Caracterização molecular da diversidade genética de
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1. P expansa um recurso alimentar dispon vel e de grande import ncia para as popula es humanas em toda a sua rea de ocorr ncia SALERA JR et al 280 Rev Colombiana cienc Anim 4 2 279 290 2012 ORIGINAL 2006 O interesse pela esp cie v o desde o consumo direto de suas carnes ovos leo ou manteiga da gordura dos ovos produ o de medicamentos e cosm ticos e at a utiliza o dos cascos para utens lios dom sticos artesanatos e tamb m como brinquedo de crian a al m da import ncia simb lica para muitas comunidades PRITCHARD e TREBBAU 1984 ESCALONA e FA 1998 PEZZUTTI 2003 SALERA JR et al 2006 Em virtude da intensa preda o que a esp cie vem sofrendo desde os tempos coloniais o Governo Brasileiro estabeleceu em 1979 um Projeto de Prote o e Manejo dos Quel nios da Amaz nia coordenado pelo Instituto Brasileiro de Desenvolvimento Florestal IBDF IBAMA 1989 A partir de 2007 o projeto passou a ser coordenado pelo IBAMA abrangendo o Programa Nacional de Conserva o dos Quel nios Continentais envolvendo manejo conservacionista e pesquisas priorizando as Unidades de Conserva o e o RAN foi para o Instituto Chico Mendes para Conserva o da Biodiversidade RAN ICMBio Em 1998 a Funda o Universidade Federal do Tocantins UFT contando com o apoio do RAN IBAMA iniciou trabalhos com a esp cie P expansa na Ilha do Bananal entorno do Parque Nacional do Araguaia PNA MALVASIO e SALERA2. J NIOR 2004 As pesquisas realizadas nessa localidade demonstraram que a interdisciplinaridade fundamental para promover o melhor conhecimento de v rios aspectos da biologia de P expansa o que auxilia na elabora o de uma pol tica adequada para a conserva o e manejo da esp cie O conhecimento da estrutura gen tica das popula es de P expansa do PNA uma necessidade inerente visto que o entendimento dos n veis de diferencia o populacional pode ajudar com informa es gen ticas que poder o ser utilizadas na escolha de medidas mais acuradas de manejo e conserva o para a esp cie na localidade Com o advento da Rea o em Cadeia da Polimerase PCR diversos marcadores moleculares tornaram se dispon veis para a caracteriza o da estrutura gen tica de v rios t xons FERREIRA e GRATAPAGLIA 1998 O grande avan o na rea de marcadores moleculares baseados em PCR ocorreu em 1990 com a id ia da utiliza o de primers mais curtos dez pares de base e de sequ ncia arbitr ria eliminando assim a necessidade do conhecimento pr vio da regi o a ser amplificada WILLIAMS et al 1990 A t cnica foi descrita independentemente por dois grupos WELSHE e MCCLELLAND 1990 WILLIAMS et al 1990 WILLIAMS et al 1990 patentearam a metodologia com o nome mais comumente utilizado Random Amplified Polymorfic RAPD Essa t cnica possui grande potencial para detectar polimorfismo gen tico de esp cies desconhecidas genetic
3. C por 1 min 72 C a 2 min e uma extens o final de 72 C por 5 min e incuba o a 4 C por 10 min As rea es de ISSR foram submetidas a um ciclo inicial de 94 C por 2 min seguidos de 40 ciclos de 92 C por 1 min 35 C por 1 mine 72 C por 2 min e uma extens o final de 72 C por 5 min e incuba o a 4 C por 10 min 284 Rev Colombiana cienc Anim 4 2 279 290 2012 ORIGINAL Os produtos resultantes das amplifica es foram submetidos eletroforese em gel de agarose 2 para RAPD e 1 5 para ISSR Os g is foram corados com brometo de et deo 0 5 ug mL visualizados em transiluminador de luz ultravioleta e fotografadas com c mera digital para posterior interpreta o das bandas amplificadas An lises das bandas amplificadas As bandas resultantes das rea es de RAPD e ISSR foram avaliadas quanto a sua aus ncia ou presen a 0 ou 1 no gel de agarose 2 e 1 5 respectivamente Em seguida foram constru das matrizes bin rias para os dados gerados Resultados Extra o do DNA O rendimento do DNA extra do com os tr s protocolos l Il e III variou de 90 a 400 ng Tabela 2 O protocolo I foi o que apresentou o melhor rendimento 320 e 400 ng mL e por esse motivo foi o protocolo escolhido para a extra o das demais amostras de tecido de P expansa Fig 1 A raz o Aseo Asgo Obtidas variaram de 1 8 a 2 3 estando dentro da faixa recomendada Tabela 2 Figura 1 Perfil eletrofor tico do DNA d
4. RENOVAVEIS IBAMA 1989 Projetos Quel nios da Amaz nia Manual T cnico BAMA Bras lia Brasil LACERDA D R ACEDO M D P LEMOS FILHO J P LOVATO M B 2002 A t cnica de RAPD uma ferramenta molecular em estudos de conserva o de plantas Lundiana 3 2 87 92 LUZ V L F 2005 Cria o comercial de tartaruga e tracaj manual t cnico SEBRAE Cuiab Brasil MALVASIO A SALERA JUNIOR G 2004 Entrevista com a equipe do Projeto Quel nios da Ilha do Bananal Terras ind genas e Unidades de Conserva o da Natureza Brasil PECCININI SEALE D 2002 T cnicas citogen ticas enzim ticas e moleculares Em T cnicas de coleta e prepara o de vertebrados S o Paulo Aruj Instituto Pau Brasil de Hist ria Natural Brasil PEZZUTI J C B 2003 Ecologia e Etnoecologia de Quel nios no Parque Nacional do Ja Amazonas Brasil Tese Universidade Estadual de Campinas S o Paulo Brasil PRITCHARD P C H TREBBAU P 1984 The Turtles of Venezuela S 1p Society for the Study of Amphibians and Reptiles USA PORTELINHA T C G 2007 Estudo das popula es de Podocnemis expansa e Podocnemis unifilis no Rio Java s Tocantins Monografia Bacharel em Engenharia Ambiental Universidade Federal do Tocantins Brasil REDDY M P SARLA N SIDDIQ E A 2002 Inter simple sequence repeat ISSR polymorphism and its application inplant breeding Euphytica 128 9 17 SAMBROOK J FRITSCHI E F MANIATIS T 1989 Molecul
5. Rev Colombiana cienc Anim 4 2 279 290 2012 ORIGINAL PADRONIZA O DE PROTOCOLO DE EXTRA O DE DNA GEN MICO DE Podocnemis expansa E TESTES COM OS MARCADORES RAPD E ISSR ESTANDARIZACI N DE PROTOCOL DE EXTRACCI N DE ADN GENOMICO DE Podocnemis expansa E TESTES CON LOS MARCADORES RAPD E ISSR STANDARDIZATION OF PROTOCOL FOR DNA EXTRACTION OF Podocnemis expansa AND TESTS WITH RAPD AND ISSR MARKERS OLIVEIRA DEYLA PAULA Mestre DIAS OLIVEIRA JAQUELINE DAS DORES Doutora MALVASIO ADRIANA Doutora OLIVEIRA JUNIOR WALDESSE PIRAGE Doutor 1 Funda o Universidade Federal do Tocantins Avenida NS 15 ALCNO 14 Campus Universit rio de Palmas Tocantins 77 020 210 Correspond ncia deylaoliver Ogmail com waldessejuniorDuft edu br Recibido 20 03 2012 Aceptado 22 08 2012 Resumo Este trabalho teve como objetivo comparar e padronizar um protocolo eficiente para a extra o de DNA de tecido de Podocnemis expansa e testar o poder informativo dos marcadores moleculares RAPD e ISSR para a an lise da estrutura gen tica da esp cie coletadas no entorno do Parque Nacional do Araguaia Tocantins Brasil O m todo de extra o foi padronizado a partir do teste com tr s diferentes protocolos e permitiu a obten o de DNA com boa qualidade e em quantidade adequada para as rea es de RAPD e ISSR A raz o A gt eo A gt zgo das amostras apresentou um valor entre 1 8 a 2 3 indicando que estas apresentaram baixa contamina
6. a 10 000 g por 10 minutos e o sobrenadante descartado O precipitado foi lavado com 500 uL de etanol 70 centrifugado a 10 000 g por 10 minutos o sobrenadante foi descartado e o DNA precipitado foi seco temperatura ambiente Aos tubos contendo DNA adicionou se 30 uL de tamp o TE 10 mM de Tris HCI pH 8 0 1 mM de EDTA acrescido de RNAse 10 mg mL que foram mantidos 37 C por 1 hora e ent o armazenados 20 C Verifica o da extra o do DNA gen mico Os DNAs extra dos foram submetidos eletroforese em gel de agarose 1 corado com brometo de et deo 0 5 ug mL e visualizados em transiluminador de luz ultravioleta para verificar a integridade e qualidade dos DNAs Os DNA foram quantificados por absorb ncia ABS a 260nm em espectrofot metro Amersham Biosciencs Ultrospec 1100 pro Em seguida suas concentra es foram calculadas pela f rmula DNA 50 ug mL x D x A260 283 Rev Colombiana cienc Anim 4 2 279 290 2012 ORIGINAL Onde DNA a concentra o do DNA ng mL D o fator de dilui o usado para fazer a leitura espectrofotom trica e A260 a leitura obtida no comprimento de onda de 260 nm ROMANO e BRASILEIRO 2000 A rela o de absorb ncia A260 A280 foi determinada para verificar a qualidade do DNA e poss vel contamina o com prote nas Rea es de PCR com os marcadores RAPD e ISSR Foram utilizados 4 primers RAPD e 3 primers ISSR Tabela 1 para verificar a possibilidade d
7. a amplifica o via Rea o em Cadeia da Polimerase PCR INNIS et al 1990 com os DNAs extra dos pelo protocolo padronizado Os primers aqui descritos foram selecionados a partir de testes realizados anteriormente dados n o mostrados no qual se testaram 33 primers RAPD Operon Technologies Inc Alameda CA EUA e 34 primers ISSR Tabela 1 Rela o dos primers RAPD e ISSR selecionados para a amplifica o e suas respectivas sequ ncias nucleot dicas Marcador Primer Sequ ncia 5 3 RAPD OPM 20 AGG TCT TGG G RAPD OPM 10 TCT GGC GCA C RAPD OPT 16 GGT GAA CGC T RAPD OPT 20 GAC CAA TGC T ISSR SPAR 01 ACT GAC TGA CTG ACT G ISSR GACA 4 GACA GACA GACA GACA ISSR AACC 4 AACC AACC AACC AACC As rea es de amplifica o das 30 amostras de DNA de P expansa foram realizadas em um termociclador PxE 0 2 Thermo Electron Corporation Inc As rea es continham 1X de tamp o da Taq DNA polimerase Tris HCI 100 mM pH 8 5 KCI 500 mM LGC do Brasil Rio de Janeiro Brasil 2 5 mM de MgCl gt LGC do Brasil Rio de Janeiro Brasil 0 25 mM de dNTPs LGC do Brasil Rio de Janeiro Brasil 0 2 uM de primers 1 5 U de enzima Tag DNA polimerase UFAM AM DNA 50 a 100 ng e gua ultrapura O ciclo de amplifica o de RAPD foi composto por uma etapa de desnatura o inicial de 40 s a 94 C seguido de 3 ciclos de 94 C por 40 s 35 C por 1 min e 72 C por 2 min e por 37 ciclos de 94 C por 40 s 37 C por 1 min 37
8. amente permitindo a obten o de resultados de forma r pida LACERDA et al 2002 Al m disso apresenta baixo custo tornando se uma ferramenta acess vel a muitos laborat rios LACERDA et al 2002 281 Rev Colombiana cienc Anim 4 2 279 290 2012 ORIGINAL Mais recentemente vem sendo utilizado a t cnica denominada Inter Simple Sequence Repeats ISSR ZIETKIEWICZ et al 1994 GUPTA et al 1994 Nesta t cnica os SSRs s o utilizados como primers para amplificar principalmente regi es entre SSRs ZIETKIEWICZ et al 1994 REDDY et al 2002 podendo ser ou n o ancorados nas posi es terminais 3 ou 5 de um a quatro bases degeneradas dentro das sequ ncias flanqueadoras GUPTA et al 1994 As repeti es de microssat lite utilizado como primers podem ser di nucleot deos tri nucleot deos tetra nucleot deos ou penta nucleot deos ZIETKIEWICZ et al 1994 O ISSR um m todo simples r pido reprodut vel e que supera muito das limita es t cnicas descritas para alguns marcadores como o pr prio RAPD TSMURA et al 1996 No entanto um DNA puro e de boa qualidade pr requisito para qualquer an lise molecular ARAS et al 2003 Por m os protocolos convencionais de extra o de DNA n o s o necessariamente reprodut veis para todas as esp cies sendo necess rio realizar algumas adapta es e padroniza es ARAS et al 2003 Al m disso o protocolo ideal deve ser aquele que possibilite rapi
9. ar cloning a laboratory manual New York Cold Spring Harbor Laboratory Press USA 289 Rev Colombiana cienc Anim 4 2 279 290 2012 ORIGINAL SALERA JUNIOR G MALVASIO A PORTELINHA T C G 2009 Avalia o de padr o irregular dos escudos do casco em Podocnemis expansa e Podocnemis unifilis Testudines Podocnemididae Acta Amazonica 39 2 429 436 SALERA JUNIOR G MALVASIO A GIRALDIN O 2006 Rela es cordiais Ci ncia Hoje 39 226 61 63 TSUMURA Y OHBA K STRAUSS S H 1996 Diversity and inheritance of inter simple sequence repeat polymorphisms in Douglasfir Pseudotsuga menziesii and sugi Cryptomeria japonica Theor Appl Genet 92 40 45 ROMANO E BRASILEIRO A C M 1999 Extra o de DNA de plantas Biotecnologia 2 9 40 43 WEEDEN N F TIMMERMAN G M HEMMAT M KNEEN B E LODHI M A 1992 Inheritance and reliability of RAPD markers P gs 12 17 Em Applications of RAPD technology to plant breeding Joint Plant Breeding Symposia Series Minneapolis USA WELSH J MCCLELLAND M 1990 Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers Nucleic Acids Res 18 7213 7218 WILLIAMS J G KUBELIK A R LIVAK K J RAFALSKI J A TINGEY S V 1990 DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers Nucleic Acids Res 18 6531 6535 ZIETKIEWICZ E RAFALSKI A LABUDA D 1994 Genome fingerprinting by simple sequence repeat SSR Archored polymera
10. dez efici ncia baixo custo e que preferencialmente n o necessite a utiliza o de produtos t xicos como fenol O presente estudo prop s 1 comparar e padronizar um protocolo para a extra o de DNA a partir de fragmentos de tecido de P expansa 2 testar e comparar a capacidade informacional dos marcadores RAPD e ISSR para a an lise da diversidade gen tica em uma popula o natural de P expansa do entorno do Parque Nacional do Araguaia Tocantins Brasil Material e m todos rea de estudo e coleta dos tecidos Foram capturados 30 indiv duos de P expansa de acordo com PORTELINHA 2007 IBAMA 1989 e PEZZUTI 2003 provenientes do rio Java s entorno do Parque Nacional do Araguaia Ilha do Bananal TO durante o ano de 2006 A rea situa se entre os paralelos 9 50 S e 11 10 S e os meridianos 49 56 W e 50 30 W e apresenta um regime clim tico tropical mido de transi o Aw com duas esta es bem definidas o ver o novembro a abril meses em que predominam as chuvas e o inverno maio a outubro onde marca se o per odo da seca O total pluviom trico anual fica em torno de 1 750 mm e a temperatura m dia anual gira em torno de 24 C SALERA JUNIOR et al 2009 Dos animais capturados foram retirados pequenos fragmentos de tecido das patas posteriores Cada tecido coletado foi acondicionado em microtubos 282 Rev Colombiana cienc Anim 4 2 279 290 2012 ORIGINAL contendo lcool 95 para poste
11. e 9 indiv duos extra dos com o uso do protocolo l 285 Rev Colombiana cienc Anim 4 2 279 290 2012 ORIGINAL Tabela 2 Protocolos testados concentra o do DNA ng mL e pureza do DNA expresso pela raz o A sonm Azsonm extra do de dois tecidos de P expansa com os tr s protocolos de extra o de DNA Amostras Protocolos Concentra o ng mL Raz o Asconm Azsonm 1 2 Il k k III kkk 320 ng mL 400 ng mL 250 ng mL 90 ng mL 290 ng mL 290 ng mL 1 8 1 8 1 9 2 3 1 9 2 1 Tamp o TLN PECCININI SEALE 2002 SAMBROOK et al 1989 Amplifica o por RAPD e ISSR As amplifica es com os 4 primers RAPD selecionados OPM 20 OPM 10 OPT 16 OPT 20 geraram um total de 21 bandas 10 das quais foram polim rficas 48 O n mero m dio de segmentos amplificados por primer foi de 5 3 Fig 2 J nas an lises realizadas com os 3 primers ISSR SPAR 01 GACA AACC foram obtidos 16 bandas 10 das quais foram polim rficas 62 com m dia de 5 3 por primer Fig 3 Figura 2 Perfil eletrofor tico em gel de agarose 1 5 demonstrando o padr o de amplifica o de 13 animais utilizando o primer RAPD OPM10 A 1 amostra da esquerda representa o padr o de massa molecular de 100pb 286 Rev Colombiana cienc Anim 4 2 279 290 2012 ORIGINAL Figura 3 Perfil eletrofor tico em gel de agarose 1 5 demonstrando o padr o de amplifica o de 15 animais utilizando o p
12. m grande efeito na gera o e resolu o do produto amplificado A t cnica de extra o de DNA testada nesse trabalho protocolo forneceu material com qualidade e quantidade suficientes para gerar produtos amplificados de RAPD e ISSR certificando o m todo 287 Rev Colombiana cienc Anim 4 2 279 290 2012 ORIGINAL A partir dos produtos amplificados p de se tamb m constatar que os marcadores RAPD e ISSR apresentaram amplicons polim rficos o que uma capacidade informativa promissora para a gera o de dados da estrutura gen tica de P expansa Vale notar que nos testes realizados o marcador ISSR mostrou se mais polim rfico que o marcador RAPD talvez indicando uma maior aplicabilidade nos estudos de diverg ncia gen tica O uso desses marcadores resulta em diversas vantagens pr ticas como simplicidade rapidez baixo custo e n o requer instala es sofisticadas para a sua execu o Por isso esses marcadores poder o ser utilizados em an lises gen ticas iniciais de esp cies n o caracterizadas geneticamente como a popula o de P expansa do entorno do Parque Nacional do Araguaia Ilha do Bananal Tocantins Agradecimentos Permiss o para a coleta das amostras de tecidos de P expansa foi concedida pelo RAN IBAMA O Grupo Quel nios da Ilha do Bananal apoiou com a log stica em campo Este estudo fez parte da monografia de gradua o de D P O em Ci ncias Biol gicas Funda o Universidade Federal do Toca
13. ntins D P O obteve a bolsa de Inicia o Cient fica do Conselho Nacional de Desenvolvimento Cient fico e Tecnol gico CNPq e AM bolsa de produtividade do CNPq processo n 503650 2009 9 Refer ncias ARAS S DURAN A YENILMEZ G 2008 Isolation of DNA for RAPD analysis from dry leaf material of some Hesperis L specimens Plant Molecular Biology Reporter 21 461a 461 ESCALONA T F J E 1998 Survival of nests of the terecay turtle Podocnemis unifilis in the Nichare Tawadu Rivers Venezuela Journal of Zoology 244 303 312 FERREIRA M E GRATTAPAGLIA D 1998 Introdu o ao uso de marcadores moleculares em an lise gen tica 3 ed Bras lia Embrapa Recursos Gen ticos e Biotecnologia Brasil GALV O S B 2007 Aspectos da biologia cria es comerciais e do consumo de quel nios no estado do Tocantins alternativas de manejo e sustentabilidade 2007 Monografia Bacharel em Engenharia Ambiental Universidade Federal do Tocantins Brasil 288 Rev Colombiana cienc Anim 4 2 279 290 2012 ORIGINAL GUPTA M CHYI Y S ROMERO SEVERSON J OWEN J L 1994 Amplification of DNA markers from evolutionarily diverse genomes using single primer of simple sequence repeats Theor Appl Genet 89 998 1006 INNIS M A GELFAND D H SNINSKY J J WHITE T J 1990 PCR protocols a guide to methods and applications Academic Press San Diego USA INSTITUTO BRASILEIRO DO MEIO AMBIENTE E DOS RECURSOS NATURAIS
14. o por prote nas e que os DNAs poderiam ser utilizados para testar o poder informativo dos marcadores RAPD e ISSR Os dois marcadores demonstraram ser uma ferramenta eficiente para estudos gen ticos de P expansa Palavras chave extra o de DNA Podocnemis expansa marcadores moleculares Resumen Este trabajo tuvo como objetivo comparar y estandarizar un protocolo eficiente para la extracci n de ADN de fragmentos de tejido de Podocnemis expansa y evaluar el poder informativo de los marcadores moleculares RAPD e ISSR para el an lisis de la estructura gen tica de la especie colectada en el entorno del 219 Rev Colombiana cienc Anim 4 2 279 290 2012 ORIGINAL Parque Nacional do Araguaia Tocantins Brasil El m todo de extracci n fue estandarizado a partir de la evaluaci n de tres diferentes protocolos permitiendo la obtenci n de ADN de buena calidad y en cantidad adecuada para las reacciones de RAPD e ISSR La raz n Aceo A gt zgo de las muestras present un valor entre 1 8 a 2 3 indicando que estas presentan baja contaminaci n por prote nas y que los ADNs podr an ser utilizados para evaluar el poder informativo de los marcadores RAPD e ISSR Los dos marcadores demostraron ser una herramienta eficiente para estudios gen ticos de P expansa Palabras clave extracci n de ADN Podocnemis expansa marcadores moleculares Abstract This study aims to compare and standardize an effective protocol for DNA extraction from
15. rimer ISSR AACC 4 A 1 amostra da esquerda representa o padr o de massa molecular de 100pb Discuss o Por meio dos tr s protocolos de extra o de DNA foram obtidos uma quantidade de DNA suficiente para a realiza o das rea es de PCR utilizando marcadores dominantes como o RAPD e ISSR que segundo FERREIRA E GRATAPAGLIA 1998 fica na faixa de 5 a 10 ng uL por rea o Por m considerando fatores como rendimento de DNA custo rapidez praticidade quantidade de DNA e sustentabilidade o protocolo de extra o de DNA mais qualificado para tecido de P expansa foi o protocolo Justamente por n o utilizar fenol como os demais e por apresentar precipita o salina combinada com etanol este mostrou se menos laborioso mais barato e ecologicamente mais adequado por gerar menos res duos t xicos As raz es de Azeco A gt zgo obtidas com o protocolo indicaram baixa concentra o de prote nas estando no intervalo entre 1 8 a 2 0 definido como satisfat rio por SAMBROOK et al 1998 Sabe se que a obten o de DNAs com altas quantidades de prote nas tornam a amostra impura e n o adequada para a realiza o da rea o de PCR produzindo amplicons com intensidades fracas no gel o que n o foi observado no presente estudo O efeito da qualidade e quantidade do DNA na gera o e reprodutibilidade de produtos amplificados de RAPD foram testados por WEEDEN et al 1992 Os autores observaram que a qualidade do DNA tem u
16. rior extra o dos DNAs e teste dos marcadores em laborat rio Extra o do DNA gen mico Foram comparados 3 protocolos para a extra o do DNA de tecidos de P expansa O protocolo em teste I utilizou o tamp o de lise nuclear TLN em sua metodologia e os outros dois Il e Ill s o protocolos tradicionais descritos por PECCININI SEALE 2002 e SAMBROOK et al 1989 respectivamente Nesta etapa foram utilizadas apenas duas amostras de tecido de P expansa por m procurou se padronizar a quantidade de tecido que seria utilizado para as extra es aproximadamente 200 mg de tecido Ap s essa etapa foi escolhido para a extra o das demais amostras de tecido da esp cie n 30 o protocolo que permitiu a obten o de uma maior quantidade de DNA O protocolo consiste da digest o do tecido com 800 uL de tamp o de lise nuclear TLN NaCl 400mM EDTA 25mM Tris HCI 50mM pH8 0 50 uL de SDS Dodecil Sulfato de S dio 10 e 20 uL de proteinase K 10 mg mL que foram mantidos a 55 C por aproximadamente 12 horas Ap s essa etapa foram adicionados 300 uL de NaCl 7 M saturado ao material que foi homogeneizado e deixado por 15 minutos em gelo A separa o das fases foi feita ap s centrifuga o a 10 000 g por 10 minutos Em seguida aproximadamente 600 uL do sobrenadante foram transferidos para um novo tubo est ril e precipitados com 1000 uL de etanol absoluto A solu o foi estocada em freezer por no m nimo 3 horas centrifugado
17. se chain reaction amplification Genomics 20 176 183 290
18. tissue of Podocnemis expansa and test the informative power of RAPD and ISSR markers to analyze the genetic structure of species collected in the vicinity the National Park Araguaia Tocantins Brazil The extraction method was standardized by the test with three different protocols and allowed the acquisition of DNA with good quality and in adequate quantities for there actions of RAPD and ISSR The A260 AA280 ratio of the samples showed a value between 1 8 to 2 3 indicating that they had low contamination by proteins and the DNA could be used to test the in formative power of the RAPD and ISSR markers The two markers proved to be an efficient tool for genetic studies of P expansa Keywords DNA extraction Podocnemis expansa molecular markers Introdu o Podocnemis expansa Schweigger 1812 uma das esp cies mais conhecidas de quel nios de gua doce do Brasil sendo considerada a maior tartaruga da Am rica do Sul LUZ 2005 Sua distribui o est associada ao sistema hidrogr fico da bacia Amaz nica e do Orinoco ocorrendo em rios da Col mbia Venezuela Guiana Equador Peru Bol via e Norte do Brasil chegando a atingir a regi o central do territ rio brasileiro Goi s e Mato Grosso LUZ 2005 No Estado do Tocantins um dos pontos de ocorr ncia da esp cie situa se em uma regi o com relevante import ncia ecol gica onde ocorre uma transi o de biomas conhecido como regi o ecotonal a Ilha do Bananal GALV O 2007
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