados se presentan en la tabla 3 Las relaciones carbohidrato prote na de las fracciones 1 y 2 fueron de 1 15 y 1 50 respectivamente La relaci n de la fracci n 2 se encuentra muy cercana a la obtenida por Syuto et al 15 con la cepa 1059 que fue de 1 44 Sin embargo en la fracci n 1 se determin una relaci n relativamente cercana pero adem s present el mayor n mero de prote nas antig nicas y por estas razones se seleccion para el ensayo de protecci n En la tabla 4 se presentan los resultados para este ensayo Test de protecci n La virulencia de la cepa 365 se demostr por la gran mortalidad de los controles no vacunados la cual fue del 100 hasta la diluci n 10 y descendi al 60 en la divuci n 10 donde s lo se encontraban 2 unidades formadores de colonias por dosis La mortalidad que presentaron los ratones vacunados con la vacuna comercial de VECOL contra seplicem a hemorr gica el E C NaCl 2 5 P V 47 C y la fracci n 1 de la cromatograf a fue del 65 63 y 61 respectivamente siendo la fracci n 1 la de menor mortalidad con men
10. cnica de Ouchterlony 17 se utiliz buffer veronal barbital sodico 0 05M cido barbit sico 0 01M pH 8 6 Los ant genos ensayados fueron los E C obtenidos con soluci n de NaC12 5 P V 47 C y 66 C el E C obtenido con NaC10 4 P V 47 C con las concentraciones de prote nas y carbohidratos reportadas en la tabla 1 las fracciones resultantes de la filtraci n por gel de E C NaCl 2 5 P V 47 C y la vacuna comercial contra septicemia hemorr gica de VECOL Todos los ant genos ensayados fueron concentrados por AMICON PM10 De cada uno de los ant genos se aplicaron diferentes diluciones La observaci n de las l neas de precipitinas fue realizada 72 horas despu s de aplicadas las muestras en c mara oscura como reporta Morilla 18 Ejectroforesis Se utiliz el sistema discontinuo de Laemmli 19 con las modificaciones de Pharmacia 20 y con urea 2M como denaturante geles de poliacrilamida de concentra ci n T 4 C 2 7 en buffer Tris HCI 0 55 M glicina 0 384 M y SDS 0 1 pH 8 3 y gel de separaci n T 12 6 C 2 7 Se corrieron a 180 voltios 40 mA durante 6 horas Se ti con azul de coomasie R 250 seg n Pharmacia 20 y con plata amoniacal 21 Se colocaron 30 pl de las mismas muestras utilizadas en el ensayo de inmunodifusi n adem s se colocaron muestras de membranas bacteriales preparadas con la t cnica de Osbord 22 los medios de cultivo inoculado por P multocida y sin inocular y patrones de peso molecular P M
11. entre 14 000 y 94 000 daltons Tabla 1 Comparaci n del contenido de proteina y carbohidratos de los E C en NaCl al 2 5 y 04 PY TEMPERATURA PROTEINAS CARBOHIDRATOS RELACION NaCl DE EXTRACCION Conc PIP res Conc PIP res CARBOHIDRATO Hg mL P Seco y g mL P Seco PROTEINA de c lulas de c lulas 66 203 9 1 0 128 7 0 6 0 63 2 5 47 474 7 2 3 68 5 0 3 0 14 20 177 0 0 9 15 5 0 1 0 09 0 4 47 4791 23 1 600 0 2 9 0 13 REVISTA COLOMBIANA DE QUIMICA BOGOTA COLOMBIA VOLUMEN 21 Nos 1 2 DE 1992 Test de protecci n Se realiz un ensayo comparativo inoculando intraperitonealmente 3 grupos de 100 ratones con 1 0 25 mL de vacuna comercial contra septicemia hemorr gica 2 0 25 mL de ant geno elaborado con E C a 47 C con NaCl 2 5 P V 3 0 25 mL de ant geno elaborado con la fracci n 1 obtenida de la cromatograf a La dosis de ant geno aplicada fue la correspondiente al peso seco de c lulas de una dosis de la vacuna VECOL 425 g lo que correspondi a 11 pg de prote na para el E C y 0 94 pg de prote na para la fracci n 1 Los ant genos fueron suspendidos en gel de hidr xido de aluminio al 10 V V pH 7 4 y verificada su esterilidad Los animales fueron vacunados y observados durante 21 d as sin presentar ning n cambio en su comportamiento y estado general lo cual indic la inocuidad de los ant genos Despu s de 23 d as los ratones fueron desafiados con P multocida viva cepa 365 previamente virulentada medi
12. erlony O Handbook of Inmunodifusi n and Inmunoelectroforesis 6 Ed A N N Arbar Science publishers INC 1973 Morilla A B Manual de Inmunolog a 1 Ed Diana S A Mexico 1986 24 62 Laemmli U K Nature 1970 227 680 685 Pharmacia Poliacrylamide Gel Electroforesis Laboratory tecniques laboratory separation divisi n Uppsala Suecia 1984 28 30 Silva M I Relaci n entre actividad de la galactosa 1 uridil transferasa en la membrana del eritrocito y la capacidad de aglutinaci n de este con la favina Tesis de Magister Departamento de Qu mica Universidad Nacional de Colombia Bogot 1989 REVISTA COLOMBIANA DE QUIMICA BOGOTA COLOMBIA VOLUMEN 21 Nos 1 2 DE 1992 22 Osborn M J A l Munson Methods in Enzimology 1984 31A 642 653 23 Equipo T cnico de VECOL S A Manual T cnico de Control de Calidad Pasteurella multocida VECOL SA Bogot Colombia 1988 24 Krieg R Holt G J Bergey S Manual of Sistematic Bacteriology Vol I Williams Wilkins Baltimore U S A 1984 550 557 25 Lugtemberg B Boxtel R V Evemberg D Jong M G Storm P Int Imm 1986 32 175 181 26 Srivastava K K Foster W J Can J Microbiology 1976 23 197 201 27 Rimler R B Rhoades K R Av Dis 1989 88 250 260 28 Astudillo U Wanderley M M todos Estad sticos para Ensayos Biol gicos Orga nizaci n Panamericana de la Salud Centro Panamericano de
13. fiebre aftosa Rio de Janeiro Brasil 1976 1 37 29 Heddleston K L Rebers A P Ritchie A E J Imm 1965 96 124 133
14. for tica permiti determinar que las bandas de prote nas son La fracci n 1 Present 6 bandas de prote nas con P M entre 98 800 y 31 000 daltons la fracci n 2 5 bandas de prote nas con P M entre 74 000 y 34 000 daltons la fracci n 3 present 8 bandas de P M entre 64 000 y 17 700 daltons En las fracciones 4 y 5 no se observaron bandas de prote nas lo cual confirm los resultados obtenidos en inmunodifusi n donde tampoco se present recono REVISTA COLOMBIANA DE QUIMICA BOGOTA COLOMBIA VOLUMEN 21 Nos 2 DE 1992 cimiento ant geno anticuerpo Se encontraron bandas comunes discriminadas as Una banda de 40 000 daltons en las fracciones 1 2 3 en el lisado de membranas y en el medio de cultivo inoculado esta banda fue reportada como antig nica en investigaciones de Luglemberg 25 El medio de eultivo inoculado present bandas comunes con los E C lo gue permiti establecer que la bacteria secreta al medio prote nas antig nicas coincidiendo este resultado con el reportado por Srivastava 26 Incostigaciones al respecto de Syuto 15 Lugtemberg 25 Rimler 27 fueron conside radas antig mcas bandas de prote nas con pesos moleculares de 74 44 40 31 y 25 Kdaltons de las cuales se encontraron en el presente estudio la banda de 40 Kd en las fracciones 1 2 y 3 la banda de 31 Kd en la fracci n 1 Al comparar nuestros resultados electrafor ticos con los reportados podemos considerar que las 3 frac
15. n con una dosis inferior ABSTRACT A glycoprotein complex from P multocida extracted with NaCl 2 5 W V at 47 C The protein was partially purified by gel filtration using Sephacryl S 200 Fractions 1 2 and 3 showed precipitin lines in inmunodifusion against hyperinmune serum from rabbits inoculated with saline 2 5 W V at 47 C and 66 C Several protein bands with molecular weights between 98 800 and 17 700 were obtained using SDS PAGE Fraction 1 and the crude saline extractat47 C were used as antigens adsorbed in a AL OH gel and protection mice assays were performed As a reference the commercial vacune against Hemorrhagic Septicemia produced by VECOL S A The protection index was calculated using the Reed Muench statistical method The results showed that all antigens were protective but the highest protection index was obtained for fraction 1 with the smallest dose 6 REVISTA COLOMBIANA DE QUIMICA BOGOTA COLOMBIA VOLUMEN 21 Nos 2 DE 1992 INTRODUCCION La P multocida tiene un espectro muy amplio de hospederos animales como invasor primario y nico es la causa directa de Septicemia Hemorr gica c lera aviar y ficbre de transporte y como invasor secundario de mastitis y afecciones respiratorias que agravan los cuadros cl nicos 1 Las p rdidas econ micas ocasionadas por esta bacteria son considerables es as como en Estados Unidos se estimaron p rdidas de 25 millones de d lares anuales
16. nada por diferentes compuestos ant genicos de los cuales uno de ellos present reconocimiento de identidad Adem s estos antisueros enfrentados contra las diferentes fracciones mostraron l neas de precipitaci n nicas muy claras y semejantes indicando la presencia de un solo ant geno en las fracciones 1 2 y 3 mientras que las fracciones 4 y 5 no presentaron l neas de precipitaci n con ninguno de los antisueros posiblemente por que en estas ltimas fracciones no est n presentes prote nas antig nicas o se encuentran en muy baja concentra ci n Con respecto al antisuero obtenido con la vacuna comercial contra septicemia hemorr gica cabe destacar en primer lugar que no se observaron l neas de precipitaci n al enfrentarse con los diferentes ant genos dicho resultado posiblemente se debe a una baja concentraci n de anticuerpos en el antisuero t tulo 1 400 y en segundo lugar para estos ensayos se utilizaron como ant genos las bacterias de P multocida inactivadas las cuales por su tama o no pod an migrar a trav s del gel en consecuencia no se observ la uni n ant geno anticuerpo Electroforesis Se observ que el proceso de cromatograf arealizado si fraccion y purific parcialmente los extractos crudos pues en las fracciones se presentaron pocas bandas de prote nas contra aproximadamente 14 que mostr el E C con NaCl 2 5 P V 47 C y 25 bandas que estaban presentes enel E C NaC10 4 P V 47 C Laevaluaci n electro
17. or concentraci n de proteina La medida del grado de protecci n se determin por el indice de protecci n 1 P que se define como log DL50 vacunados Dosis letal menos log DLSO de controles diferencia que Tabla 3 Contenido de Carbohidratos y Proteinas en las Fracciones 1 2 y 3 DETERMINACION PROTEINAS CARBOHIDRATOS RELACION Fracci n Conc PIP respecto Conc P P respecto CARBOHIDRATO HgjmL aproteinas del HgjmL a carbohidratos PROTEINA E Crudo del E Crudo 1 53 8 8 5 62 0 56 6 1 15 2 23 4 1 1 35 2 9 4 1 50 3 48 8 19 25 7 5 8 0 53 z REVISTA COLOMBIANA DE QUIMICA BOGOTA COLOMBIA VOLUMEN 21 Nos 1 2 DE 1992 debe ser mayor a 2 para considerarse ant geno protector 23 Para determinar los valores de log DLS50 se recurr o al tratamiento estad stico de Reed Muench reportado por Astudillo 28 los resultados se muestran en la tabla 5 Con el fin de conocer el verdadero alcance de los ant genos en materia de protecci n en este trabajo no se coloc adyuvante oleoso como se ha realizado en otros estudios 29 y adem s s lo se aplic una dosis de ant geno antes de ser desafiados Los 3 ant genos ensayados La vacuna comercial VECOL el E C NaCl 2 5 P V 47 C y la fracci n 1 presentaron ndice de protecci n de 3 1 3 3 y 3 6 respectivamente los cuales fueron superiores al valor l mite 2 por lo tanto los 3 ant genos se consideran protectores El hecho de que con dosis mucho m s peque a
18. por s lo fiebre de transporte 2 y en Colombia se han reportado p rdidas de 800 millones de pesos anuales por mastitisen bovinos 3 El uso de vacunas con microorganismos vivos e inactivados en diferentes adyuvantes ha presentado enormes inconvenientes al no ofrecer buena inmunidad y causarreacciones anafil cticas que en algunos casos son fatales 4 Estudios preliminares realizados por Carter et al 5 afirman la presencia de compuestos de tipo polisac rido con caracteristicas antig nicas Posteriormente se report la presencia de lipopolisacaridos LPS 6 en los extractos ant genicos pero con un efecto protector d bil que en ocasiones causaban fuertes reacciones t xicas Investigaciones realizadas por Rebers et al 7 con ant genos solubles mostraron la presencia de compuestos glicoprote cos como responsables de actividad protectora y descartaron la presencia de lipopolisac ridos LPS Concientes de la gran importancia de la vacunaci n para prevenir la pasteurelosis en Colombia en este trabajo se determinaron las mejores condiciones de extracci n fraccionamiento y efecto protector del complejo glicoprote co 8 MATERIALES Y METODOS Caracterizaci n de P multocida Se utiliz la cepa 365 cultivada en un medio liquido compuesto de prote na refinada extracto hidrolizado de case na extracto de levadura polipeptonas de carne y sacarosa pH 7 0 7 2 con aireaci n entre 90 150 L min agitaci n entre 90 150 rpm 37 C d
19. s de prote nas la fracci n 1 0 94 Hg por dosis se obtenga un mayor ndice de protecci n 3 6 confirma que en esta fracci n se encuentra m s purificado el ant geno y proporciona la posibilidad de obtener vacunas solubles m s efectivas y que eliminen las reacciones secundarias de las vacunas tradicio nales Tabla 4 Resultados del Ensayo de Protecci n Despu s de 12 D as de Desafiados los Ratones Diluci n cepa Unidades for N ANIMALES MUERTOS N TOTAL DE INOCULADOS de descarga madoras de col Vacuna Antigeno con Ant geno con controles P multocida lonias dosis comercial EC 2 5 viv fracci n de no NaCl 47 C cromatograf a vacunados 10 2 125 X10 10 10 10 10 10 10 5 5 10 2 125 X10 7 10 10 10 10 10 5 5 10 2 125 X107 9 10 9 10 8 10 5 5 10 2 125 X 10 8 10 9 10 2 10 5 5 10 2 125 X10 6 10 7 10 6 10 5 5 10 2 125 X10 7 10 6 10 9 10 5 5 107 2 125 8 10 7 10 5 10 5 5 10 212 5 10 5 10 4 10 5 5 10 21 5 10 0 10 0 10 5 5 1012 2 0 10 0 10 0 10 3 5 GRAN TOTAL 65 100 63 100 61 100 48 50 Los animales enfermos a la fecha fueron considerados muertos REVISTA COLOMBIANA DE QUIMICA BOGOTA COLOMBIA VOLUMEN 21 Nos 1 2 DE 1992 Tabla 5 Resultados del Tratamiento Estad stico Realizado al Test de Protecci n log DLSO SDL50 LCDLSO LP Controles 10 3 NH NH Vacuna comercial 6 2y VECOL S A 7 2 0 52 8 2 3 1 Extracto 2 5 p v 6 2y NaCl 47 C 7 0 0 44 8 2 3 3 Fracci n 1 de 5 9y la column
20. urante 24 0 30 horas Este cultivo fue proporcionado por VECOL S A delos lotes empleados para la producci n de vacuna contra Septicemia Hemorr gica y vacuna triple se realizaron cultivos en agar sangre y agar nutriente a 37 C por 24 Loras para realizar las pruebas de pureza como se indica en Baker 9 y Bryan 10 Extracci n del complejo Glicoproteico De acuerdo con el esquema I se realiz la extracci n del complejo glicoprote co empleando NaCl 2 5 p v y diferentes temperatu ras 20 47 y 66 C Adem s se efect o una segunda extracci n utilizando NaCl 0 4 P V soluci n hipot nica 47 C y lisis bacterial por congelaci n y descongelaci n pero el resto de etapas fueron iguales Los extractos erudos se sometieron a liofilizaci n o a filtraci n a trav s de AMICON membrana P M 10 fraccionamiento de los extractos crudos E C Se fraccionaron en una columna de Sephacryl S 200 70 X 2 6 cm equilibrada con NaCl 1 P V Se eluy con Buffer de fosfato 0 01 M pH 6 8 empleando velocidad de flujo de 5 mL h Se colectaron fracciones de 2 5 mLad4 C Serealizaron los perfiles de eluci n determinando absorbancia a 280 nm La metodolog a empleada para la extracci n y fraccionamiento del complejo glicoproteico se bas en los reportes de Kodamaet al 14 y Syuto et al 15 con algunas modificaciones ss REVISTA COLOMBIANA DE QUIMICA BOGOTA COLOMBIA VOLUMEN 21 Nos 1 2 DE 1992 Cultivo Bacterial 1 65 g c lulas L de
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