Mode opératoire recherche du Vibrio cholerae - missions
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1. nie ne eebe Ve teen does da none ee den eebe nada et 15 B GELOSE NON SELECTIVE aan a E e a n E ETES 17 C COLORATION DE GRAM nina ays iays anys a ENNEN EEN 18 D EST DODERER Ed 20 E TESTAU LATEX Aessen dencre aspa E reine einer eege See 21 F ENSEMENCEMENT EN STRIE Ee Ee ege Le nt Pts at M EE 22 G TABLEAU DES CONSOMMABILES aR NSS AR Sl EEN 24 H LABORATOIRE DE CONFINEMENT SECURITE BIOLOGIQUE NIVEAU 3 25 l LISTE DES EQUIPEMENTS J CALIBRAGE DE LA METHODE QUANTITATIVE K PLANNING HEBDOMADAIRE DU PROGRAMME D ANALYSE LISTE DES TABLEAUX ET FIGURES TABLEAU 2 DESCRIPTION DES ETAPES DE VALIDATION 8 TABLEAU 1 PROJECTION INDICATIVE DES ANALYSES A RRALISER 9 TABLEAU 3 TABLEAU DES EE Ee EE detre O 13 FIGURE 1 PLAN DE VALIDATION DES METHODES D ANALYSES nn eee 7 FIGURE 2 SCHEMA METHODOLOGIQUE 1 Objectifs et r sultats de l tude 1 1 Contexte Les pid mies de chol ra sont r currentes dans les pays du bassin du lac Tchad en particulier depuis une vingtaine d ann es Les sources de contamination et les modes de transmission sont encore mal compris malgr les hypoth ses propos es d s le2. 33 0 1 55 23 42 25 33 0 6 10 37 30 17 TABLE DES MATIERES 1 OBJECTIFS ET RESULTATS DE LU ETUDE ENEE REENEN NEES eege Nee cas 5 1 1 CONTEXTE etre ee de 5 1 2 le E 6 1 3 RESULTAT 1 VALIDATION AU LABORATOIRE D UNE METHODE QUALITATIVE ET QUANTITATIVE D ISOLEMENT DU VIBRION CHOLERAE 6 1 4 RESULTATS 2 FORMATION DU PERSONNEL eee 1 5 RESULTATS RECHERCHE DE LA PRESENCE DU V CHOLERAE DANS L ENVIRONNEMENT 2 SCHEMA DE PRINCIPE DES DEUX METHODES 10 3 PRELEVEMENT DE TERRAIN DE HYDRIQUIE 11 4 MODE OPERATOIRE POUR L ISOLEMENT DU VIBRIO CHOLERAE DANS DES ECHANTILLONS D EAU 12 4 1 METHODEQUALITATIVEL ege una a ENEE late cet ec ee ete etes vent PS D GE LE 4 0 110 L EE D DE RE D EE 4 1 2 Ensemencement initier dis aa aaa ias nue reor sias d n E SE dE 41 e eidel LEE 4 2 METHODE QUANTITATIVE 4 2 1 Filtration 4 22 E rise nie RAR nn Ds Po RUE E Ge den EE 4 2 4 Test QU Latex au trente Reine de ete tent tease se 4 2 5 Conservation des souches positives 14 5 BIBLIOGRAPHIE sisi a 14 II 15 A
3. b Collecterle film blanchatre en surface l aide d une oeuse c Effectuer un isolement sur milieu TCBS1 rerama Si colonie bien isol e d aspect plates lisses et de couleur jaune Colonies m isol es alu uu ssiuoSriu SUD po yN 7 1 a Filtrer 1 litre du deuxi me chantillon surune ou plusieurs membranes max 5 pour litre noter les volumes exactes b Placer ensuite chaque membrane sur des boites de g loses TCBS Nota si un trop grand nombre de colonies sont pr sentes sur la membrane proc der des dilutions afin a Les colonies supectes apparraissent jaunes etplates et d gradentla b D nombrer l ensemble des colonies suspectes pour chaque boite ensuite d encadrerle r sultats et appliquer ensuite additionner les r sultats afin d obtenir la concentration pour un litre d chantillon Repliquer une colonie supsecte par boite de g lose TCBS sur une g lose non s l ctive afin de proc der l identification de la colonie suspect Repliquerles colonies supects sur une g lose non s lective de type R aliserle test R aliser le test d OXYDASE de GRAM R aliser une galerie d identification 20 R aliser un test au LATEX Figure 2 Sch ma m thodologique Les modes op ratoires sont pr sent s en annexe 7 un facteur correctif au r sultats du
4. d nombrement U01 21 1 9P anepuenb poy nN 10 3 Pr l vement de terrain de type hydrique Bonne pratique de pr l vement Le pr lever doit se laver les mains avant chaque pr l vement et utiliser des gants jetables R aliser le pr l vement d eau en duplicate 2 fois 1 litre en bouteille PVC ou plastique st rile Noter sur le terrain le lieu l heure la provenance du lieu village le plus proche coordonn es GPS si besoin Etiqueter les bouteilles avec les codages pr par s au laboratoire pr l vements 1 P1 et pr l vement 2 P2 Un premier litre sera analys d s r ception au laboratoire ou dans la journ e P1 l autre P2 sera stock ferm en chambre froide 4 C et l abri de la lumi re Les r cipients doivent tre autoclavable afin de pouvoir tre st rilis ou usage unique d faut utilis des bouteilles d eau min rale non usag es Transport et conservation Les chantillons doivent tre transport s dans une glaci re ferm e l abri de la lumi re contenant des pains de glace afin de maintenir une temp rature inf rieure 10 C et arriver au laboratoire moins de 12h apr s pr l vement La glaci re de transport doit tre lav e et d sinfect e apr s chaque journ e d utilisation solution nettoyage 0 1 en chlore dissoudre 1 5 gr de Hypochlorite de Calcium dans un litre d eau Une tra abilit des ch
5. porosit 0 45u Millipore HAWG047S6 boite de 600 x 2 Rampe de filtration avec 3 puits de filtration r utilisable et flambable en inox Pompe vide XX2504735 EE EQUIPEMENT LABORATOIRE Refr g rateur 2 Incubateur 37 C 1 Iinubaer3 j Groupe electrog ne Thermom tre de contr le pour incubateur El Ell Ee ET ET WE Autoclave pour destruction et d sinfection EQUIPEMENT TERRAIN POUR PRELEVEMENT pHm tre 1 tere WTW k Flaconnage 1 litre plastique st rile usage FRAIS unique autoclavable plastiques d eau min rale non usag es ons main is as ai i Gant jetable 500 pade ANALYSE LABORATOIRE Pipette pasteur plastique 612 1702 boite de 250 Pipette Pasteur verre 612 0914 Boite de 1000 Micropipette 20 200pl 613 5265 Cone de 250 yl 613 0248 boite de 960 cones 500 tubes 214 1132 vendu par 500 Tube Corning de 50 ml st ril Grosseron Erlenmeyer 150ml VW Sac autoclave API 20 E catalogue BioM rieux France 5 rue des Aqueducs BP 10 Huile de paraffine 69290 Craponne renseignements 20 galerie 20190 Catalogue analytique API 20 70100 Huile de paraffine 1x125 ml boite de 25 galerie 4 4 2 1 2 5000 assistance technique r actifs et quipements T l 0 820 22 9090 commerciaux et commandes
6. DES STRIES DANS UN MOUVEMENT DE VA ET VIENT EN PRENANT SOIN DE NE PAS TRAVERSER CREUSER O ARRACHER LE MILIEU VOUS DEVEZ LA DEPOSER UNIQUEMENT EN SURFACE REFERMEZ LA BOITE DE PETRI ET PLONGEZ NOUVEAU L ANSE DANS LA FLAMME DU BEC BUNSEN JUSQU A L INCANDESCENCE PATIENTEZ QUELQUES SECONDES LE TEMPS QU ELLE REFROIDISSE 22 2 ROUVREZ VOTRE BOITE DE PETRI ET EFFECTUEZ LE MEME MOUVEMENT DE STRIES DANS LE 2ND TIERS DE LA BOITE EN PRENANT SOIN DE REPASSER SUR L EXTREMITE DE LA DERNIERE STRIE EFFECTUEE PRECEDEMMENT SUR LE 1ER TIERS ET CELA DANS LE BUT DE RECUPERER SUR L ANSE DE LA SOLUTION VOTRE ANSE ETANT STERILE A LA SUITE DE SON PASSAGE SOUS LA FLAMME FAIRE DES STRIES SANS RECUPERER DE LA SOLUTION DEJA PRESENTE SUR LA BOITE SERAIT INUTILE REFERMEZ LA BOITE DE PETRI PLONGEZ A NOUVEAU L ANSE DANS LA FLAMME DU BEC JUSQU A INCANDESCENCE PATIENTEZ QUELQUES SECONDES LE TEMPS QU ELLE REFROIDISSE 1 3 2 COMME PRECEDEMMENT FAITES DES STRIES DANS LE ET DERNIER TIERS DE VOTRE BOITE EN PRENANT GRAND SOIN DE RECUPERER DE LA SOLUTION EN REPASSANT UNE SEULE FOIS SUR L EXTREMITE DE LA DERNIERE STRIE EFFECTUEE DANS LE 2ND TIERS UNE FOIS VOUS STRIES TERMINEES REFERMEZ LA BOITE DE PLONGEZ L ANSE DANS LA FLAMME DU BEC BUNSEN JUSQU A SON INCANDESCENCE ET POSEZ LA SUR LE PRISME VOTRE MILIEU EST AINSI ENSEMENCE AVEC LA SOLUTION BACTERIENNE INCUBEZ VOTRE BOITE LES RESULTATS DEVRAIENT MONTRER DES COLONIES MUL
7. alkaline Incubation 24h 30 C Mesure de la turbidit de S et comparaison avec standard Mac Farland R alisation partir de 5 de 4 solutions filles S1 S2 S3 S4 de concentration 1 1000 1 100 1 10 1 Incubation 24h 30 C Mesure de la turbidit des 6 solutions S1 S2 53 54 55 S6 et comparaison avec standard Mac Farland Ensemencement de 6 membranes 0 22um par filtration des 6 solutions et d pose sur g lose TCBS Incubation 24h 37 C Lecture des boites et r alisation d une courbe Mac Farland Turbidit fx nombre d UFC 100ml 27 Mode op ratoire recherche du Vibrio cholerae dans l environnement k Planning hebdomadaire du programme d analyse di Mardi I i 7 Identification de trois 3 Transfert du surnageant Ge icolonies diff rentes sur E S isur milieu de culture z N Ge i We R ception r f rencement 5 Reprise des colonies bien boite positive d s lectif TCBS GE i iet stockage des i iisol es d aspect plates i P 2 heures L i iDestruction des boites de petri i chantillons ilisses et de couleur jaunes GEES i i I on eur TCBS r isolement sur de 8 o 4 Incubation 24h 37 I i ipr paration des i i test rapide chol ra i Matin REECH SE i i i iNettoyage et pr paration du 2 heures i s ro agglutination i si atypique API 20 E
8. en laboratoire 6 Incubation 24 h 37 C idernier recours i si positif macroscopique imilieux de cultures pour lai i ilancer un manip iquantitative isemaine bis Lecture des filtres idiff rente sur par boite i 11 bis Encemencement des comptage de toutes les positive 1 Filtration des i ee e i SA i E 5 2 imilieux TCBS avec 3 filtres bact ries suspectes i i chantillons d eau et mise i e SE i GRAM on BEER chantillon en parall lei 1 heure i Pr aration des RE ss Ewe ement oC des milieux 1200 500 ml sur l chantillon 4 bis R isolement de 3 has Apr s post colonies repr sentatives sur 779 agglutination i ide culture pour la semaine i i si atypique API 20 E en dernier midi Incubation 16h 30 C Mee i x ess i D heures i 2 heures 2 bis Incubation 24h 37 C 5 bis Incubation 24h 37 C Saisie infos suivi dans cahier de aisie infos suivi dans aisie infos suivi dans aisie infos suivi dans cahier Saisie infos suivi dans cahier M thode qualitative M thode quantitative Pr paration et saisie de r sultats 28
9. milieu g los 4 empruntes successives de recueil E a 1 valuuation de la variation de la Comptage des colonies sur filtre apr s d p t sur TCBS Sensibilit et gamme de la m thode 4 chantillons de provenance diff rentes Tableau 1 Description des tapes de validation Mat riel 1 Solution titr e VC 3 filtres 3 milieu enrichissment 3 TCBS 3 GNA 3 test oxydase aneneen A D Q Q K 4 chantillons terrain 20 filtres 4 milieu enrichissement 4 50ml A TCBS 12 GNA ahimindhiasma nanlimimaaa ai f de concentration croissante effectuer 6 standards x Farland 6 solutions titr es i 6 menbranes 4 Solution titr e VC i 8 filtres 8 boites TCBS 2 Solution titr e VC i 8 filtres 8 boites TCBS 11 Solution titr e VC i 4 filtres 16 boites TCBS 4 chantillons terrain Mare Puits Point de 1 stockage Rivi re 1 4 R sultats 2 Formation du personnel La validation de ces deux m thodes sera effectu e dans le Laboratoire de Recherche v t rinaire et zoologique de Farcha Ndjamena LRVZ Cette tape de validation des techniciens microbiologistes du Laboratoire de R f rence de Ndjamena Microbiologie humaine et du LRVZ Microbiologie environnementale et animale permettra de r aliser le protocole et d optimiser sa mise en place La formation permettra aux techniciens 3 bin mes de tester les deux m thodes comme indiqu dans le programme d an
10. t moins Test QT 3 D position de la membrane Validation de la m thode de d position de F membrane impr gnation versus d p t Test QL 2 Sensibilit de la m thode et mesure de l abattement sur des solutions Evaluation de la sensibilit de la m thode t moins pr sence absence sur des chantillons terrain Test QT 4 Gamme de comptage Evaluation de la gamme de comptage de la m thode quantitative sur des chantillons terrain Figure 1 plan de validation des m thodes d analyses Le d tail de la r partition des diff rentes solutions titr es et des chantillons terrain est donn dans le tableau de l annexe h r partition des consommables La validation de ces deux m thodes devra galement permettre d ajuster les temps et dur es des diff rentes tapes d analyse afin d optimiser le initial d finit au chapitre 3 x Test QL 1 pr sence absence pr sence absence M thode qualitative TEST QT 1 gt o x TEST QT 3 TEST QT 4 quantitative sur But du test Objectif Valider la m thode de d tection Tester la S sensibilit sur des solutions t moin Valider la m thode de d tection Tester la sensibilit sur des chantillons terrain Obtenirune corr lation entre lachargeen i vibrio cholerae le nombre d Unit R aliser de F
11. 06 e Laboratory Methods for theDiagnosis of Epidemic Dysentery and Cholera Centers for Disease Control and Prevention Atlanta Georgia 1999 e Detection Isolation and Identification of Vibrio cholerae from the Environment Anwar Christopher Grim Rita R Colwell and G Balakrish Nair Current Protocols in Microbiology 2006 e Protocole AFSSA pour l identification du Vibrio Cholera dans les produits de la mer f v 2010 e Laboratory methods for the diagnosis of V cholerae Centers for Disease Control and Prevention Atlanta 1999 e Manuel de s curit biologique en laboratoire Organisation mondiale de la sant 3e dition 2005 e Vibrio cholerae in the Environment A Simple Method for Reliable Identification of the Species S Baron S Chevalier and J Lesne 2007 e Microbiologie des aliments M thode horizontale pour la recherche des Vibrio spp potentiellement ent ropathog nes norme ISO TS 21872 1 2007 e Environmental reservoirs of Vibrio cholerae and their role in cholera Luigi Vezzulli Carla Pruzzo Anwar Huq and Rita R Colwell 2009 e Le diagnostic bact riologique du chol ra Marie Laure Quilici Revue francophone des laboratoires Avril 2011 14 Annexes a G lose s lective type TCBS DOMAINE D UTILISATION La g lose au Thiosulfate Citrate Bile Saccharose TCBS constitue un milieu s lectif destin l isolement de Vibrio cholerae et des autres vibrions ent rop
12. 5 0g Agar 15 0g pH 7 4 0 2 500 grammes permettent de pr parer 17 9 litres de milieu PREPARATION Verser 28 g de poudre dans un litre d eau distill e et porter bullition jusqu dissolution compl te St riliser 15 minutes 121 C l autoclave DESCRIPTION La g lose nutritive sert de milieu de culture de base pour repiquer les souches conserver ou pour v rifier la puret des subcultures avant d effectuer des tests biochimiques et s rologiques Ce milieu sous forme semi solide est utilis en tubes inclin s culot et pente pour conserver des souches de r f rence 1 La g lose nutritive contient 1 5 d Agar et peut tre suppl ment e si n cessaire avec 10 de sang ou autres liquides biologiques Ce milieu utilis sans additif convient la culture des germes qui ne pr sentent pas d exigence nutritive particuli re Voir aussi la G lose de base au sang n 2 CM0271 pour un milieu plus riche en l ments nutritifs CONSERVATION Conserver le milieu d shydrat 10 25 C jusqu la date de p remption indiqu e sur le flacon Conserver le milieu pr t l emploi 2 8 C 17 c Coloration de Gram MATERIEL LAMES COLORANTS EVIERS ET BAC EN VERRE MODE OPERATOIRE e R aliser un frottis un talement e Fixer la pr paration la flamme normalement on fixe avec de l alcool et on flambe s cher soigneusement puis laisser refroidir la lame e Immerger les lames dans la sol
13. PE DE RISQUE 1 NIVEAU DE S CURIT De base niveau de s curit biologique 1 De base niveau de s curit biologique 2 Confinement niveau de s curit biologique 3 Confinement haute s curit niveau de s curit biologique 4 TYPE DE LABORATOIRE Enseignement de base Services de sant primaires laboratoire d analyses ou de recherche Diagnostic sp cialis recherche Manipulation de germes pathog nes dangereux PRATIQUES DE PABORATOIRE BTM BTM et v tements protecteurs logo de risque biologique Comme niveau 2 plus v tements sp ciaux acc s r glement et flux d air dirig Comme niveau 3 plus sas air l entr e douche la sortie et limination sp cifique des d chets BTM bonnes techniques microbiologiques ESB enceinte de s curit biologique Mode op ratoire recherche du Vibrio cholerae dans l environnement APPAREILLAGE DE S CURIT Aucun paillasse sans protection Paillasse sans protection et ESB contre le risque d a rosols ESB ou autres moyens de confinement primaire pour l ensemble des activit s ESB classe 111 ou combinaisons pressuris es utilis es avec une ESB classe Il autoclave deux portes formant sas mural air filtr 25 i Liste des quipements FILTRATION Boite p tri 90mm Grosseron 391 1505 500 Boite p tri 50mm VWR 391 0895 1620 Membrane millipore 47mm
14. T l 0 820 22 3000 Fax 0 820 22 API 20 r actifs R actif coloration de Gram Tryptone sel si besoin de diluant ABS AEB 611494 10 6 bouteilles de 90m 10 l noel aeschemunex com Eau pepton e Alkaline 5000 G lose E 6 Route de BP13 2 500g 69571 Dardilly Cedex Peptone bact riologique LP 0037b France 1 Tel 0033 4 72 52 33 70 G lose Nutritive Agar Tel 0033 4 72 52 33 84 commercial 500g 1 IDF za Myriam mosse thermofisher com G lose glucos e l extrait de levure appel e Fax 0033 4 78 66 03 76 2 Piere Goun Age FOA E00 Email oxoid fr thermofisher com Biorad 57142 Vibrio Vibrio cholerae 01 Polyvalent Antiserum 1 Bio Rad France Service cholera 01 one awet ami flacon 1ml pour 10 test environ 10 Bio Recherche Antiserum 1ml T l commercial 06 08 37 71 30 MrJoulain secr tariat commercial 01 47 95 60 00 cellule des march 53832 Oxydase Oxydase disque industrie environnement disque saiaga lt H 10 0147956294 0810122189 fax 01 47 95 61 35 Mode op ratoire recherche du Vibrio cholerae dans l environnement j Calibrage de la m thode quantitative Calibrage de la m thode quantitative l aide de solutions titr es et de standard Mc Farland R alisation d une solution m re S par la mise en culture d une souche de Vibrio Cholerae fourni gracieusement parle laboratoire de N Djamena dans de l eau peptonn e
15. TIPLES ET REGROUPEES SUR LE PASSAGE DES STRIES DU 1ER TIERS DE LA BOITE PUIS DANS LE 2ND TIERS ELLES DEVRAIENT ETRE PLUS ESPACEES ET DONC MOINS NOMBREUSES LE DERNIER TIERS DEVRAIT ENFIN LAISSER APPARA TRE DES COLONIES ISOLEES ET PURES NE CONTENANT QU UN SEUL TYPE DE BACTERIE CES COLONIES DE BACTERIES PURES POURRONT PAR LA SUITE ETRE REPIQUEES POUR UNE ANALYSE PLUS POUSSEE 23 Mode op ratoire recherche du Vibrio cholerae dans l environnement g Tableau des consommables Test Bouteille 1 5 litre chantillon terrain Standard Mac Farland solution titr e Enrichissement w DEN Membrane 0 22 um 47 mm chantillon ou solution titr e Total membrane Tube de coning st rile plastique verre avec EPHA tube 50 ml EPHA M thode qualitative M thode quantitative Analyse de terrain Surnageant boite de petri 90 mm TCBS E nsemensement Boite de petri 50 mm avec milieu TCBS Colonnies repr sentatives colonnies jaunes 1 1 1 2 1 3 Boite de 90 Confirmation Pr paration l tat frais Petits b tonnets recourb s avec mobilit en fl che lame sous microscope Oxydase sur PCA uniquement Gram petits b tonnets recourb s Gram n gatif Latex API 20E compter toutes les colonnies caracteristiques isolement 1 3 24 h Laboratoire de confinement s curit biologique niveau 2 GROU
16. Version n 1 du 21072011 Mode op ratoire Recherche de Vibrio Cholerae dans l environnement hydrique R dacteurs Dr SUDRE Bertrand Chercheur Affili l Universit de Franche Comt Mr LE GOFF Nicolas Fondation Veolia Environnement Partenaires de mise en uvre Action Contre la Faim DUNOYER Jessica Fondation Veolia Environnement HAASER Franck LE GOFF Nicolas Laboratoire Farcha Relecteurs externes Mr MOSQUERON Luc VEOLIA Environnement Recherche et Innovation Nom Pr nom Jessica DUNOYER Bertrand Sudre DIGUIMBAYE DJAIBE COLETTE NGANDOLO BONGO NARE ABAKAR NAMINOU NDILASSOUM NELOUM LUCIE HAASER FRANCK LEGOFF NICOLAS Institution ACF F UMR chrono environement Besan on LRVZ LRVZ LRVZ LRVZ Fondation Veolia Fondation Veolia Position PM Wash chol ra cap MD PHD Directrice adj Chef de Service BACTERIOLOGIE Recherches et Diagnostics Responsable de l Unit MICROBIOLOGIE ALIMENTAIRE Point focal ANALYSE D EAU u Vibrio cholera COORDONNEES DES PARTICIPANTS adresse email washurgcap td missions acf org bsudre free fr Diguimbayedjaibe c gmail com Bongo _nov yahoo fr naminoumba yahoo fr ndilassoumlucie yahoo fr Franck HAASER veolia com nicolas le goff veolia com t l phone 235 62 42 61 73 46 700 752 105 235 66 29 57 34 235 66 23 05 24 235 66 99 99 41 235 66 83 1091
17. Violet de gentiane 2 g e Alcool 95 20 ml SOLUTION B e Oxalate d ammonium 0 8 g e Eau distill e 80 ml MELANGER LES SOLUTIONS A ET B LAISSER REPOSER 24 HEURES AVANT L EMPLOI VERSER A TRAVERS UN PAPIER FILTRE DANS UN FLACON 2 SOLUTION IODEE DE GRAM e lodelg e lodure de potassium 2 g e Eau distill e 300 ml DISSOUDRE D ABORD L IODURE DE POTASSIUM DANS ENVIRON 30 ML D EAU DISTILLEE AJOUTER L IODE ET MELANGER JUSQU A DISSOLUTION AJOUTER LE RESTE D EAU DISTILLEE MELANGER CONSERVER DANS UN FLACON EN VERRE BRUN OU EN PLASTIQUE OPAQUE A L ABRI DE LA LUMIERE 3 SOLUTION DE SAFRANINE SOLUTION A e Safranine O 2 5 g e Alcool 95 qsp 100 ml SOLUTION A BIS e Solution A 10 e Eau distill e 90 ml 4 DECOLORANT MELANGER A PARTIES EGALE ALCOOL A 95 ET ACETONE LE MELANGE EST A FAIRE EXTEMPORANEMENT 19 d Test d oxydase PRINCIPE I permet de mettre en vidence une enzyme la ph nyl ne diamine oxydase des bact ries partir de leur culture en milieu g los Cette enzyme est capable d oxyder un r actif le N dim thyl paraph nyl ne diamine MODE OPERATOIRE Le r actif peut se trouver sous deux formes soit en solution sur une lame de verre d poser un carr de papier filtre et l imbiber d une solution fra chement pr par e de r actif soit sous la forme d un disque pr impr gn par le r actif Dans les deux cas craser avec une effilure de pipet
18. alyse de l annexe L 1 5 R sultats 3 Recherche de la pr sence du V cholerae dans l environnement Les deux tapes pr c dentes seront ensuite suivies d une campagne de pr l vements de terrain pour la recherche et la quantification qui permettra d approfondir les connaissances sur la transmission hydrique La r alisation de la m thode quantitative pour les chantillons positifs par la m thode qualitative est bas e sur duplicate de chaque pr l vement pour lesquels le codage des duplicates sera important la conservation durant la r alisation de la m thode qualitative temp rature ambiante abris de la lumi re volume Sur l ensemble du projet 52 chantillons seront analys s r partis comme suit site nbr site N chantillons n campagne n pr l vement Marre 4 3 1 12 Fleuve Lac 4 3 1 12 Puits 4 2 1 8 Jarres 5 2 2 20 somme ANALYSE 52 Tableau 2 projection indicative des analyses r aliser Ce tableau correspond une projection indicative des analyses r aliser Une adaptation l pid miologie de la maladie sur le terrain peut amener une modification du type et du nombre de pr l vements 2 Sch ma de principe des deux m thodes Pr l vement a Filtrer sur une ou plusieurs membranes max 5 pour 1litre noter les volumes exactes b Les placer ensuite dans un tube d eau peptonn e alkaline de 50ml c Agiter vigoureusement a Sortirles chantillons sans les agiter
19. antillons devra tre mise en place syst matiquement fiche de suivi par chantillon comportant le lieu la date l heure de pr l vement ainsi que le nom du pr leveur et l ensemble des informations devra tre report sur un fichier regroupant l ensemble des informations Ces informations doivent tre consign es dans un cahier de laboratoire Un pr l vement une page 11 4 Mode op ratoire pour l isolement du Vibrio Cholerae dans des chantillons d eau 4 1 M thode qualitative 4 1 1 Filtration Noter la date sur le cahier de paillasse le codage le type d chantillon et la provenance initiale du technicien sur la page d di e l chantillon Noter les param tres physico chimique pH Turbidit salinit temp rature Filtrer un litre d chantillon sur des membranes de porosit 0 22 um Si l chantillon est turbide il est possible d utiliser plusieurs membranes afin de pouvoir filtrer 11 sur au maximum de 5 membranes Placer les membranes enroul es dans 50 ml d eau alcaline puis agiter vigoureusement Incuber pendant 16h 30 C 4 1 2 Ensemencement Sortir les chantillons de l tuve sans les agiter En effet les Vibrions se situent en surface le surnageant est un film blanch tre la surface de la colonne de liquide Collecter le d veloppement en surface l aide d une oeuse st rile proc der un isolement en
20. athog nes en particulier Vibrio parahaemolyticus dans les poissons les produits de la mer et les autres pr l vements biologiques d origine animale HISTORIQUE La formule d origine mise au point par Nakanishi a t modifi e ult rieurement par Kobayashy et al pour l isolement s lectif des Vibrio pathog nes PRINCIPES Les concentrations lev es en thiosulfate et en citrate de sodium ainsi que la forte alcalinit du milieu inhibent fortement la croissance des ent robact ries La bile de boeuf et le chlorure de sodium ralentissent la culture des ent rocoques et inhibent le d veloppement des germes Gram positif Par acidification du milieu r sultant de la fermentation du saccharose les Vibrio provoquent le virage au jaune de l indicateur au thymol et au bleu de bromothymol partir du thiosulfate qui constitue une source de soufre la production de sulfure d hydrog ne est r v l e en pr sence de citrate ferrique Tous les Vibrio sont H2S n gatifs MODE D EMPLOI Refroidir et maintenir le milieu 44 47 C Couler en bo tes de Petri st riles Laisser solidifier sur une surface froide Faire s cher les bo tes l tuve couvercle entrouvert Ensemencer l inoculum par talement en surface Incuber 37 C pendant 18 24 heures l abri de la lumi re sortir les boites en avance LECTURE Les colonies pr sentent les aspects suivants Caract ristiques Micr
21. cholerae identifi il convient de v rifier leur appartenance au serogroupe 01 ou 139 l aide du texte Latex seul s rogroupe responsable du chol ra chez l homme 4 2 M thode quantitative L analyse quantitative sera r alis e sur le deuxi me chantillon qui sera stock en chambre froide lorsque le premier chantillon analys par la m thode qualitative apportera un r sultat positif au premier ensemencement 4 2 1 Filtration Filtrer un litre d chantillon sur des membranes porosit 0 22um Si l chantillon est turbide il est possible d utiliser plusieurs membranes afin de pouvoir filtrer 1 litre Toutefois un nombre maximum de 5 membranes sera utilis il est donc important de reporter sur le cahier de paillasse le volume exact filtr afin de pouvoir exprimer ensuite le r sultat en nombre de colonies pour 100 Chaque membrane devra tre mise en culture ind pendamment sur des boites de g lose TCBS de 55mm Incuber 37 C pendant 24h 4 2 2 Lecture Les colonies suspectes apparaissent jaunes et plates avec un halo D nombrer les colonies suspectes sur chaque boite et additionnez les r sultats afin de connaitre la concentration en vibrion pr sent dans le volume filtr Exprimer ensuite le r sultat en nombre de colonies pour 100 ml noter le comptage brutes et le nombre d UFC pour 100 ml Si un trop grand nombre de bact ries sont pr sentes sur les membranes rendant leur le
22. cture impossible r aliser des dilutions selon le sch ma ci dessous Pur 100 mL d chantillon 1 10 1 100 1 1000 10mL 1mL 0 1 mL Tableau 3 Tableau des dilutions S lectionner trois volumes en fonction de la charge bact rienne observ e lors de la premi re filtration 4 2 3 Confirmation Repiquer les colonies suspectes sur g lose non s lective type GNA Incuber 24h 37 C 4 Voir document en annexe 5 Voir document en annexe 13 Apr s incubation r aliser l oxydase et la coloration de Gram Siles tests pr c dents sont concluants r aliser un test au latex puis une galerie 20E par chantillon 4 2 4 Test au Latex Une fois les vibrio cholerae identifi il convient de v rifier leur appartenance au serogroupe O1 l aide du texte Latex 4 2 5 Conservation des souches positives Les souches de vibrio cholerae isol es partir des chantillons environnementaux peuvent tre conserv es sur des boites de g lose GNA pour des conservations court terme ou congel 80 C dans un bouillon 10 de glyc rol pour une conservation long terme Une alternative dans la conservation des collections de souche pure est l utilisation de g lose de conservation tubes de g lose conservation BIORAD 63683 la temp rature ambiante et l abri de la lumi re 5 Bibliographie e Toxigenic Vibrio cholera the aquatic environnement Alam 20
23. nti O1 antis rum est possible 21 f Ensemencement strie Source http www commentfaiton com fiche voir 10003 comment_ensemencer_un_milieu_solide_par_la_methode_des_stries_d isolement DESINFECTEZ TOUT D ABORD A L ALCOOL VOTRE PLAN DE TRAVAIL CHLORE ALLUMEZ LE BEC BUNSEN EN PRENANT SOIN D OBTENIR UNE FLAMME BLEUE AFIN DE STERILISER L AIR ALENTOUR DANS UN RAYON DE 10 CENTIMETRES VOUS NE DEVEZ PAS VOUS ECARTER AU DELA DE CE SECTEUR FAUTE DE QUOI VOUS RISQUERIEZ DE CONTAMINER VOTRE BOITE DE PETRI RAPPELEZ VOUS QUE VOUS AVEZ MIS DE L ALCOOL SUR VOTRE PLAN DE TRAVAIL LA BOITE DE TEMPERATURE AMBIANTE TOUT EN LA LAISSANT FERMEE POUR LE MOMENT ESSAYEZ LE PLUS POSSIBLE DE NE PAS LA LAISSER OUVERTE DANS LE BUT D EVITER TOUTE CONTAMINATION INDESIRABLE INSCRIVEZ SUR LE COTE OU LE FOND DE LA BOITE A QUOI CORRESPOND LE CONTENU NOM ECHANTILLON CONCENTRATION DATE PASSEZ L ANSE DANS LA FLAMME DU BEC BUNSEN JUSQU A CE QU ELLE DEVIENNE INCANDESCENTE DANS LE BUT DE LA STERILISER PATIENTEZ QUELQUES SECONDES LE TEMPS QUE LA TEMPERATURE DIMINUE PUIS PLONGEZ L ANSE DANS LA SOLUTION BACTERIENNE FAITES EN SORTE QU UNE GOUTTELETTE RESTE PRISONNIERE DE LA BOUCLE DE L ANSE C EST CE VOLUME QUE VOUS ALLEZ ENSEMENCER SUR VOTRE MILIEU OUVREZ LA BOITE DE PETRI ET DIVISEZ MENTALEMENT CELLE CI EN 3 PARTIES EGALES 1 DEPOSEZ LA SOLUTION MICROBIENNE AVEC L ANSE DANS LA 1ER TIERS DE LA BOITE EN EFFECTUANT
24. oorganismes Colonies jaunes planes de 2 3 mm de diam tre Vibrio cholerae Colonies jaunes de grandes tailles Vibrio alginolyticus Colonies jaunes ou translucides Vibrio fluvialis Vibrio vulnificus Colonies incolores centre vert Vibrio parahaemolyticus Colonies bleues Pseudomonas Aeromonas Colonies minuscules transparentes Ent robact riac es ou autres 15 FORMULE TYPE Pouvant tre ajust e de fa on obtenir des performances optimales Pour 1 litre de milieu SE e De re EE 10 0 g Extrait autolytique de levure 5 0 g SACCNATOS EE 20 0 g Bile de boeuf bact riologique 5 0 g Cholate de sodium 3 0 g Citrate d 10 0 Thiosulfate de sodium 10 0 g Chlorure Ee ME E 10 0 g Citrate ferrique ammoniacal u u L 1 0g Bleu de bromothymol AN 40 0 mg Bleu d th mOl S L SS 40 0 mg Agar agar bact riologique 14 0 g pH du milieu pr t l emploi 25 C 8 6 0 2 16 b G lose non s lective type GNA NUTRITIVE GELOSE Milieu d usage courant qui peut tre enrichi avec 10 de sang ou autres liquides biologiques COMPOSITION grammes litre Extrait de viande de b uf 1 0g Extrait de levure 2 0g Peptone 5 0g Chlorure de sodium
25. ormant Colonies Evaluation de la i gamme de comptage sur des solutions t moins Tester la mesure Estimation de la variabilit de la Tester la chantillons t moins comptage Tester la M thode de d p t du substrat d abattement m thode Tester la des chantillons mesure Lu LL Ql une courbe correlation pue SEN i enrichissements sur TCBS v rifier les 9 gamme de i m thode de u d position et l abattement 9 gamme de Etapes de culture d identification et de comptage Caract res macroscopiques Caract res microscopiques Etat frais Gram Test oxydase Serotype Gal rie API 20 E Caract res macroscopiques Caract res microscopiques Etat frais Gram Test oxydase Serotype Gal rie API 20 E R aliser une gamme de solution de VC une comparaison avec des standards Mac Farland apr s 24h d incubation effectuer les filtrations et Comptage des colonies sur filtre apr s d p t sur TCBS Sensibilit et gamme de la m thode 14 solutions de concentrations d croissantes L2 10 2 8 10 R x concentratiQnkkkt 4 Permettra d avoir un premi re estimation u U della variabilit de la m th deux 1 TEST QT 2 m thode sur des Ivariabilit 96 12 variabilit de m thode pour deux concentrations connues pour un volume donn e de 100ml Connaitre le pourcentage de recueil sur filtre avec la m thode d apposition sur
26. pproche transversale pour la r ponse aux questions de sant publiques Ce travail pilote n a jamais t r alis au Tchad et participe au dynamisme des capacit s de recherche et l change des comp tences et d au sein des laboratoires inclus dans le projet 1 2 Objectifs Ce document a pour objectif de pr senter une m thode d identification et de quantification du vibrion chol rique Vibrio Cholerae O1 dans des pr l vements hydriques environnementaux Les m thodes propos es sont issues de la bibliographie existante et adapt es au contexte et aux objectifs de l tude Le protocole sera msie en deux tapes tout d abord valid en laboratoire avec la participation de plusieurs techniciens d analyses microbiologiques du laboratoire de Recherche v t rinaire et zoologique de Farcha Ndjamena et ensuite mis en application dans une phase pilote a partir de diff rents pr l vements environnementaux provenant de campagne d chantillonnage de terrain Le but de ce travail est de valider et d optimiser le mode de pr l vement et d analyse afin de pouvoir tablir la pr sence l absence du Vibrio Cholerae dans des pr l vements provenant de diff rents milieux hydriques tels que l eau de marre de fleuves au point de puisage les puits utilis s pour la consommation humaine ou des jarres de conservation de l eau au sein du domicile Les r sultats attendus sont les suivants 1 3 R sultat 1 Validation au labo
27. ratoire d une m thode qualitative et quantitative d isolement du Vibrion cholerae La validation de ces deux m thodes se fera en plusieurs tapes comme d crites dans la figure n 1 dessous Ces diff rentes tapes permettront de valider pr sence de Vibrio cholerae O1 l aide de la m thode qualitative sur des solutions titr es et sur des chantillons pr lev s sur le terrain voir en annexe K valider la m thode quantitative apr s le calibrage l aide de standard Mac Farland et de solutions titr es voir annexe J La validation de la m thode quantitative se fera en quatre tapes qui permettront de v rifier la sensibilit et la gamme de mesure la variabilit du comptage utilisation d une m thode d ensemencement par d p t de membrane sur la g lose sa faisabilit sur des chantillons de terrain Validation des m thodes M thode quantitative Test QT 1 Gamme de comptage Evaluation de la gamme de comptage de la m thode quantitative sur des solutions t moins Test de calibration Mc Farland Obtenir une corr lation entre la charge en vibrio A SC cholerae et le nombre d Unit Formant Colonies M thode qualitative Test 01 1 Sensibilit de m thode Test QT 2 Variabilit du comptage Evaluation de la variabilit du comptage sur des Evaluation de la sensibilit de la m thode Ste solutions t moins titr es pr sence absence sur des solutions
28. s ann es soixante dix portant sur la contamination des ressources hydriques et le r le potentiel de la contamination interhumaine par les aliments partages eau dans les pid mies de chol ra en zone subsah lienne 2010 apr s l intervention d ACF au Tchad un rapport de capitalisation de l intervention lors de pid mie a soulign importance un cadre logique d analyse pour l identification des voies de transmission pour l orientation des strat gies de lutte En 2011 Action contre La Faim participe la r ponse op rationnelle l pid mie de chol ra au Tchad En parall le des actions de r ponses de terrain un programme de recherche op rationnelle a t mis en place pour prolonger ce travail de capitalisation qui a d but en janvier 2011 Un travail collaboratif est r alis avec l Universit de Franche Comte pour l orientation et la r daction de ce travail pilote en microbiologie de l environnement ainsi qu un soutien op rationnel et technique est apport la Fondation Veolia Environnement dans le cadre de ces travaux pour la Global Alliance Against Cholera http www choleraalliance org Le r le de la microbiologie de l environnement dans la lutte contre le chol ra peut apporter des informations pour la prise de d cision op rationnelle et assoir ainsi les recommandations sur la pr vention du risque de transmission aupr s des populations expos es Il est une partie int grante d une a
29. stries sur une boite de g lose TCBS il est pr f rable d avoir des boites de 90 mm de diam tre car cela permet de meilleur isolement 4 1 3 Lecture tat frais Aspect monomorphe vol de moucherons du au flagelle polaire Coloration de GRAM n gatif flore monomorphe de bacilles fins en virgules Sont consid r es comme colonies suspectes les colonies plates lisses de couleur jaune faisant fermenter le saccharose Si les colonies ne sont pas correctement isol es proc der un nouvel isolement sur g lose s lective TCBS Pour les tests de confirmation il faut absolument travailler sur des souches pures ce moment la filtration et mise en culture pour la m thode quantitative pour les chantillons suspect s d tre positif 4 1 4 Confirmation e _Repiquer 3 colonies suspectes sur des g loses s lectives de type pour identification e Incuber 16 24h 37 C e Apr s incubation r aliser test l oxydase et la coloration de Gram Ce caract re biochimique discriminant avec l ensemble des autres vibrio l exception de Vibrio Mimicus ne sera pas test 2 Voir document en annexe 3 Voir document en annexe 12 Si les tests d oxydase et de coloration de Gram sont concluants le test de mobilit et le test au latex sont r alis s Apres le test au latex Si les r sultats de sont pas concluant faire une galerie 20E Test au Latex Une fois les vibrio
30. te Pasteur une colonie de germes tudier sur ce papier instrument n oxydant pas le r actif RESULTAT Si la colonie prend une teinte rose violette Le germe poss de une oxydase le test est positif Si la colonie reste incolore le germe ne poss de pas d oxydase le test est n gatif C gauche test n gatif droite test positif 20 e Test aulatex REACTIFS Antis rums polyvalents pour le s rogroupe O1 et 0139 lames de microscope en verre MODE OPERATOIRE 1 Ajouter deux gouttes s par es de PBS une lame de microscope 2 Ajouter une anse de croissance fra che partir d une sous culture de 6 16 heures de V cholerae sur milieu non s lectif chaque goutte et m langer 3 Ajouter une goutte de taille gale du groupe O1 antis rum polyvalent l une des gouttes 4 M langer la suspension antis rum culture en inclinant la lame d avant en arri re D terminer s il y a une r action d agglutination en 0 5 1 min ce qui indique un r sultat positif L auto agglutination c est dire une agglutination dans la solution saline sans s rum est indicative d un morphotype qui ne peut tre saisi par des antis rums Pour le typage des colonies avec morphotype bruts voir le protocole joint au kit 5 Test des colonies n tant pas du s rogroupe O1 en utilisant l antis rum 0139 et en r p tant les tapes 1 4 mais son remplacement par un antis rum anti 0139 pour a
31. ution de Cristal violet pendant 1mm e Lavage l eau en transvasant les lames e Immerger les lames dans du Lugol en les agitant e Laver nouveau l eau e D colorer jusqu disparition de la couleur violette dans l alcool en faisant couler goutte goutte sur la lame inclin e ou en immergeant les lames pendant une dizaine de secondes dans le d colorant e Laver l eau e Contre colorer avec la solution de safranine dilu e pendant 20 30 secondes e Laver l eau et s cher l air e Observer l objectif X100 en immersion avec de l huile RESULTAT LES BACTERIES GRAM SONT COLOREES EN VIOLET FONCE LES BACTERIES GRAM SONT COLOREES EN ROSE CECI ETANT DU UNE DIFFERENCE DE COMPOSITION DE LA PAROI LORSQUE L ON COLORE PEU DE LAMES PLUTOT QUE D IMMERGER LES PREPARATIONS ON PEU LES RECOUVRIR DE COLORANTS LE DECOLORANT DOIT ETRE CHANGE CHAQUE JOUR RISQUES D ERREURS FAUX GRAM e talement trop pais e D p t de colorant dans le flacon de violet de gentiane filtrer le colorant pour rem dier e Solution iod e de Gram mal goutt e d colorant laiss trop peu de temps globalement mieux vaut trop que pas assez e Solution de safranine laiss e tr s longtemps plus d une minute FAUX GRAM e Solution iod e de Gram laiss e trop peu de temps e D colorant laiss trop longtemps mal rinc REACTIFS 1 VIOLET DE GENTIANE ADAPTATION DE HUCKER 18 SOLUTION A e
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