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1. Chaque point de gamme est r alis en triplicata Ceci permet de s assurer des param tres d efficacit de la qPCR les gains de fluorescence et seuils sont r gl s pour obtenir une courbe standard pr sentant des param tres d efficacit PCR optimum pente la plus proche de 3 3 et R le plus proche de 1 Les efficacit s et les pentes des 2 courbes doivent tre les plus proches possibles pour des r sultats pr cis Cette courbe standard est enregistr e dans la machine Une fois ces constantes de gains choisies il faut toujours reprendre les m mes pour les exp riences ult rieures Le m me protocole PCR qu en 2 amp 3 s applique Quartaton Quaitaion Data fll Gere Expression Bt End Port EE Aloe Dsciinaon llc Run rem RE 63 Ed 65 Teas Red 500200 Log Starting Quantity oo J Standard Se Os Unknown i VC E 944 R0092 Slope 3 tid v int 48 123 Texas Red E 89 7 RO 987 Slope 3 597 y int 51 280 Pour chaque exp rience nouvelle r alis e au minimum 2 points par exemple 25 et 12 5 ng ul de la gamme talon ainsi qu un contr le n gatif eau et un positive control 12 5 ng ul ADN d grad fourni seront toujours r alis s en triplicata Ils servent de standards internes aux exp riences et permettent la comparaison des r sultats obtenus de manipulation en manipulation Les rapports de fluorescence sont voisins de 1 2 Pr paration de la plaque volume final de 15 ul puits Le m l2. de 50 des fragments bp lt taille moyenne 0 5 0 6 100 300 0 6 0 8 500 15000 10000 50000 10000 50000 Pour un DNAQual lt 0 5 l ADN est tr s fortement d grad mais peut toutefois convenir pour certaines applications en augmentant la quantit Notes Pour un DNAQual gt 1 5 il est vraisemblable que le g ne cible soit amplifi dans cet chantillon et DNAQual n est pas utilisable de fa on fiable pour valuer la qualit de l ADN D ventuelles mutations ou d l tions du g ne cible dans certaines pathologies peuvent conduire des valeurs de DNAQual lt 1 sans que l ADN soit d grad O D D Q 7 avenue de Scandinavie 91953 Les Ulis Cedex France T l 01 69 07 94 77 Fax 01 69 07 95 34 adv eurobio fr eurobio fr Certifi s ISO 9001 et ISO 13485 e AbCys EUrObIO DNAQual REAL TIME PCR GAEDNQO0 UN10 GAEDNQOO UN V 33 reactions 96 reactions STORAGE keep all reagents at 20 C before opening After opening avoid more than 3 freezing defrosting cycles BH Instructions for use Research Use Only Reagents compatible with the following real time PCR equipments Applied Biosystems Prism 7500 qTOWER 2 2 Cepheid Smart Cycler Il Qiagen Rotor Gene Stratagene MX3005P Biorad Chromo4 CFX 96 Roche LightCycler 480 CONTENT OF THE KIT Reagents for 33 reactions Reagents for 96 reactions Master Mix 480 ul Master Mix 3x 480 ul Ready to use 3 minicapsules of s
3. e le ratio entre le nombre de copies du g ne cible et du g ne calibrateur dans l chantillon normalis par rapport ce ratio dans l ADN de r f rence Normalized fold expression Les points de gamme standard servent de r f rence interne Le ratio des fluorescences cible calibrateur du standard est ainsi gal 1 Pour qu un run soit valide le contr le n gatif eau ne doit pas donner d amplification et le positive control ADN d grad doit pr senter un ratio d expression normalis e inf rieur ou gal 0 6 Pour chaque chantillon test ce ratio est calcul automatiquement par la machine Pour comparer des r sultats de plaque plaque entrer manuellement les m mes valeurs de seuils que la plaque m re Exemple de proc dure suivre lors de la cr ation d une plaque pour test DNAQUAL sur Bio Rad CFX Manager Pour toute autre machine se r f rer la programmation de la machine et adapter le protocole d crit ci dessous Edition du protocole de PCR selon les conditions de BioRad Edition de la plaque Options Protocol 223 Plate D Start Run QuickPlate_96 wells_All Channels pltd N Selected Plate QuickPlate_96 wells_All Channels pltd Edit Selected Preview Fluorophores FAM HEX Texas Red Cy5 Quasar 705 Plate Type BR Clear Scan Mode All Channels 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 D Unk Unk Unk Unk Unk Unk Unk Unk Unk Unk Unk Unk F Unk Unk Unk Unk Unk Unk Unk Unk Unk Unk Unk Unk ET Cliquez s
4. Error 1 0 See Protocol 1 for optimizing the standard curve To compare results from plate to plate manually enter the same threshold values as the mother plate Example of results Gene Expression 0 8 0 6 0 4 Normalized Fold Expression 0 2 0 0 Cible Target 15 INTERPRETATION of RESULTS On the histogram Normalized gene expression DNAQual values are displayed The individual Ct values obtained from the qPCR software also give an indication of the amount of amplifiable DNA by qPCR by comparison to the standard curve A relationship between DNAQual value and the average size of DNA fragments present in a sample has been established For an application requiring higher size fragments it is recommended to increase the amount of DNA Average size of DNA bp 50000 50000 In each sample a mixture of different sizes of DNA fragments is present The distribution of theses sizes for a given value of DNAQual is presented in the table below DNAQual Size of 50 of fragments bp lt average size 0 5 0 6 100 300 0 6 0 8 500 15000 0 8 1 10000 50000 gt 1 10000 50000 For a DNAQual lt 0 5 DNA is very degraded but may be adapted to some applications by increasing the amount of DNA Notes For a DNAQual gt 1 5 it is likely that the target gene is amplified in this sample and DNAQual may not be useable with accuracy to evaluate the quality of its DNA Some deletions or mutations in the targ
5. O a gt Q 7 avenue de Scandinavie 91953 Les Ulis Cedex France T l 01 69 07 94 77 Fax 01 69 07 95 34 adv eurobio fr eurobio fr Certifi s ISO 9001 et ISO 13485 e AbCys 1 EUrObIO DNAQual PCR EN TEMPS REEL GAEDNQO0 UN10 GAEDNQ00 UN V 33 r actions 96 r actions Conditions de stockage conserver tous les r actifs 20 C jusqu utilisation et apr s premi re utilisation viter plus de 3 cycles de cong lation d cong lation BA Mode d emploi Pour un usage de recherche uniquement R actifs compatibles avec les syst mes de PCR en temps r el suivants Applied Biosystems Prism 7500 TOWER 2 2 Cepheid Smart Cycler Il Qiagen Rotor Gene Stratagene MX3005P Biorad Chromo4 CFX 96 Roche LightCycler 480 CONTENU DU KIT Compos s version 33 tests Compos s version 96 tests Master Mix 480 ul Master Mix 3x 480 ul Pr t l emploi 3 minicapsules de standard 3 minicapsules de Ouvrir la 20 C Apr s d ADN de r ference standard d ADN de minicapsule reconstitution viter plus 0 5 1 et 2 microgrammes r ference l aide du de 3 cycles de 0 5 1 et 2 microgrammes d capsuleur et cong lation d cong lation r hydrater l ADN voir Protocole 3 tubes vides pour les 3 tubes vides pour les Apr s reconstitution les standards standards standards DNA sont transf r s dans ces tubes et conserv s 20 C viter plus de 3 cycles de cong lation
6. alibrateur et VIC pour le g ne cible Noter le nom Calib pour Texas Red et Cible pour VIC Indiquez le nom de l chantillon dans Sample Name et tapez Entrer La moyenne de 3 chantillons de m me nom sera calcul e N oubliez pas de cocher ou taper Entrer sinon le changement ne se fait pas Les chantillons apparaissent d sormais sur le plan de plaque d marrer ecm Cliquez sur Experiment Settings target et cochez Calib comme R f rence Dans Settings n oubliez pas d indiquez le type de votre plaque selon qu elle soit blanche ou transparente et le volume r actionnel 15 ul ou plus si c est le cas Dans Experiment Settings samples choisir le nom du point standard 25 ng ul toujours inclus dans une exp rience pour la normalisation par rapport un ADN de haute qualit et le calcul de la d gradation de ADN des chantillons par rapport celui ci Cliquez sur Ok enregistrez la plaque Cliquez sur Start Run Indiquez le nom de fichier dans lequel l enregistrer A noter que les changements de noms et autres param tres peuvent tre fait en fin de run en cliquant sur View Edit plate R sultats Pour obtenir un graphe de gene expression il faut exclure de l analyse tous les chantillons ayant un valeur N A Utiliser les param tres suivants Analysis Mode Baseline Subtracted Curve Fit Ct Determination Single Thres
7. ange r actionnel doit tre pr par selon le tableau ci apr s Noter qu il est recommand que le test soit r alis sur 75 ng d ADN mais cette quantit peut tre diminu e jusqu 5 ng Ne pas exc der en revanche 300 ng au del duquel la qPCR ne serait plus lin aire et les r sultats impr cis Cette quantit peut tre d termin e au pr alable par OD 260 nm soit utiliser un volume constant pour une s rie d chantillon dont la concentration ne varie pas plus d un facteur 10 entre eux exemple entre 5 50 ng Compos s Volume Concentration finale pour un puits Notes Faire des triplicatas pour les diff rents chantillons tester assure une meilleure pr cision dans la mesure mais des duplicata peuvent galement tre utilis s Mettre 12 ul de Master Mix dans tous les puits puis ajouter l ADN tester Sceller la plaque 96 puits avec un film adh sif Le volume d ADN utilis peut tre de 1 ou 2 ul et de Mastermix 14 et 13 ul respectivement mais cela peut conduire des impr cisions de pipettages La gamme talon doit tre r alis e avec les m mes volumes que les chantillons 3 Programme PCR D naturation initiale 3 min 95 C 40 Cycles PCR 10 sec 95 C 30 sec 63 C 30 sec 72 C collecte et analyse des donn es cette tape du cycle 4 Expression des r sultats obtenus Ils sont exprim s en histogrammes avec en abscisse le nom de l chantillon et en ordonn
8. d cong lation Positive control 1 tube Positive control 1 tube Pr t l emploi 20 C d ADN d grad 12 5 ng ul d ADN d grad 12 5 ng ul Eau Biologie Mol culaire Eau Biologie Mol culaire Pr t l emploi T 1 d capsuleur 1 d capsuleur Voir Protocole R utilisable pour 50 minicapsules Mat riels n cessaires non fournis Plaque PCR temps r el Spectrophotom tre UV pour d termination quantit d ADN des chantillons tester appareil de qPCR en temps r el micropipettes c nes filtres st riles microtubes st riles centrifugeuse de paillasse pour microtubes de type eppendorf max 16 000 g Notes et pr cautions Centrifuger tous les tubes avant utilisation ne pas vortexer S assurer que les instruments ont t install s calibr s et maintenus en accord avec les recommandations du fabricant Il est possible d utiliser ce kit avec des ADN extraits de pr l vement en paraffine L utilisation de ce produit est limit e au personnel qualifi dans les techniques de qPCR Une attention particuli re doit tre mise en uvre pour conserver la puret des r actifs et des m langes r actionnels L utilisation de gants est obligatoire Des m thodes appropri es de pr paration d ADN g nomique doivent tre utilis es Limites d utilisation D ventuelles amplifications mutations ou d l tions du g ne cible dans certaines pathologies peuvent affecter DNAQual voir interpr tatio
9. ed Limitations for use Some amplifications mutations or deletions of the target gene in some pathologies can affect DNAQual see interpretation of results Alterations other than DNA breaks can affect DNAQual SENSITIVITY AND INTERFERENCE The minimum amount of DNA to test is 5 ng well For more than 200 ng well the accuracy of the test decreases The sensitivity is therefore higher than a SybGreen test or agarose gel advantageous for rare samples for which the amount of material is limited There is no interference if bacterial DNA human RNA or phenol contaminates genomic DNA 10 PRINCIPLE This kit allows assessing quantitatively the quality of DNA by quantifying the number of copies of a target gene compared to a calibrator gene in any human DNA sample by qPCR This method uses quantification software existing on qPCR machines The Biorad CFX manager software is given as an example in this technical sheet but can be adapted to any qPCR machine The 2 genes target and calibrator are measured with 2 specific probes carrying a specific fluorophore in duplex Texas Red excitation A 586 nm for the calibrator and VIC excitation A 538 nm equivalent HEX Yakima Yellow for the target gene The results are expressed by comparison with a reference DNA of high quality A standard curve with the reference DNA in triplicates for 50 25 and 12 5 ng first allows to refine the qPCR parameters gains that allow artificially amplify t
10. et gene may lead to DNAQual values lt 1 in absence of DNA degradation 16
11. he fluorescence on some qPCR machines on the qPCR machine available in your laboratory Gains will be set so that the ratio between the 2 fluorescence intensities target calibrator equals 1 for 50 25 and 12 5 ng ul of reference DNA The R and efficiency E of PCR must be set ideally R as close as possible to 1 and E for each probe as close as possible to 100 and close to each other the slope as close as possible to 3 3 A negative control water and a positive control Degraded DNA are also included The software calculates the ratio of fluorescence of the target gene over the calibrator The delta of delta of Ct AACt method of qPCR software is used for calculation Results are automatically transformed as 2 AACt and displayed automatically by histograms The number of copies of the reference gene in a sample is expressed compared to the reference DNA indicated as containing either 12 5 25 or 50 ng ul The ratio is 1 in this reference DNA If the software does not include the AACt method calculate the amounts for each gene from the Ct values and calculate the ratio The individual values of Ct also give an indication of the amount of amplifiable DNA in a sample by qPCR by comparison with the standard curve PROTOCOL 1 Standard curve of DNA The standard curve corresponds to serial dilutions of reference DNA 50 25 and 12 5 ng ul These DNAs are prepared by opening the minicapsules using the shell opener One shell opener for the
12. hold Analysis Mode Normalized expression AAC t Chart Data Relative to zero Baseline Method per Fluorophore VIC Auto Calculated Texas Red Auto Calculated Threshold Setting per Fluorophore VIC 51 46 User Defined Texas Red 504 20 User Defined Scaling options Unscaled Chart Error 1 0 Voir Protocole 1 pour l optimisation des courbes standard Pour comparer des r sultats de plaque a plaque entrer manuellement les m mes valeurs de seuils que la plaque m re Exemple de r sultats Gene Expression 0 8 0 6 0 4 Normalized Fold Expression 0 2 0 0 Cible Target INTERPRETATION DES RESULTATS Sur l histogramme des r sultats de Normalized gene expression la valeur DNAQual est obtenue Les valeurs individuelles de Ct obtenues a partir du logiciel de qPCR donnent aussi une indication de la quantit d ADN amplifiable par qPCR en comparant a la courbe standard Une relation entre la valeur DNAQual et la taille moyenne attendue de fragments d ADNs pr sents dans un chantillon a pu tre tablie Pour une application n cessitant une taille sup rieure a la taille moyenne il est recommand d augmenter la quantit d ADN Taille moyenne ADN simple brin bp 50000 50000 0 5 0 6 0 6 0 8 Sachant que tout chantillon est un m lange de fragments de plusieurs tailles la distribution moyenne de ces tailles en fonction de DNAQual est visible sur le Tableau ci dessous DNAQual Taille
13. ls 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 ni ni ni ni ni ni ni ni ni ni Select Plate Select Create New Select Standard wells of the 96 well plate 13 Select Sample Type and label them as standard Select Select Fluorophores to choose the fluorophores Select Texas Red for the calibrator gene and VIC for the target gene Write the Calib for Texas Red and Target for VIC For each of them enter the concentration 50 25 and 12 5 ng ul of DNA generally 2 triplicates of 50 25 or 12 5 ng ul are sufficient per experiment once the standard curve has been established for example for 25 ng ul enter 2 5 06 Select one well for water and select it as NTC At the end of the experiment this well will be excluded from the analysis using exclude well from analysis because its value is 0 indicated N A All samples with N A must be excluded in order to obtain a histogram of gene expression for the valid samples For the first experiment verifying the standard curve there are no other samples For experiments testing unknown samples select the wells of the samples including the positive control degraded DNA Select the 3 wells as the same condition Label them as Unknown in Sample Type Select Texas Red for the calibrator gene and VIC for the target gene Indicate the name of the sample in Sample Name and press Enter Click on Replicate serie
14. n des r sultats Des alt rations autres que des cassures pontages etc peuvent affecter la valeur de DNAQual SENSIBILITE ET INTERFERENCE La quantit minimum d ADN a tester est de 5 ng puits Au dela de 200 ng puits la pr cision du test diminue La sensibilit est donc consid rablement sup rieure a un test en SybGreen ou un gel d agarose avantageux pour des chantillons rares ou dont la quantit de mat riel est limit e Ce test ne subit pas d interf rence si l ADN g nomique est contamin par de l ADN bact rien de VARN humain ou du ph nol PRINCIPE Ce kit permet de quantifier la qualit d un ADN g nomique en mesurant le nombre de copies d un gene cible versus un gene calibrateur universel dans n importe quel chantillon d ADN g nomique humain par PCR quantitative qPCR Cette m thode utilise les logiciels de quantification des machines qPCR classiques le syst me Biorad CFX est donn en exemple dans cette fiche mais peut tre adapt a toute machine de qPCR Les deux g nes calibrateur et cible sont mesur s l aide de 2 sondes sp cifiques de couleurs fluorescente diff rentes mises en duplex Texas Red excitation A 586 nm pour le calibrateur et VIC excitation A 538 nm equivalent HEX Yakima Yellow pour le gene cible Tous les r sultats sont exprim s par rapport un ADN g nomique de r f rence de haute qualit qui ne contient qu une copie du g ne cible et du g ne calibra
15. of DNA standards as samples 3 PCR Program Initial denaturation 3 min at 95 C 40 PCR Cycles 10 sec at 95 C 30 sec at 63 C 30 sec at 72 C collection and analysis of data 4 Results They are displayed as histograms with on the x axis the name of the sample and on the y axis the ratio between the number of target gene and calibrator normalized to the ratio in the reference DNA of high quality normalized fold expression The points of the standard curve are used as internal reference The ratio of fluorescence target calibrator of the standard equals 1 by using the AACt method For each sample the machine calculates this ratio automatically For a run to be valid the negative control must not result in any signal and the positive control degraded DNA must have a normalized expression equal or below 0 6 Example of procedure to create a plate for DNAQUAL on Biorad CFX Manager after establishment of the standard curve 1 For other PCR machines refer to the corresponding programming and adapt from the protocol described below Editing of the protocol according to the BioRad system Editing of the plate Protocol 223 Plate n gt Start Run Create New Express Load QuickPlate_96 wells_All Channels pltd Ea lect Existing Selected Plate QuickPlate_96 wells_All Channels pltd Edit Selected Fluorophores FAM HEX Texas Red Cy5 Quasar 705 Plate Type BR Clear Scan Mode All Channe
16. rting Quantity C3 Standard os Unknown VC 944 R 0 992 Slope 3 464 v int 49 123 Texas Red E 99 7 R 987 Slope 3 59 y int 51 280 For each new experiment at least 2 concentrations for instance 25 and 12 5 ng ul of the standard curve as well as a negative control water and a positive control 12 5 ng ul degraded DNA provided are always performed in triplicate These are used as internal standard and allow comparisons between experiments The fluorescence ratios are close to 1 2 Preparation of the plate final volume 15 ul well The PCR mix should be prepared according to the table bellow It is recommended to perform the test on 75 ng of DNA per well but this amount can be decreased to 5 ng Do not exceed however 300 ng as results may not be accurate This amount can be determined first by OD measurement at 260 nm or the same volume can be used for a series of samples for which the concentration does not vary more than 10 times between samples example between 5 and 50 ng Reagents Volume Final Concentration for 1 well 12 Notes Making triplicates for the different samples leads to higher accuracy but duplicates can also be performed Dispense 12 ul in the wells and add DNA Seal the plate with an adhesive film The volume of DNA used can be 1 or 2 ul and Mastermix 14 et 13 ul respectively but these lower volumes can increase variations The standard curve must be performed with the same volume
17. s and choose 1 for the first series of replicates 2 for the second etc Choose 3 for the number of replicates in horizontal Do not forget to press on Enter for the change to be validated The plate then appears as below Select Experiments Settings target and select Calib as Reference Then in Settings indicate the type of plate white or transparent and the volume 15 ul or more if it is the case For Experiment Settings samples choose the name of the 50 25 or 12 5 ng ul standard DNA included in each experiment for normalization to the high quality DNA and calculation of degradation of DNA samples Select Ok save the plate Select Start Run Indicate the name of the file to save it as Note that any changes in the plate layout or for calculations can be performed after the run by choosing view edit plate 14 Results To obtain the gene expression graph all samples displaying N A must be excluded from the analysis The parameters below must be chosen Analysis Mode Baseline Subtracted Curve Fit Ct Determination Single Threshold Analysis Mode Normalized expression AAC t Chart Data Relative to zero Baseline Method per Fluorophore VIC Auto Calculated Texas Red Auto Calculated Threshold Setting per Fluorophore VIC 51 46 User Defined Texas Red 504 20 User Defined Scaling options Unscaled Chart
18. se standards is provided and is usable for opening 50 minicapsules To recover DNA from a minicapsule place it in the grey holding base The Data 2D matrix code must face down Cover the capsule holding base with the red lid While holding the grey base turn the lid clockwise until it stops Recover the opened minicapsule and proceed to rehydration add 40 microliters of Molecular Biology water let it rest for 10 minutes and pipet up and down 10 times with a P20 filter tip then transfer the content of the minicapsule with the P20 2x20 microliters into the tube labeled with the corresponding concentration and with the color code below Color Code for minicapsules and tubes 11 SHELLOPENER 4 INSTRUCTIONS FOR USE The software establishes a standard curve and thresholds automatically Nevertheless the user must notice of a point is incoherent and exclude it as well as adjust the threshold manually Each concentration of standards is tested in triplicate This ensures that the R and efficiency E of PCR are set ideally R as close as possible to 1 and E for each probe as close as possible to 100 and close to each other the slope as close as possible to 3 3 The standard curve is recorded on the machine so that if more than one plate is processed the same gains are used The same protocol as in 2 amp 3 applies Quaitaion Guartision at gl Gene apes Et End Port EE Alek Dict ly QC S Run irio Boe Ba 64 65 Log Sta
19. tandard 3 minicapsules of standard Open the minicapsule 20 C After reference DNA 0 5 1and2 reference DNA 0 5 1 and 2 withthe shell opener reconstitution avoid micrograms micrograms and rehydrate DNA more than 3 see Protocol freezing defrosting cycles 3 empty tubes for standards 3 empty tubes for standards After reconstitution standard DNA are transfered into these tubes and kept at 20 C avoid more than 3 freezing defrosting cycles Positive control 1 tube of Positive control 1 tube of Ready to use 20 C Degraded DNA 12 5 ng wul Degraded DNA 12 5 ng wul Molecular Biology water Molecular Biology water Ready to use 1 shell opener 1 shell opener See Protocol for RT opening 50 minicapsules Materials required and not provided PCR plate UV Spectrophotometer for measuring DNA concentration of samples to be tested qPCR machine pipets tips with filters centrifuge for microtubes max 16 000 g Notes and caution Centrifuge all tubes before use do not vortex the probes Ensure that all instruments are installed calibrated and maintained according to manufacturers recommendations It is possible to use this kit with DNA extracted from paraffin blocks Use of this product is limited to qualified personnel in the techniques of qPCR Extreme care should be taken to preserve the purity of the components of the kit and reaction setups Use gloves Appropriate methods for DNA preparation must be us
20. teur Une gamme standard de cet ADN de r f rence 3 triplicata 50 25 et 12 5 ng ul chacun permettra d affiner les param tres de la qPCR obtention des r glages des gains permettant d amplifier artificiellement la mesure d une fluorescence sur certaines machines pour la machine de qPCR disponible au laboratoire Les gains seront r gl s pour que le rapport des 2 fluorescences Cible Calibrateur soit gal 1 pour 50 25 et 12 5 ng ul de l ADN de r f rence Le R et les efficacit s E de PCR sont r gl s id alement R au plus proche de 1 et Efficacit E des deux sondes les plus voisines possibles et de 100 la pente de la droite la plus proche de 3 3 Un contr le n gatif eau et un positive control ADN d grad seront galement inclus Le logiciel calcule le rapport de fluorescence du g ne cible sur fluorescence du calibrateur La m thode de delta de delta de Ct AAC des logiciels de qPCR est utilis e pour les calculs Les r sultats seront automatiquement transform s en 2 AACt et exprim s en histogrammes automatis s Le nombre de copies de g ne cible est exprim par rapport cet ADN de r f rence qui est indiqu comme contenant 12 5 25 ou 50 ng ul de g ne cible Le rapport est gal 1 dans cet ADN Dans le cas o le logiciel ne dispose pas de la m thode du AAC calculer les quantit s pour chaque g ne partir des Ct et faire le rapport Les valeurs individuelles de Ct donnent aussi une indica
21. tion de la quantit d ADN amplifiable dans l chantillon test par qPCR en comparant la courbe standard PROTOCOLE 1 R alisation de la gamme standard d ADN La gamme correspond a une cascade de dilution de ADN de r f rence 50 25 et 12 5 ng ul Ces ADNs sont pr parer en d capsulant les minicapsules l aide du d capsuleur Un d capsuleur pour les standards est fourni cot des r actifs Il est utilisable pour au moins 50 capsules Pour r cup rer ADN d une minicapsule placer celle ci dans le support gris Le code Data matrice 2D doit se trouver la base Couvrir le support gris avec le couvercle rouge En tenant le support gris tourner le couvercle dans le sens des aiguilles d une montre jusqu en butt e R cup rer la minicapsule et proc der la r hydratation Pour se faire ajouter 40 microlitres d eau Biologie Mol culaire laisser reposer 10 minutes et effectuer 10 pipetage refoulement avec un c ne de P20 puis transf rer le contenu de la minicapsule avec c ne de P20 2x20 ul dans le tube marqu de la concentration correspondante avec le code couleur ci dessous Code couleur des minicapsules et tubes SHELL JPENER INSTRUCTIONS FOR USE Le logiciel tablit la droite standard et les seuils de mani re automatique Cependant il est de vigilance de l utilisateur de remarquer si un point peut tre incoh rent et de l exclure ainsi que de r gler les seuils manuellement si n cessaire
22. ur l onglet Plate s lectionnez Create New S lectionnez les puits Standards de la plaque 96 puits Cliquez sur Sample Type pour les indiquer en tant que standard Cliquez sur Select Fluorophores pour s lectionner les fluorophores utilis s Cochez Texas Red pour le g ne calibrateur et VIC pour le g ne cible Noter le nom Calib pour Texas Red et Cible pour VIC Pour chacun d entre eux indiquez la concentration dans concentration 50 25 et 12 5 ng ul d ADN g n ralement 2 triplicata 25 et 12 5 ng ul sont suffisants une fois la gamme standard tablie Exemple pour 25 ng ul entrez 2 5 06 S lectionner un puits avec de l eau et indiquer NTC A la fin de l exp rience celui ci sera exclu de l analyse exclude well from analysis car sa valeur est 0 N A Proc der de la m me mani re si des chantillons test s sont indiqu s N A pour obtenir un histogramme de gene expression Pour la premi re qPCR v rifiant la courbe standard il n y a pas d autres chantillons Pour les exp riences testant des chantillons inconnus s lectionnez ensuite les puits des chantillons tester y compris le positive control ADN d grad fourni S lectionnez les 3 puits r unissant la m me condition Indiquez les chantillons tester en tant que Unknown dans Sample Type Fa tes de m me pour les fluorophores cochez Texas Red pour le g ne c
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