DAKO ChemMateä Detection Kit Peroxidase/DAB, Rabbit/Mouse
Contents
1. Tetrayltetraammonium Tetrachlorid und ist gekennzeichnet Gesundheitssch dlich R40 Krebserregende Wirkung nicht auszuschlie en R43 Sensibilisierung durch Kontakt mit der Haut m glich R68 Irreversible Sch den m glich S35 Abf lle und Beh lter m ssen auf sichere Weise entsorgt werden S36 37 Bei der Arbeit geeignete Schutzhandschuhe und Schutzkleidung tragen Fl schchen 9 Permanent Red Chromogen enth lt Fast Red KL Salz und ist gekennzeichnet Giftig R45 Kann Krebs erzeugen S35 Abf lle und Beh lter m ssen auf sichere Weise entsorgt werden S45 Bei Unfall oder Unwohlsein sofort Arzt hinzuziehen wenn m glich dieses Etikett vorzeigen S53 Exposition vermeiden vor Gebrauch besondere Anweisungen einholen Vorsicht Dieses Produkt enth lt eine Substanz die noch nicht vollst ndig erforscht wurde Die Klassifizierung ist ausschlie lich auf der Grundlage eines Vergleichs mit Substanzen hnlicher Struktur erfolgt Personen unter 18 Jahren d rfen mit diesem Produkt grunds tzlich nicht arbeiten Alle Anwender m ssen sorgf ltig in das richtige Arbeitsverfahren die gef hrlichen Eigenschaften des Produkts und die notwendigen Sicherheitsma nahmen eingewiesen werden Weitere Informationen bitte dem Material Sicherheitsdatenblatt MSDS entnehmen 5 Dieses Produkt enth lt Natriumazid NaN eine in reiner Form u erst giftige Chemikalie Ansammlungen von Natriumazid k nnen auch in Konzentrationen die nicht al2. La proc dure est constitu e d une double coloration s quentielle dans laquelle le premier antig ne est r v l l aide de HRP DAB et le second antig ne est r v l l aide de AP Permanent Red Le r actif de blocage des deux enzymes endog nes inhibe l activit de la phosphatase alcaline de la peroxydase et de la pseudoperoxydase endog nes pr sentes dans certains tissus Apr s blocage des enzymes endog nes la premi re tape est une incubation de l chantillon avec un anticorps de souris ou de lapin convenablement dilu suivie d une incubation avec le r actif Polym re HRP Ce r actif est un polym re de dextran conjugu avec la HRP qui transporte galement les anticorps dirig s contre les immunoglobulines de souris et de lapin La r action est r v l e par le chromogene DAB Apr s l tape de blocage utilisant le r actif de blocage Doublestain l chantillon est incub avec un second anticorps de souris ou de lapin convenablement dilu Au cours de l tape suivante le r actif Lapin Souris LINK est ajout il s agit d un polym re de dextran transportant les anticorps dirig s contre les immunoglobulines de souris et de lapin puis il est suivi d une incubation avec le r actif Polym re AP Le chromog ne Permanent Red permet de r v ler la seconde r action Tous les r actifs sp cifi s l exception des anticorps primaires sont fournis dans le kit R actifs R actifs fournis Les mat r
3. Ne pas utiliser apr s la date de p remption mentionn e sur le kit Ne pas intervertir les composants de la trousse provenant de lots diff rents Si les r actifs ont t conserv s dans d autres conditions que celles sp cifi es ces conditions doivent tre v rifi es par l utilisateur En cas de r actions impr vues ne pouvant pas tre expliqu es par des changements de proc dures de laboratoire et de suspicion d un probl me avec le produit contactez nos Services techniques Pr paration de l chantillon Le kit peut tre utilis pour le marquage des coupes de tissus incluses en paraffine fix es au formol et les frottis cellulaires fix s Plusieurs types de fixateurs peuvent tre utilis s pour conserver les chantillons Les m thodes standard de traitement des tissus en vue d une coloration immunohistochimique doivent tre utilis es pour toutes les coupes de tissus 1 L paisseur optimale des coupes de tissus incluses en paraffine fix es au formol et des coupes congel es est de 4 6 um Les chantillons doivent tre mont s sur des lames pour microscope Les coupes doivent tre mont es sur les lames de fa on aussi plate et lisse que possible La pr sence de plissements trop nombreux affecterait les r sultats de la coloration REMARQUE Pour pouvoir entrer dans le porte lames et tre utilis es avec le Dako Autostainer les lames de microscope ne doivent pas d passer 26 mm de largeur Les coupes en pa
4. 2 Polymer HRP bersch ssigen Waschpuffer abklopfen und Objekttr ger wie zuvor abwischen 200 uL Polymer HRP aufbringen um Probe zu bedecken 10 1 Minuten inkubieren Probe zweimal wie unter Schritt 1 beschrieben sp len Schritt 4 DAB Arbeitsl sung Die DAB Arbeitsl sung wie in Abschnitt A 1 beschrieben ansetzen bersch ssigen Waschpuffer abklopfen und Objekttr ger wie zuvor abwischen Die Probe mit 200 uL DAB Arbeitsl sung bedecken 5 15 Minuten inkubieren Die optimale Inkubationszeit kann unterschiedlich sein und sollte vom jeweiligen Labor selbst ermittelt werden Probe mit destilliertem oder entionisiertem Wasser aus einer Waschflasche Strahl nicht direkt auf das Gewebe richten vorsichtig sp len Abfallprodukte der DAB Arbeitsl sung in einem Sonderm llbeh lter auffangen und entsprechend entsorgen Wenn das F rbeverfahren unterbrochen werden muss k nnen die Objekttr ger in einem Waschpufferbad nach der Inkubation von DAB Arbeitsl sung bis zu einer Stunde bei Raumtemperatur 20 25 C aufbewahrt werden ohne dass das F rberesultat beeintr chtigt wird Schritt 5 Fl schchen 5 Doublestain Block bersch ssigen Waschpuffer abklopfen und Objekttr ger wie zuvor abwischen 200 uL Doublestain Block zugeben um die Probe zu bedecken 3 1 Minuten inkubieren Probe wie unter Schritt 1 beschrieben sp len Schritt 6 Prim rer Antik rper Nr 2 oder Negativ Kontrollreagenz Nr 2 bersch ssigen Waschpuffer ab
5. Etape 9 Solution Permanent Red dos e Pr parer la solution Permanent Red dos e comme indiqu a la section A 2 La solution Permanent Red dos e doit tre utilis e dans les 30 minutes Eliminer le tampon en exc s en tapotant et essuyer les lames comme pr c demment Appliquer 200 ul de la solution Permanent Red dos e pour recouvrir l chantillon Laisser incuber pendant 5 20 minutes La dur e optimale de l incubation peut varier et doit tre d termin e par chaque laboratoire Rincer les lames soigneusement avec de l eau distill e ou d sionis e provenant d une pissette ne pas diriger le jet directement vers les tissus Recueillir les d chets contenant le chromog ne inutilis dans le r cipient pour produits dangereux afin de les liminer de fa on appropri e Placer les lames rinc es dans un bain d eau distill e ou d sionis e fra che pendant 5 minutes tape 10 Contre coloration instructions pour l h matoxyline Immerger les lames dans un bain d h matoxyline La dur e de l incubation d pend de la concentration de l h matoxyline utilis e Faire suivre la contre coloration l h matoxyline d un rin age soigneux l eau distill e ou d sionis e Facultatif immerger les lames de tissus dans un bain d ammoniaque 37 mmol l et rincer d licatement l eau distill e ou d sionis e pendant 2 5 minutes L ammoniaque 37 mmol l est pr par e en m langeant 2 5 ml d hydroxyde d ammonium
6. Polymer AP reagent Permanent Red Chromogen visualizes the second reaction All specified reagents except the primary antibodies are provided with the kit Reagents Reagents provided The materials listed below are sufficient for 150 tests The number of tests is based on the use of 200 uL of each reagent per test Vial 1 3x 11 mL Dual Endogenous Enzyme Block Ready to use Endogenous enzyme block solution containing 0 5 hydrogen peroxide detergents enzyme inhibitors and preservative pH 2 Vial 2 3x 11 mL Polymer HRP Ready to use 114055 002 K5361 EFG SGA 13 10 06 p 5 28 Dextran polymer conjugated with horseradish peroxidase and affinity isolated immunoglobulins Supplied in Tris HCl buffer containing stabilizing protein and preservative Vial3 3x11mL DAB Substrate Buffer Substrate buffer solution pH 7 5 containing lt 0 1 hydrogen peroxide stabilizers enhancers and an antimicrobial agent Vial 4 1x 1 5 mL DAB Chromogen 5 3 3 diaminobenzidine tetrahydrochloride chromogen solution Vial 5 3x11 mL Doublestain Block Ready to use Blocking solution Vial 6 3x 11 mL Rabbit Mouse LINK Ready to use Dextran polymer coupled with secondary antibodies against mouse and rabbit immunoglobulins In buffered solution containing stabilizing protein and preservative Vial 7 3x 11 mL Polymer AP Ready to use Dextran polymer conjugated with alkaline phospatase and affinity isolated immunoglobuli
7. actif secondaire 10 minutes Solution de DAB dos e K5361 Substrat 10 minutes Blocage Doublestain K5361 Auxiliaire 3 minutes Anticorps primaires ne figurant pas d ja Individuel Anticorps primaire 10 minutes dans la liste Autostainer Lapin Souris LINK K5361 R actif secondaire 10 minutes Polym re AP K5361 R actif tertiaire 10 minutes Solution Permanent Red dos e K5361 Substrat Lot 10 minutes Etape 2 Protocole de coloration Charger le mod le K5361 pour le kit du syst me EnVision G 2 Doublestain sur l CRAN EXECUTION DU PROGRAMME DE COLORATION Indiquer le nombre de lames de la s rie et charger les r actifs et leurs dur es d incubation dans le mod le Le positionnement des lames sera alors indiqu sur l cran Plan de disposition des lames et le positionnement et le volume de r actif devant tre charg s sur l instrument Autostainer seront indiqu s sur l cran Plan de disposition des r actifs Veuillez galement consulter le manuel de l op rateur Avant de charger les lames selon les instructions du Plan de disposition des lames il est conseill d humidifier les lames pendant 5 minutes dans du tampon de lavage Dako code S3006 Placer les flacons dans le portoir r actifs selon le Plan de disposition des r actifs Veiller charger les r actifs appropri s et utiliser les volumes corrects Apporter une attention toute particuli re au chargement des flacons d anticorps primaires Amorcer les
8. l instrument Dako Autostainer il est n cessaire de r aliser un nouveau mod le Veuillez consulter le mod le ci dessous ainsi que le Manuel de l op rateur de l instrument Autostainer correspondant Mod le K5361 1 Rinse Buffer 2 End Enz Block 3 Rinse Buffer 4 Primary Antibody 5 Rinse Buffer 6 Secondary Reagent 7 Rinse Buffer 8 Rinse Buffer 9 Swtch 10 Substrate 11 Rinse Water 12 Swtch ff 13 Auxiliary 14 Rinse Buffer 15 Primary Antibody 16 Rinse Butter 17 Secondary Reagent 18 Rinse Buffer 19 Rinse Buffer 20 Tertiary Reagent 21 Rinse Suter 22 Rinse Buffer 23 Swtch 24 Substrate Batch 25 Rinse Water 26 Swtch REMARQUE Avant de charger les lames selon les instructions de ECRAN EXECUTION DU PROGRAMME DE COLORATION les r actifs suivants doivent tre ajout s la liste des r actifs Veuillez consulter le Tableau 1 ci dessous et le Manuel de l op rateur de l instrument 114055 002 K5361 EFG SGA 13 10 06 p 18 28 Autostainer correspondant pour conna tre les noms les tapes du mod le et les dur es d incubation Tableau 1 Ajouts n cessaires a la liste des r actifs R actif Code tape du mod le Dur e d incubation Blocage des deux enzymes endogenes K5361 Bloc Enz End 5 minutes Anticorps primaires ne figurant pas d ja Individuel Anticorps primaire 10 minutes dans la liste Autostainer Polym re HRP K5361 R
9. pompes eau et tampon D marrer le programme la fin du programme rincer les lames avec de l eau distill e ou d sionis e Pour la contre coloration et le montage veuillez consulter les tapes 10 et 11 de la section B 2 Interpr tation des r sultats L antigene reconnu par Panticorps primaire n 1 est color par le chromogene DAB L emploi du chromog ne DAB conduit un produit final color en brun L antig ne reconnu par l anticorps primaire n 2 est color par le chromog ne Permanent Red L emploi du chromog ne Permanent Red conduit un produit final color en rouge Ces deux couleurs permettent une r v lation par rapport a la contre coloration due l h matoxyline Une coloration non sp cifique apparaitra comme une coloration brune ou rouge diffuse sur les lames trait es avec le r actif de contr le n gatif Les noyaux seront color s en bleu par la contre coloration par l h matoxyline 114055 002 K5361 EFG SGA 13 10 06 p 19 28 DEUTSCH Verwendungszweck Zur In vitro Diagnostik Das EnVision M G 2 Doublestain System dient zum immunhistochemischen Nachweis von Antigenen in formalinfixierten paraffineingebetteten Geweben oder fixierten Zellausstrichen unter Verwendung prim rer Maus bzw Kaninchen Antik rper von Dako Dieses Visualisierungssystem dient zum gleichzeitigen Nachweis von zwei verschiedenen Antigenen innerhalb einer Probe Das System kann in manuellen Verfahren oder mit Dako
10. 1 End Enz Block 5 Minuten In der Autostainer Liste noch nicht enthaltene Individuell Prim rer Antik rper 10 Minuten prim re Antik rper Polymer HRP K5361 Sekund res Reagenz 10 Minuten DAB Arbeitsl sung K5361 Substrat 10 Minuten Doublestain Block K5361 Zus tzlich 3 Minuten In der Autostainer Liste noch nicht enthaltene Individuell Prim rer Antik rper 10 Minuten prim re Antik rper Rabbit Mouse LINK K5361 Sekund res Reagenz 10 Minuten Polymer AP K5361 Terti res Reagenz 10 Minuten Permanent Red Arbeitsl sung K5361 Substrat Charge 10 Minuten Schritt 2 F rbeprotokoll Die Matrix K5361 f r das EnVision G 2 Doublestain System Kit in den BILDSCHIRM F RBEDURCHLAUF PROGRAMMIEREN laden Die Anzahl der Objekttr ger im Durchlauf angeben und die Reagenzien und deren Inkubationszeiten in die Matrix eingeben Die Positionen der Objekttr ger werden dann im Objekttr ger Positionierungsschema Bildschirm angezeigt w hrend der Reagenz Positionierungsschema Bildschirm die Positionen und Volumina der in den Autostainer zu ladenden Reagenzien angibt Bitte auch das Benutzerhandbuch zu Rate ziehen Es ist empfehlenswert die Objekttr ger vor der Beladung gem dem Objekttr ger Positionierungsschema Bildschirm 5 Minuten in Dako Wash Buffer Code Nr S3006 vorzubefeuchten Die Fl schchen entsprechend dem Reagenz Positionierungsschema in den Reagenzst nder einsetzen Unbedingt die richtigen Reagenzien in den korrekten Meng
11. 15 mol l concentr avec 1 litre d eau distill e ou d sionis e L ammoniaque 37 mmol l inutilis e peut tre conserv e temp rature ambiante 20 25 C dans un flacon ferm herm tiquement pendant une p riode de 12 mois tape 11 Montage Pour un montage aqueux les milieux de montage tels que le Dako Glycergel Mounting Medium code C0563 ou le Faramount Aqueous Mounting Medium code S3025 sont recommand s Pour un montage non aqueux le milieu de montage permanent Dako Permanent Mounting Media code S3026 est recommand apr s que les lames ont pu compl tement s cher l air libre 114055 002 K5361 EFG SGA 13 10 06 p 17 28 C Proc dure de coloration pour les instruments Dako Autostainer Tous les r actifs du kit l exception des flacons 4 et 9 sont fournis dans des flacons de r actifs Autostainer La solution DAB dos e et la solution Permanent Red dos e doivent toutes deux tre pr par es dans des flacons de r actifs Autostainer quand elles sont utilis es avec le Dako Autostainer Instrument Le syst me EnVision M G 2 Doublestain a t adapt pour pouvoir tre utilis avec les instruments Dako Autostainer conform ment au mod le indiqu ci dessous Avant de proc der la coloration selon les instructions du mod le sur les appareils Dako Autostainer lire soigneusement le Manuel de l op rateur de l instrument Autostainer correspondant Avant de d marrer l instrument Autostainer les
12. 2 E an HR ENTE le annee 12 ROCAS US A E 12 Mat riels requis mais non fournis iii 13 ee EN 14 Conservation lerne Hoi 15 Pr paration de l chantillon sise 15 Eltere 15 Pr paration des r actifs ions cates nennen A AA Renee 15 A 1 Solutionide DAB GOS66 eee nein sn DD Ra 15 A 2 Solution Permanent Red dos e cccccceceeeeeeeeeseeeeeeeeeeeeeeeeeeeeenaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaeeeeeeeeeeeess 15 A 3 Directive relative la dilution optimale des anticorps Drimaires 15 B Proc dure de coloration pour une utilisation manuelle 16 B 1 Remarques relatives la proc dure nssnoosenennnttttttttrrerrtnttttttersttesttnntttttteennnnn ttnn nennt 16 B 2 Protocole de coloration sise 16 C Proc dure de coloration pour les instruments Dako Autostainer 18 Interpr tation des r sultats sise 19 EE coun E E A geet 27 Explication des Symboles ee ib 28 114055 002 K5361 EFG SGA 13 10 06 p 3 28 DEUTSCH Verwendungszweck RE 20 Zusammenfassung und Erkl rung ss 20 VerfahrenSprinZip BE 20 Reagenzien se ca Sens now Er a ne Is eiserne 20 Mitgelieferte Reagenzien eee 20 Erforderliches aber nicht mitgeliefertes Material 21 Vorsichtsmatnahmen eere a etara araea a e REA E aE E a EA ORERE AA REUE E REEE EE a Eare aT 22 Aufbewahrung een iR 23 Vorbereitung der Probe see 23 ST QE LE TEE RP RD TN 23 R agenzvorbereitung rss ae 23 R 1 DABH Arbeilslosung ernennen Re te wits ie 23 A 2
13. AP Pr t l emploi Polym re de dextran conjugu la phosphatase alcaline et des immunoglobulines isol es par affinit Fourni dans un tampon Tris HCI contenant une prot ine de stabilisation et un conservateur SUBSTRATE BUFFER Tampon substrat Permanent Red Solution de substrat tamponn e CHROMOGEN Chromog ne Permanent Red Solution de chromog ne Permanent Red Mat riels requis mais non fournis Tissus absorbants Ammoniaque 37 mmol l en option Diluant anticorps Dako code S0809 ou S2022 Contre colorant h matoxyline de type h matoxyline de Mayer aqueuse Dako code S3309 Lamelles couvre objet 114055 002 K5361 EFG SGA 13 10 06 p 13 28 Instrument Dako Autostainer en option Anticorps primaires et r actif de contr le n gatif Dako Eau distill e ou d sionis e Solution de d masquage de l pitope thanol 95 et 70 Chambre humide en option Microscope optique grossissement 20 800x Milieu de montage de type Dako Glycergel Mounting Medium code C0563 ou milieu de montage aqueux Dako Faramount Aqueous Mounting Medium Ready to Use code 3025 ou milieu de montage permanent non aqueux Dako code S3026 Tissus positifs et n gatifs a utiliser comme proc d de contr le Lames SuperFrost Plus lames rev tues de poly L lysine ou Dako Silanized Slides code S3003 Cuves ou bains de coloration Minuterie capable de mesurer des intervalles de 2 a 40 minutes Pissettes Tampon de lavage c
14. Autostainer Ger ten verwendet werden Die Ergebnisse m ssen von einem qualifizierten Pathologen unter Ber cksichtigung der Krankengeschichte und anderer Diagnostiktests des Patienten ausgewertet werden Zusammenfassung und Erkl rung Beim EnVision G 2 Doublestain System handelt es sich um ein EnVision Visualisierungssystem der zweiten Generation Dieses System eignet sich f r den gleichzeitigen Nachweis von zwei Antigenen die in niedrigen Konzentrationen in einer Probe vorhanden sind Die Visualisierung basiert auf Peroxidase HRP mit DAB als Chromogen und alkalischer Phosphatase AP mit Permanent Red als Chromogen Da es sich um ein biotinfreies System handelt werden unspezifische F rbungen aus endogenen Avidin Biotin Aktivit ten deutlich abgeschw cht Folgende Angaben bitte den Allgemeinen Richtlinien zur immunhistochemischen F rbung von Dako bzw den Anweisungen des Detektionssystems f r IHC Verfahren entnehmen 1 Verfahrensprinzipien 2 Erforderliche aber nicht mitgelieferte Materialien 3 Aufbewahrung 4 Vorbereitung der Probe 5 F rbeverfahren 6 Qualit tskontrolle 7 Fehlersuche und behebung 8 Auswertung der F rbung 9 Allgemeine Beschr nkungen Verfahrensprinzip Das Verfahren ist eine sequenzielle Doppelf rbung bei der das erste Antigen mit HRP DAB und das zweite Antigen mit AP Permanent Red sichtbar gemacht wird Der duale endogene Enzym Block hemmt die in einigen Geweben vorhandene endogene alk
15. Meerrettichperoxidase und affinit tsisolierten Immunglobulinen konjugiertes Dextranpolymer Geliefert in Tris HCI Puffer mit Stabilisatorprotein und Konservierungsmittel Fl schchen 3 3 x11mL DAB Substrate Buffer Substratpufferl sung pH 7 5 enth lt lt 0 1 Wasserstoffperoxid Stabilisatoren Beschleuniger und eine antimikrobielle Substanz Fl schchen 4 1x1 5 mL DAB Chromogen 5 3 3 Diaminobenzidin Tetrahydrochlorid Chromogenl sung Fl schchen 5 3x11mL Doublestain Block Gebrauchsfertig Blockierungsl sung Fl schchen 6 3x11mL Rabbit Mouse LINK Gebrauchsfertig Mit sekund ren Antik rpern gegen Kaninchen und Maus Immunglobuline gekoppeltes Dextranpolymer In gepufferter L sung enth lt ein stabilisierendes Protein und Konservierungsmittel Fl schchen 7 3x11mL Polymer AP Gebrauchsfertig Mit alkalischer Phosphatase und affinitatsisolierten Immunglobulinen konjugiertes Dextranpolymer Geliefert in Tris HCI Puffer mit Stabilisatorprotein und Konservierungsmittel Fl schchen 8 3x11 mL Permanent Red Substrate Buffer Substratpuffer L sung Fl schchen 9 1x 300 uL Permanent Red Chromogen Permanent Red Chromogen L sung Erforderliches aber nicht mitgeliefertes Material Absorbierende T cher Ammoniakwasser 37 mmol L optional Antibody Diluent Dako Code Nr S0809 oder S2022 Gegenf rbung H matoxylin z B Dako Mayer s Hematoxylin Code Nr S3309 auf w ssriger Basis Deckgl ser D
16. O CE EnVision G 2 Doublestain System Rabbit Mouse DAB Permanent Red Code K5361 2nd edition 2 me dition 2 Ausgabe For use with rabbit and mouse primary antibodies For 150 tests Utilisation avec des anticorps primaires de souris et de lapin Pour 150 tests Zur Verwendung mit prim ren Kaninchen und Mausantik rpern f r 150 Tests 114055 002 K5361 EFG SGA 13 10 06 p 1 28 Contents Table des mati res Inhalt Page Page Seite ENGLISH Intended USE E E E A iaa 5 Summary and Explanation siceraria ea 5 Principles Of Proc dure das 5 e in O O iaid aidaa leeres 5 Reagents ge En WE 5 Materials required but not provided ss 6 NA 7 IA AA AAA A lege 7 SPECIMEN PEN nenn ata 7 Procedure sare A ein 8 A Reagent prepara ni ads 8 Fol DABE Working SOON serian ee une 8 A 2 Permanent Red Working Solution ss 8 A 3 Guideline for optimal dilution of primary antibodies coccccccnnnnnnccconononoononcnononnnnonnnnnonons 8 B Staining procedure for manual use neser nnne 8 B 1 Proc dural Mot iaa td im een 8 B 2 Staining prO OCO ee demi ii aa dad 8 C Staining procedure for Dako Autostainer instruments oooocccccncncccnoccccccncccnononcncnnnnnnnnnna conan 10 Interpretation RS Aia 11 A PP AA 27 Explanation OS YMDOS ci a AAA Ee dee Eer 28 114055 002 K5361 EFG SGA 13 10 06 p 2 28 FRANGAIS rs 12 Resume et explication sise 12 Principes de la proc dure si isssssssiieiieeeeeeessssseeeeeeeeeeennesse 1
17. Permanent Red Arbeitsl sung nu en 23 A 3 Richtlinie f r die optimale Verd nnung prim rer Antik rper ssssssssssssennerrrrerreeesreesrrrrrrnne 23 B Manuelles F rbeverfahren sise 24 B 1 Hinwelse zum Verfahren nee 24 B 2 Fa rbep rotokoll eira a As 24 C F rbeverfahren f r Dako Autostainer Ger te AEN 25 Auswertung der Ergebnisse ee As 27 Literalt r O e Deeg 27 Erl uterung der Symbol ss ns elle 28 114055 002 K5361 EFG SGA 13 10 06 p 4 28 ENGLISH Intended Use For in vitro diagnostic use EnVision G 2 Doublestain System is intended for use in immunohistochemistry with Dako primary mouse and rabbit antibodies for the detection of antigens in formalin fixed paraffin embedded tissues or fixed cell smears This visualization system is designed for the simultaneous detection of two different antigens within one specimen The system may be used in manual procedures or with Dako Autostainer instruments Interpretation of results must be made within the context of the patient s clinical history and other diagnostic tests by a qualified pathologist Summary and Explanation EnVision G 2 Doublestain System is a 2nd generation EnVision visualization kit This system is useful for the simultaneous detection of two antigens present in low concentrations within one specimen The visualization is based on peroxidase HRP using DAB as chromogen and alkaline phosphatase AP using Permanent Red as
18. Table 1 below for name 114055 002 K5361 EFG SGA 13 10 06 p 10 28 template step and incubation time and to Operator s Manual for the dedicated Autostainer Instrument Table 1 Necessary additions to the reagent list Reagent Code Template Step Incubation Time Dual Endogenous Enzyme Block K5361 End Enz Block 5 minutes Primary antibodies not already in the Autostainer list Individual Primary Antibody 10 minutes Polymer HRP K5361 Secondary Reagent 10 minutes DAB Working Solution K5361 Substrate 10 minutes Doublestain Block K5361 Auxiliary 3 minutes Primary antibodies not already in the Autostainer list Individual Primary Antibody 10 minutes Rabbit Mouse LINK K5361 Secondary Reagent 10 minutes Polymer AP K5361 Tertiary Reagent 10 minutes Permanent Red Working Solution K5361 Substrate Batch 10 minutes Step 2 Staining protocol Load the Template K5361 for EnVision G 2 Doublestain System kit into the PROGRAM STAINING RUN SCREEN Specify the number of slides in the run and load the reagents with incubation times into the template The positioning of the slides will then be shown in the Slide Layout Map Screen and the positioning and volume of the reagent to be loaded on the Autostainer Instrument will be shown in the Reagent Layout Map Screen Please also refer to the Operator s Manual Prior to loading the slides according to the Slides Layout Map Screen it is recommended to pr
19. ako Autostainer Ger t optional Dako Prim re Antik rper und Negativkontrollen Destilliertes oder entionisiertes Wasser Epitope Retrieval Solution Ethanol 95 und 70 Feuchtigkeitskammer optional 114055 002 K5361 EFG SGA 13 10 06 p 21 28 Lichtmikroskop 20 fache bis 800 fache Vergr erung Fixiermittel wie Dako Glycergel Mounting Medium Code Nr C0563 oder Dako Faramount Aqueous Mounting Medium Ready to Use Code Nr S3025 bzw Non Aqueous Permanent Mounting Medium Dako Code Nr S3026 Positive und negative Kontrollgewebe zur Verfahrenskontrolle Objekttrager SuperFrost Plus Poly L Lysin beschichtet oder Dako Silanized Slides Code Nr S3003 Farbeschalen oder Bader Zeitmesser muss Intervalle von 2 40 Minuten anzeigen k nnen Waschflaschen Wash Buffer Dako Code Nr S3006 Wasserbad mit Deckel Xylol Toluol oder Xylolersatz Vorsichtsma nahmen 1 Nur f r Fachpersonal bestimmt 2 Fl schchen 2 Polymer HRP Fl schchen 6 Kaninchen Maus LINK und Fl schchen 7 Polymer AP enthalten Material tierischen Ursprungs Wie alle Produkte biologischen Ursprungs m ssen auch diese entsprechend gehandhabt werden 3 Fl schchen 3 DAB Chromogen oder Fl schchen 9 Permanent Red Chromogen oder die angesetzte DAB Arbeitsl sung oder Permanent Red Arbeitsl sung keinem starken Lichteinfall aussetzen 4 Fl schchen 4 DAB Chromogen enth lt 1 5 3 3 Diaminobenzidin Tetrahydrochlorid Biphenyl 3 3 4 4
20. alische Phosphatase Peroxidase und Pseudoperoxidase Aktivit t Nach der Blockierung endogener Enzyme ist der erste Schritt die Inkubation der Probe mit einem optimal verd nnten prim ren Maus oder Kaninchen Antik rper gefolgt von der Inkubation mit dem Polymer HRP Reagenz Dieses Reagenz ist ein HRP konjugiertes Dextranpolymer das auch Antik rper gegen Kaninchen bzw Maus Immunglobuline enth lt Die Reaktion wird durch DAB Chromogen visualisiert Nach einem Blockierungsschritt mit dem Doublestain Block Reagenz wird die Probe mit einem zweiten optimal verd nnten prim ren Maus oder Kaninchen Antik rper inkubiert Im n chsten Schritt wird Rabbit Mouse LINK hinzugegeben ein Dextranpolymer das Antik rper gegen Maus und Kaninchen Immunglobuline tr gt gefolgt von der Inkubation mit dem Polymer AP Reagenz Permanent Red Chromogen visualisiert die zweite Reaktion Alle angegebenen Reagenzien au er den prim ren Antik rpern sind im Kit enthalten Reagenzien Mitgelieferte Reagenzien Die unten aufgef hrten Materialien sind ausreichend f r 150 Tests Die Anzahl der Tests basiert auf einer Reagenzienmenge von je 200 uL pro Test Fl schchen 1 3x 11 mL Dual Endogenous Enzyme Block Gebrauchsfertig Endogene Enzym Blockierungsl sung enth lt 0 5 Wasserstoff peroxid Tenside Enzymhemmer und Konservierungsmittel pH 2 114055 002 K5361 EFG SGA 13 10 06 p 20 28 Fl schchen 2 3x11mL Polymer HRP Gebrauchsfertig Mit
21. auf einem Mikroskop Objekttrager fixiert Die Schnitte sind auf den Objekttragern so flach und faltenfrei wie m glich zu fixieren Zu viele Falten wirken sich negativ auf die F rbungsergebnisse aus HINWEIS F r den Einsatz in Dako Autostainern d rfen die Objekttr ger nicht breiter als 26 mm sein damit sie in die Objekttr ger Halterung passen Paraffineingebettete Schnitte sollten aus einem vorgew rmten Wasserbad destilliertes oder entionisiertes Wasser heraus fixiert werden Dieses Wasserbad darf keine Additive enthalten wie z B Gelatine Poly L Lysin usw Die Schnitte werden mindestens 60 Minuten lang z B ber Nacht durch W rme getrocknet gew hnlich bei einer Temperatur von h chstens 60 C Damit die Schnitte gut auf den Objekttr gern haften muss vor dem Trockenprozess im Ofen alles Wasser unter den Schnitten entfernt worden sein Verfahren A Reagenzvorbereitung A 1 DAB Arbeitsl sung DAB Arbeitsl sung wird durch gr ndliches Vermischen von 1 mL DAB Substratpuffer Fl schchen 3 mit 1 Tropfen 25 30 uL DAB Chromogen Fl schchen 4 zubereitet Jeweils 1 mL Aliquot ist ausreichend f r 10 Gewebeschnitte Nur soviel ansetzen wie f r die zu f rbenden Objekttr ger erforderlich ist Zubereitete DAB Arbeitsl sung ist bei Lagerung bei 2 8 C etwa 5 Tage stabil Diese L sung vor Gebrauch gr ndlich durchmischen Die Qualit t der F rbung wird durch ein innerhalb von 5 Tagen in der L sung auftretendes Pr zi
22. chromogen The system is biotin free thus significantly reducing non specific staining resulting from endogenous avidin biotin activity Refer to Dako s General Instructions for Immunohistochemical Staining or the detection system instructions of IHC procedures for 1 Principle of Procedure 2 Materials Required Not Supplied 3 Storage 4 Specimen Preparation 5 Staining Procedure 6 Quality Control 7 Troubleshooting 8 Interpretation of Staining 9 General Limitations Principles of Procedure The procedure is a sequential double staining where the first antigen is visualized using HRP DAB and the second antigen is visualized using AP Permanent Red Dual Endogenous Enzyme Block inhibits endogenous alkaline phosphatase peroxidase and pseudoperoxidase activity present in some tissues After blocking of endogenous enzymes the first step is incubation of the specimen with an optimally diluted primary mouse or rabbit antibody followed by incubation with the Polymer HRP reagent This reagent is an HRP conjugated dextran polymer that also carries antibodies to mouse and rabbit immunoglobulins The reaction is visualized by DAB Chromogen Following a blocking step using the Doublestain Block reagent the specimen is incubated with a second optimally diluted primary mouse or rabbit antibody In the next step Rabbit Mouse LINK is added a dextran polymer carrying antibodies to mouse and rabbit immunoglobulins followed by incubation with the
23. de r v lation a t con u pour la d tection simultan e de deux antig nes diff rents sur un chantillon unique Le syst me peut tre utilis dans le cadre de proc dures manuelles ou avec les instruments Dako Autostainer L interpr tation des r sultats doit tre r alis e par un professionnel certifi et tenir compte des ant c dents cliniques du patient et des autres examens diagnostiques R sum et explication Le systeme EnVision G 2 Doublestain est un kit de r v lation EnVision de 2 g n ration Ce syst me est utile pour la d tection simultan e de deux antig nes pr sents de faibles concentrations dans un seul chantillon La r v lation est bas e sur la peroxydase HRP l aide de DAB comme chromog ne et de phosphatase alcaline AP l aide de Permanent Red comme chromog ne Le syst me n emploie pas de biotine ce qui permet de r duire de fa on significative la coloration non sp cifique provenant de l activit avidine biotine endog ne Voir les Instructions g n rales de coloration immunohistochimique Dako ou les instructions du syst me de d tection concernant les proc dures IHC pour 1 Principe de la proc dure 2 Mat riels requis mais non fournis 3 Conservation 4 Pr paration de l chantillon 5 Proc dure de coloration 6 Contr le de qualit 7 R solution des probl mes 8 Interpr tation de la coloration 9 Limites g n rales Principes de la proc dure
24. e wet the slides for 5 minutes in Dako Wash Buffer code S3006 Position the vials in the reagent rack according to the Reagent Layout Map Take care to load proper reagents and proper volumes Pay particular attention to the loading of the vials with primary antibodies Prime the water and buffer pumps Start the program After program end rinse slides in distilled or deionised water For counterstain and mounting please refer to Step 10 and 11 in section B 2 Interpretation of Results The antigen recognized by primary antibody No 1 is stained with DAB chromogen Use of DAB chromogen yields a brown coloured end product The antigen recognized by primary antibody No 2 is stained with Permanent Red chromogen Use of Permanent Red chromogen yields a red coloured end product Both colours allow for visualization against a hematoxylin counterstain If non specific staining is present this will be recognized as a diffuse brown or red staining on the slides treated with the negative control reagent Nuclei will be stained blue by the hematoxylin counterstain 114055 002 K5361 EFG SGA 13 10 06 p 11 28 FRANCAIS Int r t Pour diagnostic in vitro Le syst me EnVision M G 2 Doublestain est destin une utilisation en immunohistochimie avec les anticorps primaires de souris et de lapin Dako dans le cadre de la d tection des antig nes dans les tissus fix s au formol inclus en paraffine ou les frottis cellulaires fix s Ce syst me
25. einem Sonderm llbeh lter auffangen und entsprechend entsorgen Objekttr ger 5 Minuten in einem frischen Bad mit destilliertem oder entionisiertem Wasser sp len Schritt 10 Gegenf rbung Anweisungen f r H matoxylin Objekttr ger in ein H matoxylin Bad eintauchen Die Inkubationsdauer richtet sich nach der St rke der verwendeten H matoxylinl sung Nach der H matoxylin Gegenf rbung gr ndlich in destilliertem oder entionisiertem Wasser sp len Optional Die Objekttr ger mit den Gewebeschnitten in ein Bad mit 37 mmol L Ammoniakwasser einlegen und 2 5 Minuten vorsichtig mit destilliertem oder entionisiertem Wasser sp len Ammoniakwasser 37 mmol L wird durch Mischen von 2 5 0 5 mL konzentriertem 15 mol L Ammoniumhydroxid mit 1 Liter destilliertem oder entionisiertem Wasser zubereitet Nicht verwendetes 37 mmol L Ammoniakwasser kann bei Raumtemperatur 20 25 C in einer gut verschlossenen Flasche bis zu 12 Monate aufbewahrt werden Schritt 11 Fixierung Zur Fixierung im w ssrigen Medium werden Fixiermittel wie Dako Glycergel Mounting Medium Code Nr C0563 oder Faramount Aqueous Mounting Medium Code Nr S3025 empfohlen Zur permanenten Fixierung im nicht w ssrigen Medium wird Dako Permanent Mounting Media Code Nr S3026 empfohlen nachdem die Objekttr ger an der Luft vollst ndig getrocknet sind C F rbeverfahren f r Dako Autostainer Ger te Alle Reagenzien des Kits mit Ausnahme von Fl schchen 4 und 9 werden i
26. en verwenden Dabei insbesondere bei der Beladung der Fl schchen mit prim ren Antik rpern u erst sorgf ltig vorgehen Die Wasser und Pufferpumpen vorf llen Das Programm starten Nach Beendigung des Programms die Objekttr ger mit destilliertem oder entionisiertem Wasser sp len Angaben zu Gegenf rbung und Fixierung bitte den Schritten 10 und 11 in Abschnitt B 2 entnehmen Auswertung der Ergebnisse Das vom prim ren Antik rper Nr 1 erkannte Antigen wird mit DAB Chromogen angefarbt Die Verwendung von DAB Chromogen ergibt ein braun gef rbtes Endprodukt Das vom prim ren Antik rper Nr 2 erkannte Antigen wird mit Permanent Red Chromogen angef rbt Die Verwendung von Permanent Red Chromogen ergibt ein rot gef rbtes Endprodukt Beide Farben erm glichen eine Visualisierung gegen eine H matoxylin Gegenf rbung Das Vorliegen einer unspezifischen F rbung stellt sich als diffuse braune oder rote F rbung der mit der Negativkontrolle behandelten Objekttr ger dar Zellkerne werden durch die H matoxylin Gegenf rbung blau gef rbt Reference R f rence Literatur 1 Sheehan DC Hrapchak BB Theory and practice of histotechnology St Louis CV Mosby Company 1980 114055 002 K5361 EFG SGA 13 10 06 p 27 28 Explanation of symbols Explication des symboles Erlauterung der Symbole Catalogue number Temperature limitation Use by Toxic Br 8 C Limites de temp rature P REF Reference du catalogue Utilis
27. er avant Toxique 2 C Zul ssiger T Zi Bestellnummer p Verwendbar bis Giftig Temperaturbereich A A Contains sufficient for lt n gt In vitro diagnostic medical S tests device Manufacturer IVD Dispositif m dical de diagnostic Vi Si suffisant pour lt n gt sel Fabricant in vitro S A S Inhalt ausreichend f r lt n gt Hersteller In vitro Diagnostikum Tests Consult instructions for use Consulter les instructions Batch code Harmful Chi d utilisation LOT Code du lot x Nocif Gebrauchsanweisung beachten Chargenbezeichnung b Gesundheitssch dlich Produced by Produit par Hersteller Dako Denmark A S Produktionsvej 42 DK 2600 Glostrup Denmark Danemark D nemark Tel 45 44 85 95 00 Fax 45 44 85 95 95 114055 002 K5361 EFG SGA 13 10 06 p 28 28
28. erte Angaben zur Probenvorbereitung bitte der Packungsbeilage des jeweiligen primaren Antikorpers entnehmen Nach der Demaskierung die Probe mit Waschpufferl sung aus einer Waschflasche Strahl nicht direkt auf das Gewebe richten vorsichtig spulen und 5 Minuten in ein frisches Waschpufferbad legen Vor Beginn der Immunf rbung alle Reagenzien auf Raumtemperatur 20 25 C bringen Alle Inkubationen ebenfalls bei Raumtemperatur durchf hren Proben d rfen w hrend der F rbung nicht austrocknen Trockene Proben k nnen unspezifische F rbungen aufweisen B 2 F rbeprotokoll Schritt 1 Fl schchen 1 Dual Endogenous Enzyme Block bersch ssigen Waschpuffer durch Abklopfen entfernen und den Bereich um die Probe herum vorsichtig abtupfen um Fl ssigkeitsreste zu entfernen und das Reagenz an der vorgesehenen Stelle zu halten 200 uL Dual Endogenous Enzyme Block auftragen um Probe zu bedecken 5 1 Minuten inkubieren Mit Pufferl sung aus einer Waschflasche Strahl nicht direkt auf das Gewebe richten vorsichtig sp len und 5 Minuten in ein frisches Pufferbad legen Schritt 2 Prim rer Antik rper Nr 1 oder Negativ Kontrollreagenz Nr 1 bersch ssigen Waschpuffer abklopfen und Objekttrager wie zuvor abwischen 200 uL prim ren Maus oder Kaninchen Antik rper oder Negativkontrolle zugeben siehe Abschnitt A 3 um die Probe zu bedecken 10 1 Minuten inkubieren Probe wie unter Schritt 1 beschrieben sp len Schritt 3 Fl schchen
29. es Rinse specimen as described in Step 1 twice Step 9 Permanent Red Working Solution Prepare Permanent Red Working Solution as described in section A 2 Prepared Permanent Red Working Solution should be used within 30 minutes Tap off excess buffer and wipe slides as before Apply 200 uL Permanent Red Working Solution to cover the specimen Incubate for 5 20 minutes Optimal incubation time may vary and should be determined by each individual laboratory Rinse slides gently with distilled or deionised water from a wash bottle do not focus directly on specimen Collect chromogen containing waste in a hazardous materials container for proper disposal Place rinsed slides in a fresh distilled or deionised water bath for 5 minutes Step 10 Counterstain instructions are for hematoxylin Immerse slides in a bath of hematoxylin Length of incubation time depends on the strength of hematoxylin used Follow hematoxylin counterstaining with a thorough rinse in distilled or deionised water Optional Immerse tissue slides into a bath of 37 mmol L ammonia water and rinse gently in distilled or deionised water for 2 5 minutes Ammonia water 37 mmol L is prepared by mixing 2 5 mL of 15 mol L concentrated ammonia hydroxide with 1 liter of distilled or deionised water Unused 37 mmol L ammonia water may be stored at room temperature 20 25 C in a tightly capped bottle for up to 12 months Step 11 Mounting For aqueous mounting mounting media suc
30. fety Data Sheet MSDS for additional information 5 This product contains sodium azide NaN a chemical highly toxic in pure form At product concentrations though not classified as hazardous sodium azide may react with lead and copper plumbing to form highly explosive build ups of metal azides Upon disposal flush with large volumes of water to prevent metal azide build up in plumbing 6 Wear appropriate Personal Protective Equipment to avoid contact with eyes and skin 7 Unused solution should be disposed of according to local State and Federal regulations Storage Store the kit at 2 8 C Do not use after expiration date stamped on the kit Do not interchange kit components from different lots If reagents are stored under any conditions other than those specified the conditions must be verified by the user If unexpected staining is observed which cannot be explained by variations in laboratory procedures and a problem with the product is suspected contact our Technical Services Specimen Preparation The kit can be used for formalin fixed paraffin embedded tissue sections and fixed cell smears A variety of fixatives may be used for specimen preservation Standard methods for tissue processing 114055 002 K5361 EFG SGA 13 10 06 p 7 28 for immunohistochemical staining should be used for all tissue sections 1 The optimal thickness of formalin fixed paraffin embedded tissue sections and frozen sections is 4 6 um The speci
31. h as Dako Glycergel Mounting Medium code C0563 or Faramount Aqueous Mounting Medium code 3025 is recommended 114055 002 K5361 EFG SGA 13 10 06 p 9 28 For non aqueous permanent mounting Dako Permanent Mounting Media code S3026 is recommended after slides have been left to air dry completely C Staining procedure for Dako Autostainer instruments All reagents in the kit except Vial 4 and Vial 9 are provided in Autostainer Reagent Vials DAB Working Solution and Permanent Red Working Solution should both be prepared in Autostainer Reagent Vials when used on the Dako Autostainer Instrument EnVision G 2 Doublestain System has been adapted for use on the Dako Autostainer instruments according to the template outlined below Before staining according to the template on the Dako Autostainer Instruments carefully read the Operators Manual for the dedicated Autostainer Instrument Prior to starting the Autostainer Instrument slides and reagents must be placed according to the Slide Layout Map and the Reagent Layout Map The following pre treatment steps should be carried out before using EnVision G 2 Doublestain System on formalin fixed paraffin embedded tissue sections The specimen should be deparaffinized and rehydrated Some specimens should be subjected to epitope demasking by heat induced epitope retrieval or enzyme digestion Please refer to section A 3 and the package insert of the individual Dako primary antibody for s
32. iante 20 25 C sans que cela affecte les r sultats de la coloration tape 5 Flacon 5 Blocage Doublestain liminer le tampon de lavage en exc s en tapotant et essuyer les lames comme pr c demment Appliquer 200 ul de la solution de blocage Doublestain pour recouvrir l chantillon Laisser incuber 3 1 minutes Rincer l chantillon comme indiqu l tape 1 tape 6 Anticorps primaire n 2 ou r actif de contr le n gatif n 2 liminer le tampon de lavage en exc s en tapotant et essuyer les lames comme pr c demment Appliquer 200 ul de la solution d anticorps primaire de lapin ou de souris ou bien de r actif de contr le n gatif voir section A 3 pour recouvrir l chantillon Laisser incuber 10 1 minutes Rincer l chantillon comme indiqu l tape 1 114055 002 K5361 EFG SGA 13 10 06 p 16 28 Etape 7 Flacon 6 Lapin Souris LINK Eliminer le tampon de lavage en exc s en tapotant et essuyer les lames comme pr c demment Appliquer 200 ul de la solution Lapin Souris LINK pour recouvrir l chantillon Laisser incuber 10 1 minutes Rincer l chantillon comme indiqu l tape 1 deux fois Etape 8 Flacon 7 Polym re AP Eliminer le tampon de lavage en exc s en tapotant et essuyer les lames comme pr c demment Appliquer 200 ul de la solution Polymere AP pour recouvrir l chantillon Laisser incuber 10 1 minutes Rincer l chantillon comme indiqu l tape 1 deux fois
33. iels qui figurent dans la liste ci dessous permettent de r aliser 150 tests Le nombre de tests est bas sur l utilisation de 200 ul de r actif par test 114055 002 K5361 EFG SGA 13 10 06 p 12 28 Flacon 1 Flacon 2 Flacon 3 Flacon 4 Flacon 5 Flacon 6 Flacon 7 Flacon 8 Flacon 9 3x11ml 3x11ml 3x11ml 1x1 5 ml 3x11ml 3x11ml 3x11ml 3x11ml 1 x 300 pl Blocage des deux enzymes endog nes Pr t l emploi Solution de blocage des enzymes endog nes contenant 0 5 de peroxyde d hydrog ne des d tergents des inhibiteurs enzymatiques et un conservateur pH 2 Polym re HRP Pr t l emploi Polym re de dextran conjugu de la peroxydase de raifort et immunoglobulines isol es par affinit Fourni dans un tampon Tris HCI contenant une prot ine de stabilisation et un conservateur DAB SUBSTRATE BUFFER Tampon substrat DAB Solution de tampon substrat pH 7 5 contenant du peroxyde d hydrog ne lt 0 1 des stabilisants des activateurs et un agent antimicrobien Chromog ne DAB Solution chromog ne de t trahydrochlorure de 3 3 diaminobenzidine 5 Blocage Doublestain Pr t l emploi Solution de blocage Lapin Souris LINK Pr t l emploi Polym re de dextran coupl aux anticorps secondaires dirig s contre les immunoglobulines de souris et de lapin En solution tamponn e contenant une prot ine de stabilisation et un conservateur Polym re
34. ived from biological sources proper handling should be used 3 Do not expose Vial 3 DAB Chromogen or Vial 9 Permanent Red Chromogen or the prepared DAB Working Solution or Permanent Red Working Solution to strong light 4 Vial 4 DAB Chromogen contains 1 5 3 3 diaminobenzidine tetrahydrochloride biphenyl 3 3 4 4 tetrayltetraammonium tetrachloride and is labelled Harmful R40 Limited evidence of a carcinogenic effect R43 May cause sensitisation by skin contact R68 Possible risk of irreversible effects S35 This material and its container must be disposed of in a safe way S36 37 Wear suitable protective clothing and gloves Vial 9 Permanent Red Chromogen contains Fast Red KL salt and is labelled Toxic R45 May cause cancer S35 This material and its container must be disposed of in a safe way S45 In case of accident or if you feel unwell seek medical advice immediately show label where possible 53 Avoid exposure obtain special instructions before use Caution This product contains a substance which has not yet been fully tested The classification has been made solely on the basis of a comparison with substances with a similar structure As a main rule persons under 18 years of age are not allowed to work with this product Users must be carefully instructed in the proper working procedure the dangerous properties of the product and the necessary safety instructions Please refer to the Material Sa
35. klopfen und Objekttrager wie zuvor abwischen 200 uL optimal verd nnten prim ren Maus oder Kaninchen Antik rper oder Negativkontrolle zugeben siehe Abschnitt A 3 um die Probe zu bedecken 10 1 Minuten inkubieren Probe wie unter Schritt 1 beschrieben sp len 114055 002 K5361 EFG SGA 13 10 06 p 24 28 Schritt 7 Flaschchen 6 Kaninchen Maus LINK Ubersch ssigen Waschpuffer abklopfen und Objekttr ger wie zuvor abwischen 200 uL Kaninchen Maus LINK zugeben um die Probe zu bedecken 10 1 Minuten inkubieren Probe zweimal wie unter Schritt 1 beschrieben sp len Schritt 8 Flaschchen 7 Polymer AP bersch ssigen Waschpuffer abklopfen und Objekttrager wie zuvor abwischen Die Probe mit 200 uL Polymer AP bedecken 10 1 Minuten inkubieren Probe zweimal wie unter Schritt 1 beschrieben sp len Schritt 9 Permanent Red Arbeitsl sung Permanent Red Arbeitsl sung wie in Abschnitt A 2 beschrieben zubereiten Zubereitete Permanent Red Arbeitsl sung innerhalb von 30 Minuten verwenden bersch ssigen Puffer abklopfen und Objekttrager wie zuvor abwischen Die Probe mit 200 uL Permanent Red Arbeitsl sung bedecken 5 20 Minuten inkubieren Die optimale Inkubationszeit kann unterschiedlich sein und sollte vom jeweiligen Labor selbst ermittelt werden Objekttr ger mit destilliertem oder entionisiertem Wasser aus einer Waschflasche Strahl nicht direkt auf das Gewebe richten vorsichtig sp len Chromogenhaltige Abfallprodukte in
36. lames et les r actifs doivent tre positionn s selon le Plan de disposition des lames et le Plan de disposition des r actifs Les tapes de pr traitement suivantes doivent tre mises en uvre avant d utiliser le syst me EnVision G 2 Doublestain sur les coupes de tissus fix es au formol et incluses en paraffine L chantillon doit tre d paraffin et r hydrat Certains chantillons doivent faire l objet d un d masquage de l pitope par restauration de l pitope par la chaleur ou digestion enzymatique Pour des informations sp cifiques sur la pr paration de l chantillon veuillez vous r f rer la section A 3 et la notice de l anticorps primaire individuel Dako Apr s le d masquage l chantillon doit tre d licatement rinc l aide d une solution tampon de lavage provenant d une pissette ne pas diriger le jet directement vers les tissus et plac dans un bain de solution tampon de lavage fra che pendant 5 minutes Tous les r actifs doivent tre quilibr s temp rature ambiante 20 25 C avant la coloration immunologique De m me toutes les incubations doivent se d rouler temp rature ambiante Ne pas laisser s cher les chantillons pendant la proc dure de coloration Les chantillons dess ch s peuvent pr senter une coloration non sp cifique accrue tape 1 Programmation de l instrument Autostainer Avant la premi re utilisation du systeme EnVision G 2 Doublestain avec
37. le demasquage l chantillon doit tre d licatement rinc l aide d une solution tampon de lavage provenant d un flacon pissette ne pas diriger le jet directement vers les tissus et plac dans un bain de solution tampon de lavage fra che pendant 5 minutes Tous les r actifs doivent tre quilibr s temp rature ambiante 20 25 C avant la coloration immunologique De m me toutes les incubations doivent se d rouler temp rature ambiante Ne pas laisser s cher les chantillons pendant la proc dure de coloration Les chantillons dess ch s peuvent pr senter une coloration non sp cifique accrue B 2 Protocole de coloration tape 1 Flacon 1 Blocage des deux enzymes endog nes liminer le tampon de lavage en exc s en tapotant et essuyer soigneusement le contour de l chantillon pour liminer tout le liquide restant et maintenir le r actif l int rieur de la zone sp cifi e Appliquer 200 ul de la solution de blocage des deux enzymes endog nes pour recouvrir l chantillon Laisser incuber 5 1 minutes Rincer doucement les lames l aide d une solution tampon de lavage provenant d une pissette ne pas diriger le jet directement vers les tissus et les placer dans un bain de solution tampon de lavage fra che pendant 5 minutes tape 2 Anticorps primaire n 1 ou r actif de contr le n gatif n 1 liminer le tampon de lavage en exc s en tapotant et essuyer les lames comme pr c demment A
38. ls bei Raumtemperatur durchf hren Proben d rfen w hrend der F rbung nicht austrocknen Trockene Proben k nnen unspezifische F rbungen aufweisen Schritt 1 Programmierung des Autostainers Vor der erstmaligen Verwendung des EnVision G 2 Doublestain Systems auf dem Autostainer Ger t ist eine neue Matrix ein neues Schema zu erstellen Bitte f r den jeweiligen Autostainer die Matrix unten und das Benutzerhandbuch beachten Matrix K5361 Rinse Buffer End Enz Block Rinse Buffer Primary Antibody Rinse Buffer Secondary Reagent Rinse Buffer Rinse Buffer Switch 8 10 Substrate 11 Rinse Water 12 Swtchf 13 Auxiliary 14 Rinse Buffer 15 Primary Antibody 16 Rinse Buffer 17 Secondary Reagent 18 Rinse tl LD 0 AA LA P sch 19 Rinse Buffer 20 Tertiary Reagent 21 Rinse Bute 22 Rinse Buffer 23 Swtch 24 Substrate Batch 25 Rinse Water 26 Swtchf HINWEIS Vor dem Beladen mit Objekttragern gem dem BILDSCHIRM FARBEDURCHLAUF PROGRAMMIEREN m ssen folgende Reagenzien zur Reagenzienliste hinzugef gt werden Bitte Bezeichnung Matrixschritt und Inkubationszeit der Tabelle 1 und dem Benutzerhandbuch des jeweiligen Autostainers entnehmen 114055 002 K5361 EFG SGA 13 10 06 p 26 28 Tabelle 1 Notwendige Erganzungen der Reagenzienliste Reagenz Code Nr Matrix Schritt Inkubations zeit Dual Endogenous Enzyme Block K536
39. men should be mounted on microscope slides The sections should be mounted on the slides as flat and wrinkle free as possible Too many wrinkles will have an impact on the staining results NOTE For use on Dako Autostainer instruments the microscope slides must have a width of no more than 26 mm to be able to fit into the slide holder Paraffin sections should be mounted from a pre heated water bath containing distilled or deionised water The water bath should contain no additives such as gelatine poly L lysine etc Sections should be dried by heating generally at a temperature lt 60 C for a minimum of 60 minutes e g overnight To ensure proper adherence of sections to slides it is important to drain the water from beneath the sections prior to the oven drying process Procedure A Reagent preparation A 1 DAB Working Solution DAB Working Solution is prepared by thoroughly mixing 1 mL of DAB Substrate Buffer Vial 3 with 1 drop 25 30 uL of DAB Chromogen Vial 4 Each 1 mL aliquot is sufficient for 10 tissue sections Prepare only the volume required for the number of slides that shall be stained Prepared DAB Working Solution is stable for approximately 5 days when stored at 2 8 C This solution should be mixed thoroughly prior to use Any precipitate developing within 5 days in the solution does not affect staining quality DAB Working Solution should be prepared in an Autostainer Reagent Vial when used on the Dako Auto
40. n Autostainer Reagenzfl schchen geliefert DAB und Permanent Red Arbeitsl sung in Autostainer Reagenzfl schchen zubereiten wenn sie auf einem Dako Autostainer Ger t verwendet werden EnVision G 2 Doublestain System wurde wie aus der untenstehenden Matrix ersichtlich f r die Verwendung auf den Dako Autostainer Ger ten optimiert Das Bedienerhandbuch des betreffenden Autostainer Ger ts vor F rbungen mit Dako Autostainern gem dem Schema gr ndlich lesen Objekttr ger und Reagenzien m ssen vor der Verwendung des Autostainers gem dem Objekttr ger Positionierungsschema und dem Reagenz Positionierungsschema eingesetzt werden Folgende Vorbehandlungsschritte vor Anwendung des EnVision G 2 Doublestain System auf formalinfixierten paraffineingebetteten Gewebeschnitte durchf hren Die Probe entparaffinieren und rehydrieren Einige Proben bed rfen einer Epitopdemaskierung durch hitzeinduzierte Epitopdemaskierung oder enzymatische Andauung Detaillierte Angaben zur Probenvorbereitung bitte Abschnitt A 3 und der Packungsbeilage des jeweiligen prim ren Antik rpers von Dako entnehmen Nach der Demaskierung die Probe mit Waschpufferl sung aus einer Waschflasche Strahl nicht direkt auf das Gewebe richten vorsichtig sp len und 5 Minuten in ein frisches Waschpufferbad legen 114055 002 K5361 EFG SGA 13 10 06 p 25 28 Vor Beginn der Immunf rbung alle Reagenzien auf Raumtemperatur 20 25 C bringen Alle Inkubationen ebenfal
41. ng Solution to cover specimen Incubate for 5 15 minutes Optimal incubation time may vary and should be determined by each individual laboratory Rinse specimen gently with distilled or deionised water from a wash bottle do not focus directly on tissue Collect DAB Working Solution waste in a hazardous materials container for proper disposal If the staining procedure must be interrupted slides may be kept in a wash buffer bath following incubation of DAB Working Solution for up to one hour at room temperature 20 25 C without affecting staining result Step 5 Vial 5 Doublestain Block Tap off excess wash buffer and wipe slides as before Apply 200 uL Doublestain Block to cover specimen Incubate for 3 1 minutes Rinse specimen as described in Step 1 Step 6 Primary antibody No 2 or negative control reagent No 2 Tap off excess wash buffer and wipe slides as before Apply 200 uL optimally diluted mouse or rabbit primary antibody or negative control reagent see section A 3 to cover specimen Incubate for 10 1 minutes Rinse specimen as described in Step 1 Step 7 Vial 6 Rabbit Mouse LINK Tap off excess wash buffer and wipe slides as before Apply 200 uL Rabbit Mouse LINK to cover the specimen Incubate for 10 1 minutes Rinse specimen as described in Step 1 twice Step 8 Vial 7 Polymer AP Tap off excess wash buffer and wipe slides as before Apply 200 uL Polymer AP to cover the specimen Incubate for 10 1 minut
42. ns Supplied in Tris HCI buffer containing stabilizing protein and a preservative Vial 8 3x 11 mL Permanent Red Substrate Buffer Substrate buffer solution Vial 9 1x300 pL Permanent Red Chromogen Permanent Red Chromogen solution Materials required but not provided Absorbent wipes Ammonia water 37 mmol L optional Antibody Diluent Dako code S0809 or S2022 Counterstain Hematoxylin such as water based Dako Mayer s Hematoxylin code S3309 Coverslips Dako Autostainer instrument optional Dako primary antibodies and negative control reagents Distilled or deionised water Epitope Retrieval Solution Ethanol 95 and 70 Humid chamber optional Light microscope 20 800x objective magnification Mounting media such as Dako Glycergel Mounting Medium code C0563 or Dako Faramount Aqueous Mounting Medium Ready to Use code 3025 or non aqueous permanent mounting medium Dako code S3026 Positive and negative tissues to use as process controls Slides SuperFrost Plus poly L lysine coated slides or Dako Silanized Slides code S3003 114055 002 K5361 EFG SGA 13 10 06 p 6 28 Staining jars or baths Timer capable of 2 40 minute intervals Wash bottles Wash Buffer Dako code S3006 Water bath with lid Xylene toluene or xylene substitutes Precautions 1 For professional users 2 Vial 2 Polymer HRP Vial 6 Rabbit Mouse LINK and Vial 7 Polymer AP contain material of animal origin As with any product der
43. ode Dako 3006 Bain marie avec couvercle Xylene tolu ne ou substituts de xyl ne Pr cautions 1 Pour utilisateurs professionnels 2 Le flacon 2 Polymere HRP le flacon 6 Lapin Souris LINK et le flacon 7 Polym re AP contiennent des mati res d origine animale Comme pour tout produit provenant d une source biologique une manipulation appropri e s impose 3 Ne pas exposer le flacon 3 Chromog ne DAB ou le flacon 9 Chromog ne Permanent Red ou les solutions de DAB ou de Permanent Red dos es une fois pr par es une forte lumi re 4 Le flacon 4 Chromog ne DAB contient 1 5 de t trahydrochlorure de 3 3 diaminobenzidine t trachlorure de biph nyl 3 3 4 4 t traylt traammonium et est tiquet Nocif R40 Effet canc rog ne suspect preuves insuffisantes R43 Peut entra ner une sensibilisation par contact avec la peau R68 Risque possible d effets irr versibles S35 Ce produit et son r cipient doivent tre limin s comme des d chets dangereux S36 37 Porter un v tement de protection et des gants appropri s Le flacon 9 Chromog ne Permanent Red contient des sels Fast Red KL et est tiquet Toxique R45 Peut provoquer un cancer S35 Ce produit et son r cipient doivent tre limin s comme des d chets dangereux S45 En cas d accident ou de malaise consulter imm diatement un m decin si possible lui montrer l tiquette S53 viter l exposition se procurer des inst
44. pecific information on specimen preparation Following demasking the specimen should be rinsed gently with wash buffer solution from a wash bottle do not focus directly on tissue and placed in a fresh wash buffer bath for 5 minutes All reagents should be equilibrated to room temperature 20 25 C prior to immunostaining Likewise all incubations should be performed at room temperature Do not allow specimens to dry out during the staining procedure Dried specimens may display increased non specific staining Step 1 Programming of the Autostainer Instrument Prior to the first application of EnVision G 2 Doublestain System on Dako Autostainer Instrument a new template has to be made Please refer to the template below and to Operators Manual for the dedicated Autostainer Instrument Template K5361 Rinse Butter End Enz Block Rinse Butter Primary Antibody Rinse Buffer Secondary Reagent Rinse Buffer Rinse Buffer Swtch 10 Substrate 11 Rinse Water 12 Swtch 13 Auxiliary 14 Rinse Buffer 15 Primary Antibody 16 Rinse Buffer 17 Secondary Reagent 18 Rinse Buffer 19 Rinse Buffer 20 Tertiary tert Conon P LA N sch 21 Rinse Buffer 22 Rinse Buffer 23 Swtch 24 Substrate Batch 25 Rinse Water 26 Swtch NOTE Before loading slides according to the PROGRAM STAINING RUN SCREEN the following reagents have to be added to the reagent list Please refer to
45. pitat nicht beeintr chtigt Ist die DAB Arbeitsl sung f r den Dako Autostainer vorgesehen diese in einem Reagenzglas des Autostainers ansetzen A 2 Permanent Red Arbeitsl sung Eine Permanent Red Chromogen Arbeitsl sung wird durch gr ndliches Mischen von 100 Teilen Permanent Red Substratpuffer Fl schchen 8 mit einem 1 Teil Permanent Red Chromogen Fl schchen 9 angesetzt z B durch Mischen von 1 mL Permanent Red Substratpuffer aus Fl schchen 8 mit 10 uL Permanent Red Chromogen Fl schchen 9 Nur soviel ansetzen wie f r die Anzahl der zu f rbenden Objekttrager erforderlich ist L sung innerhalb von 30 Minuten verbrauchen Ist die Permanent Red Arbeitsl sung f r den Dako Autostainer vorgesehen diese in einem Reagenzglas des Autostainers ansetzen A 3 Richtlinie f r die optimale Verd nnung prim rer Antik rper Das EnVision G 2 Doublestain System ist kompatibel mit Dako konzentrierten prim ren Antik rpern in geeigneter Verd nnung Optimale Verd nnungen sind vom Anwender selbst zu ermitteln 114055 002 K5361 EFG SGA 13 10 06 p 23 28 B Manuelles Farbeverfahren B 1 Hinweise zum Verfahren Folgende Vorbehandlungsschritte vor Anwendung des EnVision G 2 Doublestain Systems auf formalinfixierten paraffineingebetteten Gewebeschnitten durchf hren Die Probe entparaffinieren und rehydrieren Einige Proben bedurfen einer Epitopdemaskierung durch hitzeinduzierte Epitopdemaskierung oder enzymatische Andauung Detailli
46. ppliquer 200 ul de la solution d anticorps primaire de lapin ou de souris ou de r actif de contr le n gatif voir section A 3 pour recouvrir l chantillon Laisser incuber 10 1 minutes Rincer l chantillon comme indiqu l tape 1 tape 3 Flacon 2 Polym re HRP liminer le tampon de lavage en exc s en tapotant et essuyer les lames comme pr c demment Appliquer 200 ul de la solution Polym re HRP pour recouvrir l chantillon Laisser incuber 10 1 minutes Rincer l chantillon comme indiqu l tape 1 deux fois tape 4 Solution de DAB dos e Pr parer la solution de DAB dos e comme indiqu la section A 1 liminer le tampon de lavage en exc s en tapotant et essuyer les lames comme pr c demment Appliquer 200 ul de la solution de DAB dos e pour recouvrir l chantillon Laisser incuber pendant 5 15 minutes La dur e optimale de l incubation peut varier et doit tre d termin e par chaque laboratoire Rincer soigneusement avec de l eau distill e ou d sionis e provenant d une pissette ne pas diriger le jet directement vers les tissus Recueillir la solution de DAB dos e rejet e dans un r cipient pour mati res dangereuses afin de l liminer de fa on appropri e Si la proc dure de coloration doit tre interrompue les lames peuvent tre conserv es dans un bain de tampon de lavage apr s l incubation dans la solution de DAB dos e et ce jusqu une heure temp rature amb
47. raffine doivent tre mont es depuis un bain marie pr chauff contenant de l eau distill e ou d sionis e Le bain marie ne doit contenir aucun additif comme de la g latine de la poly L lysine etc Les coupes seront s ch es par chauffage g n ralement une temp rature ne d passant pas 60 C pendant 60 minutes au moins toute la nuit par exemple Afin que les coupes adh rent parfaitement aux lames il est important d vacuer toute l eau se trouvant sous les coupes avant le processus de s chage l tuve Proc dure A Pr paration des r actifs A 1 Solution de DAB dos e La solution DAB dos e est pr par e en m langeant soigneusement 1 ml de tampon substrat DAB flacon 3 avec 1 goutte 25 30 ul de chromog ne DAB flacon 4 Chaque aliquote de 1 ml est suffisante pour 10 coupes de tissu Pr parer uniquement le volume n cessaire pour traiter le nombre de lames a colorer Une fois pr par e la solution DAB dos e est stable pendant environ 5 jours si elle est conserv e a 2 8 C Cette solution doit tre soigneusement m lang e avant emploi La formation d un pr cipit dans la solution dans les 5 jours n affecte pas la qualit de la coloration La solution DAB dos e doit tre pr par e dans un flacon de r actif Autostainer quand elle est utilis e sur un instrument Dako Autostainer A 2 Solution Permanent Red dos e La solution Permanent Red dos e est pr par e en m langeant soigneusemen
48. ructions sp ciales avant l utilisation Avertissement Ce produit contient une substance qui n a pas encore t totalement test e Sa classification s est effectu e uniquement d apr s des comparaisons avec des substances pr sentant une structure similaire En r gle g n rale les personnes g es de moins de 18 ans ne sont pas autoris es manipuler ce produit Les utilisateurs doivent tre soigneusement inform s des proc dures de travail appropri es du caract re dangereux de ce produit et des instructions de s curit n cessaires Veuillez vous reporter la fiche de donn es de s curit FDS pour plus d informations 5 Ce produit contient de l azide de sodium NaN un produit chimique hautement toxique a l tat pur Aux concentrations du produit bien qu il ne soit pas class comme dangereux l azide de sodium peut r agir avec le plomb et le cuivre des canalisations pour former des d p ts hautement explosifs d azides m talliques Lors de l limination du produit laisser couler l eau flot pour viter toute accumulation d azide m tallique dans la tuyauterie 6 Porter un quipement de protection personnel appropri pour viter tout contact avec les yeux et la peau 114055 002 K5361 EFG SGA 13 10 06 p 14 28 7 Se d barrasser de la solution inutilis e conform ment aux r glementations locales et nationales en vigueur Conservation Conserver le kit l obscurit entre 2 et 8 C
49. s gef hrlich klassifiziert sind mit Blei und Kupferabflussrohren reagieren und hochexplosive Metallazide bilden Nach der Entsorgung stets mit viel Wasser nachsp len um Azidansammlungen in den Leitungen vorzubeugen 6 Entsprechende Schutzkleidung tragen um Augen und Hautkontakt zu vermeiden 7 Nicht verwendete L sung ist entsprechend rtlichen bundesstaatlichen und staatlichen Richtlinien zu entsorgen 114055 002 K5361 EFG SGA 13 10 06 p 22 28 Aufbewahrung Das Kit bei 2 8 C aufbewahren Das Kit nach Ablauf des auf dem Kit aufgedruckten Verfalldatums nicht mehr verwenden Kitkomponenten aus unterschiedlichen Chargen nicht austauschen Werden die Reagenzien nicht entsprechend den angegebenen Bedingungen aufbewahrt m ssen die Bedingungen vom Anwender gepr ft werden Falls es zu einer unerwarteten Farbung kommt die sich nicht durch Unterschiede bei Laborverfahren erklaren lasst und auf ein Problem mit dem Produkt hindeutet ist unser technischer Kundendienst zu verstandigen Vorbereitung der Probe Das Kit kann fur formalinfixierte paraffineingebettete Gewebeschnitte und fixierte Zellausstriche verwendet werden Fur die Konservierung der Proben sind verschiedene Fixiermittel geeignet Fur alle Gewebeschnitte Standardmethoden der Gewebeverarbeitung zur immunhistochemischen Farbung verwenden 1 Die optimale Dicke von formalinfixierten paraffineingebetteten Gewebeschnitten und Gefrierschnitten betr gt 4 6 um Die Probe wird
50. stainer instrument A 2 Permanent Red Working Solution Permanent Red Working Solution is prepared by thoroughly mixing 100 parts of Permanent Red Substrate Buffer Vial 8 with 1 part of Permanent Red Chromogen Vial 9 e g mix 1 mL Permanent Red Substrate Buffer Vial 8 with 10 uL Permanent Red Chromogen Vial 9 Prepare only the volume required for the number of slides that shall be stained Use the solution within 30 minutes Permanent Red Working Solution should be prepared in an Autostainer Reagent Vial when used on the Dako Autostainer instrument A 3 Guideline for optimal dilution of primary antibodies EnVision G 2 Doublestain System is compatible with suitably diluted Dako concentrated primary antibodies Optimal dilution should be determined by the user B Staining procedure for manual use B 1 Procedural notes The following pre treatment steps should be carried out before using EnVision G 2 Doublestain System on formalin fixed paraffin embedded tissue sections The specimen should be deparaffinized and rehydrated Some specimens should be subjected to epitope demasking by heat induced epitope retrieval or enzyme digestion Please refer to the package insert of the individual primary antibody for specific information on specimen preparation Following demasking the specimen should be rinsed gently with wash buffer solution from a wash bottle do not focus directly on tissue and placed in a fresh wash buffer bath for 5 min
51. t 100 parties de tampon substrat Permanent Red flacon 8 avec 1 partie de chromogene Permanent Red flacon 9 par exemple m langer 1 ml de tampon substrat Permanent Red flacon 8 avec 10 ul de chromog ne Permanent Red flacon 9 Pr parer uniquement le volume n cessaire pour traiter le nombre de lames colorer Utiliser la solution dans les 30 minutes La solution Permanent Red dos e doit tre pr par e dans un flacon de r actif Autostainer quand elle est utilis e sur un instrument Dako Autostainer A 3 Directive relative la dilution optimale des anticorps primaires Le systeme EnVision G 2 Doublestain est compatible avec les anticorps primaires concentr s Dako convenablement dilu s La dilution optimale doit tre d termin e par l utilisateur 114055 002 K5361 EFG SGA 13 10 06 p 15 28 B Proc dure de coloration pour une utilisation manuelle B 1 Remarques relatives a la proc dure Les tapes de pr traitement suivantes doivent tre mises en uvre avant d utiliser le syst me EnVision G 2 Doublestain sur les coupes de tissus fix es au formol et incluses en paraffine L chantillon doit tre d paraffin et r hydrat Certains chantillons doivent faire l objet d un d masquage de l pitope par restauration de l pitope par la chaleur ou digestion enzymatique Pour plus d informations sur la pr paration de l chantillon veuillez vous r f rer la notice de Panticorps primaire individuel Apr s
52. utes All reagents should be equilibrated to room temperature 20 25 C prior to immunostaining Likewise all incubations should be performed at room temperature Do not allow specimens to dry out during the staining procedure Dried specimens may display increased non specific staining B 2 Staining protocol Step 1 Vial 1 Dual Endogenous Enzyme Block Tap off excess wash buffer and carefully wipe around the specimen to remove any remaining liquid and to keep the reagent within the prescribed area Apply 200 uL Dual Endogenous Enzyme Block to cover specimen Incubate for 5 1 minutes Rinse gently with wash buffer 114055 002 K5361 EFG SGA 13 10 06 p 8 28 solution from a wash bottle do not focus directly on tissue and place in a fresh wash buffer bath for 5 minutes Step 2 Primary antibody No 1 or negative control reagent No 1 Tap off excess wash buffer and wipe slides as before Apply 200 uL mouse or rabbit primary antibody or negative control reagent see section A 3 to cover specimen Incubate for 10 1 minutes Rinse specimen as described in Step 1 Step 3 Vial 2 Polymer HRP Tap off excess wash buffer and wipe slides as before Apply 200 uL Polymer HRP to cover specimen Incubate for 10 1 minutes Rinse specimen as described in Step 1 twice Step 4 DAB Working Solution Prepare DAB Working Solution as described in section A 1 Tap off excess wash buffer and wipe slides as before Apply 200 uL DAB Worki
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