Biochimie I,1,a - Science on Stage
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1. D chlorophylle b Si KS E Jee e So A de la Y Sol ol Solution totale 7 Sol x Sol Sok Sc Giuant SH 4 2801 liquide f mobile EF phase liquide stationnaire partage des solut s entre les 2 phases 5 Figure A Sch matisation d une chromatographie sur papier papier en coupe longitudinale Sol lt c ir 50 w e Sol 50 phase fixe Sol SO 1 Vd so so phase mobile Sol Sal Sol Figure B Sch ma du partage d un solut entre la phase mobile et la phase stationnaire papier en coupe longitudinale vu de profil Bernadette Lourtie 2008 FIGURE A Le B carot ne est lu en premier et migre avec le front de l luant Le B carot ne est un pigment apolaire liposoluble il sagit d un hydrocarbure appartenant la famille des terp noides Le carot ne est insoluble dans l eau de la phase fixe et soluble dans l luant compos de solvants organiques Le partage du f carot ne entre le solvant de la phase liquide stationnaire et le solvant de la phase liquide mobile n a pas lieu Les xanthophylles sont des carot nes oxyd s Plus polaires que les carot nes ils sont moins solubles dans l luant et un peu plus solubles dans l eau que ces derniers 115 se partagent donc entre ces 2 solvants au cours l lution2. solution de pigments Il faut veiller ne pas endommager le filtre 2 S cher convenablement avec du papier absorbant sans trop malmener les feuilles Photo 1 D couper les feuilles en petits morceaux dans le mortier ajouter une petite pinc e de sable et broyer en additionnant 6 d thanol Photo A 9 Verser le filtrat obtenu dans un petit r cipient en verre d une contenance proche de 5 afin de le remplir compl tement avec le filtrat et d viter Photo 2 l oxydation des pigments et fermer avec un bouchon 4 Lorsque les feuilles sont bien broy es filtrer grossi rement dans un cristallisoir l aide de la petite passoire Presser sur le broyat l aide du pilon Photo 5 Photo 35 OBernadette Lourtie 2008 NSC SonS Be Science on Stage Belgium B Chromatographie de partage 1 Pr paration de la bande de papier Attention Les bandes de papier Whatman doivent tre manipul es avec beaucoup de SOINS Elles ne doivent pas tre touch es mains nues mais seulement avec des gants de protection d faut de papier pour chromatographie le papier buvard blanc peut faire l affaire voir photo 6 1 1 0 5 mm du bord sup rieur de la bande de papier au milieu percer un petit trou pour pouvoir accrocher la bande au crochet du bouchon de l prouvette 1 2 Avec la r gle tracer un petit trait tous les cm le long de l un des grands
3. Voet Biochimie traduction fran aise de la 3 dition am ricaine De Boeck Universit 2005 143 e 4 L Lehninger Biochimie traduction de la 2 dition Flammarion M decine Sciences 1977 105 106 e 5 M Vanbelle Biochimie descriptive 1 SR partie Introduction la biochimie moderne pour agronomes Facult des Sciences Agronomiques de l UCL 1970 2 34 35 e 6 Julia Proust amp col Physique Chimie 2de la chimie au quotidien Magnard 2004 11 173 184 e V Audebert amp col Sciences de la Vie et de la Terre Terminale S enseignement de sp cialit dition Bordas Collection Tavernier Lizeaux 2002 1 196 e 8 J Baudin amp col Chimie Terminale S enseignement obligatoire dition Nathan Collection Sirius 2002 2 42 58 Sites Web e M thodes physiques de s paration et d analyse et m thodes de dosage des biomol cules Techniques chromatographiques la chromatographie liquide m canismes et modalit s http www snv jussieu fr bmedia lafont chromato A62 html e Biologie et Recherche les diff rentes techniques de chromatographie http www 123bio net cours chromato introchromato html e Colorants alimentaires dans un sirop fiche du professeur http wwwd4b ac lille fr physiquechimie lycee seconde pci chimie obligatoire synthe e _Spectrophotom trie colorim trie dosage de l acide phosphorique dans le coca cola http www unige ch science
4. d affinit Chromatographie de partage en phase inverse Chromatographie d affinit Chromatographie de partage en phase Chromatographie Chromatographie directe de partage en d change d ions phase inverse de paires d ions Chromatographie Chromatographie de partage en pour la s paration Infographie inspir e de phase directe d nantiom res www snv jussieu fr bmedia lafont chromato A62 html Facteurs intervenant dans le partage des mol cules en fonction des m canismes de s paration la solubilit dans un solvant liquide chromatographie de partage la taille la forme des mol cules chromatographie d exclusion la polarit chromatographie d adsorption chromatographie d adsorption en phase invers e la charge lectrique chromatographie par change d ions pr sence de groupe d atomes formant des sites particuliers chromatographie d affinit La classification des diff rents types de chromatographie repose sur le fait que l on a privil gi l effet de l un des facteurs ci dessus cependant aucune m thode ne repose exclusivement sur un seul de ces facteurs OBernadette Lourtie 2008 NSC SonS Be Science on Stage Belgium BIOLOGIE VEGETALE BIOCH I 1 Ce qu il faut comprendre La chromatographie de partage sur papier Whatman ou sur colonne CLC fait partie des diff rents modes de chromatographie en phase liquide 1 La m thode R partition d un solut X entre c
5. sur papier peut para tre d su te en comparaison des chromatogrammes obtenus en chromatographie d adsorption sur couche mince CCM EnA Chromatogramme Lactuca sativa ther de p trole 3 ac tone 1 dichlorom thane 1 ether thylique 0 5 mL Code Ligne de d p t Front du solvant des couleurs Canal bord inf rieur Violaxanthine Fheophorbige Chlorophylle a RW N oxanthine kuone Chlorophylle b Ph ophytines a et b B ta carot ne RW 20 mm t 255 E d Canal 2 3 Lourtie Illustration Lourtie Chromatogramme Lactuca sativa Cependant les deux m thodes doivent tre ma tris es par des l ves se destinant poursuivre des tudes scientifiques D autre part la comparaison des chromatogrammes obtenus par chacune des deux m thodes peut tre source de questions int ressantes OBernadette Lourtie 2008 NSC SonS Be Ss Science on Stage Belgium BIOLOGIE VEGETALE BIOCH I 1 sources Bibliographie e 1 G Coutouly amp col Travaux dirig s de biochimie biologie mol culaire et bioinformatique 27 dition Collection Biosciences et techniques diteur doin 2006 m thodes chromatographiques 254 284 e 2 G Coutouly amp col Travaux dirig s de biochimie biologie mol culaire et bioinformatique 27 dition Collection Biosciences et techniques diteur doin 2006 m thodes spectrophotom triques 302 304 me e 3 D Voet
6. 65 Ac tonitrile ther tnyiique Chloroforme 0 40 Polarit interm diaire 0 50 Ac tate d thyle 0 58 s s III soose RT 1 0 75 Dim thylsulfoxyde 0 82 15 WW WW 0 88 Ethanol 0 95 M thanol eau acide ac tique dim thylsulfoxyde HE mn acide ac tique ac tate d thyle cyclohexane ther thylique 2 propanol dichiorom thane En ac tonitrile benzene chloroforme Infographie B Lourtie Source www snv jussieu fr bmedia lafont chromato A62 html source www snv jussieu fr bmedia lafont chromato A62 html OBernadette Lourtie 2008 NSC SonS Be Science on Stage Belgium BIOLOGIE VEGETALE BIOCH I 1 a Protocole 5 R cup rer le d p t accumul dans la passoire avec une spatule ou une cuill re A Extraction d une solution en plastique le placer dans le mortier et nouveau rajoutant 2 totale de pigments d thanol 6 R p ter la filtration grossi re comme 1 Rincer l eau d min ralis e quelques gek expliqu e au point 4 feuilles du v g tal choisi ici des feuilles de carotte Daucus 7 Filtrer le contenu du cristallisoir dans l aide de l entonnoir et du filtre en papier Rien ne doit d border du filtre Presser d licatement le d p t contre le filtre avec une cuill re en plastique afin d extraire un maximum
7. c t s du papier 2 cm du bord inf rieur du papier tracer tr s d licatement en appuyant peine une ligne en travers du papier Cette ligne sera la ligne de d p t bord sup rieur trou 30 3 cm niveau pour l luant ligne de d p t 2 cm e bord inf rieur 7 1 Pr parer 2 Tester Figure 1 pr paration d une bande de papier pour la chromatographie de partage et test vide 2 Faire un test vide du dispositif 2 1 Accrocher la bande sur le crochet du bouchon et placer le bouchon sur l prouvette 1000 ml vide sans l luant 2 2 V rifier lorsque le syst me est ferm que le bord inf rieur du papier ne touche pas le fond de l prouvette Le cas ch ant raccourcir la bande de papier et faire un nouvel essai OBernadette Lourtie 2008 BIOLOGIE VEGETALE BIOCH I 1 La bande de papier ne devra toucher ni le fond ni les c t s de l prouvette 2 3 Evaluer la hauteur que devra atteindre l luant dans l prouvette Le bord inf rieur du papier devra plonger dans l luant mais le niveau de l luant devra rester en dessous de la tache de d p t Indiquer la hauteur par un trait au marqueur 2 4 Fabriquer un cache en papier noir qui sera plac sur l prouvette pendant la s paration des pigments 3 Pr paration de l luant 3 1 Pr lever chaque solvant avec une pipette munie d une propipette Utiliser une pipette par solvant Composer le m la
8. et par cons quent ils migrent moins vite que le f carot ne La lut ine est la forme oxyd e de l a carot ne et la z axanthine est la forme oxyd e du Les chlorophylles sont des mol cules amphiphiles constitu es d un anneau porphyrique hydrophile et d une cha ne hydrocarbon e en hydrophobe insoluble dans l eau et soluble dans les solvants organiques Les chlorophylles se partagent entre les 2 solvants et migrent moins vite que les xanthophylles car elles sont moins solubles dans l luant que ces derniers Ce sont les mol cules qui pr sentent la plus grande taille dans le m lange de pigments Chloro C55H7205N4Mg 3 Chloro C55H7006N4Mg La chlorophylle b se diff rencie de la chlorophylle par la pr sence d un groupe formyle R2 la place d un groupe m thyle R2 en position 13 La chlorophylle b est donc plus polaire et moins soluble dans l luant que chlorophylle a Les pigments hydrosolubles tels que les anthocyanidines ne migrent pas et restent au niveau de la tache de d p t FIGURE A et B Dans la chromatographie de partage il faut imaginer une phase mobile se d pla ant lentement devant une phase stationnaire fixe liquide immobile s avec la r alisation de N quilibres jusqu puisement de la concentration du solut X dans la phase mobile NSC SonS Be gi Science on Stage Belgium BIOLOGIE VEGETALE BIOCH I
9. le d tecteur qui permet de mesurer l intensit lumineuse transmise et l intensit lumineuse incidente lo e L appareil affiche la valeur de log l I sans unit Cette valeur est comprise entre 0 et 2 e Pour r aliser une mesure il faut effectuer un r glage du z ro avec une solution appel e le blanc e Un calculateur ordinateur traduit les mesures sous forme du graphique d une fonction Absorbance f OBernadette Lourtie 2008 NSC SonS Be Science on Stage Belgium BIOLOGIE VEGETALE BIOCH I 1 1 3 Les spectres d absorption des principaux pigments photosynth tiques 380 430 560 595 625 Violet Jaune Orange Rouge Chlorophylle b Chlorophylle Bacteriochlorophylle a _ arot no des Phyco rythrine Absorbance longueurs d onde spectre d absorption pr sente la variation de l absorption par une particule atome mol cule en fonction de la longueur d onde de la lumi re incidente Chaque particule est caract ris e par la forme g n rale de son spectre d absorption hauteurs relatives des pics et leur position en longueur d onde En analyse qualitative le spectre d absorption permet de d terminer la nature d une substance chimique En analyse quantitative l intensit d absorption est fonction de la concentration de la particule qui absorbe lumi re chaque longueur d onde l absorption de la
10. 1 Mesurer calculer 1 Calculer le rapport frontal Rf pour chaque pigment s par e Mesurer la hauteur de migration de l luant distance entre la ligne de d p t et le front l luant e Mesurer la distance d parcourue par chaque pigment distance entre la ligne de d p t et le centre de la tache e Calculer pour chaque pigment le rapport frontal Rf distance parcourue par le pigment distance parcourue par l luant Pour un luant donn et une esp ce chimique donn e le Rf est caract ristique de l esp ce Remarque L luant le plus souvent utilis pour la chromatographie des pigments v g taux sur papier est celui qui est utilis dans cet exemple ther de p trole 85 ac tone 10 cyclohexane 5 II peut tre int ressant de faire des essais avec des luants de composition diff rente Les ph ophytines ne sont pas visibles dans les conditions de l exp rience La chromatographie sur couche mince CCM permet de s parer les ph ophytines voir conclusions page 13 Il s agit d adopter un regard critique en ce qui concerne l exp rience d crite aux pages 122 123 de l ouvrage suivant R Perrier amp col Exp riences faciles et moins faciles en sciences biologiques Collection Biosciences et techniques diteur doin 1997 122 123 2 La technique peut tre rendue quantitative avec une erreur de 10 de deux fa ons les observations sur le papi
11. GETALE BIOCH 1 a Un document utile la structure chimique des pigments v g taux La famille des Struct d hlorophylles a b et d ructure des chloro es a be R1 R2 chlorophylles Num rotation selon IUPAC IUB 1987 R3 Chl a CH CH CH CH Chl b CH CH C H CH CH O KEN CH CH CH Phytol hydrophobe alcool est rifiant longue cha ne E Infographie B Lourtie La famille des carot noides e Les carot nes H H do d DS vi s H H Les xanthophylles OH H H CH H H CH e E Za a KH Zo ef Wa s wf n CH V7 V7 Dei Si Sei Ki Se d eaxanthinc Forme oxyd e du f Carot ne La famille des flavonoides pelargonidine R R H cyanidine R OH R H R OCH delphinidine R R 0H p tunidine R OCH R OH malvidine R R Anthocyanidines OBernadette Lourtie 2008 NSC SonS Be Science on Stage Belgium BIOLOGIE VEGETALE 1 Ce qu il faut savoir faire Choisir le type de chromatographie en fonction des compos s s parer Compos s s parer PM gt 2000 PM lt 2000 Chromatographie d exclusion Polaires solubles dans l eau Chromatographie d affinit Chromatographie pour la s paration d nantiom res Chromatographie d adsorption
12. IE VEGETALE Tableau des r sultats pour des valeurs choisies pics Position abs cm BIOCH I 1 Code des couleurs absorp NI absorp absorption Rf Canal i 88 91 7 95 7 018 extrait total WW 0 Rech 25 6 12 3 56 3 31 4 15 7 1 93 47 2 21 6 25 7 9 13 67 8 34 2 chloro b 12 4 26 5 0 255 20 9 7 99 69 6 32 8 Canal 3 23 5 9 55 67 4 33 5 Rouge 7 13 1 11 15 1 e 15 9 7 56 21 8 15 1 chloro 15 8 26 5 3 6 3 42 39 5 15 5 xanthophylles 20 9 26 5 6 49 5 85 32 8 15 1 3 39 3 24 27 1 11 3 B carot ne 24 2 26 5 2 25 1 71 26 8 10 3 0 784 0 784 1 57 1 05 Interpr tation des r sultats Le graphique montre OBernadette Lourtie 2008 Une forte absorption dans les canaux pour la tache de l extra it total La tache rouge brun tre sur la ligne de d p t est due aux pigments hydrosolubles qui n ont pas t lu s La forte absorption dans le vert s explique par la pr sence de pigments rouges les anthocyanidines La chlorophylle b pigment photosynth tique vert absorbe principalement dans le rouge et dans le bleu et en moindre mesure dans le vert Ceci est mettre en rapport avec la couleur vert jaun tre de la chlorophylle b Une forte absorption dans le bleu au niveau du spot de la chlorophylile b Il y a peut tre une superposition d un pigment jaune xanthophylle et de la chlorophylle b Ceci expliquerait la couleur jaune visible sur le chromatogr
13. Science on Stage Belgium BIOLOGIE VEGETALE BIOCH I 1 TRAVAUX PRATIQUES 1 a Techniques de chromatographie en phase liquide e Chromatographie de partage d un extrait total de pigments v g taux e Exp rience Assist e par Ordinateur EXAO avec des l ves du 3 degr OBernadette Lourtie 2008 NSC SonS Be Science on Stage Belgium BIOLOGIE VEGETALE BIOCH I 1 e Chromatographie de partage d un extrait total de pigments v g taux e Exp rience Assist e par Ordinateur AVERTISSEMENT La chromatographie des pigments v g taux n cessite imp rativement d tre r alis e sous hotte aspirante vu la toxicit des solvants organiques S curit Les consignes de s curit d usage laboratoire de chimie doivent tre appliqu es la lettre Le port de gants et de lunettes de protection ainsi que d une blouse de laboratoire est indispensable Protection de l environnement Les solvants organiques doivent imp rativement tre jet s avec les d chets de laboratoire et d pos s dans une collecte de produits chimiques Connaissances BIOLOGIE La structure chimique des pigments v g taux voir page 2 CHIMIE techniques de chromatographie en phase liquide voir pages 3 5 Mat riel Pour l extraction des pigments d Du mat riel biologique au choix feuilles feuilles de carotte feuil
14. amme cet endroit Une chromatographie bidimensionnelle pourrait apporter une r ponse mais la coloration des pigments dispara t d s que le chromatogramme s che La chlorophylle pigment photosynth tique vert bleu tre absorbe dans le rouge et dans le bleu et en moindre mesure dans le vert Les carot noides xanthophylles et carot nes sont des pigments jaunes orange et absorbent essentiellement dans le bleu Rouge 650 750 nm La couleur des corps opaques est d termin e par les rayons r fl chis par ces corps en d autres mots par les rayons qu ils n absorbent pas Orange 600 650 nm Violet z ia 400 450 nm Pour un compos qui absorbe la lumi re une longueur d onde d termin e la coloration r sultante est celle obtenue par l addition de toutes les autres couleurs sauf celle qui est absorb e L il per oit cette coloration comme tant la compl mentaire c est dire celle qui est oppos e dans le triangle des couleurs Jaune Bleu 550 600 nm 450 500 nm Vert 500 550 nm NSC SonS Be i Science on Stage Belgium BIOLOGIE VEGETALE BIOCH I 1 Question remue m ninges Peut on mettre en relation les r sultats obtenus en mesure de photom trie classique partir d objets photographi s ou scann s et les spectres d absorption des pigments v g taux obtenus par spectrophotom trie El ments de r ponse 1 Spectrophotom trie 1 1 La m thode La spectrophoto
15. anal de couleur V et B chaque canal de couleur R V et B varie entre les valeurs comprises entre 0 et 255 bits image en couleur est constitu e par la superposition de images monochromes V et obtenues partir des fichiers images V et OBernadette Lourtie 2008 NSC SonS Be ge Science on Stage Belgium BIOLOGIE VEGETALE BIOCH I 1 Conclusions Spectrophotom trie Photom trie classique avec Mesurim e A partir d un faisceau incident lo e A partir d un faisceau incident l polychromatique monochromatique l appareil mesure RVB sur une tache de pigment le logiciel l intensit de la lumi re transmise mesure l intensit de la lumi re r fl chie travers une solution de pigment solution sens du d placement lumi re incidente lumi re transmise d chemin optique e Le spectre d adsorption repr sente graphiquement sans unit f en nm e graphique d intensit de couleur sur une ligne en absorption et mesure lin aire repr sente f d en cm ou mm avec distance de migration e graphique d intensit de couleur sur une ligne en absorption et mesure logarithmique repr sente D O sans unit f en cm ou e Les 3 canaux de couleurs se superposent pour chaque valeur de d A A Sa d cm ou mm 0 D Commentaires La chromatographie des pigments v g taux
16. e noir correspond une charge nulle et le blanc correspond une charge maximum On obtient des couleurs en filtrant suivant 4 nuances de couleurs rouge bleu et 2 nuances de vert 1 filtre rouge R avec 256 nuances de rouge 1 filtre bleu B avec 256 nuances de bleu et 2 filtres verts avec 256 nuances de vert chacun Cela correspond 16 777 216 couleurs diff rentes 2 2 Acquisition d images partir d un scanner plat compatible TWAIN e Caract ristiques le pilote il s agit d un programme compatible TWAIN qui sert d interface entre les logiciels traitement d images et le scanner pour l acquisition la r solution correspond au nombre de pixels par pouce qu un scanner peut acqu rir L unit d acquisition est le dpi ou ppp dot per inch points par pouce qui peut tre diff rente en largeur et en longueur la palette des couleurs caract rise chaque scanner et est exprim e en bits e Fonctionnement d un scanner plat Le principe g n ral de fonctionnement d un scanner consiste en une source lumineuse qui se d place pr s de la surface d un document La lumi re mise est r fl chie et capt e par un capteur photosensible qui convertit la lumi re valeurs arithm tiques en charges lectriques valeurs analogiques qui sont converties leur tour en signal digital valeurs num riques par un convertisseur analogique num rique Un microcontr leur met l image en forme format JPEG avant
17. er la surface du spot est proportionnelle au log de la concentration mesurer l absorption travers le papier apr s r v lation 4 les techniques d lution d couper la r gion du papier qui contient l esp ce luer cette r gion et doser l esp ce dans l luat 4 EXAO utiliser un logiciel de mesure sur l image Mat riel d Un appareil photo num rique un scanner plat ou les deux d Un ordinateur Les outils de mesure sur l image du logiciel MESURIM PRO auteur J F Madre Acad mie d Amiens France permettent d aborder des mesures de photom trie classique partir d objets photographi s scann s Ces outils travaillent sur les images telles qu elles sont repr sent es dans la m moire de l ordinateur les r sultats d pendent de la qualit de la num risation et d indications correctes d chelle Ces outils demandent d tre utilis s avec circonspection voir avertissement de l auteur concernant l interpr tation des r sultats Annuaire des logiciels de SVT gratuits et disponibles sur internet en t l chargement SVT Edu net http perso wanadoo fr joudan eric logiciel htm Acad mie Nantes http www ac nantes fr 8080 peda disc svt tice htm Apr s t l chargement du logiciel on peut utilement se constituer un mode d emploi partir des explications propos es dans le Sommaire et les exemples d utilisation OBernadette Lourtie 2008 NSC SonS Be Sc
18. hromatographie liquide liquide deux phases liquides non miscibles La phase mobile l luant est liquide coefficient de partage La phase stationnaire est liquide Le facteur intervenant dans le KE m canisme de s paration la diff rence de solubilit des esp ces dans les 2 solvants Revoir en chimie les chapitres sur l quilibre chimique le d placement de l quilibre chimique la solubilit concentration de X dans 1 DI concentration de X dans 2 Kps Le m canisme mis en jeu dans ce type de chromatographie est le partage des solut s agitateur du m lange entre les 2 solvants non miscibles qui constituent d une part la 1 repr sente la phase mobile phase stationnaire et d autre part la phase 2 repr sente la phase stationnaire de mobile La phase stationnaire peut tre constitu e par Figure C Sch matisation du partage d un solut entre film liquide impr gn sur un 2 phases liquides non miscibles support rigide silice cellulose Source G Coutouly amp al Travaux dirig s de biochimie biologie mol culaire et bioinformatique d doin 2006 254 film liquide fix par liaison covalente phases greff es sur silice le greffage est r alis par des ponts siloxane Si X 1 gt Si O Si CH R 2 La chromatographie sur papier La chromatographie sur papier est une chromatogra
19. ience on Stage Belgium BIOLOGIE VEGETALE 1 a Exemple 1 mesure d intensit de lumi re avec le logiciel MESURIM PRO On peut mesurer la variation d intensit de couleur dans un canal de couleur ou dans l ensemble des canaux le long d un segment suivant une bande plus ou moins large Les r sultats sont donn s sous la forme d une courbe qui peut tre donn e en mission intensit en absorption oppos de l intensit si la mesure est lin aire ou en estim e si la mesure est logarithmique hi bref Biher Edison Frolire magr Dejma ve Op cnb sat mz e gie 7 Ze Tout GD Largeur en pixels de la bande de mesure 3 HR Mesurer Mesurer bes intensit s dans le Bleu Suni Mesure en mlsslon Mesure Untaire e Mesure en absorption O Mesure logaritmique 03 7 d tt ER EI 11 0 0 2 14 4 10 8 1 28 15 Ab 10 4 K EK 1 9 1 34 l demarrer lc ot T chriques d Exemple 2 mesure de lumi re dans un rectangle et mesure de lumi re sous la surface color e 2 1 Mesure de la densit optique D 0 dans le rectangle du spot de la chlorophylle heel hel lee A ml 2 D Mes images Chromato carotte chromato carotte mes jpe M nr r iT Mesure de lumi re dans un rectangle Fermer Z ro S ries de mesures Masquer z ro valeurs brutes Vale
20. l luant entra ne le m lange par capillarit II ne s agit pas d un ph nom ne de surface mais d un ph nom ne de diffusion Comme en lectrophor se sur support papier gel d ac tate de cellulose modifi gel d agarose il s agit d une migration dans un support poreux imbib Le support minimise la diffusion des substances lors de la migration suite une migration selon la taille tamisage mol culaire des mol cules Ce qu il faut retenir La chromatographie de partage est une chromatographie liquide liquide bas e sur le partage des solut s dans le solvant de la phase stationnaire liquide et dans l luant qui constitue la phase mobile liquide Chaque solut est soumis une s rie de facteurs qui influencent sa migration Fiche technique Echelle de polarit des solvants organiques Table de miscibilit des solvants 0 01 Ether de p trole hexane 0 04 Cyclohexane 0 18 T trachlorure de carbone _acide ac tique NX Table de miscibilit des solvants Apolai polaires ac tone ac tonitrile Si _ac tonitrile TT Miscible Tolu ne 0 29 0 28 Ether isopropylique benz ne III 038 Ether thyique Cenorotomme 042 Chlorure m ihyi ne Kess EEEE 0 49 Dichloro thane dim thysulfoxyde 0 56 Ac tone dioxane butanol ac tate d tnyie I 0
21. les d arbre algues Dans cet exemple nous avons choisi des feuilles fanes de carotte Mortier pilon d Un peu de sable fin propre PRODUIT CHIMIQUE POUR L EXTRACTION Vd Ethanol d natur 95 C2H60 R11 et S 7 16 Pour la filtration simple lent d 1 petite passoire Bernadette Lourtie 2008 1 erlenmeyer d 1 cristallisoir 1 entonnoir filtres en papier 1 spatule ou 1 cuill re en plastique Pour la filtration sous vide rapide V B chner et fiole vide reli e une trompe eau Pour la chromatographie de partage d Cuve de d veloppement une prouvette gradu e de 1000 mli quip e d un bouchon muni d un crochet Un cache en papier noir pour recouvrir l prouvette d Bandes de papier Whatman de 30 cm x 3 cm 1 petite prouvette gradu e d pipettes gradu es 10 ml d 3 poires propipettes y 1 petit capillaire pour effectuer les d p ts V R gle en plastique transparent d Crayon papier ou porte mine d Papier absorbant PRODUITS CHIMIQUES POUR LA CHROMATOGRAPHIE d Ether de p trole essence G R11 45 65 S 9 16 29 53 45 R11 36 66 67 S9 16 26 d Cyclohexane C6H12 R11 38 50 53 65 67 S9 16 33 60 61 62 Ac tone Propanone Pour d appareil photo num rique ou un scanner plat compatible TWAIN ou les deux d ordinateur d le logiciel Mesurim NSC SonS Be Science on Stage Belgium BIOLOGIE VE
22. lumi re par une particule en solution d pend de la nature de la particule de sa concentration c en mol LT du chemin optique d en cm parcouru par la lumi re l int rieur de la solution et d un coefficient d extinction molaire caract ristique de la substance pour un solvant donn en L mo em Loi de Beer Lambert Lorsqu une lumi re monochromatique d intensit l traverse un milieu homog ne l intensit de lumi re transmise selon une fonction exponentielle lorsque le chemin optique d et la concentration c augmentent A log l l D O sans unit c A amp d absorbance ou densit optique sans unit e coefficient d extinction molaire constante caract ristique de l esp ce mol culaire L mol cm concentration mol L d chemin optique cm longueur d onde OBernadette Lourtie 2008 NSC SonS Be 10 Science on Stage Belgium BIOLOGIE VEGETALE 1 2 Les mesures de photom trie classique partir d objets photographi s ou scann s 2 1 Acquisition d images partir d un appareil photo num rique Comme pour tout appareil photographique l image passe d abord par une s rie de lentilles optiques Ensuite une cellule photosensible CCD Charged Coupled Device Capteur transfert de charges convertit la lumi re en charges lectriques Le CCD ne voit que des nuances de gris l
23. m trie est une m thode d analyse physico chimique qui permet d identifier et de doser des particules ions mol cules pr sentes dans une solution sans l alt rer Utilis e en biochimie cette m thode est bas e sur la mesure de l intensit d absorption ou d mission d un rayonnement lectromagn tique par les particules doser Les rayonnements le plus souvent utilis s sont l UV lt 400 nm la lumi re visible 400 nm 800 nm et lIR gt 800 1 2 Le spectrophotom tre Spectrophotom tre D tecteur amplificateur Monochromateur solution s lection de lumi re incidente 4 chemin optique miroir source de lumi re blanche cran du calculateur e Une source de lumi re blanche lumi re visible met un rayonnement vers un r seau par l interm diaire d un miroir e Le r seau disperse la lumi re blanche en ses lumi res monochromatiques violet bleu vert jaune orange et rouge e monochromateur s lectionne une longueur d onde l aide d une fente e La lumi re de longueur d onde s lectionn e l lumi re incidente traverse une cuve rectangulaire en quartz de dimension connue d trajet optique et contenant la solution de l esp ce chimique color e analyser e cellule photo lectrique traduit en courant lectrique le nombre de photons qu elle re oit 1 lumi re transmise Cette derni re coupl e un amplificateur lectronique constitue
24. ne faut en aucun cas d placer le dispositif pendant l exp rience Ce qu il faut obtenir Photo 7 Dispositif pour la chromatographie de partage des pigments v g taux OBernadette Lourtie 2008 5 3 Lorsque la chromatographie est termin e sortir la bande de l prouvette et la photographier imm diatement avec un appareil photo num rique facultatif Ensuite avec un crayon marquer le front de l luant ainsi que le centre des taches laiss es par les pigments s par s Attention La couleur des pigments dispara t au fur et mesure que la bande s che Front de l luant d 26 1 cm b ta carot ne d 25 2 cm xanthophylles E d 21 5 cm chlorophylle a d 15 2 cm chlorophylle b 14 1 Chromatogramme Daucus carota 12 08 07 anthocyanidines Ligne de d p t JPG Lourtie Photo 8 Chromatogramme obtenu partir d un extrait total de Daucus carota carotte NSC SonS Be Science on Stage Belgium BIOLOGIE VEGETALE BIOCH I 1 Que s est il pass Chromatographie sur papier des pigments v g taux avec un luant compos de 85 d ther de p trole 10 d ac tone et 5 de cyclohexane Chromatographie de partage r seau cellulosique frot de l luant K ef b ia carot ne m d Sol 7 H Sol 501 Vsol Sol S Sol xanthophylles EES sso O1 T d JV e crlorophylle a
25. nge de solvants dans la petite prouvette gradu e Ether de p trole 85 ac tone 10 cyclohexane 5 3 2 Retirer le papier du bouchon de l prouvette Verser l luant dans l prouvette jusqu la hauteur rep r e voir 2 3 3 3 Fermer l prouvette avec le bouchon et mouiller les parois de l prouvette en lui imprimant doucement une rotation Laisser saturer pendant 20 30 min le temps d effectuer les d p ts 4 Effectuer le d p t de l extrait total 4 1 Avec le capillaire pr lever une petite quantit d extrait de pigments et d poser une goutte sur la ligne de d p t Photo 6 4 2 Laisser compl tement s cher avant d effectuer un nouveau d p t Pour acc l rer l vaporation il est d usage d utiliser un s che cheveux 4 3 Effectuer une dizaine de d p ts successifs en laissant toujours s cher entre chaque d p t La tache ne devrait pas avoir plus de 5 mm de diam tre Plus l extrait est dilu dans l thanol plus la tache sera tendue Si n cessaire laisser s vaporer l thanol pour concentrer l extrait NSC SonS Be Science on Stage Belgium BIOLOGIE VEGETALE BIOCH I 1 5 S paration des pigments 5 1 Accrocher la bande de papier au crochet du bouchon et placer la bande dans l prouvette Fermer avec le bouchon 5 2 Placer le cache en papier sur l prouvette et laisser migrer l luant presque jusqu en haut 28 cm Cela prend environ 50 min Il
26. phie de partage La phase fixe est form e par l eau adsorb e la cellulose du papier qui constitue le support rigide Les mol cules d eau li es la cellulose repr sentent le premier solvant La phase mobile est constitu e par l luant qui repr sente le second solvant ou m lange de solvants Les facteurs qui interviennent dans cette m thode et qui influencent la vitesse et donc la hauteur de migration des esp ces sont multiples La solubilit des esp ces dans chacun des 2 solvants une esp ce plus soluble dans la phase mobile l luant se d place plus rapidement qu une esp ce qui l est moins Le coefficient de partage K d une esp ce X entre 2 solvants 51 52 X s X s2 OBernadette Lourtie 2008 NSC SonS Be Science on Stage Belgium BIOLOGIE VEGETALE BIOCH I 1 La teneur en eau du papier d pend directement du degr hygrom trique ambiant La quantit de solvant de la phase fixe et la concentration de l esp ce partager entre les 2 phases fixe et mobile influencent la vitesse de s paration La polarit de la phase fixe eau et celle de la phase mobile l luant Voir fiche technique pour la chromatographie chelle de polarit des solvants organiques Le pH la temp rature La taille des mol cules la chromatographie sur papier implique l impr gnation du m lange s parer dans le support rigide le papier lors du d p t La migration de
27. s chiam williams tp Pharmacie 09 Colorimetrie pdf e _ Spectrophotom trie d absorption document de travaux pratiques Principe de l absorptiom trie d esp ces chimiques en solution http formation etud u psud fr chimie experiences tp 101a documents_ e le cours informatique PC et p riph riques 18 Acquisition image appareil photo num rique et scanner http www ybet be hardich18 hard1_ch18 htm e informatique Monthey le scanner http www Impc ch e de document http fr wikipedia org wiki Num C3 A9riseur de document e Cnam ELE 101 Composants lectroniques dispositifs opto lectroniques http www cnam fr elau publi algani images ELE101_CNAM_7_2008 pdf e Diodes lectroluminescentes http www rqmp ca medias Projets20de20recherche Projet_aimez LEDS fr pdf e Diodes lectroluminescentes http fr wikipedia org wiki Diode_ C3 A9lectroluminescente OBernadette Lourtie 2008 NSC SonS Be a
28. seur f analogique num ngue Lignes Pixels HTA canal bleu valeurs NUMENQUES cd bleu CTT comprises entre 0 et 255 D EE AN 1 canal vert Image digitale LL ge ag 1111 canal vet M T TECCO CTT rouge microcontroleur ORDINATEUR Fichier photo JPEG 3 fichiers images digitales un pour chaque canal le scanner parcourt le document ligne par ligne chaque ligne est d compos e taches l mentaires correspondant des pixels le capteur analyse la couleur de chaque pixel couleur de chaque pixel est d compos e en composantes rouge vert et bleu chacune des composantes de couleur est mesur e et repr sent e par une valeur num rique La num risation s effectue en codage binaire 0 1 l unit l mentaire de stockage une case m moire de l ordinateur est appel e bit binary information L unit de travail est l octet ensemble constitu de 8 bits calcul binaire 1 1 10 qui ne se lit pas dix mais un z ro Dans un octet on peut stocker des valeurs num riques comprises entre 0 et 255 Z ro 00000000 1 00000001 2 00000010 00000011 4 00000100 5 00000101 255 11111111 le pixel qui re oit la valeur 255 est celui qui correspond la valeur arithm tique de l intensit lumineuse la plus lev e num risation conduit la cr ation de 3 fichiers images digitales un pour chaque c
29. son transfert vers l ordinateur Il existe deux technologies diff rentes la technologie CCD voir appareil photo num rique et la technologie CIS Contact Image Sensor capteur d images par contacts e Description d un scanner CIS Dans ce syst me un dispositif unique est directement en contact au travers de la vitre avec le document num riser Ce dispositif unique regroupe la source lumineuse la lentille et le capteur La lentille cylindrique fait converger vers le capteur la lumi re mise par des diodes lectroluminescentes DEL de couleurs rouge bleue et verte Les capteurs CMOS Complementary Metal Oxyd Semi conductor utilise une rampe de DEL et requiert une distance tr s troite entre les capteurs et le document Les DELs de couleurs mettent dans les longueurs d onde suivantes Bleu 450 nm 500 nm Vert 500 nm 570 et Rouge 610 nm 760 Scanner plat technologie CIS capteur d image par contacts couvercle boitier DEL diodes lectroluminescentes rouges vertes et bleues Lentille cylindrique Capteur photosensible OBernadette Lourtie 2008 NSC SonS Be Science on Stage Belgium BIOLOGIE VEGETALE 1 e Fonctionnement d un scanner CIS Photos ou document SCANNER Intensit s lumineuses valeurs anthm tiques EEN DEL cellules photosensibles Signaux lectriques valeurs analogiques convertis
30. urs moyennes dans le rectangle Valeurs du Valeurs z ro brutes 10 0133 blanc d intensit E DEA D dans le 00343 COUT FT E i absorption dans le bleu 10 0338 0 00 0 00514 Ze LE globale 0 0169 0 001717 0 0355 D limiter avec la souris 0 001 7 0 01 66 Choix dans le rouge 0 0139 le rectangle de mesure sur l image OBernadette Lourtie 2008 NSC SonS Be Science on Stage Belgium BIOLOGIE VEGETALE BIOCH I 1 2 2 Mesure de D O sous la surface color e dans le rectangle Mesure de lumi re sous la surface color e Fermer Z ro S ries de mesures Masquer z ro valeurs brutes Valeurs moyennes dans la zone de mesure Valeurs du Valeurs zro Choix dans le rouge 0 001 F1 blanc brutes F intensit EE CS dans le vert 0 001 2 0 001 F1 0 00342 adsorption dene le bleu 5 0139 0 00171 0 A globale 0 00458 0 00171 0 0156 0 0171 0 00629 Application 1 1 Mesures de photom trie classique sur l image du chromatogramme de Daucus carota obtenue avec un scanner plat CIS CanoScan Lide 30 absorption 20 25 Graphique 1 Mesure d intensit de couleur sur une ligne mesure lin aire en absorption dans l ensemble des 3 canaux RVB courbe noire dans le canal bleu courbe bleue dans le canal rouge courbe rouge et dans le canal vert courbe verte OBernadette Lourtie 2008 NSC SonS Be e Science on Stage Belgium BIOLOG
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