G09036RIDASCREEN Calprotectin2013-07-18-FR - R
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1. n ralit s Avant utilisation porter imp rativement tous les r actifs et la plaque de microtitration temp rature ambiante 20 25 C Sortir les barrettes de puits de la plaque de microtitration du RIDASCREEN Calprotectin 13 07 18 6 Kommentar CF1 die Ubersetzerin war hier der Meinung dass Mirotiterplatte Plate bersetzt werden sollte Bitte pr fen flacon en aluminium d s qu elles sont a temp rature ambiante Les r actifs doivent tre bien m lang s juste avant l utilisation Apr s utilisation conserver les lames de microtitration dans le flacon ferm et les r actifs entre 2 et 8 C Les lames de microtitration ne doivent pas tre r utilis es Les r actifs et les lames de microtitration ne doivent pas tre utilis s lorsque l emballage est endommag ou que le r cipient n est pas tanche viter tout contact direct entre les chantillons et les composants de la trousse afin de pr venir une contamination crois e Tenir l abri du rayonnement direct du soleil pendant l ex cution du test Il est recommand de recouvrir ou de sceller les plaques de microtitrage pour viter les pertes par vaporation 9 2 Pr paration du tampon de lavage M langer 1 volume du concentr de tampon de lavage Wash dans 9 volumes d eau distill e 1 10 Pour cela verser 100 ml de concentr dans une prouvette 1000 ml et remplir avec de l eau distill e jusqu 1000 ml Les cristaux ventuellement2. En cas de contact cutan rincer l eau L ensemble des r actifs et mat riaux entrant en contact avec des chantillons potentiellement infectieux doivent tre manipul s avec des agents de d sinfection adapt s ou passer en autoclave 121 C pendant au moins une heure ATTENTION Pour viter la formation de gaz nocifs les r sidus de liquide contenant le r actif d arr t doivent tre neutralis s avant d tre plac s dans une solution d hypochlorite 8 Pr l vement et conservation des chantillons Si possible les chantillons de selles doivent tre refroidis pendant le transport et conserv s entre 2 et 8 C jusqu au d but du test Si l analyse n est pas effectu e r ception sous 3 jours une conservation 20 C ou une temp rature inf rieure est recommand e Si les chantillons de selles sont congel s les granulocytes neutrophiles pr sents risquent de mourir et la calprotectine d tre lib r e C est pourquoi la concentration peut tre l g rement plus lev e qu avec des chantillons frais viter les cong lations et d cong lations multiples des chantillons Les chantillons de selles ne doivent pas tre m lang s dans les r cipients de transport contenant des milieux de transport renfermant des conservateurs des s rums animaux des ions m talliques des agents oxydants ou des d tergents car ceux ci pourraient interf rer avec RIDASCREEN Calprotectin 9 R alisation du test 9 1 G
3. SE ET mg kg CV VM mg kg ET mg kg CV EE 53 8 29 SA 56 6 3 0 5 3 hae es 96 6 55 5 7 102 4 6 3 6 2 REC 136 5 5 6 4 1 130 5 5 2 4 0 Gel 246 7 14 1 5 7 267 6 15 0 5 6 13 1 2 Pr cision inter analyse La pr cision inter analyse a t d termin e par 3 techniciens qui ont test 4 r f rences en double dans le cadre de 20 analyses 2 par jour men es sur plusieurs jours Les valeurs DO de ces mesures ont permis de d terminer les concentrations en calprotectine l aide l talon ou la courbe d talonnage et de calculer la valeur moyenne VM l cart type ET et le coefficient de variation CV des mesures pour chaque chantillon Tableau 4 Pr cision inter analyse du test RIDASCREEN Calprotectin talon Courbe d talonnage GE ET mg kg CV VM mg kg ET mg kg CV R f rence zez 43 7 7 57 5 4 1 asl SE 106 5 72 6 8 112 8 8 3 7 3 SES 1296 78 6 0 138 5 7 6 5 5 R f rence 260 9 28 3 10 9 284 7 22 7 8 0 RIDASCREEN Calprotectin 13 07 18 15 13 2 Pr cision de l extraction La pr cision de l extraction a t d termin e par 2 techniciens qui ont test en double 3 chantillons de selles se trouvant au del du seuil dans le cadre de 10 analyses 5 jours 2 cycles par jour sur plusieurs jours Les chantillons ont t extraits avant chaque analyse et dilu s en cons quence Les valeurs DO de ces mesures ont per
4. au diagnostic in vitro Ce test doit tre effectu uniquement par du personnel de laboratoire ayant re u une formation ad quate Les recommandations relatives au travail dans les laboratoires m dicaux doivent tre respect es Les instructions concernant la r alisation du test doivent tre rigoureusement suivies RIDASCREEN Calprotectin 13 07 18 5 Les chantillons de selles doivent tre consid r s comme potentiellement infectieux et manipul s conform ment a la r glementation nationale relative a la s curit Ne pas pipeter les chantillons ou les r actifs a la bouche viter tout contact avec une peau rafl e ou avec les muqueuses buccales Porter des gants usage unique pour manipuler les chantillons et se laver les mains apr s le test Ne pas fumer manger ni boire dans les zones o sont manipul s les chantillons ou les r actifs de test Le tampon de lavage contient du thimerosal 0 1 comme conservateur viter tout contact avec la peau ou la muqueuse buccale L talon le contr le positif et le contr le faiblement positif ainsi que le tampon d extraction et de diluant d chantillon contiennent du Nah 0 05 ou 0 1 comme conservateur viter tout contact avec la peau ou la muqueuse buccale Le peroxyde d hydrog ne substrat est corrosif Le manipuler avec pr caution Le r actif d arr t contient de l acide sulfurique 1 N viter tout contact avec la peau et avec les v tements
5. disease Gut 2005 54 364 368 Fagerberg UL et al Colorectal inflammation is well predicted by fecal calprotectin in children with gastrointestinal symptoms J Pediatr Gastroenterol Nutr 2005 40 450 455 RIDASCREEN Calprotectin 13 07 18 16 Konikoff MR Denson LA Role of fecal calprotectin as a biomarker of intestinal inflammation in IBD Inflamm Bowel Dis 2006 12 6 524 534 Schopfer AM et al Fecal calprotectin correlates more closely with the simple endoscopic score for Crohn s disease SES CD than CRP blood leukocytes and the CDAI Am J Gastroenterol 2010 105 162 169 Van Rheenen PF et al Faecal calprotectin for screening of patients with suspected inflammatory bowel disease diagnostic meta analysis BMJ 2010 341 c3369 RIDASCREEN Calprotectin 13 07 18 17
6. plage de valeurs Il est recommand de diluer rapport 1 5 dans Diluent 3 les chantillons pr sentant une concentration en calprotectine sup rieure 600 mg kg dans le cadre de l talonnage 1 point ou sur la courbe d talonnage et de les retester RIDASCREEN Calprotectin 13 07 18 13 En outre nous recommandons de diluer rapport 1 5 dans Diluent 3 les chantillons pr sentant une valeur DO sup rieure a 3 0 dans le cadre de l valuation par talonnage a 1 point et de les retester 12 Limites de la m thode Le test RIDASCREEN Calprotectin permet de d pister les pitopes de la calprotectine humaine dans les selles Le diagnostic ne doit pas reposer exclusivement sur la d termination des concentrations en calprotectine et il doit tenir compte de l anamn se du patient RIDASCREEN Calprotectin 13 07 18 14 13 Caract ristiques de performance 13 1 Pr cision 13 1 1 Pr cision intra analyse La pr cision intra analyse a t d termin e dans le cadre d une analyse men e avec 4 r f rences test es en 40 r p titions chacune Les valeurs DO de ces mesures ont permis de d terminer les concentrations en calprotectine a l aide de l talon ou la courbe d talonnage et de calculer la valeur moyenne VM l cart type ET et le coefficient de variation CV des mesures pour chaque chantillon Tableau 3 Pr cision intra analyse du test RIDASCREEN Calprotectin Etalon Courbe d talonnage
7. RIDASCREEN Calprotectin R f G09036 R Biopharm AG An der neuen BergstraBe 17 D 64297 Darmstadt C Allemagne T l 49 0 61 51 81 02 0 Fax 49 0 61 51 81 02 20 1 Domaine d application Pour usage diagnostique in vitro RIDASCREEN Calprotectin est un kit de dosage immunoenzymatique destin a la d tection quantitative de la calprotectine humaine dans des chantillons de selles 2 R sum et explication du test La calprotectine est une prot ine se liant au calcium qui est entre autre compos e de granulocytes neutrophiles et qui est lib r e en cas d inflammation La calprotectine pr sente dans les selles sert de biomarqueur pour les processus inflammatoires et les modifications n oplasiques des voies gastro intestinales La calprotectine galement appel e MRP 8 14 calgranuline A B ou S100A8 A9 est une prot ine du groupe S100 qui se lie au calcium et au zinc Dans des conditions physiologiques la calprotectine se lie au calcium cette liaison conditionne la haute stabilit en cas d exposition la chaleur et dans le cadre d une prot olyse La calprotectine est compos e de granulocytes neutrophiles et de monocytes Dans le cytosol des neutrophiles la calprotectine est pr sente a des concentrations comprises entre 5 et 15 mg l et repr sente environ 60 des prot ines cytosoliques solubles et 5 de la prot ine complete La fonction biologique de la calprotectine reste en partie obscure On s
8. anticorps monoclonal souris dirig contre la calprotectine humaine Tampon d extraction concentr x3 tampon tris contient du NaN3 a 0 05 Tampon de diluant d chantillon solution de NaCl tamponn e avec des prot ines contient du NaN 0 1 pr t l emploi de couleur rouge Tampon de lavage concentr x10 solution de NaCl tamponn e avec du phosphate contient du thimerosal a 0 1 et un d tergent a 0 1 Etalon si un talonnage 1 point est utilis contient du NaN3 0 1 pr t a l emploi 5 talons si une courbe d talonnage est utilis e Concentrations en calprotectine des talons 1 5 19 5 56 1 95 275 800 mg kg contiennent du NaN 0 1 pr ts l emploi Contr le positif contient du NaNs 0 1 pr t l emploi Contr le faiblement positif contient du NaNz 0 1 pr t l emploi Anticorps monoclonal souris conjugu de la peroxydase dans une solution prot ique stabilisante pr t l emploi Substrat peroxyde d hydrog ne t tram thylbenzidine TMB pr t l emploi R action d arr t acide sulfurique 1 N pr te l emploi RIDASCREEN Calprotectin 13 07 18 4 5 Conservation des r actifs Tous les r actifs doivent tre conserv s entre 2 et 8 C et peuvent tre utilis s jusqu la date de p remption imprim e sur l tiquette Le tampon de lavage dilu est stable pendant 4 semaines lorsqu il est conserv en
9. ble d termination le tampon de dilution d chantillon RIDASCREEN Diluent 3 en guise de contr le n gatif et le contr le positif Control pour garantir la stabilit du r actif et l ex cution correcte du test L utilisation du contr le faiblement positif est facultative RIDASCREEN Calprotectin 13 07 18 11 Le test se d roule correctement lorsque la valeur d extinction DO du contr le n gatif 450 nm 620 nm est inf rieure 0 05 et que la valeur d extinction DO moyenne de l talon en cas d valuation par talonnage 1 point se situe dans la plage indiqu e sur la fiche technique sp cifique chaque lot de fabrication Le contr le positif permet de d terminer la validit du test que l on utilise l talon ou les cinq talons il doit se situer dans la plage de concentrations sp cifique chaque lot de fabrication indiqu e sur la fiche technique Lorsque le test RIDASCREEN Calprotectin est effectu sur un appareil ELISA enti rement automatis ouvert selon l automate la valeur DO mesur e de l talon Calibrator lorsque l valuation est r alis e par talonnage 1 point peut tre hors plage indiqu e sur le certificat sp cifique chaque lot de fabrication Sur les appareils ELISA enti rement automatis s galement seul le contr le positif Control est important pour d terminer la validit des r sultats de test il doit donc toujours tre
10. e R Biopharm AG ou du distributeur R Biopharm local Si l op rateur ne souhaite pas utiliser le logiciel RIDA SOFT Win net il peut utiliser d autres logiciels d valuation comportant le mod le de r gression logistique 4 param tres RIDASCREEN Calprotectin 13 07 18 12 11 1 Etalonnage un point avec quantification selon le mod le de r gression logistique 4 parametres Les param tres n cessaires au calcul 4PL A D de la courbe d talonnage ainsi que la valeur th orique pour l talon le contr le positif et le contr le faiblement positif sont indiqu s sur la fiche technique sp cifique chaque lot de fabrication jointe la trousse de test ils doivent tre compar s aux valeurs indiqu es dans le logiciel d valuation avant chaque mesure Dans les contr les qualit finaux R Biopharm AG d termine la courbe d talonnage dans des conditions de test optimales pour chaque charge de la trousse y compris les param tres A D ainsi qu une valeur th orique et une plage DO autoris e pour l talon ou une plage de concentrations autoris e pour le contr le positif et le contr le faiblement positif L talon est int gr afin de comparer les fluctuations et de contr ler la qualit du test Le contr le positif fournit des informations sur la validit du test Le logiciel RIDA SOFT Win net calcule un facteur de correction E partir de la valeur moyenne de la double d termination de l talon et de sa val
11. enir des r sultats corrects il convient donc de respecter rigoureusement les instructions L incubat pr sent dans les puits doit ensuite tre vid dans un r cipient d chet contenant une solution d hypochlorite des fins de d sinfection Puis placer la plaque sur le papier absorbant pour liminer l humidit r siduelle Enfin laver 5 fois avec un tampon de lavage dilu de 300 ul voir Rubrique 9 2 RIDASCREEN Calprotectin 13 07 18 10 Apr s chaque lavage veiller a vider compl tement les puits en les posant sur un endroit encore sec et inutilis du papier Si un automate de lavage est utilis veiller bien le r gler en fonction du type de plaque de microtitration utilis e En outre centrifuger une suspension de selles pr sentant des particules pour les liminer manuellement du puits et viter d obstruer les aiguilles de lavage Lors des tapes de lavage veiller aspirer tout le liquide Apr s la derni re tape de lavage la plaque doit tre enti rement recouverte d un papier absorbant propre ou d un essuie tout pour laboratoire pour liminer l humidit r siduelle 9 7 Deuxi me incubation Ajouter 100 ul de conjugu Conjugate dans tous les puits Enfin incuber la plaque pendant une heure temp rature ambiante 20 25 9 8 Deuxi me tape de lavage Suite l incubation le conjugu pr sent dans les puits doit tre vid dans un r cipient d chet contenant une sol
12. eur th orique ce qui lui permet de d duire les extinctions des chantillons de selles Une valuation s re et fiable des r sultats de test peut tre tablie dans les limites de la courbe d talonnage 11 2 Quantification l aide de la courbe d talonnage Le test RIDASCREEN Calprotectin peut tre valu par le biais d une courbe d talonnage qui doit tre int gr e dans chaque analyse L exemple de trac de courbe d talonnage peut tre r alis partir de la fiche technique sp cifique aux charges Dans les contr les qualit finaux R Biopharm AG d termine une valeur th orique et une plage de concentrations autoris e pour le contr le positif et le contr le faiblement positif dans des conditions de test optimale pour chaque charge de la trousse Lorsque la quantification est r alis e l aide de la courbe d talonnage le contr le positif fournit des informations sur la validit du test La plage de concentration pr d finie du contr le positif doit tre atteinte 11 3 R sultat du test partir d une valeur seuil gt 50 mg kg de calprotectine humaine dans les selles le r sultat est consid r comme positif Si les r sultats sont inf rieurs la valeur seuil les chantillons sont consid r s comme n gatifs La valeur seuil propos e pour les adultes savoir 50 mg kg peut galement tre appliqu e aux enfants de 4 17 ans Nous recommandons chaque laboratoire d tablir sa propre
13. int gr L utilisation du contr le faiblement positif Low control n est pas indispensable Un cart par rapport aux valeurs fournies et un assombrissement du r actif ou un bleuissement du substrat incolore avant l ajout dans le puits peuvent tre des signes de d gradation du r actif Si les valeurs pr d finies ne concordent pas v rifier les l ments suivants avant de recommencer le test Stabilit des r actifs utilis s Capacit de fonctionnement de l appareil utilis par ex talonnage Ex cution correcte du test Contr le visuel des composants de la trousse la recherche de contamination et d absence d tanch it une solution de substrat bleut e ne doit plus tre utilis e Si les conditions ne sont toujours pas remplies apr s r p tition du test contacter le fabricant ou le distributeur R Biopharm local 11 valuation et interpr tation La concentration en calprotectine en mg kg de selles est d termin e dans le cadre du test ELISA RIDASCREEN Calprotectin soit par talonnage 1 point voir Rubrique 11 1 soit selon le mod le de r gression logistique 4 param tres 4PL soit l aide d une courbe d talonnage voir Rubrique 11 2 Le logiciel d valuation RIDA SOFT Win net est n cessaire pour calculer les r sultats Le logiciel RIDA SOFT Win net ou l une de ses mises jour peuvent tre obtenus sur simple demande aupr s d
14. l chantillon Le flacon de coproculture RIDASCREEN pr rempli de 2 5 ml de tampon d extraction pr t l emploi peut contenir 10 mg d chantillon de selles Si les selles sont liquides 10 ul d chantillon peuvent tre mesur s l aide de la pipette puis pipet s directement dans le tampon d extraction Le pr l vement et l extraction de l chantillon sont d crits et illustr s pr cis ment dans le mode d emploi joint au flacon de coproculture RIDASCREEN il peut galement tre t l charg sur le site www r biopharm de RIDASCREEN Calprotectin 13 07 18 9 Les extraits de selles ne doivent pas tre conserv s mais tre utilis s imm diatement apr s dilution dans le cadre du test a Dilution manuelle des chantillons Diluer 100 ul de la suspension de selles obtenue avec le flacon de coproculture RIDASCREEN r f GZ3006 d crit dans la rubrique 8 du mode d emploi du GZ3006 dans 900 ul de tampon de dilution d chantillon RIDASCREEN Diluent 3 Utiliser 100 ul de l chantillon de selles sa dilution finale directement dans le cadre du test b Dilution d chantillon automatis e Si le test est r alis sur un appareil DSX ELISA enti rement automatis de la soci t Dynex le protocole de mesure appliquer sera mis disposition et install sur demande aupr s de R Biopharm AG Positionner le nombre requis de puits sur le support de la plaque de microtitrationRIDASCREEN Calpro
15. mis de d terminer les concentrations en calprotectine l aide l talon ou la courbe d talonnage et de calculer la valeur moyenne VM l cart type ET et le coefficient de variation CV des mesures pour chaque chantillon Tableau 5 Pr cision de l extraction inter analyse talon Courbe d talonnage VM mg kg ET mg kg CV VM mg kg ET mg kg CV el aa 64 0 5 0 7 9 67 4 5 0 7 5 pas ee 114 1 10 3 9 0 123 2 10 7 8 7 SE 264 0 33 3 12 6 284 8 22 1 7 8 14 Bibliographie Johne B et al Functional and clinical aspects of the myelomonocyte protein calprotectin J Clin Pathol Mol Pathol 1997 50 113 123 Fagerhol MK Calprotectin a faecal marker of organic gastrointestinal abnormality Lancet 2000 268 353 363 Tibble JA et al Surrogate markers of intestinal inflammation are predictive of relapse in patients with inflammatory bowel disease Gastroenterology 2000 119 15 22 Tibble J et al A simple method for assessing intestinal inflammation in Crohn s disease Gut 2000 47 506 513 Summerton CB et al Faecal calprotectin a marker of inflammation throughout the intestinal tract Eur J Gastroenterol Hepatol 2002 841 841 845 Striz l Trebichavski l Calprotectin a pleiotropic molecular in acute and chronic inflammation Physiol Res 2004 53 245 253 Costa F et al Calprotectin is a stronger predictive marker of relapse in ulcerative colitis than in Crohns
16. ne tape de lavage et une seconde incubation avec un anticorps monoclonal conjugu a de la peroxydase de raifort interviennent ensuite En cas de pr sence de calprotectine il se forme un complexe en sandwich compos de l anticorps immobilis de la calprotectine et de l anticorps conjugu Les anticorps marqu s a l enzyme non li s sont limin s lors d une tape de lavage ult rieure Apr s ajout du substrat l enzyme li e change la couleur de la solution pr sente dans les puits de la plaque de microtitration qui passe d incolore bleue lorsque l chantillon est positif En ajoutant le r actif d arr t la couleur passe du bleu au jaune L extinction mesur e est proportionnelle la concentration en calprotectine pr sente dans l chantillon RIDASCREEN Calprotectin 13 07 18 3 4 Contenu de la trousse Les r actifs d une trousse permettent d effectuer 96 d terminations Plate Extract Diluent 3 Wash Calibrator Couvercle transparent Standard 1 Standard 5 Couvercle blanc Control Couvercle rouge Low control Couvercle vert Conjugate SeroSC SeroStop 96 d terminations 2 x 100 ml 100 ml 100 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 12 ml 12 ml 12 ml Plaque de microtitration 12 lames de microtitration s cables sur un support rev tues d
17. nsion le facteur de dilution variable doit tre pris en compte lors de l valuation voir Tableau 2 Tableau 2 Facteur de dilution lors de l ajout constant au tampon d extraction dilu 5 ml en fonction de la quantit de selles pes e Poids mg Facteur de dilution ml 80 62 50 85 58 82 90 55 55 95 52 63 100 50 00 105 47 62 110 45 45 115 43 45 120 41 66 125 40 05 130 38 46 Quelle que soit la m thode de pes e l homog n it de la suspension de selles est obtenue par m lange complet au vortex Pour les selles liquides pipeter pr cis ment 100 ul et les mettre en suspension dans pr cis ment 5 ml de tampon d extraction dilu Apr s ajout du tampon d extraction les chantillons doivent tre incub s pendant 5 minutes a temp rature ambiante puis rem lang s compl tement au vortex Juste apr s l homog n isat doit tre centrifug pendant 10 minutes 3000 g au moins pour s dimenter les grosses particules de selles Le surnageant de l extrait doit tre dilu puis utilis directement pour le test RIDASCREEN Calprotectin 13 07 18 8 a Dilution manuelle des chantillons Diluer 20 ul du surnageant d cant dans 980 ul de tampon de dilution d chantillon RIDASCREEN Diluent 3 1 50 Ensuite utiliser 100 ul de l chantillon de selles sa dilution finale dans le cadre du test Le flacon de coproculture RIDASCREEN r f GZ3006 voir rubrique 9 4 2
18. peut servir d alternative au traitement et l homog n isation de l chantillon d crits ci dessus b Dilution d chantillon automatis e Si le test est r alis sur un appareil DSX ELISA enti rement automatis de la soci t Dynex le protocole de mesure appliquer sera mis disposition et install sur demande aupr s de R Biopharm AG Comme indiqu ci apr s l chantillon est ensuite dilu automatiquement par l appareil L appareil ELISA pipette 20 ul du surnageant d cant dans une plaque puits profonds puis les dilue dans 980 ul de tampon d extraction dilu 1 50 Cette op ration est suivie de deux cycles de m lange Positionner le nombre requis de puits sur le support de la plaque de microtitration RIDASCREEN Calprotectin Transf rer 100 ul de la dilution d chantillon de la plaque puits profonds vers la plaque de microtitration RIDASCREEN Calprotectin dilution finale 1 2500 Si le test est r alis sur un autre automate de pipetage ELISA contacter R Biopharm AG 9 4 2 Pr paration et mise en suspension de l chantillon dans le flacon de coproculture RIDASCREEN r f GZ3006 Le flacon de coproculture RIDASCREEN r f GZ3006 est une alternative rapide et simple la pr paration et la mise en suspension des chantillons par pes e des selles d crites la rubrique 9 4 1 Propos en tant qu accessoire du RIDASCREEN Calprotectin il simplifie consid rablement la pr paration de
19. pr sents dans le concentr doivent tre pr alablement dissous par r chauffement bain d eau 37 C 9 3 Pr paration du tampon d extraction M langer 1 volume de concentr de tampon d extraction Extract 100 ml dans 2 volumes d eau distill e 200 ml 1 3 9 4 Pr paration des chantillons Dans la mesure du possible maintenir les chantillons de selles entre 2 et 8 C jusqu leur traitement En cas de conservation prolong e gt 3 jours les maintenir a 20 C ou une temp rature inf rieure Les chantillons congel s doivent tre ramen s lentement temp rature ambiante 9 4 1 Traitement et remise en suspension des chantillons par pes e Peser 100 mg d chantillon de selles dans un tube essai puis pipeter 5 ml du tampon d extraction dilu dilution selon un rapport 1 50 Il est possible de peser entre 80 et 130 mg d chantillon de selles et pour garantir un rapport de dilution constant 1 50 les volumes de tampon d extraction sont d finis en fonction de l chantillon de selles pes voir Tableau 1 RIDASCREEN Calprotectin 13 07 18 7 Tableau 1 Quantit de tampon d extraction dilu n cessaire en fonction du volume de selles pes Poids mg Volume ml 80 4 00 85 4 25 90 4 50 95 4 75 100 5 00 105 5 25 110 5 50 115 5 75 120 6 00 125 6 25 130 6 50 Si des volumes de tampon d extraction constants de 5 ml sont remis en suspe
20. t ainsi s pargner une coloscopie inutile RIDASCREEN Calprotectin 13 07 18 2 De nombreuses publications ont d montr que la d tection de la calprotectine dans les selles correspondait tr s troitement avec les r sultats histologiques et endoscopiques de l activit pathologique chez les patients MICI C est pourquoi la d tection de la calprotectine dans les selles sert galement documenter de mani re objective la r ussite du traitement chez les patients souffrant d inflammations chroniques ainsi qu d tecter et circonscrire pr cocement une r cidive dans le cadre de la surveillance de ces patients pendant la p riode asymptomatique D tection de la calprotectine dans les selles e Distinction s re entre les maladies inflammatoires chroniques de l intestin et le syndrome du c lon irritable e D tection pr coce d une activit inflammatoire dans le tractus intestinal e Documentation objective de l intensit de l inflammation des fins de suivi en cours de traitement e Marqueur pour les inflammations aigu s de l intestin 3 Principe du test RIDASCREEN Calprotectin met en uvre des anticorps sp cifiques utilis s dans une r action antig ne anticorps de type sandwich Des anticorps monoclonaux dirig s contre la calprotectine humaine se lient a la surface du puits de la plaque de microtitrage Une suspension de l chantillon de selles a analyser est pipet e et incub e dans le puits de la plaque de microtitrage U
21. tectin La suspension de selles extraite avec le flacon de coproculture est dilu e automatiquement selon un rapport 1 10 dilution finale 1 2500 sur les plaques de microtitration de l automate ELISA Pour ce faire 10 ul de la suspension de selles sont pipet s directement du flacon de coproculture RIDASCREEN r f GZ3006 dans la plaque de microtitration Calprotectin puis dilu s dans90 ul de diluant 3 Diluent 3 Si le test est r alis sur un autre automate de pipetage ELISA contacter R Biopharm AG 9 5 Premi re incubation Apr s avoir plac un nombre suffisant de puits dans le support ajouter 100 ul d talon Calibrator si un talonnage 1 point est utilis recommand dans le cadre d une double d termination ou 100 ul d talon 1 talon 5 Standard 1 Standard 5 si une courbe d talonnage est utilis e recommand dans le cadre d une double d tection puis 100 ul de tampon de dilution d chantillon RIDASCREEN Diluent 3 contr le n gatif de contr le positif Control et de dilution d chantillon de selles analyser dans chaque puits Si le contr le faiblement positif Low control est utilis en transf rer 100 ul dans le cadre du test Enfin incuber la plaque pendant une heure temp rature ambiante 20 25 C 9 6 Premi re tape de lavage Il est important de proc der un lavage minutieux pour obt
22. tre 2 et 8 C Le tampon d extraction dilu est stable pendant 6 mois lorsqu il est conserv entre 2 et 8 C et au maximum jusqu la date de p remption du concentr viter toute contamination microbienne Une fois la date de p remption pass e la qualit n est plus garantie Le flacon en aluminium des lames de microtitrage doit tre ouvert avec des ciseaux de mani re a ne pas s parer la fermeture a clip Les barrettes des puits de la plaque de microtitration inutilis es doivent tre replac es imm diatement dans le flacon en aluminium ferm et conserv es entre 2 et 8 C Tenir le substrat incolore l abri de la lumi re directe du soleil pour pr venir toute d sint gration ou tout bleuissement par auto oxydation En cas de bleuissement le substrat ne peut plus tre utilis 6 R actifs suppl mentaires n cessaires accessoires n cessaires 6 1 R actifs Eau distill e ou d sionis e 6 2 Accessoires Balance de pr cision ou flacon de coproculture RIDASCREENS r f GZ3006 Malaxeur au vortex en option voir Rubrique 9 4 Micropipette pour volumes de 20 100 ul et 1 ml Eprouvette 1000 ml Minuteur Appareil de lavage pour plaques de microtitration ou pipettes multicanaux 300 ul Photom tre pour plaques de microtitration 450 nm filtre de r f rence 620 nm Papier filtre essuie tout pour laboratoire R cipient d chets contenant une solution d hypochlorite 0 5 7 Pr cautions R serv
23. uppose qu elle agit sur la protection des cellules contre les prot ases leucocytaires et bact riennes En outre sa propri t de liaison au zinc lui conf re une action antimicrobienne La calprotectine pr sente galement des propri t s de r gulation intra et extracellulaire lors du processus inflammatoire En cas de maladie inflammatoire de l intestin les granulocytes migrent dans les intestins et lib rent la calcprotectine qui est limin e dans les selles La concentration en calprotectine dans les selles d pend de la num ration en granulocytes neutrophiles qui migrent dans les intestins et qui y lib rent la calprotectine Ainsi la concentration en calprotectine dans les selles permet de mesurer la num ration en granulocytes dans les intestins et indique l intensit d un processus inflammatoire dans l intestin La pertinence clinique particuli re de la d tection de la calprotectine dans les selles r side dans la possibilit de poser un diagnostic s r d inflammation dans le tractus intestinal En termes de sympt mes il est tr s difficile de distinguer les patients souffrant d une maladie inflammatoire chronique de l intestin MICI de ceux qui pr sentent un syndrome du c lon irritable La d termination de la concentration en calprotectine dans les selles offre dans ce cas une indication s re de la pr sence d une inflammation dans l intestin Gr ce ce biomarqueur de nombreux patients souffrant du c lon irritable peuven
24. ution d hypochlorite des fins de d sinfection Puis placer la plaque sur le papier absorbant pour liminer l humidit r siduelle Enfin laver 5 fois avec 300 ul de tampon de lavage dilu Apr s chaque lavage veiller vider compl tement les puits en les posant sur un endroit encore sec et inutilis du papier 9 9 Troisi me incubation Ajouter 100 ul de substrat SeroSC dans tous les puits Enfin incuber la plaque pendant 15 minutes dans le noir temp rature ambiante 20 25 C Par ailleurs la r action est arr t e en ajoutant 50 ul de r actif d arr t SeroStop dans tous les puits Suite au m lange soigneux tapotement l ger sur le support l extinction est mesur e 450 nm avec une longueur d onde de r f rence de 620 nm Remarque lorsque les chantillons de patients sont tr s positifs le substrat peut former un pr cipit noir tre Ces chantillons doivent tre dilu s selon un rapport 1 10 puis de nouveau test s voir la Rubrique 9 5 dilution finale de l chantillon de selles 1 25000 10 Contr le qualit signes de d gradation du r actif des fins de contr le qualit transf rer imp rativement et chaque test l talon Calibrator si un talonnage 1 point est utilis recommand pour la d termination double ou les talons 1 5 Standard 1 Standard 5 si une courbe d talonnage est utilis e recommand dans le cadre d une dou
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