Genscreen™ HIV
Contents
1. les valeurs d absorbance individuelles des contr les n gatifs ou des contr les de milieu de cultures de cellules le cas ch ant doivent tre sup rieures 0 000 UA et inf rieures ou gales 0 100 UA Une des valeurs d absorbance d une cupule du contr le n gatif peut amp tre limin e si elle est situ e en dehors de ces normes La moyenne des contr les n gatifs peut dans ce cas tre calcul e partir des deux valeurs d absorbance restantes Si deux contr les n gatifs ou plus ne respectent pas ces crit res le dosage doit tre de nouveau effectu Les absorbances moyennes des contr les positifs doivent tre sup rieures ou gales 0 500 UA et la valeur d absorbance de chaque contr le positif doit tre situ e dans le domaine de reproductibilit de 0 65 1 35 fois la moyenne des contr les positifs Toutes les valeurs d absorbance des contr les positifs doivent tre prises en compte 2 Calcul de la moyenne des absorbances partir des contr les valid s d terminer les absorbances moyennes des contr les n gatifs et positifs en divisant la somme de leurs valeurs d absorbance par le nombre de contr les utilis s 23 3 Calcul de la valeur sevil La valeur seuil est calcul e par la somme d un facteur constant 0 070 avec la valeur d absorbance moyenne des contr les n gatifs CNX Valeur seuil 0 070 CNX Exemple CNX 0 033 Valeur Seuil 0 070 0 033 0 103 4 Interpr tation des r2. REMARQUE est possible d utiliser d autres lots de solution de lavage R2 identifi 20 x en vert sur l tiquette de tampon substrat R8 identifi TMB buf en bleu de chromog ne R9 identifi TMB 11 x en violet et de solution d arr t R10 identifi 1N en rouge que ceux fournis dans la trousse sous r serve d utiliser un seul et m me lot de ceux ci au cours d un m me essai Ces r actifs peuvent tre utilis s avec d autres produits de notre soci t De plus la solution de lavage R2 identifi 20 x en vert sur l tiquette peut tre m lang e avec l une des deux autres solutions de lavage inclues dans les diff rents kits r actifs Bio Rad R2 identifi 10 x en bleu ou 10 x en orange sur l tiquette correctement reconstitu es condition qu un seul m lange soit utilis pour une m me manipulation donn e Contacter nos services techniques pour obtenir des informations d taill es e Avant utilisation attendre 30 minutes pour que les r actifs s quilibrent la temp rature du laboratoire 18 30 C e Ne pas r aliser le test en pr sence de vapeurs r actives acides alcalines ald hydes ou de poussi res qui pourraient alt rer l activit enzymatique des conjugu s Utiliser une verrerie parfaitement lav e et rinc e l eau distill e ou de pr f rence du mat riel usage unique Ne pas laisser la microplaque s cher entre la fin du lavage et le d but de la distribution des r actifs V rifi
3. Bond WW Favero MS Petersen NJ et al Inactivation of Hepatitis B virus by intermediate to high level disinfectant chemicals J Clin Micro 18 535 538 1983 CE marking European directive 98 79 CE on in vitro diagnostic medical devices Marquage CE Directive europ enne 98 79 CE relative aux dispositifs m dicaux de diagnostic in vitro Marcodo CE Directiva europea 98 79 CE sobre productos sanitarios para diagn stico in vitro EG Markierung Europ ische Richtlinie 98 79 EG ber In vitro Diagnostika Marchiatura CE Direttiva europea 98 79 CE relativa ai dispositivi medico diagnostici in vitro e Marca o CE Directiva europeia 98 79 CE relativa aos dispositivos m dicos de diagn stico in vitro e CE m rkning Europa direktiv 98 79 EG om medicintekniska produkter l r in vitro diagnostik CE m rkningen Europa direktiv 98 79 EF om medicinsk udstyr til in vitro diagnostik For in vitro diagnostic use Pour diagnostic in vitro Para diagn stico in vitro n vitro Diagnostikum Per uso diagnostico in vitro Para uso em diagn stico in vitro n vitro diagnostik n vitro diagnose Manufacturer Fabricant Fabricante Hersteller Produttore Fabricante Tillverkad av Fremstillet af Batch code Code du lot C digo de lote Chargen Bezeichnung Codice del lotto C digo do lote Batch nr Batchkoden Storage temperature limitation limites de temp ratures de stocka
4. sents dans l chantillon test ils se lient alors aux anticorps qui tapissent les cupules et y resteront fix s pendant l tape de lavage qui suit Le d p t des chantillons est confirm par un changement de couleur du diluant d chantillon du vert au bleu 2 Le conjugu 1 est ensuite ajout dans chaque cupule puis incub Ceci permet aux anticorps biotinyl s de mouton anti p24 pr sents dans le conjugu 1 de se lier aux anticorps antig nes VIH 1 captur s dans les cupules Ces complexes antig nes anticorps demeurent fix s aux puits lors de l tape de lavage qui suit 3 Le conjugu 2 est alors distribu puis incub l avidine du conjugu 2 se lie sp cifiquement aux complexes anticorps antig nes VIH 1 li s aux cupules l exc dent nonli du conjugu est limin par lavage 4 La r v lation de la r action se fait par ajout puis incubation de la solution de travail TMB Une coloration bleue ou bleu vert se d veloppe proportionnellement la quantit d antig ne VIH 1 pr sente dans l chantillon La r action colorim trique est arr t e par l adjonction d acide qui modifie la coloration du bleu vert au jaune La densit optique des chantillons et des contr les est d termin e par spectrophotom trie une longueur d onde de 450 620 700 nm 17 3 COMPOSITION DE LA TROUSSE Genscreen HIV 1 ANTIGEN EIA ETIQUETAGE NATURE DES R ACTIFS PR SENTATION 71120 RI MICROPLAQUE 2 plaques 12 barrette
5. sultats La pr sence ou l absence des antig nes VIH1 est d termin e en comparant pour chaque chantillon l absorbance enregistr e celle de la valeur seuil calcul e Les chantillons dont les valeurs d absorbance sont inf rieures 0 000 doivent tre de nouveau test s Les chantillons dont les valeurs d absorbance sont sup rieures aux limites de lin arit du lecteur sont consid r s r actifs Les chantillons dont les valeurs d absorbance sont inf rieures la valeur seuil sont consid r s non r actifs au test EIA antig ne VIH 1 Genscreen et peuvent tre consid r s comme n gatifs pour l antig ne VIH 1 Dans ce cas il n est pas n cessaire d effectuer un autre test Les chantillons dont les valeurs d absorbance sont sup rieures ou gales la valeur seuil sont consid r s comme initialement r actifs au test EIA Genscreen antig ne VIH 1 Les chantillons initialement r actifs doivent tre de nouveau test s deux foix afin de valider les r sultats du test initial Si la suite de ces nouveaux tests les deux nouvelles valeurs d absorbance obtenues sont inf rieures la valeur seuil le r sultat initial est non reproductible et l chantillon d origine est d clar n gatif pour l antig ne VIH 1 selon le test Genscreen HIV 1 Antigen L origine des r actions non reproductibles est souvent en relation avec les causes suivantes lavage insuffisant des microplaques contamination crois e d cha
6. ces antig nes l antig n mie peut r appara tre plus tard au cours de la progression de la maladie 1 Le test Genscreen HIV 1 Antigen EIA est destin tre utilis comme une aide au diagnostic et au pronostic de l infection par le VIH 1 PRINCIPE DE LA TROUSSE Genscreen HIV 1 ANTIGEN EIA Le test Genscreen HIV 1 Antigen EIA est un test immunoenzymatique pour la d tection in vitro de l antig ne p24 de la capside du virus de l immunod ficience humaine de type 1 VIH 1 libre dans des chantillons de s rum de plasma humains et de surnageant de culture cellulaire Le test Genscreen HIV 1 Antigen Confirmatory Assay code 71121 est un test utilis en compl ment du test Genscreen HIV 1 Antigen ElA pour confirmer la pr sence d antig ne p24 du VIH dans des chantillons dont la r activit a t r p t e Le test Genscreen HIV 1 Antigen EIA repose sur l utilisation d une phase solide pr par e avec des anticorps monoclonaux de souris anti VIH 1 d un premier conjugu pr par avec des anticorps biotinyl s de mouton anti p24 et d un deuxi me conjugu pr par avec de l avidine coupl e la peroxydase de Raifort La mise en oeuvre du test comprend les tapes r actionnelles suivantes 1 Les chantillons tudier ainsi que les s rums de contr le sont distribu s dans leurs puits respectifs dans lesquels e diluant des chantillons a t pr alablement ajout Si des antig nes VIH 1 sont pr
7. respect des temps et temp ratures d incubation indiqu s erreurs dans les d p ts des r actifs pr sence de m taux ou d eau de javel dans les puits Les performances de ce test n ont pas t valu es sur des chantillons post mortem ou sur fluides biologiques autres que le s rum ou le plasma ou chantillons de culture cellulaire 25 15 26 La sensibilit analytique estim e 8 pg ml lors des valuations du test peut varier en fonction des conditions op ratoires et de la variabilit interlots En cons quence seule une sensibilit analytique inf rieure 15 pg ml peut tre garantie par Bio Rad La coloration du diluant des chantillons peut ne pas tre modifi e en pr sence d chantillon de culture cellulaire en fonction du milieu de culture utilis e La m thode colorim trique de v rification du d p t des chantillons et ou des conjugu s et ou de la solution de r v lation ne permet pas de v rifier l exactitude des volumes distribu s mais seulement de montrer la pr sence d chantillons et ou des conjugu s et ou de la solution de r v lation Le taux de r ponses erron es obtenues avec cette m thode est li e la pr cision du syst me utilis des CV cumul s de pipetage et de lecture sup rieurs 10 peuvent d grader significativement la qualit de cette v rification Dans le cas d un lavage inefficace apr s l tape d incubation du conjugu la v rification automatique de la distribut
8. x 5 min 30 x 5 min Incubation Incubation statique Incubation statique Incubation statique Incubation statique 40 C 40 1 C 40 1 C 40 1 C 18 30 C chaleur s che chaleur s che chaleur s che dans l obscurit 60 x 5 min 30 5 min 30 5 min 30 5 min Pour les chantillons test s l origine 37 ou 40 C tout nouveau test ou toute confirmation devra tre effectu selon la m me proc dure La dur e indicative de ce test est d environ 3 h 30 4 heures partir du d but de la premi re tape d incubation Chaque cycle de la proc dure d utilisation du test doit tre effectu int gralement et sans interruption une fois commenc Deux contr les positifs et trois contr les n gatifs doivent tre r alis s sur chaque plaque En cas de test effectu sur chantillons de cellules trois contr les n gatifs de milieu de culture cellulaire sont n cessaires au lieu du contr le n gatif de la trousse CO Le seuil de r activit pour les chantillons de patients est d termin en fonction des signaux obtenus avec les contr les sur chaque plaque individuelle Eviter que les plaques ne soient expos es la lumi re au cours de la derni re tape d incubation apr s adjonction de la solution de travail TMB Suivre strictement le protocole propos et appliquer les bonnes pratiques de laboratoire 1 Etablir soigneusement le plan de distribution et d identification des chantillons 2 Pr parer la solutio
9. ci REMARQUE les chantillons de culture cellulaire peuvent ne pas changer de couleur en fonction du milieu de culture utilis Dans ce cas ne pas appliquer cette v rification automatique V rification spectrophotom trique du d p t de la solution de r v lation ll est possible de v rifier la pr sence de la solution de r v lation ros e par lecture automatique 490 nm une cupule contenant la solution de r v lation doit avoir une densit optique sup rieure 0 100 une DO plus faible indique une mauvaise distribution de la solution de r v lation ll y a une diff rence de coloration significative entre une cupule vide et une cupule contenant la solution de r v lation ros e 13 PERFORMANCES 24 Sensibilit diagnostique 138 chantillons de patients infect s par le VIH diff rents stades de l infection AIDS ARC autres ont t test s et trouv s positifs avec le test Genscreen Antigen EIA 20 panels de s roconversion bien document s ont t tudi s Les r sultats obtenus sont comparables aux r sultats obtenus avec d autres tests de dosage de l antig ne HIV e 55 surnageants de cultures cellulaires de VIH1 dont 53 de groupe M et 2 de groupe O ainsi que le panel de dilution Ag VIH SFTS 96 ont tous t trouv s positifs avec le test Genscreen HIV 1 Antigen EIA l exception de 2 dilutions d un surnageant de culture cellulaire de groupe O Les 53 surnageants de cultures cell
10. cozzo Genscreen HIV 1 Ag EIA 192 Tests 71120 TEST IMMUNOENZYMATIQUE EIA POUR LA D TECTION DE L ANTIGENE P24 DU VIRUS DE L IMMUNOD FICIENCE ACQUISE HUMAINE DE TYPE 1 VIH 1 DANS LE S RUM LE PLASMA HUMAIN ET LES SURNAGEANTS DE CULTURE CELLULAIRE Contr le de qualit du fabriquant Tous les produits fabriqu s et commercialis s par la soci t Bio Rad sont plac s sous un syst me d assurance qualit de la r ception des mati res premi res jusqu la commercialisation des produits finis Chaque lot du produit fini fait l objet d un contr le de qualit et n est commercialis que s il est conforme aux crit res d acceptation La documentation relative la production et au contr le de chaque lot est conserv e par notre soci t TABLE DES MATI RES INT R T CLINIQUE PRINCIPE DE LA TROUSSE Genscreen ANTIGEN EIA COMPOSITION DE LA TROUSSE Genscreen HIV 1 ANTIGEN EIA MAT RIEL N CESSAIRE MAIS NON FOURNI CONSIGNES D HYGI NE ET DE S CURIT PR CAUTIONS CHANTILLONS RECONSTITUTION DES R ACTIFS VALIDIT CONSERVATION MODE OP RATOIRE CALCUL ET INTERPR TATION DES R SULTATS V RIFICATION SPECTROPHOTOM TRIQUE DU D P T DES CHANTILLONS ET DES R ACTIFS PERFORMANCES LIMITES DU TEST R F RENCES BIBLIOGRAPHIQUES INT R T CLINIQUE l agent tiologique du syndrome d immunod ficience acquise SIDA est un r trovirus que l on a nomm Virus de l
11. e 0 370 ml de solution de lavage Respecter un temps de trempage temps d attente de 20 60 secondes Aspirer de nouveau R p ter le lavage 4 fois un minimum de 5 lavages Le volume r siduel doit tre inf rieur 10 yl si n cessaire s cher la plaque par retournement sur une feuille de papier absorbant 1 Distribuer rapidement 100 yl de la solution de travail conjugu 2 dans toutes les cupules Le conjugu doit tre agit avant emploi N B La distribution de la solution de travail du conjugu 2 qui est color en vert peut tre v rifi e visuellement ce stade de la manipulation 2 Si cela est possible recouvrir la microplaque d un film neuf Incuber 30 5 minutes 37 1 C ou 40 1 C dans un incubateur statique chaleur s che 3 Retirer le film adh sif vider toutes les cupules par aspiration et laver au moins 5 fois comme pr c demment Le volume r siduel doit tre inf rieur 10 pl si n cessaire s cher les barrettes par retournement sur une feuille de papier absorbant 4 Distribuer rapidement dans toutes les cupules 100 yl de la solution de r v lation de l activit enzymatique R8 R9 pr alablement pr par e Laisser la r action se d velopper l obscurit pendant 30 5 minutes temp rature ambiante 18 30 C Lors de cette incubation ne pas utiliser de film adh sif N B la distribution de la solution de r v lation qui est color e en rose peut tre contr l e visuelle
12. e de sodium peut former des azotures de plomb ou de cuivre dans les canalisations du laboratoire Ces azotures sont explosifs Pour viter toute accumulation d azotures rincer grande eau les canalisations si les solutions contenant de l azoture sont limin es par l vier apr s leur inactivation e Certains r actifs contiennent du ProClin 300 0 04 O 1 et ou 0 5 Xi Irritant R43 peut entra ner une sensibilisation par contact avec la peau 528 37 Apr s contact avec la peau se laver imm diatement et abondamment avec de l eau et du savon Porter des gants appropri s 19 6 20 PR CAUTIONS La qualit des r sultats est d pendante du respect des bonnes pratiques de laboratoires suivantes Le nom du test ainsi qu un num ro d identification sp cifique du test sont mentionn s sur le cadre de chaque microplaque Ce num ro d identification sp cifique figure galement sur chaque barrette Genscreen HIV 1 Ag EIA Num ro sp cifique d identification 49 Cette identification doit tre v rifi e avant chaque utilisation Toute barrette dont le num ro de test est absent ou diff rent de celui correspondant au test r alis ne doit pas tre utilis e Ne pas utiliser de r actifs apr s la date d expiration Ne pas modifier le mode op ratoire Reconstituer soigneusement les r actifs en vitant toute contamination Ne pas m langer des r actifs de lots diff rents au cours d un m me essai
13. er l exactitude et la pr cision des pipettes et le bon fonctionnement des appareils utilis s Lavage il est indispensable de respecter scrupuleusement les proc dures de lavage afin d obtenir les performances maximales du test Ne jamais utiliser le m me r cipient pour distribuer le conjugu et la solution de r v lation La r action enzymatique est tr s sensible tous m taux ou ions m talliques En cons quence aucun l ment m tallique ne doit entrer en contact avec les diff rentes solutions contenant les conjugu s ou le substrat e La solution de r v lation tampon substrat chromog ne doit tre color e en rose L apparition d une autre coloration dans les minutes suivant la reconstitution indique que le r actif est inutilisable et doit tre remplac Pour cette pr paration utiliser de pr f rence des r cipients et du mat riel de distribution en plastique usage unique ou de la verrerie pr alablement lav e l acide chlorhydrique 1N rinc e l eau distill e et s ch e Conserver cette solution l abri de la lumi re CHANTILLONS Pr lever un chantillon de sang selon les pratiques en usage Les chantillons pouvant tre utilis s sont du s rum du plasma ou des chantillons de culture cellulaire Les anticoagulants EDTA h parine citrate de sodium CPDA 1 et ACD ont t valu s et sont consid r s comme utilisables Les chantillons pr lev s l aide de tubes anticoagulants d
14. ge Temperatura limite e Lagerungstemperatur Limiti di temperatura di conservazione Limites de temperatura de armazenamento Temperaturbegr nsning Temperaturbegraensning BIO RAD 3 Bd Raymond Poincar Catalogue number R f rence catalogue e N mero de cat logo Bestellnummer e Numero di catalogo e N mero de cat logo Katalognummer e Katalognummer Authorised Representative Repr sentant agr e Representante autorizado Bevollm chtigter Distributore autorizzato Representante Autorizado e Auktoriserad representant e Autoriseret repr sentant Expiry date YYYY MM DD Date de p remption AAAA MM JJ Estable hasta AAAA MM DD Vervvendbar bis JJJJ MM TT Da utilizzare prima del AAAA MM GG e Data de expira o AAAA MM DD Utg ngsdatum r M nad Dag Anvendes fer AA A MM DD Consult Instruction for use Consulter le mode d emploi Consulte la instrucci n para el uso Siehe Gebruchsanweisung e Consultare le istruzioni per uso Consulte o folheto Informativo e Se instruktionsanvisning vid anv ndning Se instruktion far brug C 0459 cl 92430 MARNES LA COQUETTE France T l 33 0 1 47 95 60 00 Fax 33 0 1 47 41 91 33 07 2007 code 883519
15. ilu e 10 Si le liquide contaminant est un acide les surfaces souill es seront neutralis es au pr alable avec du bicarbonate de soude puis nettoy es l aide d eau de javel et s ch es avec du papier absorbant Le mat riel utilis pour le nettoyage devra tre jet dans un conteneur sp cial pour d chets contamin s les chantillons les r actifs d origine humaine ainsi que le mat riel et les produits contamin s seront limin s apr s d contamination soit par trempage dans de l eau de javel la concentration finale de 5 d hypochlorite de sodium 1 volume d eau de javel pour 10 volumes de liquide contamin ou d eau pendant 30 minutes soit par autoclavage 121 C pendant 2 heures minimum ATTENTION NE PAS INTRODUIRE DANS L AUTOCLAVE DE SOLUTIONS CONTENANT DE L HYPOCHLORITE DE SODIUM e La fiche de donn es de s curit est disponible sur demande e Eviter tout contact du tampon substrat du chromog ne et de la solution d arr t avec la peau et les muqueuses risques de toxicit d irritation et de br lures Ne pas omettre de neutraliser et ou d autoclaver les solutions ou effluents de lavage ou tout liquide contenant des chantillons biologiques avant de les jeter dans l vier D autre part la manipulation et l limination des produits chimiques doivent tre effectu es selon les bonnes pratiques de laboratoire Certains r actifs contiennent de l azoture de sodium comme conservateur l azotur
16. immunod ficience Humaine VIH Le VIH a t isol chez des patients atteints du SIDA et chez des individus sains faisant partie d une population risque pour le SIDA 2 On sait que la transmission se fait par voie sexuelle par l utilisation d aiguilles contamin es par transfusion de produits sanguins contamin s et de la m re infect e au foetus ou au nouveau n par voie placentaire 8 Il est normalement possible de d tecter dans le sang ou le plasma d un individu ayant t expos au virus des anticorps sp cifiques du virus confirmant ainsi l exposition Dans la phase qui pr c de l apparition d anticorps d tectables des antig nes viraux libres sont d j en circulation dans le sang l un de ces antig nes viraux est l antig ne p24 qui correspond la principale prot ine de la nucl ocapside Les tests de d pistage de l antig ne du VIH peuvent tre utilis s pour d tecter la pr sence d antig nes viraux et donc pour diagnostiquer une infection par le VIH et ce avant que la s roconversion n ait lieu La p riode d antig n mie qui pr c de l apparition des anticorps anti VIH est variable et peut durer de quelques jours quelques semaines chez les individus infect s Lors de la s roconversion les anticorps sp cifiques du virus forment des complexes immuns avec les antig nes circulants avec pour cons quence une forte chute du taux d antig nes libres dans le sang et ventuellement la disparition compl te de
17. ion de la solution de r v lation par lecture 490 nm des densit s optiques des cupules peut donner des r sultats erron s avec des densit s optiques sup rieures 0 100 en l absence de solution de r v lation Cependant ce ph nom ne n a pas t observ durant les valuations conduites sur 939 chantillons test s R FER NCES BIBLIOGRAPHIQUES 1 Barre Sinoussi F Chermann JC Rey F et al Isolation of T lymphotropic retrovirus from a patient at risk for acquired immune deficiency syndrome AIDS Science 220 868 871 1983 2 Gallo RC Salahuddin SZ Popovic M et al Frequent detection and isolation of cytopathic retroviruses HTLV II rom patients with AIDS and at risk for AIDS Science 224 500 503 1984 3 Coffin J Haase A Levy JA et al What to call the AIDS virus Nature 321 10 1986 4 Van der Graff M Diepersloot R Transmission of human immunodeficiency virus HIV HTLVAII LAV a review nfection 14 203 211 1986 5 Weis R Retrovirus and human disease J Clin Pathol 40 1064 69 1987 6 Tovo P Gabiano C Riva C et al Specific antibody and virus antigen expression in congenital HIV infection Lancet 1 1201 1987 7 Tegtmeier G Current tests for serologic detection of HIV 1 infection J Clin Immunoassay 11 123 125 1988 8 Schumacher R Garrett P Tegtmeier G et al Comparative detection of anti HIV in early HIV seroconversion J Clin mmunoassay 11 130 134 1988 9 Casey JM Kim Y Andersen PR et al Hu
18. man T cell lymphotropic virus type Ill immunologic characterization and primary structure analysis of the major internal protein p24 J Virology 55 417 423 1985 10 Ritter J Escaich S Trepo C et al HIV antigen detection in antibody negative sera Abstract 1627 IV International Conference on AIDS 1988 11 Veronese FD Sarngadharan MG Rahman R et al Monoclonal antibodies specific for p24 the major core protein of human T cell Leukemia virus type Ill Natl Acad Sci USA 82 5199 5202 1985 12 Schaeffler B Flesher A Shriver K Tam MR Monoclonal antibody detection of p25 HIV antigen in the serum and CSF of patients within the AIDS spectrum Abstract 7759 IV International Conference on AIDS 1988 13 Bos ES van der Doelen AA van Rooy N Schurs AHWM 3 3 5 5 Tetramethylbenzidine as an Ames test negative chromogen for horseradish peroxidase in enzyme immunoassay J Immunoassay 2 187 204 1981 14 Garner RC Walpole AL Rose FL Testing of some benzidine analogues for microsomal activation to bacterial mutagens Cancer letters 1 39 42 1975 15 Resnick L Veren K Salahuddin SZ et al Stability and inactivation of HTIVIII LAV under clinical laboratory environments JAMA 255 1887 1891 1986 16 Sarngadharan MG Markham PD The role of human Tlymphotropic retroviruses in leukemia and AIDS in Wormser GP ed AIDS and Other Manifestations of HIV Infection New Jersey Noyes Publications 1987 pp 218 220 17
19. ment ce stade de manipulation Il y a une diff rence de coloration significative entre une cupule vide et une cupule contenant la solution de r v lation ros e se reporter au paragraphe 12 pour la v rification automatique V RIFICATION SPECTROPHOTOM TRIQUE DU D P T DES CHANTILLONS ET DES R ACTIFS 15 Ajouter 100 yl de la solution d arr t R10 en adoptant la m me s quence et le m me rythme de distribution que pour la solution de r v lation Homog n iser le m lange r actionnel N B La distribution de la solution d arr t qui est incolore peut tre contr l e visuellement ce stade de la manipulation La coloration du substrat ros e pour les chantillons n gatifs ou bleu pour les chantillons positifs dispara t des cupules qui deviennent incolores pour les chantillons n gatifs ou jaunes pour les chantillons positifs apr s addition de la solution d arr t 16 Essuyer soigneusement le dessous des plaques Au moins 4 minutes apr s la distribution de la solution d arr t et dans les 30 minutes qui suivent l arr t de la r action lire la densit optique 450 620 700 nm l aide d un lecteur de plaques 17 S assurer avant la transcription des r sultats de la concordance entre la lecture et le plan de distribution et d identification des plaques et des chantillons 11 CALCUL ET INTERPR TATION DES R SULTATS 1 Validation de l essai Un test est valide si les crit res suivants sont remplis
20. ment tre utilis e pour ce test Dans ce cas diluer un volume de solution de lavage concentr e dans 29 volumes d eau Solution de travail conjugu 1 R4 R et Solution de travail conjugu 2 R5 R Les conjugu s 1 RA et 2 R5 sont des solutions conecnir es 100 X Pr parer s par ment la solution de travail conjugu 1 et la solution de travail conjugu 2 en diluant chacune au 1 101 me dans le diluant de conjugu R6 Effectuer la pr paration dans des r cipients propres en plastique Inscrire sur le r cipient le num ro de lot la date et l heure de pr paration et la date des conjugu s concentr s 1 ou 2 ainsi que l heure limite d utilisation 24 heures apr s pr paration M langer doucement les solutions de travail avant utilisation Apr s avoir t m lang es la solution de travail conjugu 1 est jaune et la solution de travail conjugu 2 est verte Pr paration de la solution de travail conjugu 1 ou 2 par barette Nombre de barettes 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 24 n cessaires Quantit de conjugu 20 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 240 concentr yl Quantit de diluant 2 2 3 4 5 6 Z 8 9 10 11 12 24 du conjugu ml une plaque enti re deux plaques enti res Solution de r v lation enzymatique R8 R9 Diluer le R9 dans le R8 au 1 1 1 me exemple 1 ml de r actif R9 dans10 ml de r actif R8 sachant que 10 ml sont n cessaires et suffisants po
21. n de lavage dilu e 3 Sortir le cadre support et les barrettes R1 de l emballage protecteur 4 D poser directement sans pr lavage de la plaque successivement suggestion de plan de distribution de la plaque 4 1 50 pl de diluant d chantillon dans chaque cupule 4 2 150 yl de contr le n gatif CO en 81 C1 4 3 150 yl de contr le positif C1 en D1 E1 4 4 150 yl d chantillon en G1 etc En fonction du syst me utilis il est possible de modifier la position ou l ordre de distribution des contr les En cas de test effectu sur chantillons de cellules trois contr les n gatifs de milieu de culture cellulaire sont n cessaires au lieu du contr le n gatif de la trousse CO S assurer que le diluant d chantillon est bien m lang l chantillon ou au contr le NB la distribution des chantillons et du diluant chantillons peut tre contr l e visuellement ce stade de la manipulation Le diluant d chantillon passe du vert au bleu povr signaler que l chantillon ou le contr le a bien t ajout dans le puits Lorsque les solutions contenues dans chaque puits sont bien m lang es elles ont une couleur uniforme Les chantillons de culture cellulaire peuvent ne pas changer de couleur en fonction du milieu de culture utilis se r f rer au chapitre 12 pour la v rification automatique V RIFICATION SPECTROPHOTOM TRIQUE DU D P T DES CHANTILLONS 5 Lorsque cela est possible couvrir d un film au
22. n provenant d un patient atteint de Lupus Eryth mateux a t trouv r actif avec le test Genscreen V HIV 1 Antigen EIA mais n a pas t confirm positif avec le test de confirmation Pr cision La r p tabilit intra essai a t tudi e en testant 3 chantillons positifs et 1 n gatif 30 fois chacun lors du m me essai La reproductibilit inter essai t tudi e en testant 3 chantillons positifs et un n gatif en triplicate pendant 5 jours par deux techniciens diff rents Les coefficients de variation obtenus sur les chantillons positifs test s sont inf rieurs 10 14 LIMITES DU TEST e La proc dure du test Genscreen HIV 1 Antigen EIA et le mode d interpr tation des r sultats doivent tre utilis s pour la recherche de l antig ne VIH 1 dans des chantillons de s rum de plasma ou de cultures cellulaires Il est recommand aux utilisateurs de ce kit de lire la pr sente notice d utilisation avec attention avant r alisation du test Les proc dures du test doivent tout particuli rement tre respect es en ce qui concerne le pipetage des chantillons et des r actifs le lavage des plaques et la dur e des tapes d incubation Un chantillon ne doit pas tre consid r comme r actif pour l antig ne VIH 1 partir d un seul r sultat r actif Afin d tablir la sp cificit de la r activit de chaque chantillon selon ce test il est n cessaire d effectuer de nouveaux dosages comme par exemple un
23. ntillons non r actifs par un chantillon fortement titr en antig ne VIH 1 contamination ponctuelle de la solution de r v lation par des agents chimiques oxydants eau de javel ions m talliques etc contamination ponctuelle de la solution d arr t Si apr s la r p tition de l essai la valeur d absorbance mesur e sur l un des deux doublets est sup rieure ou gale la valeur seuil le r sultat initial est reproductible et l chantillon est d clar r actif selon le test Genscreen HIV 1 Antigen conform ment aux limites d crites ci apr s Les chantillons dont la r activit a t r p t e avec le test Genscreen HIV 1 Antigen EIA doivent tre confirm s avec le test Genscreen HIV 1 Antigen Confirmatory Assay code 71121 l chantillon peut tre consid r positif pour l antig ne VIH 1 seulement si l antig ne VIH 1 est neutralis lors de la proc dure de confirmation 12 V RIFICATION SPECTROPHOTOM TRIQUE DU D P T DES CHANTILLONS ET DES R ACTIFS V rification spectrophotom trique du d p t des chantillons Apr s la distribution successive du diluant des chantillons R3 puis des chantillons il est possible de v rifier la pr sence des chantillons tester dans les cupules par une lecture spectrophotom trique 620 nm la densit optique d une cupule contenant un chantillon devra tre sup rieure 0 250 une DO inf rieure indique une mauvaise distribution de celui
24. oivent remplir le tube jusqu au niveau indiqu afin d viter une mauvaise dilution Extraire le s rum ou le plasma du caillot ou des globules rouges d s que possible pour viter toute h molyse Une h molyse tr s prononc e peut affecter les performances du test Les chantillons pr sentant des agr gats doivent tre clarifi s par centrifugation avant le test Les particules ou agr gats de fibrine en suspension peuvent donner des r sultats faussement positifs Les chantillons de culture de cellules n cessitant une dilution avant utilisation peuvent tre dilu s avec du milieu de culture cellulaire quivalent au milieu utilis pour la culture NE PAS UTILISER D CHANTILLONS INACTIV S PAR LA CHALEUR Les chantillons seront conserv s 2 8 C si le d pistage est effectu dans les 7 jours ou peuvent tre conserv s congel s 20 C Les plasmas devront subir une d congelation rapide par chauffage pendant quelques minutes 40 C pour limiter la pr cipitation de la fibrine En raison de l instabilit de l Ag VIH la chaleur des temp ratures sup rieures 40 C ne pourront pas tre utilis es Les chantillons ayant t congel s et d congel s plus de 3 fois ne doivent pas tre utilis s Si les chantillons doivent voyager les emballer selon la r glementation en usage pour le transport des agents tiologiques Extraire le s rum ou le plasma du caillot ou des globules rouges d s que possible pour
25. ram thylbenzidine TMB 5 ml RIO SOLUTION D ARR T 2 flacons Solution d acide sulfurique 1N 2 x 28 ml Films adh sifs pour microplaques 25 films 4 MATERIEL N CESSAIRE MAIS NON FOURNI Eau distill e Eau de Javel hypochlorite de sodium de 5 8 qui peut tre dilu e une concentration minimum de 10 de javel ou hypochlorite de sodium 0 5 Autres d sinfectants possibles thanol 70 ou WescodyneT 0 5 West Chemical Products Inc Pipettes de pr cision pour distribuer des volumes de 10 200 yl 1 ml 5 ml et 10 ml pr cision 10 Pipetteur multicanaux pour distribuer 100 pl ou 200 yl facultatif Eprouvettes gradu es 25 ml 100 ml 1000 ml Conteneur de d chets contamin s Bain marie ou incubateur de microplaques thermostat 37 C 1 C ou 40 1 C Dispositif de lavage manuel semi automatique ou appareil de lavage pour plaque de microtitration J e Appareil de lecture pour microplaques quip de filtres 450nm et 620 700nm e Barrettes non sensibilis es lorsque des plaques incompl tes sont test es sur automates e R cipients pour r actifs EIA facultatif Gants usage unique Papier absorbant R cipients propres en plastique polystyr ne ou polypropyr ne pour la pr paration des solutions de travail conjugu s et de la solution TMB Milieu de culture cellulaire par exemple RPMI 1640 contenant 10 de s rum de veau foetal quivalen
26. s de 8 cupules sensibilis es avec des anticorps murins monoclonaux anti p24 du VIH 1 Conservateur ProClin 300 Azide de Sodium lt 0 1 R2 SOLUTION DE LAVAGE CONCENTR E 20x 1 flacon Tampon TrisNaCI pH 7 4 235 ml Conservateur ProClin 300 0 04 R3 DILUANT DES CHANTILLONS 1 flacon Conservateur ProClin 300 0 5 20 ml Colorant vert t moin de l addition des chantillons co S RUM DE CONTR LE N GATIF Humain 1 flacon S rum humain non r actif pour l antig ne VIH et les anticorps anti VIH 10 ml anti VHC anti HTLV I et AgHbs Sulfate de gentamicine 0 005 Conservateur ProClin 300 0 5 S RUM DE CONTR LE POSITIF 1 flacon Antig ne VIH 1 purifi et dissoci 7 ml Conservateur ProClin 300 0 5 R4 CONJUGU 1 CONCENTR 100 x 1 flacon Anticorps de mouton biotinyl anti p24 Sulfate de gentamicine 0 005 1 ml Conservateur ProClin 300 0 5 Colorant jaune R5 CONJUGU 2 CONCENTR 100 x 1 flacon Avidine coupl e la peroxydase de Raifort Sulfate de gentamicine 0 005 1 ml Conservateur ProClin 300 0 5 Colorant vert R DILUANT DES CONJUGU S 1 flacon Tampon avec stabilisants de prot ines 100 ml Conservateur ProClin 300 0 5 R8 TAMPON SUBSTRAT 1 flacon Solution d acide citrique et d ac tate de sodium pH 4 0 60 ml contenant 0 01576 d eau oxyg n e et 476 de dim thylsulfoxyde DMSO R9 CHROMOG NE 1 flacon Solution contenant de la t t
27. t celui utilis pour la culture de cellules infect es en cas de test effectu sur chantillons de cellules Nous consulter pour une information pr cise concernant les appareils valid s par nos services techniques CONSIGNES D HYGI NE ET DE S CURIT Tous les r actifs de la trousse sont destin s l usage du diagnostic in vitro Porter des gants usage unique lors de la manipulation des r actifs et des chantillons et se laver les mains soigneusement apr s leur manipulation Ne pas pipeter la bouche Le mat riel d origine humaine utilis dans la pr paration du contr le n gatif a t test et trouv n gatif en antig ne VIHT en anticorps anti VIH1 et VIH2 en antig ne HB en anticorps anti VHC ainsi qu en anticorps anti HTIV1 HTIV 2 le contr le positif a t inactiv par la chaleur en pr sence d un agent dissociant Du fait qu aucune m thode ne peut garantir de fa on absolue l absence de virus VIH H patites B ou C ou d autres agents infectieux consid rer ces r actifs ainsi que les chantillons de patients comme potentiellement infectieux et les manipuler avec les pr cautions d usage Consid rer le mat riel directement en contact avec les chantillons et les r actifs ainsi que les solutions de lavage comme des produits contamin s Eviter les claboussures d chantillons ou de solutions les contenant les surfaces souill es seront nettoy es par de l eau de javel d
28. test de confirmation Tout test immunoenzymatique hautement sensible peut tre sujet des r actions non sp cifiques qui peuvent entra ner des r sultats faussement positifs La proportion des chantillons r actifs faussement r actifs d pend de a sensibilit et de la sp cificit du kit utilis Des r sultats n gatifs peuvent tre obtenus pour des chantillons dont le taux en antig ne VIH est trop bas comparativement aux limites de d tection du test tout comme des r sultats n gatifs peuvent tre observ s si le marqueur recherch n est pas pr sent au stade de la maladie auquel l chantillon a t pr lev La variabilit des virus VIH ne permet pas d exclure la possibilit de r actions faussement n gatives Aucune m thode connue ne peut offrir l assurance que le virus VIH est absent Si l addition d chantillon ou de r actif n a pas t faite conform ment aux instructions il est possible d obtenir un r sultat faussement n gatif Il faut envisager d effectuer un nouveau dosage en cas de suspicion clinique d infection ou d erreur au cours de la proc dure Une valeur d absorbance inf rieure 0 000 UA signale une erreur au cours de la proc dure ou un probl me li au mat riel l chantillon concern doit alors tre retest les facteurs pouvant affecter la validit des r sultats sont les suivants mauvais d p t de l chantillon dans le puits mauvais lavage des puits des microplaques non
29. tocollant en appuyant bien sur toute la surface pour assurer l tanch it 6 Incuber la plaque pendant 60 x 5 minutes 37 1 C ou 40x 1 C avec un incubateur statique chaleur s che 7 Retirer le film adh sif Aspirer le contenu de toutes les cupules dans un conteneur pour d chets contamin s contenant de l hypochlorite de sodium et ajouter imm diatement dans chacune d elles un minimum de 0 370 ml de solution de lavage Respecter un temps de trempage temps d attente de 20 60 secondes Aspirer de nouveau R p ter le lavage 4 fois un minimum de 5 lavages Le volume r siduel doit tre inf rieur 10 pl si n cessaire s cher la plaque par retournement sur une feuille de papier absorbant Si l on dispose d un laveur automatique respecter le m me cycle op ratoire 8 Distribuer rapidement 100 yl de la solution de travail conjugu 1 dans toutes les cupules Le conjugu doit tre agit avant emploi N B La distribution de la solution de travail du conjugu 1 qui est color en jaune peut tre v rifi e visuellement ce stade de la manipulation 9 Si cela est possible recouvrir la microplaque d un film neuf Incuber 30 5 minutes 37 1 C ou 40 1 C dans un incubateur statique chaleur s che 10 Retirer le film adh sif Aspirer le contenu de toutes les cupules dans un conteneur pour d chets contamin s contenant de l hypochlorite de sodium et ajouter imm diatement dans chacune d elles un minimum d
30. ulaires de VIH1 de groupe M sont compos s des g notypes suivants 10 de g notype A 10 de B 9 de C 5 de D 11 de E 2 de F 2 de G 1 de H 2 de J et 1 de N Le panel de dilution Ag VIH SFTS 96 comprend les g notypes suivants A B C D E F G H du groupe M et 1 g notype de groupe O Sensibilit analytique Le seuil de sensibilit du test a t tudi sur une gamme de dilutions pr par es partir de l talon national fran ais lysat viral purifi de g notype B dilu en plasma citrat n gatif ainsi que sur le panel BBI PRA 801 Lors de ces essais le seuil de d tection a t estim 8 pg ml d antig ne HIV quelque soit le protocole utilis La gamme d talonnage obtenue avec le standard HIV 1 Ag Standard code 72217 de Bio Rad est lin aire de O 100 pg ml Sp cificit diagnostique La sp cificit du test d termin e partir e d une population de 4038 donneurs de sang est estim e 99 95 d une population de 209 patients hospitalis s est estim e 100 Un panel de 105 chantillons de patients a t test comprend des chantillons e contenant des anticorps dirig s contre HAV HCV HTLV HSV EBV Rubella Toxoplasma Gondii Treponema pallidum CMV contenant des autoanticorps des taux d lgG d lgM de facteur rhumato de lev s provenant de femmes enceintes de cirrhotiques de polytransfus s ainsi que de patients atteints de Lupus Eryth mateux Syst matique Un seul chantillo
31. ur traiter 12 barrettes Homog n iser VALIDIT CONSERVATION La trousse doit tre gard e 2 8 C Chaque l ment de la trousse Genscreen HIV 1 Antigen EIA conserv 2 8 C peut tre utilis apr s une permi re ouverture jusqu la date de p remption indiqu e sur le coffret sauf indication sp cifique R1 Apr s ouverture du sachet les barrettes conserv es 2 8 C dans leur sachet d origine referm avec soin sont utilisables pendant 1 mois R2 La solution de lavage dilu e peut tre conserv e 2 30 C pendant 2 semaines La solution de lavage concentr e R2 peut tre conserv e 2 30 C R8 R9 Apr s reconstitution les r actifs conserv s l obscurit sont utilisables 6 heures temp rature ambiante 18 30 C R4 R5 Apr s reconstitution les conjugu s sont utilisables 24 heures temp rature ambiante 8 30 21 10 MODE OP RATOIRE Deux proc dures pour la d tection de l antig ne p24 du VIH 1 dans le s rum ou le plasma humains ou dans des 22 chantillons de culture cellulaire sont pr sent es ci dessous Proc dure Incubation Conjugu 1 Conjugu 2 R v lation incubation incubation colorim trique Incubation Incubation statique Incubation statique Incubation statique Incubation statique 37 C 37 1 C 37 1 C 37 1 C 18 30 C chaleur s che chaleur s che chaleur s che dans l obscurit 60 x 5 min 30 x 5 min 30
32. viter toute h molyse NE PAS UTILISER DE S RUMS OU PLASMAS CONTAMIN S HYPERLIP MIQUES OU HYPERH MOLYSES REMARQUE Aucune interf rence n a t mise en vidence sur des chantillons contenant 80 mg l de bilirubine 36 mg l d immunoglobuline M ou G ainsi que sur des chantillons lip miques contenant jusqu 5 g l de lipides et sur des chantillons h molys s contenant jusqu 5 g l d h moglobine RECONSTITUTION DES R ACTIFS Tous les r actifs doivent tre temp rature ambiante 18 30 C avant utilisation exception faite des conjugu s concentr s 1 et 2 RA et R5 1 R actifs pr ts l emploi R actif R1 Microplaque Chaque support cadre contenant 12 barrettes est conditionn en sachet ZIP Couper le sachet l aide de ciseaux ou scalpel 0 5 1 cm au dessus du ZIP Ouvrir le sachet et sortir le cadre Replacer dans le sachet les barrettes inutilis es Refermer le sachet soigneusement et le replacer 2 8 C R actif R3 Diluant pour chantillons R actif CO S rum de contr le n gatif R actif C1 S rum de contr le positif R actif R10 Solution d arr t 2 R actifs reconstituer Solution de lavage concentr e 20 fois R2 Diluer 20 fois la solution dans l eau distill e On obtient ainsi la solution de lavage pr te l emploi Pr voir 800 ml pour une plaque de 12 barrettes REMARQUE La solution de lavage Genscreen EIA 30X qui fait partie d autres kits Genscreen peut gale
Download Pdf Manuals
Related Search