Epi proColon Colon 2.0 CE
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1. Nota Cada muestra de ADN con conversi n bisulfito bisDNA muestra del paciente control Epi proColon Positive o control Epi proColon Negative la prueba se realizar por triplicado Nota Antes del uso centrifugar Epi proColon Polymerase durante 10 20 segundos a 1000 150 fcr usando una centr fuga de mesa para eliminar las gotas de la tapa 9 3 1 Preparaci n de la PCR Master Mix Descongelar 1 o 2 tubos de Epi proColon PCR Mix dependiendo del n mero de an lisis de muestras de pacientes y controles que se deseen realizar v ase Tabla 5 Agitar con el v rtex el los tubo s de Epi proColon PCR Mix durante 5 10 segundos centrifugar el los tubo s brevemente P gina 13 de 29 e Transferir el volumen correspondiente de Epi proColon PCR Mix y Epi proColon Polymerase como figura en la Tabla 5 a un microtubo de 2 0 ml e Mezclar con el v rtex el PCR Master Mix durante 5 10 segundos e Centrifugar brevemente el PCR Master Mix para eliminar las gotas de la tapa Nota Usar el PCR Master Mix inmediatamente no almacenar Volver a congelar el Epi proColon PCR Mix y el Epi proColon Polymerase sobrante inmediatamente despu s de su uso Nota Para cada PCR se requieren 16 ul de Epi proColon PCR Mix y 0 8 ul de Epi proColon Polymerase Vol menes indicados ya incluyen m rgenes de pipeta No es requerido de preparar reacci n adicional para la preparaci n del Master Mix Tabla 5 Preparaci n de PCR Master Mix incluyiendo m rgenes2. es decir generando un sample sub set como se describe en el manual de usuario del instrumento de LightCyclerf 480 e Hacer clic en Analysis en el LightCycler 480 Basic Software para abrir la ventana Analysis Overview e Seleccionar Abs Quant Fit Points para todas las muestras e Activar la Epi proColon Color Compensation e Activar la combinaci n de filtros Filter Comb 483 533 e Configurar el primer ciclo First Cycle en 1 y el ltimo Last Cycle en 50 e Configurar el fondo en 5 22 hacer clic en el bot n azul background ajustando Min Offset en 4 y Max Offset en 21 en la ventana Cycle Range e En la ventana Noise Band configurar la compensaci n del fondo en Noise Band Fluoresc y ajustar el valor l mite en 1 6 e En la ventana Analysis configurar el valor l mite Threshold Manual en 1 6 e En la ventana Analysis ajustar el n mero de los Fit Points en 2 e Hacer clic en Calculate El Septin9 Crossing Point CP se calcula autom ticamente para cada muestra y se visualiza en la tabla de resultados e Exportar los valores CP haciendo clic en la tabla de resultados con el bot n derecho del rat n Seleccionar Export Guardar el archivo bajo un nombre apropiado P gina 20 de 29 e Activar la combinaci n de filtros Filter Comb 523 568 e Config
3. 10 ml 25 ml Pipetas de transferencia desechables en embalaje a granel no est ril de 15 cm de longitud di metro del cuello 5 mm capacidad aprox 5 ml Pipetas de transferencia desechables en embalaje a granel no est ril de 22 5 cm de longitud di metro del cuello 5 mm capacidad aprox 5 ml Placas de 96 pocillos para almacenamiento de ADN Equipamiento recomendado n ref 211 0200 de VWR International o equivalente n ref 445 2102 de VWR International n ref Y549 1 deCarl Roth GmbH Co KG o equivalente n ref 444 1372 de VWR International o equivalente ThermoMixerO C de Eppendorf n ref 5382 000 015 o con termobloque en seco 2 ml de Eppendorf n ref 5362 000 035 o equivalente Eppendorf Reference n ref 4910 000 042 y 4910 000 069 de Eppendorf o equivalente Multipette M4 de Eppendorf n ref 4982 000 012 o HandyStepO electronic de Brand n ref 705000 705001 o equivalente centr fuga 5418 de Eppendorf n ref 5418 000 017 con rotor F 45 30 11 de Eppendorf n ref 5490 015 002 o equivalente Eppendorf Research plus 8 Channel 10 100 ul de Eppendorf n ref 3122 000 035 o equivalente centr fuga 5804 R de Eppendorf n ref 5804 000 013 con rotor A 2 DWP Eppendorf n ref 5804 740 009 o equivalente Carl Roth n ref C177 2 o equivalente o Fisher Scientific n ref 11889181 o equivalente Reactivos y otros consumibles de laboratorio Reactivos y otros consumibles recomendados M
4. Ct lt 45 Ct lt 32 1 Ct no disponible Septin9 Negativo Undetermined Ct lt 32 1 Ct gt 32 1 l li Cualqui Itad nvalid ualquier resultado O Undetermined Cycle threshold umbral del ciclo 11 An lisis con el Instrumento I de Roche LightCycler 480 11 1 Preparaci n de la placa Instrumento I LightCycler 480 e Preparar la placa PCR Se recomienda la disposici n de placas que figura en la Tabla 6 e Transferir 15 ul de PCR Master Mix en los pocillos seleccionados de la placa de reacci n LightCycler 480 Multiwell Plate 96 e Centrifugar brevemente la placa de almacenamiento de bisDNA creada en el Apartado 9 2 13 durante 1 minuto a 1000 100 fcr usando la centr fuga para placas e A adir 15 ul de soluci n de bisDNA en los pocillos correspondientes de la placa PCR e Sellar la placa PCR con film de sellado LightCycler 480 e Centrifugar brevemente la placa PCR con una centr fuga para placas durante 1 minuto a 1000 100 fcr Nota La placa PCR cargada puede ser almacenada a 2 8 C durante un m ximo de 4 horas 11 2 Carga de la placa Instrumento I LightCycler 480 Nota Se recomienda guardar las configuraciones de ciclo y de an lisis en un archivo de plantilla ixo e Iniciar el software versi n 1 5 x e Crear un nuevo experimento hacer clic en New Experiment P gina 19 de 29 e Cargar el archivo de plantilla del experimento especificado o definir el siguiente experim
5. tapa y mezclar bien invirtiendo el frasco cinco veces Etiquetar el frasco poniendo la fecha de diluci n y marcar la casilla Ethanol added Almacenar el tamp n Epi proColon Wash B Buffer reconstituido a una temperatura entre 15 y 30 C durante un m ximo de 6 semanas Extracci n del ADN y conversi n bisulfito del plasma de los pacientes Epi proColon 2 0 CE contiene reactivos suficientes para procesar un m ximo de 32 muestras incluyendo los controles Incluir un control Epi proColon positivo y un control Epi proColon negativo en cada ensayo independiente Al haber 4 tubos monouso de Epi proColon Bisulfite Solution se recomienda realizar 4 ensayos independientes p ej 4 ensayos de 8 muestras cada uno Nota Una breve centrifugaci n de los microtubos se alada en el texto como Centrifugar brevemente el tubo es requerida en varios pasos de estas instrucciones con el fin de retirar las gotas de la tapa o de recoger el l quido residual Se recomienda centrifugar durante 10 20 segundos a 1 000 150 fcr usando P gina 9 de 29 una centr fuga de mesa Evitar centrifugar a mayor velocidad para prevenir la formaci n de grumos de part culas magn ticas en algunos pasos Nota La agitaci n con v rtex de los tubos y de los recipientes es requerida en algunos pasos de estas instrucciones para asegurar una mezcla homog nea de los l quidos Se recomienda el uso de un v rtex a velocidad media durante 5 10 segundos 9 2 1 Descong
6. y precauciones 7 1 Medidas de precauci n en el laboratorio Es imprescindible atenerse a las buenas pr cticas de laboratorio para minimizar el riesgo de contaminaci n entre las muestras durante o despu s de la extracci n del ADN la conversi n con bisulfito y la purificaci n Durante el proceso de extracci n evitar la contaminaci n de las muestras con nucleasas Se recomienda el uso de pipetas y puntas de pipetas monouso para prevenir la contaminaci n cruzada en las muestras de los pacientes El procedimiento est concebido para su uso en laboratorios profesionales y asume familiaridad con m todos de extracci n del ADN y ensayos PCR en tiempo real Para prevenir la contaminaci n por amplicones generados por PCR previas recomendamos la estricta separaci n de las actividades pre PCR p ej extracci n de ADN plasm tico o preparaci n de la PCR y las actividades post PCR p ej PCR en tiempo real Recomendamos adem s desechar las placas PCR usadas de modo que no liberen productos PCR Por ejemplo colocar las placas PCR usadas dentro de una bolsita de pl stico sellable inmediatamente despu s de sacarlas del instrumento PCR cerrar dicha bolsita y desecharlas en un contenedor de basura adecuado No almacenar nunca una placa PCR usada despu s de ser sacada del instrumento PCR No abrir nunca una placa PCR usada 7 2 Medidas de precauci n contra infecciones El producto no contiene sustancias ni agentes pat genos que puedan c
7. 0 I o II de Roche e Instrumento LightCycler 480 con termobloque de 96 pocillos Roche n ref 05015278001 y con versi n del software 1 5 x o Instrumento Il LightCycler 480 con termobloque de 96 pocillos Roche n ref 05015278001 y con versi n del software 1 5 x e Placa de 96 pocillos Multiwell LightCycler 480 blanca con films de sellado Roche n ref 04729692001 e Film de sellado LightCycler 480 Roche n ref 04729757001 Equipamiento adicional requerido compatible con todas las configuraciones de PCR en tiempo real e Separador magn tico Im n DynaMag 15 Invitrogen n ref 123 01D e Separador magn tico Im n DynaMag 2 Invitrogen n ref 123 21 D 6 4 Requisitos para la instalaci n La instalaci n calibraci n comprobaci n del rendimiento y el mantenimiento de los instrumentos 7500 Fast Dx PCR y 7500 Fast PCR de Applied Biosystems y los instrumentos LightCycler 480 I y LightCycler 480 II de Roche deben realizarse siguiendo las instrucciones del fabricante Nota La calibraci n mensual de los instrumentos 7500 Fast Dx PCR y 7500 Fast PCR de Applied Biosystems es obligatoria tal y como se describe en el protocolo de mantenimiento del fabricante Los instrumentos 7500 Fast Dx y 7500 Fast PCR de Applied Biosystems precisan de un mantenimiento semestral que incluya la calibraci n de los fluorocromos FAM JOE TAMRA seg n las instrucciones del fabricante P gina 7 de 29 7 Advertencias
8. 11 5 Interpretaci n de los resultados de una PCR individual Instrumento I LightCycler 480 Si el resultado del control interno de ACTB indica que la cantidad de ADN que entra en la prueba PCR individual es suficiente umbral de ciclo ACTB especificado en la Tabla 12 el resultado de PCR Septin9 define el resultado de dicha PCR individual v ase el Apartado 13 Un valor de ACTB superior al punto de intersecci n especificado en la Tabla 12 provoca que un resultado PCR individual sea invalid Tabla 12 Interpretaci n de los resultados de una PCR individual instrumento LightCycler 480 Resultado PCR individual Resultado Septin9 Resultado ACTB Septin9 Positivo CP lt 50 CP lt 33 1 Septin9 Negativo CP no disponible CP lt 33 1 Invalid Cualquier resultado CP gt 33 1 Crossing Point punto de intersecci n 12 An lisis con el instrumento ll de Roche LightCycler 480 12 1 Preparaci n de la placa instrumento II de LightCycler 480 Nota 12 2 Nota Preparar la placa PCR Se recomienda la disposici n de placas que figura en la Tabla 6 Transferir 15 ul de PCR Master Mix en los pocillos seleccionados de una placa de reacci n LightCycler 480 Multiwell Plate 96 Centrifugar brevemente la placa de almacenamiento de bisDNA creada en el Apartado 9 2 13 durante 1 minuto a1000 100 fcr usando la centr fuga para placas A adir 15 ul de soluci n de bisDNA en los pocillos correspondi
9. 9 1218 o equivalente de pie Tubos de recogida de sangre Tubos para extracci n de sangre por vac o de 10 ml BD VacutainerO K2EDTA Becton Dickinson n ref 367525 o S Monovette de 9 ml K3E Sarstedt n ref 02 1066 001 o S Monovette de 8 5 ml CPDA Sarstedt n ref 01 1610 001 6 3 Equipamiento especial y consumibles requeridos Para realizar la prueba Epi proColon 2 0 CE se requieren los siguientes consumibles y equipamientos especiales no reemplazables por otros equivalentes Si la prueba Epi proColon 2 0 CE se realiza con los instrumentos 7500 Fast o 7500 Fast Dx PCR de Applied Biosystems e Instrumento Applied Biosystems 7500 Fast Dx Real Time PCR con software para la detecci n de secuencias v1 4 21 CFR Part 11 Module Life Technologies Co n ref 4406984 o 4406985 o e Instrumento Applied Biosystems 7500 Fast Real Time PCR Life Technologies Co catalog no 4351106 or 4351107 con software para la detecci n de secuencias v1 4 21 CFR Part 11 Module Life Technologies Co n ref 4377355 e Placa de reacci n de 96 pocillos con c digo de barras MicroAmpO Fast Optical 0 1 ml Applied Biosystems Life Technologies Co 20 placas n ref 4346906 200 placas n ref 4366932 e Film adhesivo ptico de 96 y 384 pocillos MicroAmpO Applied Biosystems Life Technologies Co 25 films n ref 4360954 o 100 films n ref 4311971 Si la prueba Epi proColon 2 0 CE se realiza con los instrumentos LightCycler 48
10. Applied Biosystems oo o 19 11 An lisis con el Instrumento de Roche LightCycler 480 ooooonnconnccnnonconnoononononnnonnnonnnononono nono nnanonn nono rcnonnnonnos 19 11 1 Preparaci n de la placa Instrumento I LightCycler 480 ooooocccnnonccccnnooccccnnoncnonnnnnnnnnnnnnnononnnnnnconnncncnnancnnnnno 19 11 2 Carga de la placa Instrumento I LightCycler 480 ooooooccocccccccocooocanonononnnonancnnnccnnnnonnnnnnnncccnonanrnccnnccnnnnnanonnns 19 11 3 An lisis de los resultados Instrumento I de LightCycler 480 oooooooccnnocccccononcccnonaccncnnnncnonnnnnnncnnnnnnoconanancnnnnos 20 11 4 Validez de la prueba confirmada con los controles Epi proColon instrumento de LightCycler 480 21 11 5 Interpretaci n de los resultados de una PCR individual Instrumento LightCycler 480 s es 22 12 An lisis con el instrumento Il de Roche LightCycler 480 o ooooonnocnncconococnnocnnnononononnnonanonnnnnc nono nnononn noo nro nnnnnonoss 22 12 1 Preparaci n de la placa instrumento II de LightCycler 480 oooonoocccccnooccccnooaccnononcnononnnnncnonnnnconnnnconnnnnnnnono 22 12 2 Carga de la placa instrumento Il de LightCycler 480 ccccononncccconcconnnonoccnnnccnnnnononccnnncccnnnnnnnncnnncnnonnannnnns 22 12 3 An lisis de los resultados instrumento Il de LightCycler 480 ooooooccnnoococccooocccononaconnnnncnonnonnnnnnnannnncnnnnnnonnnnns 23 12 4 Criterios de validez para los control
11. Epi proColon Negative o ambos no es v lido los datos de las muestras de paciente procesadas junto con los controles no pueden ser interpretados Esta comprobaci n hay que repetirla para todas las muestras de pacientes del ensayo Tabla 8 Criterios de validez de los controles Epi proColon analizados con 7500 Fast 7500 Fast Dx de Applied Biosystems Resultado del control Determinaci n Resultado Septin9 Resultado ACTB PCR1 Ct lt 41 1 Ct lt 29 8 Positive Control valid PCR2 Ct lt 41 1 Ct lt 29 8 PCR3 Ct lt 41 1 Ct lt 29 8 PCR1 a 7 Ct lt 37 2 Negative Control valid PCR2 U a es Ct lt 37 2 PCR3 TANIS Ct lt 37 2 Cycle threshold umbral del ciclo 10 6 Interpretaci n de los resultados para una PCR nica 7500 Fast Fast Dx Applied Biosystems La interpretaci n de una PCR nica se efect a seg n se indica en la Tabla 9 Si el resultado del control interno de ACTB indica que la cantidad de ADN que entra en la prueba PCR individual es suficiente umbral de ciclo ACTB especificado en la Tabla 9 el resultado de PCR Septin9 define el resultado de la PCR individual v ase el Apartado 13 Un valor ACTB superior al umbral de ciclo especificado en la Tabla 9 define el resultado de la PCR individual como Invalid PCR Tabla 9 Interpretaci n de los resultados de la PCR individual 7500 Fast Fast Dx Applied Biosystems Resultado PCR RT Resultado Septin9 Resultado ACTB individual Septin9 Positivo
12. Inspector Wells 41 412 Sample Name use Detector Reporter Quencner task Quantity Color E me oO e one non OOOO O M ACTE JOE none Unknown Figura 1 Captura de pantalla del software SDS v1 4 despu s de confirmar las configuraciones en la ventana Well Inspector 247500 Fast System SDS Software Plate1 Standard Curve O xj E File view Tools 21CFR11 Instrument Analysis Window Help la x 054 00 2B58 Ea Setup Y Instrument m Instrument Control m Temperature Start Estimated Time Remaining hh mm Sample Heat Sink Cover Block Stop r Cycle Disconnect Status Stage Rep Time mm ss Step Estend State m Thermal Cycler Protocol Thermal Profile Auto Increment Ramp Rate Stage 1 Stage 2 Stage 3 Reps 1 Reps Reps E sao Add Cycle Add Hold Add Dissociation Stage Delete Help Settings Sample Volume pL 0 Die aa E Data Collection Stage 2 Step 2 655 20 35 y Ready Disconnected User anne Nm 2 Figura 2 Captura de pantalla del software SDS v1 4 tras crear el programa PCR P gina 17 de 29 10 4 An lisis de resultados 7500 Fast Fast Dx de Applied Biosystems Nota Analizar los resultados PCR s lo con la versi n del software SDS v1 4 Nota Ejecuciones incompletas o ejecuciones en las cuales se produce un mensaje de error no se deben analizar El documento de ejecu
13. Quick Kit M5 02 001 En la segunda fase el ADN tratado con bisulfito bisDNA es sometido a un ensayo d plex PCR usando Epi proColon Sensitive PCR Kit M5 02 002 detect ndose el ADN metilado en Septin9 y un control interno ADN ACTB fi actina que permite evaluar si el ADN disponible es adecuado Los controles incluidos en el Epi proColon Control Kit M5 02 003 son obligatorios como controles positivos y negativos para cada ensayo La extracci n del ADN del plasma del paciente se realiza mediante la adhesi n del ADN libre circulante a part culas magn ticas procediendo luego a separarlas del plasma gracias a un soporte magn tico Las eventuales impurezas se eliminan de las part culas magn ticas en las fases de lavado La fase de eluci n sirve para separar el ADN purificado de las part culas magn ticas disolvi ndolo en el tamp n de eluci n El ADN contenido en el tamp n de eluci n ser sometido a una reacci n qu mica que modificar espec ficamente los residuos de citosina no metilada en el ADN El tratamiento con bisulfito es el m todo de elecci n para analizar la metilaci n del ADN La conversi n se basa en la adici n nucleof lica de un ion bisulfito a la citosina de un nucle tido con la consiguiente reacci n de desaminaci n para dar sulfonato de uracilo mientras que la 5 metilcitosina citosina metilada no experimenta la reacci n de desaminaci n y permanece invariable Los bloqueadores y las sondas usados en l
14. a Producto sanitario para el diagn stico in vitro lt o N de lote Oo Fecha de caducidad Fabricante Almacenar a la temperatura indicada N mero de pruebas No reutilizar 69 4 E Dr 18 Referencias 1 deVos T et al Circulating methylated SEPT9 DNA in plasma is a biomarker for colorectal cancer Clinical Chemistry 55 7 1337 46 2009 2 Lofton Day C et al DNA methylation biomarkers for blood based colorectal cancer screening Clinical Chemistry 54 2 414 423 2008 3 Model F et al Identification and validation of colorectal neoplasia specific methylation markers for accurate classification of disease Mol Cancer Res 5 153 163 2007 4 Eads C A et al MethyLight a high throughput assay to measure DNA methylation Nucleic Acids Research Volume 28 Issue 8 e32 2000 P gina 28 de 29 19 Contacto Epi proColon 2 0 CE es un producto de Epigenomics AG Geneststr 5 10829 Berl n Alemania Para m s informaci n y asistencia enviar un e mail o llamar a supportOproducts epigenomics com Tel 0049 30 24345 222 Fax 0049 30 24345 555 Nota para el comprador Epi proColon Epi proColon es una marca registrada de Epigenomics AG Todas otras marcas registradas y nombres incluidos en este documento son propiedad de sus respectivos propietarios LightCycler6 480 System es una marca registrada de F Hoffmann La Roche Ltd Applied BiosystemsO MicroAmpO son ma
15. a reacci n PCR distinguen entre las secuencias metiladas y las no metiladas Epi proColon 2 0 CE detecta una secuencia bisDNA que contiene sitios CpG metilados en la regi n v2 del gen Septin9 y el bisDNA total de una regi n del gen ACTB La porci n del ensayo d plex relacionada a Septin9 consiste en cebadores ubicados en regiones gen ticas sin dinucle tidos CpG Una vez ha tenido lugar la conversi n con bisulfito dentro de la regi n se a ade un bloqueador espec fico para las secuencias no metiladas de manera que se amplifica preferentemente las secuencias metiladas Se usa una sonda de detecci n fluorescente espec fica para el gen Septin9 metilado con el fin de identificar nicamente las secuencias metiladas amplificadas en la reacci n PCR4 P gina 3 de 29 Contenido del kit 4 1 Contenido Tabla 1 Contenido del Epi proColon Plasma Quick Kit Temperatura de Reactivo Recipientes Volumen almacenaje Epi proColon Lysis Binding Buffer 1 frasco 125 mil de 15 C a 30 C Epi proColon Wash A Concentrate 1 frasco 60 ml de 15 C a 30 C Epi proColon Magnetic Beads 1 frasco 4 ml de 15 C a 30 C Epi proColon Wash B Concentrate 1 frasco 7 mi de 15 C a 30 C Epi proColon Elution Buffer 1 tubo 6 ml de 15 C a 30 C Epi proColon Bisulfite Solution 4 tubos de 1 9 ml cada uno de 15 C a 30 C Epi proColon Protection Buffer 1 tubo 1 mi de 15 C a 30 C Tabla 2 Contenido del Epi proColon Sensit
16. a segunda centrifugaci n 9 Procedimiento de la prueba Se recomienda el uso de un pipetador de repetici n para los siguientes reactivos Epi proColon Lysis Binding Buffer Epi proColon Magnetic Bead Suspension Ethanol en el paso 9 2 3 Epi proColon Wash A Buffer Epi proColon Wash B Buffer Epi proColon Elution Buffer Epi proColon Bisulfite Solution Epi proColon Protection Buffer y PCR Master Mix Adem s recomendamos encarecidamente el uso de un agitador de noria y no un agitador de plataforma horizontal y pipetear el ADN extra do y tratado con bisulfito con pipetas de precisi n 9 1 9 2 Preparaci n de las soluciones activas 9 1 1 Preparaci n del tamp n de lavado Epi proColon Wash A Buffer A adir 60 0ml de etanol absoluto para biolog a molecular gt 99 5 al Epi proColon Wash A Concentrate usando un cilindro est ril graduado o una pipeta serol gica Cerrar la tapa mezclar bien invirtiendo el frasco cinco veces evitar la formaci n de espuma Etiquetar el frasco poniendo la fecha de diluci n y marcar la casilla Ethanol added Almacenar el tamp n Epi proColon Wash A Buffer reconstituido a una temperatura entre 15 y 30 C durante un m ximo de 6 semanas 9 1 2 Preparaci n del tamp n de lavado Epi proColon Wash B Buffer A adir 40 0ml de etanol absoluto para biolog a molecular 299 5 al Epi proColon Wash B Concentrate usando un cilindro est ril graduado o una pipeta serol gica Cerrar la
17. as de plasma humano La presencia de Septin9 metilado est asociada al c ncer colorrectal y puede contribuir por lo tanto a su detecci n Epi proColon 2 0 CE incluye Epi proColon Plasma Quick Kit M5 02 001 Epi proColon Sensitive PCR Kit M5 02 002 y Epi proColon Control Kit M5 02 003 2 Resumen y explicaci n de la prueba Epi proColon 2 0 CE es un ensayo in vitro basado en la reacci n en cadena de la polimerasa PCR para la detecci n cualitativa de la metilaci n del gen Septin9 en ADN aislado en 3 5 ml de plasma del paciente Los restos de citosina en la regi n v2 del gen Septin9 est n metilados en tejido afectado por c ncer colorrectal CRC pero no en la mucosa del colon normal Esta metilaci n no es normal y puede ser detectada con amplificaci n espec fica del ADN presente en el flujo sangu neo La detecci n de ADN de CRC en plasma mediante el uso del marcador biol gico Septin9 metilado se ha confirmado en varios estudios caso control sobre pacientes con CRC y controles negativos confirmados por colonoscopia El ensayo Epi proColon 2 0 CE realizado en una muestra de sangre ofrece al paciente que niega someterse a la colonoscopia de cribado una alternativa v lida a las dem s opciones no invasivas 3 Principios del procedimiento Epi proColon 2 0 CE se divide en dos fases En la primera fase se realiza la extracci n del ADN del plasma seguido por la conversi n con bisulfito del ADN purificado usando Epi proColon Plasma
18. ausar enfermedades en personas o animales Las muestras de sangre y de plasma humanos analizadas en este ensayo deber n ser manipuladas como potencialmente infecciosas ateni ndose a protocolos de seguridad en el laboratorio como los procedimientos indicados en la Directiva Europea 2000 54 CE sobre la protecci n de los trabajadores contra los riesgos relacionados con la exposici n a agentes biol gicos durante el trabajo o dem s normativas sobre seguridad biol gica 8 Recogida y manejo de muestras 8 1 Recogida de sangre y almacenamiento de sangre La recogida y el almacenamiento de la muestra de sangre se pueden realizar de acuerdo con las siguientes condiciones e Para la toma de la muestra de sangre usar tubos VacutainerO K EDTA de 10 ml o S MonovetteO Potassium EDTA de 9 ml Seguir las recomendaciones del fabricante para realizar la recogida de la sangre La sangre debe procesarse inmediatamente La sangre puede ser almacenada a una temperatura entre 2 y 8 C durante un m ximo de 24 horas antes de la preparaci n del plasma No congelar las muestras de sangre e Alternativamente se pueden utilizar tubos S Monovette CPDA de 8 5 ml para la recogida de la sangre Seguir las recomendaciones del fabricante para realizar la recogida de la sangre La sangre debe procesarse inmediatamente La duraci n m xima del almacenamiento de la sangre en tubos S Monovette CPDA es de 48 horas a una temperatura entre 15 y 25 C No congelar la
19. ca PCR Se recomienda la disposici n de placas que figura en la Tabla 6 P gina 14 de 29 Nota Transferir 15 ul de PCR Master Mix en los pocillos seleccionados de la placa de reacci n de 96 pocillos MicroAmpO Fast Optical Si se requiere centrifugar brevemente la placa de almacenamiento de bisDNA creada en el Apartado 9 2 13 a 1000 100 fcr usando la centr fuga para placas A adir 15 pl de soluci n de bisDNA en los pocillos correspondientes de la placa PCR Sellar la placa con film adhesivo ptico MicroAmp Centrifugar brevemente la placa con una centr fuga para placas durante 1 minuto a 1000 100 fcr La placa PCR cargada puede ser almacenada en un frigor fico a 2 8 C durante un m ximo de 4 horas 10 3 Carga de la placa 7500 Fast Fast Dx Applied Biosystems Nota El PCR Master Mix no contiene ROX ni otros colorantes de referencia Por esta raz n el ajuste de la referencia pasiva debe ser none Nota Se recomienda guardar un archivo de plantilla sdt con las configuraciones de ciclos y an lisis PCR Iniciar el software versi n SDS v1 4 Cargar el archivo de plantilla espec fico del experimento o crear un nuevo documento de placa Hacer clic sobre Create New Document Definir estos ajustes para el documento de placa o Assay Standard Curve cuantificaci n absoluta o Container 96 Well Clear o Template Blank Document o seleccionar el archivo de plantilla Epi proColon 2 0 CE corr
20. ci n debe contener los datos de fluorescencia durante 45 ciclos e Despu s de completar el ciclo PCR hacer clic en ok e Abrir el men Results y seleccionar Amplification Plot e Configurar Analysis Setting del detector Septin9 de la siguiente manera o Data Delta Rn vs Cycle o Detector Septin9 o Line color Detector Color o Manual Ct Threshold 50000 aparece como 5 0e 004 o Manual baseline Start cycle 10 o Manual baseline End cycle 22 e Definir Analysis Setting del detector ACTB o Data Delta Rn vs Cycle o Detector ACTB o Line color Detector Color o Manual Ct Threshold 25000 aparece como 2 5e 004 o Manual baseline Start cycle 10 o Manual baseline End cycle 22 e Hacer clic en Analyze e Hacer clic en Save e El c lculo de los valores de Septin9 Ct y de ACTB Ct es autom tico e Seleccionar los pocillos para el an lisis e Las curvas de amplificaci n se muestran en el men Amplification Plot e Los valores Ct aparecen en Report Nota Comprobar visualmente todas las curvas de amplificaci n Las curvas de amplificaci n con puntos incoherentes m s all del umbral picos del ruido o de forma lineal se deber an considerar negativas V ase la Figura 3 Delta Rn vs Cycle Delta Rn vs Cycle p5 p A Data Delta Rri vs Cyce Y Data Delta An vs Cycle Y ete
21. ciendo la cantidad de bisDNA Abrir la tapa del microtubo Colocar el tubo abierto en el termoagitador Dejar que se seque durante 10 1 minutos a 23 2 C sin agitar 9 2 13 Eluci n Transferir el microtubo a una gradilla no magn tica y a adir o 60 ul de Epi proColon Elution Buffer Cerrar el tubo Reuspender las part culas magn ticas con el v rtex durante 5 10 segundos Incubar durante 10 1 minutos a 23 2 C en un termoagitador a 1000 100 rpm Centrifugar brevemente el tubo Colocar el tubo en las gradillas magn ticas DynaMag 2 durante 2 6 min Transferir todo el eluato 60 ul de soluci n de ADN a una placa de 96 pocillos usando una pipeta de precisi n de 10 100 ul y sellar la placa con un film adhesivo empleando un aplicador especial Preparar la placa de almacenamiento del bisDNA con arreglo a la Tabla 4 Tabla 4 Disposici n recomendada para una placa de bisDNA 1 2 3 4 5 6 7 8 10 11 12 A PC S7 B NC 58 Cc Ss1 S9 D S2 S10 E S3 S11 F S4 S12 G S5 S13 H S6 S14 Control Epi proColon Positive Control Epi proColon Negative 9 2 14 Almacenamiento de ADN con conversi n bisulfito Si el ADN extra do y convertido por bisulfito no se usa inmediatamente almacenar el material a 2 8 C durante un m ximo de 24 horas o a entre 25 y 15 C durante un m ximo de 72 horas 9 3 Preparaci n de la PCR
22. criterios indicados en la Tabla 11 se cumplen para LAS TRES 3 r plicas de PCR por control f 10 luoreacenco 523 560 E aa Pl N A AM Epa Y N PU 2 RIERA AIDA HEEE EEE ERE 2 4 6 amp 1012141618 2 2 24 3 32 4 3 024 80 Cycles Cycles Cycles Figura 4 Captura de pantalla de curvas de amplificaci n de Septin9 usando LightCycler 480 A Una curva de amplificaci n sin un incremento exponencial claro se considerar negativa B Configurar el umbral Threshold de modo que ste sea ligeramente superior al fondo C Configurar el umbral Threshold de modo que cruce las curvas de amplificaci n al inicio del incremento exponencial de PCR Si el control Epi proColon Positive o Epi proColon Negative o ambos no es v lido los datos de las muestras de paciente procesadas junto con los controles no pueden ser interpretados Esta comprobaci n hay que repetirla para todas las muestras de pacientes del ensayo Tabla 11 Criterios de validez de los controles Epi proColon Instrumento de LightCycler 480 Resultado del control Determinaci n Resultado Septin9 Resultado ACTB PCR1 CP lt 40 6 CP lt 29 5 Positive Control valid PCR2 CP lt 40 6 CP lt 29 5 PCR3 CP lt 40 6 CP lt 29 5 PCRI CP lt 36 5 Negative Control valid PCR2 CP no disponible CP lt 36 5 PCR3 CP lt 36 5 Crossing Point punto de intersecci n P gina 21 de 29
23. ctor mSEPTS y Detector mSEPTS y 5 0008 005 Detector m Jl 5 000e 005 dE Line Color Detector Color 7 Line Color Detector Color y 4 000e 005 4 000e 005 Analysis Settings Analysis Settings A C AutoC 3 000e 005 cs 3 000e 005 Pes E 5 Manual Ct Manual Ct E 3 5 0e 004 a Threshold 5 0e 004 amp 20008 005 Hadron 3 2000e 005 f g C Auto Baseline C Auto Baseline T Manual Baseine 1 000e 005 Manual Baseine Start cycle 10 Start cycle T0 0 000e 000 gouies End cycle 22 End cycle 22 1 000e 005 ih 1 000e 005 E 1 3 56 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45 Hel 1 3 5 7 9 1113 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45 Help lp Cycle Number Cycle Number Figura 3 Captura de pantalla de curvas de amplificaci n de Septin9 usando 7500 Fast de Applied Biosystems A Ejemplos de curvas v lidas B Ejemplos de curvas negativas debido a la incoherencia de los puntos 1 o a una forma lineal 2 10 5 Validez de la prueba confirmada con controles Epi proColon 7500 Fast Fast Dx Applied Biosystems Cualquier ensayo muestras de paciente procesadas junto con los controles Epi proColon Positive y Epi proColon Negative se considera v lido si los criterios indicados en la Tabla 8 se cumplen para LAS TRES 3 r plicas de PCR por control P gina 18 de 29 Si el control Epi proColon Positive o
24. de pipeta Volumen para Volumen para Volumen para Volumen para Componente 8 16 24 32 determinaciones determinacione determinaciones determinaciones 24 PCRs s 48 PCRs 72 PCRs 96 PCRs Epi proColon PCR Mix 384 yl 768 pl 1152 pl 1536 pl Epi proColon Polymerase 19 2 pl 38 4 ul 57 6 pl 76 8 ul Tabla 6 Disposici n de placa PCR recomendada 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 PC PC pc s7 S7 S7 NC NC NC S8 S8 S8 S1 s1 s1 S9 S9 S9 S2 S2 S2 S10 S10 S10 S3 S3 S3 S11 Ss11 S11 S4 S4 S4 S12 S12 S12 S5 S5 S5 S13 S13 S13 S6 S6 S6 S14 S14 S14 Control Epi proColon Positive Control Epi proColon Negative aloe ree a per Nota Si la PCR se realiza con los instrumentos 7500 Fast PCR o 7500 Fast Dx PCR Applied Biosystems con SDS v1 4 seguir las instrucciones del apartado 10 y del apartado 13 Si la PCR se realiza con el instrumento Roche LightCycler 480 seguir las instrucciones del Apartado 11 y del Apartado 13 Si la PCR se realiza con el instrumento ll Roche LightCycler 480 seguir las instrucciones del Apartado 12 y del Apartado 13 10 An lisis con los instrumentos PCR 7500 Fast y 7500 Fast Dx de Applied Biosystems 10 1 Software requerido Este producto ha sido validado usando el software SDS v1 4 con el m dulo 21 CFR Part 11 10 2 Preparaci n de la placa PCR 7500 Fast Fast Dx Applied Biosystems e Preparar la pla
25. e contacto si lleva y resulta f cil Seguir aclarando Epi proColon Wash B Concentrate Epi proColon Elution Buffer Epi proColon Magnetic Beads Epi proColon PCR Mix Epi proColon Polymerase Epi proColon Positive Control y Epi proColon Negative Control no son nocivos 5 Almacenamiento y conservaci n Los reactivos suministrados con el Epi proColon Plasma Quick Kit M5 02 001 con el Epi proColon Sensitive PCR Kit M5 02 002 y con el Epi proColon M5 02 003 Control Kit son estables hasta la fecha de caducidad si son almacenados y manejados correctamente No usar los productos pasada la fecha de caducidad No mezclar componentes de diferentes lotes 5 1 5 2 Epi proColon Plasma Quick Kit M5 02 001 Xx 30 C 15 C Almacenar todos los reactivos del Epi proColon Plasma Quick Kit a entre 15 y 30 C Epi proColon Bisulfite Solution es sensible al contacto con ox geno Usar s lo tubos de Epi proColon Bisulfite Solution que no hayan sido abiertos antes Desechar los tubos usados Almacenar el tamp n Epi proColon Wash A Buffer y el tamp n Epi proColon Wash B Buffer reconstituidos a entre 15 y 30 C durante un m ximo de seis semanas Despu s del primer uso almacenar todos los reactivos durante un m ximo de 6 semanas a entre 15 y 30 C Epi proColon Sensitive PCR Kit M5 02 002 y C 25 C Almacenar Epi proColon PCR Mix y Epi proColon Polymerase a entre 25 y 15 C Epi proColon PCR Mix se p
26. e contiene las part culas magn ticas 9 2 6 Almacenamiento del ADN extra do Nota Si no va a ser utilizado inmediatamente el ADN extra do almacenar el material entre 2 y 8 C durante un m ximo de 24 horas No congelar el ADN extra do 9 2 7 Conversi n bisulfito Nota Epi proColon Bisulfite Solution es sensible al ox geno Usar nicamente tubos de Epi proColon Bisulfite Solution que no est n abiertos No almacenar Desechar cualquier resto de la soluci n e A adir los siguientes reactivos a los microtubos de 2 0 ml que contienen el eluato 100 ul de soluci n de ADN o 150 ul de Epi proColon Bisulfite Solution o 25 ul de Epi proColon Protection Buffer e Cerrar el tubo y mezclar la reacci n bisulfito con un v rtex durante 5 10 segundos e Centrifugar brevemente el tubo e Colocar el tubo en el termoagitador e incubar durante 45 5 minutos a 80 2 C sin agitar e Retirar el tubo del termoagitador despu s de transcurrir 45 5 min e Ajustar la temperatura del termoagitador a 23 2 C o preparar un segundo termoagitador a 23 2 C para uso posterior 9 2 8 Fijaci n Nota Para que el resultado sea correcto es esencial que la suspensi n Epi proColon Magnetic Beads sea homog nea Diferencias en la cantidad de part culas especificada pueden dar resultados err neos Para garantizar que la concentraci n de part culas magn ticas sea correcta hay que mezclar bien el frasco antes de pipetear hasta que no quede ning n re
27. e transferencia desechable dentro del tubo de 15 ml para recoger las part culas magn ticas restantes y transferirlas a un microtubo de 2 0 ml e Colocar el tubo en las gradillas magn ticas DynaMag M 2 durante 2 6 minutos e Retirar la mayor cantidad de tamp n posible con una pipeta de transferencia desechable de 15 cm estando el tubo todav a en las gradillas magn ticas DynaMag 2 Poner cuidado en no eliminar part culas magn ticas e Centrifugar brevemente el tubo e Colocar el microtubo de 2 0 ml en las gradillas magn ticas DynaMag 2 durante 2 6 minutos e Quitar la mayor cantidad de tamp n residual posible usando una pipeta de precisi n de 10 100 pul estando el tubo a n en la gradilla magn tica 9 2 5 Eluci n e Transferir el microtubo a una gradilla no magn tica e Mezclar el tamp n Epi proColon Elution Buffer con el v rtex durante 5 10 segundos e A adir 100 ul de Epi proColon Elution Buffer en cada tubo e Cerrar el tubo e Resuspender nuevamente las part culas magn ticas con el v rtex durante 5 10 segundos e Colocar el microtubo en un termoagitador ajustado a 1 000 100 rpm e incubar a 80 2 C durantel0 1 min e Centrifugar brevemente el tubo e Colocar el microtubo en las gradillas magn ticas DynaMag 2 durante 2 6 minutos e Con el tubo en la gradilla magn tica transferir todo el eluato 100 ul de soluci n de ADN a un microtubo nuevo de 2 0 ml e Desechar el microtubo de 2 ml qu
28. eeesssssssseeeessssssseeeeessssssseressssssseeeeeesssssrereeessssssseeseessssee 5 5 3 Epi proColon Control Kit M5 02 003 cooooonocccnncccnonncononnnnncconnnnnoncnonoccnnonnnnnnn non nro rnnnn rn nnnnnrnrnnnnrnnnnnnnccnnnnnnnnnnnnnnos 6 6 Materiales requeridos pero no suministrados oononccnonccnonennnnnanonnnnnonanonnnnnnnonononnnnnnnonnnnonannoncnnnnnnnoncnnnananonccnonanss 6 6 1 Equipamiento gen rico de laboratorio ooonoccccnnnoccccnnoncncnnonccncnnnnonononnnnncnonnnnnnnnn nn no rnnn ocn cnnnn cnn crnn rra nnnnnncnnnnnnos 6 6 2 Reactivos y otros consumibles de laboratorio ooooconocccnccnonocccnnnnonnnonnnnnnnnncnnnnnnnnnnnnnncnnnnnnnnnnnnnccnrnnannnnnnncccnnnnnns 6 6 3 Equipamiento especial y consumibles requeridos cccocnonnccccnncconnnonoccnnnccnnnnannonnnnncccnnnnnnnononnccononnnnnncnnnccnnnnnns 7 6 4 Requisitos para la instalaci nN ooooconnnnccnonccnonncnonacnonanonnnnonnnncnonnnnonaccnnnn Sa no nano ae e aiaee raa osoa hase ae iaaii 7 Z A AAA O TON 8 7 1 Medidas de precauci n en el laboratorio cononcccnnnccnonccnonacnonacononccnnnncnonanonnaconnnn cnn nc ro nnncananonn ano rn nc ran accannccnnass 8 7 2 Medidas de precauci n contra infecciON6S ooooocononcccnnnoncccnnnonanonnnnnnonnnnnnnonnnnnnno conan nn cnnnn cnn cnn nnn oran nn nc nnnnnnnnnannnnos 8 8 Recogida y man jo A ONO 8 8 1 Recogida de sangre y almacenamiento de Sangre ssseesesssesssseseessssererestsssssrrreersss
29. el software SDS v1 4 De las 144 muestras LoD con HeLa ADN 133 dieron positivo mientras 24 de 24 muestras sin HeLa ADN dieron negativo Mediante un modelo log stico de regresi n se determin un LoDs de 14 pg ml 95 de intervalo de confianza IC 9 pg ml 19 pg ml para la prueba Epi proColon 2 0 CE En un experimento an logo determin la sensibilidad anal tica con el instrumento de LightCyclerO 480 El valor LoD s estimado result equivalente 16 2 Reproducibilidad La reproducibilidad de los resultados de la prueba fue medida mediante la repetici n de pruebas en alicuotas procedentes de nueve pools de plasma humano en EDTA Seis de estos pools proced an de plasma de pacientes con carcinoma colorrectal diagnosticado Tres pools proced an de pacientes sanos como control Todos los pools fueron procesados en 6 r plicas por tres t cnicos usando diferentes lotes del kit Epi proColon Plasma Quick Kit M5 02 001 y tambi n del kit Epi proColon Sensitive PCR Kit M5 02 002 En 54 de 54 determinaciones de Septin9 el resultado previsto fue generado con coherencia pool con c ncer positivo al Septin9 pool sin c ncer negativo al Septin9 P gina 26 de 29 16 3 Sensibilidad cl nica y especificidad Los resultados cl nicos del Epi proColon 2 0 CE fueron determinados con 149 muestras cl nicas recogidas en prospectiva de pacientes de una poblaci n de cribado con un riesgo medio pero sin evidencias de enfermedad y con 197 muestras cl n
30. el tiempo de espera hold seg n se indica en la Tabla 7 e Cambiar la velocidad de calentamiento Ramp Rate seg n se indica en la Tabla 7 e Configurar el par metro Data Collection para Stage 2 Step 2 en 55 5 0 35 e Comprobar los ajustes del Thermal Cycler Protocol en base a la Tabla 7 v ase la Figura 2 e Guardar el documento de plantilla bajo un nombre de archivo apropiado e Abrir la bandeja del instrumento e Colocar la placa PCR en el soporte posici n Al se encuentra en el ngulo superior izquierdo comprobar que la placa est bien colocada en el soporte Cerrar la bandeja e Hacer clic en Start para iniciar la ejecuci n Tabla 7 Programa Thermal Cycler para 7500 Fast Fast Dx Applied Biosystems F Desnaturalizaci n Ciclos Enfriamiento Par metros del programa Estadio Stage 1 Stage 2 Stage 3 Repeticiones Repetitions Paso Step 1 1 2 3 1 1 45 1 Temperatura final Target C Duraci n Hold mm ss 94 62 55 5 93 40 20 00 0 05 0 35 0 30 0 05 Incremento autom tico Auto 0 0 0 Increment Velocidad de calentamiento 40 80 80 40 80 Ramp Rate Recogida de datos Oaa denn Stage 2 Step 2 55 5 0 35 P gina 16 de 29 Instrucciones de uso 237500 Fast System SDS Software Plate1 Standard Curve Bl File View Tools 21CFR11 Instrument Analysis Window Help 19 x Plate Y Well
31. elaci n del plasma y de los controles positivo y negativo Epi proColon e Descongelar un Epi proColon Positive Control y un Epi proColon Negative Control durante aprox 30 minutos a una temperatura entre 15 y 30 C e Si se usan muestras de plasma congeladas descongelar las muestras durante aprox 30 minutos a una temperatura entre 15 y 30 C e Iniciar la lisis dentro de los 60 minutos posteriores a la descongelaci n 9 2 2 Lisis Nota Antes del uso agitar brevemente el tamp n Epi proColon Lysis Binding Buffer y controlar visualmente si hay precipitado Si hay precipitado calentar el Epi proColon Lysis Binding Buffer en un ba o de agua a 37 C durante 60 minutos y agitar suavemente hasta que el precipitado vuelva a disolverse completamente Dejar queel tamp n Epi proColon Lysis Binding Buffer alcance la temperatura ambiente antes del uso e A adir lo que se indica a continuaci n a un tubo de centrifuga de 15 ml etiquetado o 3 5 ml de la muestra de plasma o Epi proColon Positive Control o Epi proColon Negative Control o 3 5 ml de Epi proColon Lysis Binding Buffer e Cerrar el tubo y mezclar con el v rtex durante 5 10 segundos e Incubar el tubo en la mesa de trabajo a 15 30 C durante 10 1 min 9 2 3 Fijaci n del ADN Nota Para que el resultado sea correcto es esencial que la suspensi n de part culas en Epi proColon Magnetic Beads sea homog nea Diferencias en la cantidad especificada de part culas beads pueden da
32. entes de la placa PCR Sellar la placa PCR con film de sellado LightCycler 480 Centrifugar brevemente la placa PCR con una centr fuga para placas durante 1 minuto a 1000 100 fcr La placa PCR cargada puede ser almacenada en un frigor fico a 2 8 C durante un m ximo de 4 horas Carga de la placa instrumento II de LightCycler 480 Se recomienda guardar las configuraciones de ciclo y de an lisis en un archivo de plantilla ixo Iniciar el software versi n 1 5 x Para crear un nuevo experimento hacer clic en New Experiment Cargar el archivo de plantilla del experimento especificado o definir el siguiente experimento en base a los par metros del programa PCR de la Tabla 13 Abrir la bandeja Colocar la placa PCR en el soporte la posici n A1 se encuentra en el ngulo superior izquierdo comprobar que la placa est bien colocada en el soporte Cerrar la bandeja Hacer clic en Start Run para iniciar P gina 22 de 29 Tabla 13 Programa est ndar PCR para el instrumento Il LightCycler 480 Par metros del Desnaturalizaci n Ciclos Enfriamiento programa Modo de an lisis None Quantification mode None Ciclos 1 50 1 Segmento 1 1 2 3 1 Temperatura final Target C 94 62 56 93 40 D i n Hol aio 0 20 00 0 00 05 0 00 35 0 00 30 0 00 30 hh mm ss Velocidad de calentamiento Ramp 1 0 1 3 1 3 1 3 1 3 Rate C s Modo de detecci n None None Single None None Instru
33. ento en base a los par metros del programa PCR de la Tabla 10 e Abrir la bandeja del instrumento e Colocar la placa PCR en el soporte la posici n A1 se encuentra en el ngulo superior izquierdo comprobar que la placa est bien colocada en el soporte Cerrar la bandeja e Hacer clic en Start Run para iniciar Tabla 10 Programa PCR est ndar para el instrumento de LightCycler 480 Par metros del Desnaturalizaci n Ciclos Enfriamiento programa Modo de an lisis None Quantification mode None Ciclos 1 50 1 Segmento 1 1 2 3 1 Temperatura final Target C 94 62 56 93 40 D i n Hol araon daola 0 20 00 0 00 05 0 00 35 0 00 30 0 00 30 hh mm ss Velocidad de calentamiento Ramp 1 0 1 3 1 3 1 3 1 3 Rate C s Modo de detecci n None None Single None None Instrumento de LightCycler 480 seleccionar el formato de detecci n Dual Color Hydrolysis Probe UPL Probe activar la combinaci n de filtro 483 533 nm y 523 568 nm y ajustar Reaction Volume en 30 11 3 An lisis de los resultados Instrumento I de LightCycler 480 Nota Los usuarios del instrumento de LightCycler 480 deben seleccionar Color Compensation ON y cargar el correspondiente archivo Epi proColon Color Compensation para la combinaci n de filtros Filter Comb 483 533 y Filter Comb 523 568 Nota Ejecutar el an lisis de los datos exclusivamente en pocillos usados
34. epi CE Instructions for Use Epi proColon 2 0 CE Epi proColon Plasma Quick Kit M5 02 001 Epi proColon Sensitive PCR Kit M5 02 002 Epi proColon Control Kit M5 02 003 Lea con atenci n las instrucciones antes de usar y c ase a ellas para obtener resultados fiables Ci IFU 0009ES rev 5 copyright Octubre 2014 Epigenomics AG M5 02 001 M5 02 002 M5 02 003 OA s a Indice 1 Nombre del producto y USO previsto oooonccooononocnnononnnnnaconocanncanononononacononanncacononnoncnnoncnnoncn nono ncnnnononcnnonccnonccnnnnnss 3 2 Resumen y explicaci n de la prueba ooncoonnoninononononnnonnnnncnnnnonanonnnnnnnonnnnnnnnn none nonn non cnn conan ona non anno nro nene none ron aran nnnnnnns 3 3 Principios del procedimientos enses eesosa ei eee seeren see Ere esar ie Eoee Sio userin earet iSense 3 A A L A E O NN 4 4 1 Contenido yeeo nr dai aa boo Dita ido e raana a eaae Neke Sotoca Did Dado Te detiene a r idea dd dat de 4 4 2 Informaciones de seg iridad viciocioconioioninacndocinnnodo lanbcinineobeinbdan bano nado und encinnqocb rinde dn acerco pino E n da cool een bo aa 4 5 Almacenamiento y CONSerVaci N ciccorionosso sintio nii a cda iran ani issver oi Sener Eos AAN SR Si K i rE S S i iii 5 5 1 Epi proColon Plasma Quick Kit M5 02 007 cccccnnnonoconnnccononononcnnnnccnnnnnnnnnnnnnccnnnnnnnnnnnnccnnnnnnnnnnnnncccnnnnnananannnnos 5 5 2 Epi proColon Sensitive PCR Kit M5 02 002 eesesssssss
35. erck KGaA n ref 1 08543 0250 o equivalente Sarstedt n ref 62 554 502 o equivalente Sarstedt SafeSeal n ref 72 695 400 o Eppendorf Safe Lock n ref 0030 120 094 o equivalente ep Dualfilter T I P S Q de Eppendorf 2 100 l n ref 0030 077 547 o equivalente 50 1000 pl n ref 0030 077 571 o equivalente Combitips advancedO de Eppendorf 0 5 ml n ref 0030 089 421 o equivalente 1 ml n ref 0030 089 430 o equivalente 10ml n ref 0030 089 464 o equivalente 25 ml n ref 0030 089 472 o equivalente pipetas de transferencia desechables graduadas no est riles VWR n ref 612 4520 o equivalente pipetas de transferencia graduadas desechables de Carl Roth n ref EA61 1 o equivalente placa de reacci n de 96 pocillos MicroAmp Fast 0 1 ml Applied Biosystems Life Technologies Co n ref 4346906 o equivalente P gina 6 de 29 Reactivos y otros consumibles Reactivos y otros consumibles recomendados Film adhesivo para placa de almacenamiento de film de sellado termorresistente para PCR n ref 391 1254 o Eppendorf ADN Storage Foil autoadhesivo n ref 0030 127 889 o equivalente Aplicador para pegar el film adhesivo MicroAmpO Adhesive Film Applicator de Applied Biosystems n ref correctamente a la placa 4333183 Bolsitas de pl stico sellables 10 x 15 cm para Carl Roth n ref P279 2 o equivalente desechar las placas PCR usadas Criovial 5 ml fondo con soporte para permanecer VWR n ref 47
36. es Epi proColon instrumento ll de LightCycler 480 oooooooocccncccccncnnnnnns 24 12 5 Interpretaci n de los resultados de reacciones PCR individuales instrumento II LightCycler 480 24 13 Interpretaci n de los resultados de una muestra de paciente oooonccnoccnoccnoccnonnonnnnononononononnnononona nono noncnnanonnnn 25 14 Control d calidad PA A O on aeaee e i a a aia aE a eo E a Aa E E rai a ESENE 14 1 Controles exte OSs ieee roren nia E E E O A E EA E EEDE R 14 2 Controles INterno Sissin Aa E EE E E R E E E a T a a 15 Limitaciones del ensayo 16 Datos sobre la eficacia del M tOdO oconoonoonnnorannnnnnonnnnnaninnononacnnonacnnononononoconansnonaonanananononconarnonaonacanenecnccnncos 26 16 1 Sensibilidad anal tica 16 2 Reproducibilidad ireira e r a EERE R T RE OEE NER ET E SE E EN 16 3 Sensibilidad cl nica y especificidad sseseesseeessseeeseeeeesseeersseeessseesssseesssseessseesseeeesstresssseesssseessteeessereesseet 27 16 4 Concordancia de los dos instrumentos de PCR en tiempo real ooccccnnnonocccncconnnononccnnccnnnnnnnrnnnnnnccnnnnann nono 27 16 5 A O NN 27 17 Significado A O 28 18 Referencias voir nia A ER A E A A i E EE E 28 19 TN 29 P gina 2 de 29 1 Nombre del producto y uso previsto Epi proColon 2 0 CE es un ensayo cualitativo para la detecci n por PCR en tiempo real de ADN metilado en Septin9 a partir de ADN convertido con bisulfito procedente de muestr
37. espondiente o Run Mode Standard 7500 Hacer clic sobre Next Hacer clic sobre New Detector Crear un nuevo detector con estos ajustes o Name Septin9 o Description Epi proColon 2 0 CE o Reporter dye FAM o Quencher dye none o Color Red Hacer clic sobre Create Another y definir estos ajustes o Name ACTB o Description Epi proColon 2 0 CE o Reporter dye JOE o Quencher dye none o Color Green Hacer clic en ok Seleccionar los dos detectores y hacer clic en Add gt gt para asignar los detectores al documento de placa Seleccionar none en el men desplegable Passive Reference Hacer clic en Done Ir al men Setup y Plate Seleccionar los 96 pocillos de la placa Ir al submen View y abrir el Well Inspector Seleccionar el detector Septin9 y ACTB P gina 15 de 29 e Comprobar que Passive Reference est configurado en none v ase Figura 1 e Hacer clic en Close e iral men Instrument para ajustar el programa PCR como se describe en la Tabla 7 e Cambiar estos ajustes o Sample Volume 30 ul o Run Mode Standard 7500 o Data Collection Stage 2 Step 2 e Crear un Thermal Profile con 3 estadios stages e Crear un Stage 2 con 3 pasos steps y un Stage 1 y Stage 3 con 1 paso cada uno e Introducir las repeticiones repetitions la temperatura final target y
38. estar P302 P352 EN CASO DE CONTACTO CON LA PIEL Lavar con agua y jab n abundantes P305 P351 P338 EN CASO DE CONTACTO CON LOS OJOS Aclarar cuidadosamente con agua durante varios minutos Quitar las lentes de contacto si lleva y resulta f cil Seguir aclarando OD PELIGRO P gina 4 de 29 Epi proColon Bisulfite Solution contiene una soluci n acuosa de bisulfito de amonio Sulfito cido de amonio Indicaciones de peligro EUHO31 En contacto con cidos libera gases muy t xicos H314 Provoca quemaduras graves en la piel y lesiones oculares graves Consejos de prudencia P264 Lavarse las manos concienzudamente A tras la manipulaci n P271 Utilizar nicamente en exteriores o en un lugar bien ventilado P280 Llevar guantes prendas gafas m scara de PELIGRO protecci n P305 351 338 EN CASO DE CONTACTO CON LOS OJOS Aclarar cuidadosamente con agua durante varios minutos Quitar las lentes de contacto si lleva y resulta f cil Seguir aclarando P312 Llamar a un CENTRO DE INFORMACI N TOXICOL GICA o a un m dico en caso de malestar Epi proColon Protection Buffer contiene cido 6 hidroxi 2 5 7 8 tetra metil croman 2 carbox lico alcohol tetrahidrofurfur lico Indicaciones de peligro H319 Provoca irritaci n ocular grave lt gt x Consejos de prudencia P305 P351 P338 EN CASO DE CONTACTO CON LOS OJOS Aclarar cuidadosamente con agua ADVERTENCIA durante varios minutos Quitar las lentes d
39. icas en modalidad caso control que inclu an muestras procedentes de pacientes con carcinoma colorrectal confirmado a nivel histol gico en todos los estadios y muestras de personas sin evidencia de enfermedad negativos confirmados por colonoscopia El ADN con conversi n bisulfito fue preparado de plasma procedente de sangre procesada dentro de las primeras cuatro horas despu s de su recogida con tubos Vacutainer K EDTA Becton Dickinson Se obtuvieron resultados v lidos de Septin9 para 346 de 346 muestras 100 En la cohorte recogida en prospectiva 1 de cada 149 muestras dio un resultado positivo La tasa de falsos positivos estimada en este grupo de pacientes es del 1 IC 95 0 4 Estas cifras se traducen en una especificidad cl nica del 99 IC 95 96 100 Entre los 99 individuos de la cohorte caso control con ninguna evidencia de enfermedad controles 96 muestras se determinaron negativas al Septin9 dando una especificad cl nica del 97 IC 95 91 99 v ase la Tabla 17 De los 98 individuos con carcinoma colorrectal diagnosticado 79 muestras resultaron positivas al Septin9 dando una sensibilidad cl nica estimada del 81 IC 95 72 87 En los casos de c ncer colorrectal localizado y en estadio precoz la prueba con Epi proColon 2 0 CE result positiva en 43 18 estadio l 25 estadio II de 56 pacientes 77 La tabla siguiente resume los datos obtenidos Tabla 17 Resumen de los da
40. icas de PCR dan positivo a Septin9 El resultado de la prueba de una muestra del paciente es NEGATIVO si al menos dos de tres r plicas de PCR dan negativo a Septin9 El resultado de la prueba es INVALIDO en todos los dem s casos Tabla 16 Interpretaci n de los resultados de la prueba Epi proColon 2 0 CE Control positivo Resultados de la PCR individual Control negativo Resultado de la prueba POSITIVE Valid Al menos dos PCR Septin9 positivas NEGATIVE Valid Al menos dos PCR Septin9 negativas INVALID Valid Todos los dem s casos INVALID Invalid n c 14 Control de calidad 14 1 Controles externos Epi proColon 2 0 CE incluye los controles Epi proColon Positive y Epi proColon Negative M5 02 003 Estos controles se deben emplear en cada ensayo para monitorizar la buena realizaci n de la prueba y garantizar la validez de los resultados de la misma Los valores de los controles Epi proColon Positive y Epi proColon Negative deben encontrarse dentro de sus m rgenes de validez v ase Tabla 8 o Tabla 11 o Tabla 14 Si un control se encuentra fuera de sus m rgenes espec ficos los resultados asociados no son v lidos no deben documentarse y se debe proceder a su repetici n Si las normas del laboratorio que disciplinan el control de calidad requieren un uso m s frecuente de controles para comprobar los resultados de la prueba atenerse a dichas normas 14 2 Controles internos El control interno permi
41. ive PCR Kit Reactivo Recipientes Volumen e Epi proColon PCR Mix 2 tubos 810 ul cada uno de 25 C a 15 C Epi proColon Polymerase 1 tubo 85 yl de 25 C a 15 C Tabla 3 Contenido del Epi proColon Control Kit Temperatura de Reactivo Recipientes Volumen almacenaje Epi proColon Negative Control 6 tubos de 3 65 ml cada uno de 25 C a 15 C Epi proColon Positive Control 6 tubos 3 65 ml cada uno de 25 C a 15 C 4 2 Informaciones de seguridad Siempre que se trabaje con productos qu micos llevar bata de laboratorio y usar guantes desechables Lavar con agua las superficies contaminadas Para m s informaci n consultar las fichas de datos de seguridad MSDS en nuestra p gina web http www epiprocolon com en laboratories septin9 test safety data sheets html Epi proColon Lysis Binding Buffer y EpiproColon Wash A Concentrate contienen TRITON X 100 y tiocianato de guanidinio Indicaciones de peligro EUHO32 En contacto con cidos libera gases muy t xicos H302 Nocivo en caso de ingesti n H312 Nocivo en contacto con la piel H318 Provoca lesiones oculares graves H332 Nocivo en caso de inhalaci n H412 Nocivo para los organismos acu ticos con efectos nocivos duraderos Consejos de prudencia P261 Evitar respirar el aerosol P273 Evitar su liberaci n al medio ambiente P301 P312 EN CASO DE INGEST ON Llamar a un CENTRO DE INFORMACI N TOXICOL GICA o a un m dico en caso de mal
42. la de resultados Exportar los valores CP haciendo clic en la tabla de resultados con el bot n derecho del rat n Seleccionar Export Guardar el archivo bajo un nombre apropiado Activar la combinaci n de filtros Filter Comb 533 580 Configurar el primer ciclo First Cycle en 1 y el ltimo Last Cycle en 50 Definir el fondo haciendo clic sobre el bot n azul Background en 5 22 configurando Min Offset en 4 y Max Offset en 21 en la ventana Cycle Range En la ventana Noise Band configurar la compensaci n del fondo en Noise Band Fluoresc y ajustar el valor l mite en 2 0 En la ventana Analysis configurar el valor l mite Threshold Manual en 2 0 En la ventana Analysis ajustar el n mero de los Fit Points en 2 Hacer clic en Calculate P gina 23 de 29 Los valores ACTB CP de cada muestra se calculan autom ticamente y se visualizan en la tabla de resultados e Exportar los valores CP haciendo clic en la tabla de resultados con el bot n derecho del rat n Seleccionar Export Guardar el archivo bajo un nombre apropiado Nota Configurar Noise Band y Threshold de modo que el valor se encuentre ligeramente por encima del fondo y cruce las curvas de amplificaci n al inicio del incremento exponencial de la PCR Si hay curvas de amplificaci n sin un incremento exponencial claro se conside
43. las muestra del campo magn tico para realizar el lavado y la agitaci n conv rtex a adir o 800 ul de Epi proColon Wash B Buffer Resuspender con el v rtex durante 5 10 segundos Centrifugar brevemente el tubo Colocar el tubo en las gradillas magn ticas DynaMag 2 durante 2 6 min Retirar la mayor cantidad posible de l quido con una pipeta de transferencia desechable nueva de 15 cm con el tubo en la gradilla magn tica Poner cuidado en no eliminar part culas magn ticas 9 2 11 Tercer lavado Separar la gradilla con las muestra del campo magn tico para realizar el lavado y la agitaci n conv rtex a adir o 400 ul de Epi proColon Wash B Buffer Resuspender con el v rtex durante 5 10 segundos Centrifugar brevemente el tubo Colocar el tubo en las gradillas magn ticas DynaMag 2 durante 2 6 min Retirar la mayor cantidad posible de l quido con una pipeta de transferencia desechable nueva de 15 cm con el tubo en la gradilla magn tica Poner cuidado en no eliminar part culas magn ticas Centrifugar brevemente el tubo Colocar el tubo en las gradillas magn ticas DynaMag 2 durante 2 6 min Quitar la mayor cantidad de l quido residual posible usando una pipeta de precisi n de 10 100 ul con el tubo en la gradilla magn tica Poner cuidado en no eliminar part culas magn ticas P gina 12 de 29 9 2 12 Secado Nota No aumentar el tiempo de secado ni la temperatura Un secado excesivo puede terminar redu
44. mento Il de LightCycler 480 seleccionar el formato de detecci n Dual Color Hydrolysis Probe UPL Probe activar la combinaci n de filtro 465 510 nm y 533 580 nm y ajustar Reaction Volume en 30 12 3 An lisis de los resultados instrumento II de LightCycler 480 Nota Ejecutar el an lisis de los datos exclusivamente en pocillos ocupados es decir definiendo un sample sub set como se describe en el manual del instrumento ll de LightCycler 480 Hacer clic en Analysis en el LightCyclerO 480 Basic Software para abrir la ventana Analysis Overview Seleccionar Abs Quant Fit Points para todas las muestras Activar la combinaci n de filtros Filter Comb 465 510 Configurar el primer ciclo First Cycle en 1 y el ltimo Last Cycle en 50 Configurar el fondo en 5 22 hacer clic en el bot n azul background ajustando Min Offset en 4 y Max Offset en 21 en la ventana Cycle Range En la ventana Noise Band configurar la compensaci n del fondo en Noise Band Fluoresc y ajustar el valor l mite en 2 0 En la ventana Analysis configurar el valor l mite Threshold Manual en 2 0 En la ventana Analysis ajustar el n mero de los Fit Points en 2 Hacer clic en Calculate El Septin9 Crossing Point CP se calcula autom ticamente para cada muestra y se visualiza en la tab
45. o instruidas en la realizaci n de ensayos PCR e La detecci n del tumor colorrectal depende de la cantidad de ADN tumoral presente en la muestra esta cantidad puede variar seg n el m todo de recogida de la muestra las condiciones de almacenamiento el estado del paciente p ej edad presencia de otras enfermedades y el estadio del tumor e Por esta raz n el resultado de la prueba no confirma la ausencia o presencia de c ncer colorrectal Cualquier resultado positivo de la prueba Epi proColon 2 0 CE se deber a confirmar mediante colonoscopia o sigmoidoscopia e Se han observado resultados positivos en pacientes con diagn stico cl nico de las siguientes patolog as Gastritis cr nica esofagitis artritis no reumatoides c ncer de pulm n c ncer de pecho y c ncer de pr stata e Tambi n se han observado resultados positivos en mujeres embarazadas e El resultado de la prueba Epi proColon 2 0 CE debe ser evaluado en relaci n con otros par metros cl nicos 16 Datos sobre la eficacia del m todo 16 1 Sensibilidad anal tica La sensibilidad anal tica ha sido evaluada por tres t cnicos cada uno realizando cuatro ensayos independientes con un set de 2 x 7 muestras con l mite de detecci n LoD que contienen concentraciones de 0 6 12 18 25 35 and 50 pg ml de HeLa ADN positiva para Septin9 resultando en 168 determinaciones Todas las determinaciones fueron v lidas usando 7500 Fast Dx de Applied Biosystems con
46. r resultados err neos Para garantizar que la concentraci n de las part culas magn ticas sea correcta se deber mezclar el frasco muy bien poco antes de pipetear hasta que no quede sedimento visible en el fondo Garantizar tambi n que la suspensi n entre los pasos de pipeteo sea homog nea e A adir al tubo de centrifuga de 15 ml en el siguiente orden o 90 ul de Epi proColon Magnetic Beads reci n resuspendida o 2 5 ml de etanol absoluto para biolog a molecular 299 5 e Cerrar el tubo y mezclar invirti ndolo 5 o 6 veces e Colocar el tubo de 15 ml en un agitador de rotaci n e Agitar a temperatura ambiente durante 45 5 minutos a velocidad media aprox 10 20 rpm Ajustar el ngulo del agitador a aprox 35 45 grados 9 2 4 Lavado del ADN Nota Antes de comenzar el lavado ajustar el termoagitador a 80 2 C para su uso posterior en la eluci n y en la conversi n bisulfito e Colocar el tubo de 15 ml en las gradillas magn ticas DynaMag M 15 durante 5 10 minutos e Desechar el sobrenadante con cuidado Poner cuidado en no eliminar part culas magn ticas o A adir 1 5 ml de tamp n Epi proColon Wash A Buffer e Resuspender completamente las part culas magn ticas con el v rtex durante 5 10 segundos e Transferir la suspensi n de part culas magn ticas a un microtubo de 2 0 ml etiquetado usando una pipeta de transferencia desechable de longitud extra 22 5 cm P gina 10 de 29 e Volver a introducir la pipeta d
47. rar n negativas Amplifiation Curves Amplification cuves Amplificatian Curves fA 7 f y f f a M N r V A Y N 2156300402422 Ade PO E de E E IET 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 35 38 40 J2 da de de 50 Cycles re OA AE a Figura 5 Capturas de pantalla de curvas de amplificaci n de Septin9 usando LightCycler 480 A Una curva de amplificaci n sin un incremento exponencial claro se considerar negativa B Configurar el umbral Threshold de modo que ste sea ligeramente superior al fondo C Configurar el umbral Threshold de modo que cruce las curvas de amplificaci n al inicio del incremento exponencial de PCR 12 4 Criterios de validez para los controles Epi proColon instrumento lI de LightCycler 480 Cualquier ensayo muestras de pacientes procesadas junto con los controles Epi proColon Positive y Epi proColon Negative se considera v lido si los criterios indicados en la Tabla 14 se cumplen para LAS TRES 3 r plicas de PCR por control Si el control Epi proColon Positive o Epi proColon Negative o ambos no es v lido los datos de las muestras de paciente procesadas junto con los controles no pueden ser interpretados Esta comprobaci n hay que repetirla para todas las muestras de pacientes del ensayo Tabla 14 Criterios de validez de los controles Epi proColon instrumento II de LightCycler 480 Resultado del control Dete
48. rcas registradas de Life Technologies Corporation DynaMag es una marca registrada de Life Technologies Corporation BD VacutainerO es una marca registrada de Becton Dickinson Inc Corporation S MonovetteO es una marca registrada de Sarstedt AG amp Co Thermomixer6 Research ReferenceO MultipetteO ep Dualfilter T 1 P S Combitips plus son marcas registradas de Eppendorf AG Safe LockTM es una marca registrada de Eppendorf AG HandyStepO es una marca registrada de Brand GmbH Co KG Con la adquisici n de este producto el comprador adquiere el derecho de usar determinadas patentes de Roche Este derecho est limitado al suministro de servicios en materia de diagn stico in vitro con muestras de procedencia humana La compra no conlleva derechos generales sobre patentes ni sobre otras licencias que vayan m s all de los derechos de uso P gina 29 de 29
49. rminaci n Resultado Septin9 Resultado ACTB PCR1 CP lt 40 5 CP lt 30 3 Positive Control valid PCR2 CP lt 40 5 CP lt 30 3 PCR3 CP lt 40 5 CP lt 30 3 PCR1 CP lt 37 1 Negative Control valid PCR2 CP no disponible CP lt 37 1 PCR3 CP lt 37 1 Crossing Point punto de intersecci n 12 5 Interpretaci n de los resultados de reacciones PCR individuales instrumento II LightCycler 480 Si el resultado del control interno de ACTB indica que la cantidad de ADN que entra en la prueba PCR individual es suficiente umbral de ciclo ACTB especificado en la Tabla 15 el resultado de PCR Septin9 define el resultado de dicha PCR individual v ase el Apartado 13 Un valor ACTB superior al punto de intersecci n especificado en la Tabla 15 define el resultado PCR como Invalid PCR P gina 24 de 29 Tabla 15 Interpretaci n de los resultados de reacciones PCR individuales instrumento II de LightCycler 480 Resultado PCR individual Resultado Septin9 Resultado ACTB Septin9 Positivo CP lt 50 CP lt 33 7 Septin9 Negativo CP no disponible CP lt 33 7 Invalid Cualquier resultado CP gt 33 7 Crossing Point punto de intersecci n 13 Interpretaci n de los resultados de una muestra de paciente El resultado de la prueba de una muestra de paciente se interpreta en base a la Tabla 16 El resultado de la prueba de una muestra del paciente es POSITIVO si al menos dos de tres r pl
50. s muestras de sangre 8 2 Preparaci n de las muestras de plasma y almacenamiento del plasma e Deshabilitar la funci n de freno de la centr fuga para evitar que se rompa la capa de c lulas e Centrifugar la sangre en los tubos de recogida de muestra durante 12 minutos a 1350 150 fcr Para realizar la conversi n de revoluciones por minuto rpm a fuerza centr fuga relativa fcr consultar el manual de uso de la centr fuga e Retirar el tubo de la centr fuga e Usar una pipeta de transferencia nueva desechable de 15 cm para transferir el plasma del tubo de recogida a un tubo de centrifuga de polipropileno de 15 ml de fondo c nico e Centrifugar el plasma en el tubo de centr fuga de 15 ml durante 12 minutos a 1350 150 fcr P gina 8 de 29 Usando una pipeta de transferencia nueva desechable de longitud extra 22 5 cm o una pipeta serol gica transferir 3 5 ml de plasma a un criovial etiquetado o a un tubo de centr fuga Las muestras de plasma pueden ser almacenadas entre 15 y 25 C durante 4 semanas como m ximo Usando los tubos VacutainerO K EDTA de 10 ml la muestra de plasma se puede almacenar entre 2 y 8 C durante un m ximo de 18 horas Nota Tenga cuidado de no perturbar o transferir la capa leucocitaria gl bulos blancos por encima de las c lulas rojas de la sangre en el tubo de recogida de sangre despu s de la primera centrifugaci n o sedimentado en el fondo del tubo de centr fuga c nico despu s de l
51. sssereeessssestreessssseerreeeessssssreet 8 8 2 Preparaci n de las muestras de plasma y almacenamiento del plasma oooococnnonocccnnonccccnnnnnnonnnnnnnonnnnncnnnnnnnnos 8 9 Procedimiento de la prueba voccoocciciaciniadcccician roseis esitet inician EENT E S SEERP da aiii 9 9 1 Preparaci n de las soluciones ACTIVAS ocoooocccnnnoncccnnooncnononnnnnnnnnncncnnnnn noc nono noc non nnn rra n nn rra nn n nr nnnn nn nnnnn nn nnannnnnnnnnns 9 9 2 Extracci n del ADN y conversi n bisulfito del plasma de los pacientes ooooconoccccnonoccccnononcnnnnnncncnnnnnnocnnananononnns 9 93 Preparaci n dela PER cnica tiara tienen adn aR e a e e Ta E A aiii 13 10 An lisis con los instrumentos PCR 7500 Fast y 7500 Fast Dx de Applied Biosystems ooonoconononononnnononoo 14 10 1 Software TE QUETIdO irira nnn e e Oe A iaa dada 14 10 2 Preparaci n de la placa PCR 7500 Fast Fast Dx Applied BiosysteM5 cooooccccnoooccccnnoncnononnccncnnnncnonnnnanonono 14 10 3 Carga de la placa 7500 Fast Fast Dx Applied BiosyStems ooooooococncccnocconocccnnccnnnnononnnnnoccnnnnnannnnnnnccnnnnanonnns 15 10 4 An lisis de resultados 7500 Fast Fast Dx de Applied Biosystems oooocoooccccnonoccccnonanccnnonrnncnnananonnonncncnnnns 18 10 5 Validez de la prueba confirmada con controles Epi proColon 7500 Fast Fast Dx Applied Biosystems 18 10 6 Interpretaci n de los resultados para una PCR nica 7500 Fast Fast Dx
52. sto de sedimentaci n en el fondo Garantizar tambi n que la suspensi n entre los pasos de pipeteo sea homog nea P gina 11 de 29 Centrifugar brevemente el microtubo de 2 0 ml con la reacci n bisulfito A adir los siguientes componentes al microtubo o 1000 pl de Epi proColon Wash A Buffer O 20 ul de Epi proColon Magnetic Beads reci n suspendidas Mezclar con el v rtex durante 5 10 segundos Esperar a que el termoagitador alcance los 23 2 C Colocar el microtubo en el termoagitador a 1000 100 rpm e incubar durante 45 5 minutos a 232 C Centrifugar brevemente el tubo Colocar el tubo en las gradillas magn ticas DynaMag 2 durante 2 6 minutos Retirar la mayor cantidad posible de l quido con una pipeta de transferencia desechable nueva de 15 cm con el tubo en la gradilla magn tica Poner cuidado en no eliminar part culas magn ticas 9 2 9 Primer lavado Separar la gradilla con las muestra del campo magn tico para realizar el lavado y la agitaci n conv rtex a adir o 800 ul de Epi proColon Wash A Buffer Resuspender con el v rtex durante 5 10 segundos Centrifugar brevemente el tubo Colocar el tubo en las gradillas magn ticas DynaMag 2 durante 2 6 min Retirar la mayor cantidad posible de l quido con una pipeta de transferencia desechable nueva de 15 cm con el tubo en la gradilla magn tica Poner cuidado en no eliminar part culas magn ticas 9 2 10 Segundo lavado Separar la gradilla con
53. te la detecci n del ADN de ACTB R actina convertido con bisulfito Este control interno coamplificado monitoriza la calidad de la muestra la preparaci n de la muestra y la idoneidad de la concentraci n de ADN de la muestra El resultado de la PCR de Septin9 est relacionado al valor Ct o CP de la PCR ACTB v ase Tabla 9 o Tabla 12 o Tabla 15 Los valores Ct o CP de la PCR ACTB que se encuentran fuera del margen indicado invalidan el resultado de la PCR en cuesti n asimismo valores muy altos alertan de un contenido muy bajo de bisDNA o de inhibici n de la PCR P gina 25 de 29 15 Limitaciones del ensayo e Para uso exclusivo en diagn stico in vitro e El producto ha sido nicamente validado para la combinaci n del Epi proColon Plasma Quick Kit M5 02 001 del PCR Epi proColon Sensitive PCR Kit M5 02 002 y del Epi proColon Control Kit M5 02 003 No se admite la sustituci n de ning n componente con kit PCR alternativos u otros m todos de extracci n de ADN e Este producto ha sido validado para el uso con plasma derivado de sangre recogida con tubos BD VacutainerO K2EDTA S Monovette 9 ml K3E y S Monovette 8 5 ml CPDA El uso de otros tipos de muestras y otros tubos de recogida de sangre no ha sido validado e Almacenamiento extendido de sangre en S Monovette 8 5 ml tubos CPDA a temperaturas elevadas puede conducir a resultados falsos positivos e El uso de este producto est restringido a personas con experiencia
54. tos de rendimiento cl nico del Epi proColon 2 0 CE Carcinomas Controles cohorte Controles Todos los carcinomas Colo ractales de cribado caso control colorrectales localizados Resultados v lidos 149 99 98 56 Septin9 positive 1 3 79 43 Septin9 negative 148 96 19 13 Positivity 1 3 81 77 16 4 Concordancia de los dos instrumentos de PCR en tiempo real La concordancia de Epi proColon 2 0 CE entre el 7500 Fast Dx System Applied Biosystems y el instrumento de LightCycler 480 ha sido determinada en una medici n comparada con 48 muestras de plasma de pacientes con carcinoma colorrectal en todos los estadios y confirmado histol gicamente y 52 muestras de individuos sin evidencia de enfermedad en el colon tras comprobarse mediante colonoscopia En el 93 93 100 de los casos los dos sistemas de medida del Septin9 concuerdan en los resultados 16 5 Interferencia No se han observado interferencias entre los controles experimentales ni entre las muestras reactivas ni no reactivas comprobadas con niveles elevados de ADN gen mico sin metilar 100 ng ml de bilirubina 0 20 mg ml de hemoglobina 1 mg ml de trigliceridos 12 mg ml de prote na albumina de suero humano 120 mg ml eritrocitos 0 4 v v K EDTA 20 mg ml colesterol 5 mg ml cido rico 0 235 mg ml y glucosa 10 mg ml P gina 27 de 29 17 Significado de los s mbolos Hal Consultar las instrucciones de uso N de refenci
55. uede descongelar y volver a congelar una nica vez Despu s del primer uso almacenar todos los reactivos durante un m ximo de 6 semanas a entre 25 y 15 C P gina 5 de 29 5 3 xo C 25 C Epi proColon Control Kit M5 02 003 Almacenar Epi proColon Control Kit a entre 25 y 15 C 6 Materiales requeridos pero no suministrados 6 1 Equipamiento gen rico de laboratorio A continuaci n se indica el equipamiento gen rico de laboratorio requerido para realizar la prueba Epi proColon 2 0 CE Todo equipamiento de laboratorio se deber a instalar calibrar usar y mantener en conformidad con las recomendaciones del fabricante Equipamiento queride Gradilla para tubos de 15 ml y 2 ml Agitador rotativo Agitador v rtex Termoagitador para tubos de 2 ml Pipetas de volumen regulable para 10 100 pl 100 1000 pl Pipetador de repetici n que permita dosificar repetidamente un volumen regulable Centr fuga de sobremesa con rotor para tubos de 1 5 2 0 ml Pipeta multicanal Centr fuga para placas microtituladoras PCR Cilindro graduado de 100 ml o pipeta serol gica de 50 ml 6 2 Reactivos y otros consumibles Etanol absoluto para biolog a molecular 299 5 Tubos de centr fuga de polipropileno de 15 ml con fondo c nico PP est ril Microtubos de 2 0 ml de fondo redondo y tapa de seguridad PP Puntas de pipeta con barrera antiaerosoles Puntas para pipetas para vol menes de 0 5 ml 1 mil
56. urar el primer ciclo First Cycle en 1 y el ltimo Last Cycle en 50 e Definir el fondo haciendo clic sobre el bot n azul Background en 5 22 configurando Min Offset en 4 y Max Offset en 21 en la ventana Cycle Range e En la ventana Noise Band configurar la compensaci n del fondo en Noise Band Fluoresc y ajustar el valor l mite en 0 8 e En la ventana Analysis configurar el valor l mite Threshold Manual en 0 8 e En la ventana Analysis ajustar el n mero de los Fit Points en 2 e Hacer clic en Calculate Los valores ACTB CP de cada muestra se calculan autom ticamente y se muestran en la tabla de resultados e Exportar los valores CP haciendo clic en la tabla de resultados con el bot n derecho del rat n Seleccionar Export Guardar el archivo bajo un nombre apropiado Nota Configurar Noise Band y Threshold de modo que el valor se encuentre ligeramente por encima del fondo y cruce las curvas de amplificaci n al inicio del incremento exponencial de la PCR Si hay curvas de amplificaci n sin un incremento exponencial claro se considerar n negativas 11 4 Validez de la prueba confirmada con los controles Epi proColon instrumento I de LightCycler 480 Cualquier ensayo muestras de pacientes procesadas junto con los controles Epi proColon Positive y Epi proColon Negative se considera v lido si los
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