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Dokument 1 - Zur Giessener Elektronischen Bibliothek

1. nn 37 24 1 3 berlebensdauer hs alias 39 2 4 2 KryOokonservierung sure ee eek 42 2 4 3 Vergleich von Fl ssig und Kryokonservierung uuesersessss nennen 44 2 5 Verd nner zur Fl ssigkonservierung von caninem Sperma 46 2 5 1 Anforderungen an einen Verd nner 242224444nnnnnennnnn ernennen 46 2 5 2 Inhaltsstoffe see eek 48 2 5 2 1 Zuckerkomponenten ccccceccceccceccceccceccceecceeceeeeeeeeeeees 48 2 9 22 Buffer 22 EIERN 50 2 5 2 3 Membranprotekliva een anne 51 Inhaltsverzeichnis 29 28 L Eigelb reed 53 25232 Milesa ame 56 2 9 2 4 Krvopr lekiva sc erg 56 2 9 2 OB Anliblolkauza sa ee 58 2 5 2 6 Sonstige Inhaltsstoffe ar ass nee sul 58 2 5 2 6 1 Antioxidantien 2222224444440040000nnnnnnnnnnnnnnn 58 2 5 2 6 2 Natriumdodecyl lauryl sulfat sodiumdodecyl lauryl sulfate SDS 60 2 5 3 Einzelne Verdunner use ae ea aa 62 29 3 1 Michverd nner s ss ee e a e E aaea 63 2 5 3 2 TRIS gepufferte Eigelb Verd nner 64 2 5 3 3 Sonstige Verdunner uressersrsee ee 65 2 5 3 4 Kommerzielle Verd nner uuussssrnenn ne nnnnnnnnennnnnnnnnn 65 2 5 3 5 Vergleichende Untersuchungen 2244444rsenn seen 65 3 Material und Methoden 4 4444rsnnn ne nnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn 75 3 11 Probanden sa en een ren 75 3 2 Spermagewinnung u a 76 3 3 Spermabeurtelling
2. 49 0 531 590080 Fax 49 0 531 509799 Webseite www menzel de Tel 49 0 6151 72 0 Fax 49 0 6151 72 2000 E Mail service merck de Webseite www merck de Tel 49 0 641 5070 Fax 49 0 641 52951 Webseite de mt com Tel 05241 89 0 Fax 05241 89 2090 E Mail info miele de Webseite www miele de Tel 49 0 8709 9229 0 Fax 49 0 8709 9229 39 E Mail minitube minitube de Webseite www minitube de Tel 49 0 40 23773 0 Fax 49 0 40 230817 E Mail info olympus de mikroskopie olympus de Webseite www olympus de Tel 49 0 89 6213 0 Fax 49 0 89 6213 2020 E Mail webmaster osram com Webseite www osram de Anhang Pechiney Plastic Packaging 289 River St Menasha WI 54952 USA Rainin Instrument LLC 7500 Edgewater Drive P O Box 2160 Oakland CA 94621 3027 USA Carl Roth GmbH amp Co KG Schoemperlenstr 1 5 76185 Karlsruhe Deutschland Postfach 100121 76231 Karlsruhe Sarstedt AG amp Co Sarstedtstra e Postfach 1220 51582 N mbrecht Deutschland Schott North America Inc Corporate Office 555 Taxter Road Elmsford NY 10523 USA Sigma Aldrich Laborchemikalien GmbH Wunstorferstr 40 30926 Seelze Deutschland Sigma Aldrich Chemie GmbH Riedstr 2 89555 Steinheim Deutschland 260 Tel 920 727 6188 Webseite www pechineyplastic packaging com Ordering 800 472 4646 Tel 510 564 1600 Fax 510 564 1727
3. Ergebnisse Samenzellen in den mit Up 1 2 verd nnten Proben zwischen Tag 0 und Tag 1 st rker ausgepr gt als in den mit TE verd nnten Proben Zwischen den mit TE und den mit Up1 aufgearbeiteten Ejakulaten konnte ein signifikanter Niveauunterschied ermittelt werden Pvera 0 033 wobei die durchschnittlichen Werte auch hier in den mit TE aufgearbeiteten Ejakulaten stets niedriger waren als in den mit Up 1 aufgearbeiteten Ejakulaten Die Zeitverl ufe zwischen den mit TE und den mit Up 1 aufgearbeiteten Ejakulaten unterschieden sich nicht signifikant Tab A10 A14 Kap 9 8 4 3 2 2 Mittels CASA gemessene Viabilit t Die durchschnittliche mittels CASA bestimmte Viabilitat nach SYBR 14 PI F rbung in den mit den verschiedenen Verd nnern aufgearbeiteten Ejakulaten bei Fl ssigkonservierung bei 4 C f r zehn Tage ist in Abb 17 dargestellt W hrend an Tag 0 wie bereits auch schon f r den Anteil an lebenden Samenzellen im Eosinausstrich beobachtet bez glich der CASA Viabilit t noch kein signifikanter Unterschied zwischen den mit den verschiedenen Verd nnern aufgearbeiteten Ejakulaten festgestellt werden konnte siehe Kap 4 2 3 2 waren im weiteren Zeitverlauf deutliche Unterschiede zwischen den verd nnten Ejakulaten zu erkennen Zwar zeigten die mit CP TE und Up 1 aufgearbeiteten Ejakulate von Tag 0 bis einschlie lich Tag 3 einen hnlichen Verlauf der durchschnittlichen CASA Viabilit t w hrend die mit Up1 2 aufgearbeiteten Ej
4. Tagen im Biladyl Verd nner erscheint der TRIS Glukose Verd nner jedoch berlegen Die Autoren postulierten au erdem einen protektiven Effekt von Eigelb auf die AR das Eigelb schien die Samenzellen gegen spontane AR zu sch tzen Prozentsatz an akrosomreagierten Spermien beurteilt anhand des Chlortetracyclin Assays Wenngleich dieser Effekt bei den kommerziellen sowie bei den im Labor hergestellten Verd nnern zu beobachten war erwies sich bez glich der akrosomalen Integrit t jedoch erneut der TRIS Glukose Verd nner als am geeignetsten Iguer Ouada und Verstegen 2001b Tsutsui et al 2003b beurteilten einen Eigelb Zitrat Glycin Glukose einen Eigelb TRIS Fruktose Zitrat und einen Eigelb Natriumzitratdihydrat Verd nner ber einen Untersuchungszeitraum von zw lf Tagen Beim Vergleich der drei Verd nner konnte festgestellt werden dass der Eigelb Natriumzitratdihydrat Verd nner f r die Fl ssigkonservierung von caninem Sperma aufgrund mangelhafter Motilit tskonservierung nicht geeignet ist Im Eigelb Zitrat Glycin Glukose sowie im Eigelb TRIS Fruktose Zitrat Verd nner betrug die Motilit t dagegen noch mindestens 60 nach einer Lagerungsdauer von sechs Tagen und mindestens 20 nach zw lf Tagen An Tag 12 war der Eigelb TRIS Fruktose Zitrat Verd nner hinsichtlich Motilitat Viabilit t beurteilt anhand Eosin Nigrosin F rbung und Akrosomintegrit t beurteilt mit der Triple F rbetechnik berlegen Der Anteil an morphol
5. f r den Anteil an schleifenf rmigen Schw nzen nachgewiesen werden Ebenso wie die beobachteten Abnahmen des Gesamtanteils an morphologisch ver nderten Samenzellen in den verd nnten Ejakulaten unmittelbar nach dem Verd nnen siehe Kap 5 3 2 4 waren auch die weitere Abnahme in den mit Up 1 verd nnten Proben bis einschlie lich Tag 2 und die zwischenzeitliche Abnahme in den mit Up1 2 aufgearbeiteten Ejakulaten zwischen Tag 2 und Tag 5 nicht nachvollziehbar Jedoch konnte eine zwischenzeitliche Verringerung des Anteils an morphologisch ver nderten Spermien zwischen Tag 4 und Tag 6 bei Fl ssigkonservierung in einem TRIS Fruktose Eigelb Verd nner auch bei Tsutsui et al 2003b gefunden werden Wie bereits zuvor diskutiert k nnte m glicherweise eine Agglutination der Spermien im Eosinausstrich Burgess et al 2001 oder eine Sedimentation morphologisch ver nderter Spermienformen f r diese Ergebnisse verantwortlich sein Auff llig war allerdings dass es in den mit CP und TE verd nnten Ejakulaten im Zeitverlauf zu keiner Verringerung des Anteils an morphologisch ver nderten Spermien kam Daher m ssen zum einen fehlerhafte Messungen in den mit Up1 2 und Up 1 verd nnten Ejakulaten in Betracht gezogen werden zum anderen k nnte jedoch auch die unterschiedliche Zusammensetzung der Verd nner urs chlich f r die gemachten Beobachtungen sein da nur in den glycerolhaltigen Verd nnern Up 1 2 und Up 1 Abnahmen des Anteils an morphologi
6. ALH gt 6 5 um und ALH gt 6 5 um und LIN lt 0 5 LIN lt 0 5 lineare Spermien STR gt 0 9 und LIN gt 0 5 STR gt 0 9 und LIN gt 0 5 nicht lineare Spermien STR lt 0 9 und LIN lt 0 5 keine Angabe kurvilineare Spermien DAP Radius 2 3 und LIN lt 0 5 keine Angabe Die Einstellungen zur Spermienerkennung f r die Motilitatsanalyse Tab 25 entsprachen den vom Hersteller empfohlenen Analyseeinstellungen Die Definition von GrdRenwerten ist essentiell um eine Unterscheidung zwischen Spermienk pfen und anderen Zellen welche eventuell im untersuchten Ejakulat vorhanden sind zu gew hrleisten Verstegen et al 2002 Der spezifizierte Fl chenbereich zur Spermienerkennung betrug in den vorliegenden Untersuchungen 20 bis 60 um Dies entspricht den in der Literatur gefundenen Gr enangaben f r canine Spermien nach denen die Dimensionen von lebenden 164 Diskussion physiologisch geformten Samenzellen folgende sind Gesamtl nge ca 68 um Kopflange ca 7um Kopfbreite ca 4 5um Mittelst ckl nge ca 11 um und Schwanzl nge ca 50 um Bartlett 1962a Christiansen 1984b Dahlbom et al 1997 Rijsselaere et al 2004a Daraus ergibt sich eine Kopffl che von etwa 28 35 um welche somit innerhalb der Grenzen des spezifizierten Fl chenbereichs lag Nach Dahlbom et al 1997 und Rijsselaere et al 2004a betr gt die durchschnittliche Kopffl che caniner Spermien sogar
7. Amann R P Pickett B W Squires E L 1984 Extenders for preservation of canine and equine spermatozoa at 5 C Theriogenology 22 4 409 415 Pursel V G Schulman L L Johnson L A 1978 Effect of Orvus ES paste on acrosome morphology motility and fertilizing capacity of frozen thawed boar sperm J Anim Sci 47 1 198 202 Riesenbeck A V lger D Hoffmann B 2001 Praxisnahe Bestimmung von Vitalit tsparametern zur Beurteilung von R densperma Tier rztl Prax 29 K 116 120 Rigau T Farr M Ballester J Mogas T Pe a A Rodriguez Gil J E 2001 Effects of glucose and fructose on motility patterns of dog spermatozoa from fresh ejaculates Theriogenology 56 5 801 815 Rijsselaere T Van Soom A Maes D de Kruif A 2002a Effect of centrifugation on in vitro survival of fresh diluted canine spermatozoa Theriogenology 57 6 1669 1681 242 Literaturverzeichnis Rijsselaere T Van Soom A Maes D de Kruif A 2002b Use of the sperm quality analyzer SQA II C for the assessment of dog sperm quality Reprod Dom Anim 37 3 158 163 Rijsselaere T Van Soom A Maes D de Kruif A 2003 Effect of technical settings on canine semen motility parameters measured by the Hamilton Thorne analyzer Theriogenology 60 8 1553 1568 Rijsselaere T Van Soom A Hoflack G Maes D de Kruif A 2004a Automated sperm morphometry and morphology analysis of c
8. Die im Zeitverlauf der Fl ssigkonservierung erkennbaren Abnahmen der Mittelwerte des Parameters LIN waren in den mit CP TE und Up 1 verd nnten Ejakulaten als signifikant zu beurteilen pzeit 0 0044 bis lt 0 0001 In den mit CP verd nnten Ejakulaten konnten ber den Uhntersuchungszeitraum f r LIN 134 Ergebnisse signifikante Niveauunterschiede zu den mit TE Pvera 0 016 und den mit Up 1 Pvera 0 0015 verd nnten Ejakulaten nachgewiesen werden Die Zeitverlaufe unterschieden sich bez glich LIN zwischen den mit CP und den mit TE verd nnten Ejakulaten signifikant pw 0 0012 und auch zwischen den mit CP und den mit Up 1 2 verd nnten Ejakulaten konnte ein signifikanter Unterschied der Zeitverl ufe ermittelt werden pw 0 0092 Die mit TE aufgearbeiteten Ejakulate zeigten bez glich des Parameters LIN einen signifikanten Niveauunterschied zu den mit Up 1 aufgearbeiteten Ejakulaten Pverd 0 016 wobei sich kein signifikanter Unterschied der Zeitverl ufe ermitteln lie Tab A10 A14 Kap 9 8 Bei Betrachtung des Parameters WOB war hnliches zu beobachten wie beim Parameter LIN Im Zeitverlauf konnten ebenfalls in den mit CP TE und Up 1 aufgearbeiteten Ejakulaten tendenzielle Abnahmen der durchschnittlichen Werte festgestellt werden wahrend es in den mit Up 1 2 aufgearbeiteten Ejakulaten im Mittel zu einer tendenziellen Zunahme kam Ebenso konnte wieder in den mit CP verd nnten Ejakulaten die gr te Differenz
9. Eosinausstrich n Xg SF Min Max im Nativsperma und in den verschiedenen Verd nnern an Tag d ur2242444400n nenn 116 Prozentsatz an Kopfkappenver nderungen bzw an abgel sten Akrosomen Werte in Klammern in der Spermac F rbung im Nativsperma und in den verschiedenen Verd nnern an Tag 0 n Xg SF Mina ee 119 Motilit tswerte subjektiv gesch tzte Vorw rtsbeweglichkeit CASA Gesamtmotilit t CASA Vorw rtsbeweglichkeit bei 4 C fl ssig konservierter Hundespermien in den verschiedenen Verd nnern im Zeitverlauf ber zehn Tage 222 22222244s2 n0nn24n2 0 nnnnnnnennnnnn nn 125 287 Anhang Tab Tab Tab Tab Tab Tab Tab Tab Tab Tab 20 21 22 23 24 25 26 A1 A2 A3 Korrelationen zwischen den mittels Neubauer Z hlkammer bestimmten und den durch CASA SpermVision System gemessenen Dichten in den Nativejakulaten und in den mit den verschiedenen Verdunnern aufgearbeiteten Ejakulaten 2 2 4 u4sum4 44444444040 148 Korrelationen zwischen subjektiv geschatzter und mittels CASA SpermVision System gemessener Vorwartsbeweglichkeit in den Nativejakulaten und in den mit den verschiedenen Verd nnern aufgearbeiteten Ejakulaten 44444444Hnnnnn nn nnnnnnnnnnnnnnnnnnnn nennen 149 Korrelationen zwischen dem im Eosinausstrich bestimmten Anteil lebender Spermien und der mittels CASA SpermV
10. Onclin K Iguer Ouada M 2005 Long term motility and fertility conservation of chilled canine semen using egg yolk added Tris glucose extender In vitro and in vivo studies Theriogenology 64 3 720 733 Waberski D Petrounkina A Weitze K F T pfer Petersen E 1999 In vitro Beurteilung von Sperma zur Vorhersage der Fertilit t Tier rztl Prax 27 G 1 7 Wales R G White I G 1958 The interaction of pH tonicity and electrolyte concentration on the motility of dog spermatozoa J Physiol 141 2 273 280 Watson P F Morris G J 1987 Cold shock injury in animal cells Symp Soc Exp Biol 41 311 340 Weitze K F 2001 Prinzipien der Verd nnung und Konservierung in Busch W Holzmann A Hrsg Veterin rmedizinische Andrologie Physiologie und Pathologie der Fortpflanzung bei m nnlichen Tieren Verlag Schattauer Stuttgart 511 517 Weitze K F Petrunkina A M 2007 Samenkonservierung biochemische Grundlagen und Prinzipien der Einfrier und Auftautechniken in Busch W Waberski D Hrsg K nstliche Besamung bei Haus und Nutztieren Verlag Schattauer Stuttgart 119 131 248 Literaturverzeichnis WHO World Health Organization 2010 WHO laboratory manual for the examination and processing of human semen 5 Aufl WHO Press Switzerland 61 Wijchman J G de Wolf B T H M Graaff R Arts E G J M 2001 Variation in semen parameters derived from comput
11. ber denen in mit Up1 2 und nur mit Up 1 verd nnten Proben Dabei waren die Mittelwerte in den mit CP verd nnten Ejakulaten f r alle drei Parameter ber den gesamten Untersuchungszeitraum stets leicht h her als in den mit TE verd nnten Ejakulaten Die im Zeitverlauf der Fl ssigkonservierung beobachteten Abnahmen der Mittelwerte f r die Parameter DAP DCL und DSL waren in allen verd nnten Ejakulaten als signifikant zu beurteilen Pze 0 0021 bis lt 0 0001 In den mit CP aufgearbeiteten Ejakulaten konnten ber den Untersuchungszeitraum bez glich der Parameter DAP DCL und DSL signifikante Niveauunterschiede zu den mit TE Pvera 0 011 bis lt 0 0001 Up 1 2 jeweils mit Pvera lt 0 0001 und Up 1 jeweils mit Pvera lt 0 0001 aufgearbeiteten Ejakulaten nachgewiesen werden Die Zeitverl ufe unterschieden sich zwischen den mit CP und TE aufgearbeiteten Ejakulaten f r den Parameter DCL signifikant pw 0 037 zwischen den mit CP und Up 1 2 aufgearbeiteten Ejakulaten f r alle drei Parameter signifikant jeweils mit pw lt 0 0001 und zwischen den mit CP und Up 1 aufgearbeiteten Ejakulaten ebenfalls f r alle drei Parameter signifikant pw 0 0013 bis lt 0 0001 Die mit TE verd nnten Ejakulate zeigten bez glich der drei genannten Parameter signifikante Niveauunterschiede zu den mit Up 1 2 jeweils mit Pvera lt 0 0001 sowie zu den mit Up1 Pvera 0 0004 bis lt 0 0001 verd nnten Ejakulaten und auch die Zeitverl ufe zwisc
12. 0 001 CASA Vorw rtsbeweglichkeit versus Anteil an Samenzellen mit nicht aufgerollter Gei el im HOS Test nach logarithmischer Transformation 120 0 552 lt 0 001 Anteil lebender Samenzellen im Eosinausstrich nach Arcus Sinus Transformation versus Anteil an Samenzellen mit nicht aufgerollter Gei el im HOS Test nach logarithmischer Transformation CASA Viabilitat nach Arcus Sinus Transformation versus Anteil an Samenzellen mit nicht aufgerollter Gei el im HOS Test nach logarithmischer Transformation 120 120 0 522 0 724 lt 0 001 lt 0 001 Anteil an morphologisch ver nderten Samenzellen nach logarithmischer Transformation versus Anteil an Samenzellen mit nicht aufgerollter Gei el im HOS Test nach logarithmischer Transformation 120 0 446 lt 0 001 F r alle getesteten Parameterkombinationen konnten statistisch signifikante Zusammenh nge nachgewiesen werden Die engste negative Korrelation bestand auch hier wieder zwischen der CASA Viabilitat und dem Anteil an Samenzellen mit nicht aufgerollter Gei el im HOS Test 155 Diskussion 5 Diskussion In der vorliegenden Arbeit wurden mittels Splitsample Verfahren drei verschiedene Verdunner f r die Fl ssigkonservierung von caninem Sperma bei 4 C vergleichend untersucht Hierbei handelte es sich um den kommerziellen Verd nner CaniPRO Chill 10 Minitub GmbH Tiefenbach CP einen selbst h
13. 1 3 erzielen Verstegen et al 2005 konnten zeigen dass sogar nach einer mittleren Lagerungsdauer von 9 1 8 Tagen mit fl ssigkonserviertem Sperma noch akzeptable Tr chtigkeitsraten erreicht werden k nnen Bei einmaliger intravaginaler Besamung erzielten sie eine Tr chtigkeitsrate von 50 mit einer durchschnittlichen Wurfgr e von 2 3 1 4 Welpen bei zweimaliger intravaginaler Besamung eine Trachtigkeitsrate von 70 mit durchschnittlich 4 6 2 8 Welpen pro Wurf Dies deutet darauf hin dass die Befruchtungsf higkeit der Spermien f r mindestens zehn Tage aufrechterhalten werden kann Verstegen et al 2005 In mit TRIS Glukose Eigelb Verd nner verd nntem Sperma zeigen noch mindestens 50 der Spermien nach 13 1 Tagen Lagerung eine gute Motilitat und auch nach 16 Tagen kann noch eine geringe Anzahl an motilen Samenzellen nachgewiesen werden Iguer Ouada und Verstegen 2001b Diese Ergebnisse machen deutlich dass mit einem TRIS Glukose Eigelb Verd nner eine gute Spermaqualitat ber bis zu zehn Iguer Ouada und Verstegen 2001b bzw vierzehn Tage Shahiduzzaman und Linde Forsberg 2007 konserviert werden kann und auch die Befruchtungsf higkeit erhalten bleibt Shahiduzzaman und Linde Forsberg 2007 Allerdings sind Untersuchungen in vivo notwendig um diese Schlussfolgerung zu best tigen Shahiduzzaman und Linde Forsberg 2007 40 Literatur Eine M glichkeit zur Untersuchung der Befruchtungsf higkeit von Samenzellen i
14. 15 16 17 Durchschnittliche mittels Neubauer Zahlkammer bestimmte Dichten der mit den verschiedenen Verd nnern aufgearbeiteten Ejakulate nach Anwendung der Wurzeltransformation 44444 4444er 102 Durchschnittliche mittels CASA SpermVision System bestimmte Dichten der mit den verschiedenen Verd nnern aufgearbeiteten Ejakulate nach Anwendung der Wurzeltransformation 102 Subjektiv gesch tzte Vorw rtsbeweglichkeit n x SD Min Max im Nativsperma und in den verschiedenen Verd nnern an Tag O 103 CASA Motilit tsparameter VAP n x SD Min Max im Nativsperma und in den verschiedenen Verd nnern an Tag O emeeeen 107 CASA Motilit tsparameter VCL n x SD Min Max im Nativsperma und in den verschiedenen Verd nnern an Tag O mmeeen 109 CASA Motilit tsparameter VSL n x SD Min Max im Nativsperma und in den verschiedenen Verd nnern an Tag O mmeeeen 109 CASA Motilit tsparameter ALH n x SD Min Max im Nativsperma und in den verschiedenen Verd nnern an Tag O mmeeen 110 CASA Motilit tsparameter BCF n x SD Min Max im Nativsperma und in den verschiedenen Verd nnern an Tag O memeeen 111 CASA Motilit tsparameter LIN n x SD Min Max im Nativsperma und in den verschiedenen Verd nnern an Tag O mmeeeen 112 Prozentualer Anteil an morphologisch ver nderten Samenzellen
15. 18 p 0 14 Allerdings lie sich hier bei getrennter Betrachtung der einzelnen Kopfkappenver nderungen in den einfaktoriellen Varianzanalysen ein signifikanter Unterschied bez glich des Anteils an sonstigen Ver nderungen ermitteln n 18 p 0 043 Im anschlie enden paarweisen Vergleich nach Student Newman Keuls erwies sich dieser ausschlie lich als signifikanter Unterschied zwischen dem Nativsperma und den mit Up 1 verd nnten Proben p lt 0 05 wobei der Anteil an sonstigen Ver nderungen in den mit Up 1 verd nnten Ejakulaten h her war als im Nativsperma In der einfaktoriellen Varianzanalyse zum Vergleich der mit CP und der mit TE aufgearbeiteten Ejakulate mit dem Nativsperma an Tag 0 lie sich hinsichtlich des 119 Ergebnisse Anteils an Kopfkappenveranderungen der Samenzellen in der Spermac Farbung ein signifikanter Unterschied beobachten n 30 p 0 017 Der im Anschluss durchgefuhrte Student Newman Keuls Test zeigte einen signifikanten Unterschied zwischen dem Nativsperma und den mit CP aufgearbeiteten Ejakulaten sowie zwischen dem Nativsperma und den mit TE aufgearbeiteten Ejakulaten jeweils mit p lt 0 05 Wie aus Tab 18 ersichtlich war der Anteil an Kopfkappenver nderungen in den mit CP und TE verd nnten Ejakulaten h her als im Nativsperma Zwischen den mit CP und den mit TE verd nnten Proben untereinander gab es keinen signifikanten Unterschied Bei getrennter Betrachtung der einzelnen Kopfkappenver nderung
16. 1986 Die beste Methode um die Eignung von Verd nnern f r die Spermakonservierung zu bewerten ist der Vergleich der Konzeptionsraten nach KB Allerdings ist dies unter experimentellen Bedingungen bei Hunden blicherweise nicht m glich deshalb werden f r die Befruchtungsf higkeit wichtige Spermienmerkmale wie Motilit t Membranstatus und akrosomale Integrit t nach l ngerer Lagerungsdauer untersucht Rota et al 1995 wobei insbesondere die gesch tzte Vorw rtsbeweglichkeit seit langer Zeit zur Beurteilung der Verd nnerqualit t herangezogen wird Schafer et al 1997 Durch Kombination von zwei oder mehrerer dieser Tests sollte es m glich sein eine signifikante Korrelation mit der Fertilit t zu erreichen Rota et al 1995 2 5 1 Anforderungen an einen Verd nner Folgende Anspr che werden an einen Verd nner f r die Spermakonservierung gestellt Bereitstellung von N hrstoffen als Energiequelle Concannon und Battista 1989 Hoffmann 2003d ausreichende Pufferkapazit t Concannon und Battista 1989 Weitze 2001 Hoffmann 2003d gegen ber aeroben und anaeroben toxischen 46 Literatur Abbauprodukten der Spermien Weitze 2001 in einem pH Wert Bereich von 6 0 7 0 Weitze 2001 Hoffmann 2003d wobei gewohnlich ein pH Wert von 6 5 6 6 Foote und Leonard 1964 Hoffmann 2003d angestrebt wird bei pH Werten gt 7 0 erh ht sich die Stoffwechselaktivitat der Samenzellen was mit einem raschen Verlust
17. Dom Anim 44 Suppl 3 63 Abstract 244 Literaturverzeichnis Schafer Somi S Aurich C 2007 Use of a new computer assisted sperm analyzer for the assessment of motility and viability of dog spermatozoa and evaluation of four different semen extenders for predilution Anim Reprod Sci 102 1 2 1 13 Schafer Somi S Kluger S Knapp E Klein D Aurich C 2006 Effects of semen extender and semen processing on motility and viability of frozen thawed dog spermatozoa Theriogenology 66 2 173 182 Seager S W J 1969 Successful pregnancies utilizing frozen dog semen A Digest 17 6 7 Seager S W J Fletcher W S 1972 Collection storage and insemination of canine semen Lab Anim Sci 22 2 177 182 Seager S W J Fletcher W S 1973 Progress on the use of frozen semen in the dog Vet Rec 92 1 6 10 Seager S W J Platz C C 1977a Artificial insemination and frozen semen in the dog Vet Clin North Am 7 4 757 764 Seager S W J Platz C C 1977b Collection and evaluation of canine semen Vet Clin North Am 7 4 765 773 Seager S W J Platz C C Fletcher W S 1975 Conception rates and related data using frozen dog semen J Reprod Fertil 45 1 189 192 Shah S Nagano M Yamashita Y Hishinuma M 2010 Microencapsulation of canine sperm and its preservation at 4 C Theriogenology 73 5 560 567 Shahiduzzaman A K M Linde Forsberg
18. England G C W 2001 Cryopreservation of epididymal dog sperm Anim Reprod Sci 67 1 2 101 111 Hoffmann B 2003a Samengewinnung und Beurteilung in Hoffmann B Andrologie Physiologie Pathologie und Biotechnologie der mannlichen Fortpflanzung Verlag Lehmanns Media Berlin 5 18 Hoffmann B 2003b Samenbeurteilung in Hoffmann B Andrologie Physiologie Pathologie und Biotechnologie der mannlichen Fortpflanzung Verlag Lehmanns Media Berlin 19 28 Hoffmann B 2003c Pathomorphologie der Samenzelle in Hoffmann B Andrologie Physiologie Pathologie und Biotechnologie der mannlichen Fortpflanzung Verlag Lehmanns Media Berlin 59 62 Hoffmann B 2003d Kunstliche Besamung KB in Hoffmann B Andrologie Physiologie Pathologie und Biotechnologie der mannlichen Fortpflanzung Verlag Lehmanns Media Berlin 85 106 Hoogewijs M De Vliegher S Govaere J De Schauwer C Van Soom A de Kruif A 2011 Analysing stallion semen Factors affecting CASA outcomes Reprod Dom Anim 46 Suppl 3 70 Abstract Hori T Kaseki H Fukuhara Y Oba H Mizutani T Kawakami E Tsutsui T 2006 Effects of addition of sodiumlaurylsulfate on frozen thawed canine spermatozoa J Vet Med Sci 68 10 1125 1128 Iguer Ouada M Verstegen J P 2001a Evaluation of the Hamilton Thorn computer based automated system for dog semen analysis Theriogenology 55 3 733 749 235 Li
19. K hlung nochmals um ca 12 Die Reduktion der Motilit t verl uft also progressiv wobei relativ gesehen nach der K hlung mehr Sch den auftreten als nach der Verd nnung Oettle 1986 Gleiche Beobachtungen konnten von Yildiz et al 2000 gemacht werden Hier kam es durch die Zugabe eines glycerolhaltigen TRIS Fruktose Eigelb Verd nners zum Nativsperma zu einer geringen Reduktion der Motilitat welche sich durch die nachfolgende K hlung deutlich verst rkte Im Gegensatz dazu konnten Sch fer Somi et al 2006 feststellen dass es durch die Verd nnung mit glycerolhaltigen TRIS Fruktose Eigelb Verd nnern mit oder ohne Equex STM Paste zu keiner Beeinflussung der gesch tzten Motilit t kam Andererseits konnte in derselben Untersuchung ein signifikanter Abfall der CASA Vorw rtsbeweglichkeit nach Verd nnung mit den gleichen Verd nnern nachgewiesen werden Sch fer Somi et al 2006 Nach Rota et al 1997 haben weder die Verd nnung mit einem glycerolhaltigen TRIS Glukose Eigelb Verd nner mit oder ohne Equex noch die quilibrierung bei 4 C einen Einfluss auf die subjektiv gesch tzte Motilit t und auch nach Sirivaidyapong et al 2001 beeinflussen die Zugabe eines TRIS Eigelb Verd nners und die anschlie ende K hlung auf 4 C die Motilit t der Samenzellen nicht 182 Diskussion Sowohl fur die subjektiv bestimmte Vorwartsbeweglichkeit als auch fur die CASA Gesamtmotilitat und die CASA Vorw rtsbeweglichkeit konnten die s
20. Nativsperma 30 0 756 lt 0 001 Sinus Transformation versus CP 30 0 733 lt 0 001 Anteil an Samenzellen mit nicht TE 30 0 781 lt 0 001 aufgerollter Gei el im HOS Test Up 1 2 12 0 795 0 002 nach logarithmischer Up 1 18 0 624 0 006 Transformation Anteil an morphologisch keiner Nativsperma 30 0 331 0 074 ver nderten Samenzellen nach CP 30 0 495 0 005 logarithmischer Transformation TE 30 0 668 lt 0 001 versus Anteil an Samenzellen mit Up1 2 12 0 673 0 016 nicht aufgerollter Gei el im HOS Up 1 18 0 808 lt 0 001 Test nach logarithmischer Transformation Mit Ausnahme der Kombination Anteil an morphologisch ver nderten Samenzellen versus Anteil an Samenzellen mit nicht aufgerollter Gei el im HOS Test bei welcher sich f r die Nativejakulate keine statistisch signifikante Korrelation lie signifikanten Zusammenhang Die h chsten Korrelationen konnten dabei zwischen der CASA Viabilitat und dem Anteil aufgerollter Gei el im HOS Test beobachtet werden siehe Tab 23 diese nachweisen zeigten alle getesteten Parameterkombinationen einen an Samenzellen mit nicht Parameter waren negativ miteinander korreliert 4 4 4 2 Korrelation ohne Trennung nach Verd nnern Tab 24 zeigt die Resultate der Korrelationsanalysen zur Untersuchung der Zusammenh nge zwischen verschiedenen ausgew hlten Untersuchungs parametern in die sowohl die Nativejakulate als auch alle verd nnten E
21. Reprod Fertil 57 Suppl 383 386 Smith S C England G C W 2001 Effect of technical settings and semen handling upon motility characteristics of dog spermatozoa measured using computer aided sperm analysis J Reprod Fertil 57 Suppl 151 159 Soderberg S F 1986 Canine breeding management Vet Clin North Am Small Anim Pract 16 3 419 433 Str m Holst B Larsson B Linde Forsberg C Rodriguez Martinez H 2000 Evaluation of chilled and frozen thawed canine spermatozoa using a zona pellucida binding assay J Reprod Fertil 119 2 201 206 246 Literaturverzeichnis Strom Holst B Larsson B Rodriguez Martinez H Lagerstedt A S Linde Forsberg C 2001 Zona pellucida binding assay a method for evaluation of canine spermatozoa J Reprod Fertil 57 Suppl 137 140 Strzezek R Fraser L 2009 Characteristics of spermatozoa of whole ejaculate and sperm rich fraction of dog semen following exposure to media varying in osmolality Reprod Biol 9 2 113 126 Thacker D L Almquist J 1953 Diluters for bovine semen Fertility and motility of bovine spermatozoa in boiled milk J Dairy Sci 36 2 173 180 Theret M Treize G Dumon C 1987 Artificial insemination of the bitch using the Osiris gun Mod Vet Pract 68 229 230 Thomassen R Farstad W 2009 Artificial insemination in canids A useful tool in breeding and conservation Theriogenology 71
22. Softwarepaket Version 3 5 6 2 Juli 2009 9 2 Analyseeinstellungen des SpermVision Systems SpermVision Version 3 5 6 2 Juli 2009 Benutzerhandbuch Manual 12049 0586 Einstellung RUDE TG Motilit tsanalyse Probenschichtdicke Pixel zu um Verh ltnis Spermienerkennung Z hlkriterien Punkte bei der Spermienbewegung Level 1 Klassifizierung unbewegliche Spermien lokalbewegliche Spermien vorwartsbewegliche Spermien Level 2 Klassifizierung 20 um 168 zu 100 Flache von 20 bis 60 um 4000 Spermien oder 8 Felder Konzentrationsmessung 8 Felder 11 AOC lt 9 5 Darstellungsfarbe rotbraun DSL lt 6 0 um Darstellungsfarbe gelb AOC 29 5 und DSL26 0 um d h jede Zelle die nicht als unbeweglich oder Iokalbeweglich eingestuft wurde Darstellungsfarbe hellgr n Die Level 2 Klassifizierung wird bei der Untersuchung der vorw rtsbeweglichen Spermien angewendet hyperaktive Spermien VCL gt 118 m s ALH gt 6 5 um und LIN lt 0 5 Darstellungsfarbe blau Anhang lineare Spermien nicht lineare Spermien kurvilineare Spermien Viabilit tsanalyse Probenschichtdicke Pixel zu um Verh ltnis Spermienerkennung Maximale Fl che der einzelnen Zelle Zahlkriterien Darstellungsfarbe intakte Spermien Darstellungsfarbe geschadigte Spermien Sonstige Einstellungen erlaubte Standardabweichung Lichtein
23. Up 1 2 68 0 57 6 77 5 Up 1 on day 10 In contrast Patho increased from day O CP 7 4 DF 2 21 TE 82 DF 1 93 Up 1 2 7 9 DF 2 08 Up 1 9 3 DF 1 72 to day 10 CP 10 7 DF 2 04 TE 10 7 DF 2 19 Up1 2 9 8 DF 2 26 Up 1 10 6 DF 1 96 and also for AV there was with the exception of the ejaculates diluted with Up 1 2 an increase from day O CP 4 2 DF 2 43 TE 3 9 DF 2 67 Up 1 2 6 6 DF 2 18 Up 1 2 8 DF 2 34 to day 10 CP 7 6 DF 2 57 TE 8 5 DF 2 14 Up 1 2 4 0 DF 2 72 Up 1 8 2 DF 1 78 These results show that in the ejaculates diluted with CP and TE an acceptable semen quality could be maintained for a storage period of ten days During the observation period motility VW GMcasa VWcasa and sperm velocity were significantly higher in samples extended with CP than in samples extended with the other extenders tested Regarding viability Lebende Viacasa over time 225 Summary the Up1 extender proved to be significantly superior to the other extenders Concerning pathomorphology the Up 1 2 extender was significantly better than the CP extender and the latter in turn significantly better than the TE extender With regard to the acrosomal changes significantly better results could be obtained with the Up1 extender than with the CP extender However overall semen quality and in particular motility was best preserved in the CP extender even if t
24. Up 1 8 2 SF 1 78 beobachtet werden Die vorliegenden Ergebnisse zeigen dass in den mit CP und TE verdunnten Ejakulaten fur eine Lagerungsdauer von zehn Tagen eine akzeptable Spermaqualitat aufrechterhalten werden konnte Die Motilitat VW GMcasa VWeasa sowie die Spermiengeschwindigkeit waren Uber den Untersuchungszeitraum im Verdunner CP signifikant h her als in den anderen getesteten Verd nnern Bez glich der Viabilit t Lebende Viacasa erwies sich im Zeitverlauf der Verd nner Up 1 als signifikant berlegen Bei Betrachtung der Pathomorphologie war der Verd nner Up1 2 signifikant besser als der Verd nner CP und Letzterer wiederum signifikant besser als der Verdunner TE Hinsichtlich der akrosomalen Ver nderungen konnten mit dem Verd nner Up 1 signifikant bessere Ergebnisse erzielt werden als mit dem Verd nner CP Insgesamt betrachtet wurde die Spermaqualitat und insbesondere die Motilitat jedoch im Verd nner CP am besten konserviert auch wenn die Unterschiede zu den anderen getesteten Verd nnern nicht f r alle Parameter signifikant waren Aufgrund dessen scheint der Verd nner CP den anderen getesteten Verd nnern berlegen und wird daher f r die Fl ssigkonservierung von caninem Sperma bei 4 C empfohlen Da in der vorliegenden Arbeit allerdings ungekl rt bleibt inwieweit sich die Fertilit t des fl ssigkonservierten Spermas im Zeitverlauf ver ndert und welche Auswirkungen die getesteten Verd nner auf den Erhalt der
25. Verstegen 2001a bzw f r Computer assisted sperm analysis Verstegen et al 2002 und beschreibt ein automatisiertes System aus Hard und Software zur Visualisierung und Digitalisierung sukzessiver Bilder von Spermien sowie zu deren Prozesssierung und der folgenden Analyse der Informationen Amann und Katz 2004 Basierend auf der Untersuchung individueller Samenzellen erm glicht CASA eine objektive Beurteilung verschiedener Spermaparameter wie Konzentration Motilit t Geschwindigkeit und Morphologie bei letzterer 25 Literatur insbesondere die Morphologie des Spermienkopfes Verstegen et al 2002 Mit dem Ziel die Genauigkeit und die Geschwindigkeit der Untersuchung zu optimieren und auch kleinste Veranderungen der Spermienbewegung zu erfassen Ellington et al 1993 Amann und Katz 2004 Pe a Martinez 2004 dabei aber die Subjektivitat menschlicher Untersucher zu vermeiden wird die computerisierte Spermaanalyse immer h ufiger routinem ig in verschiedenen human und veterinarmedizinischen Forschungs sowie Diagnostiklaboren eingesetzt Rijsselaere et al 2003 Amann und Katz 2004 Beletti et al 2005 Die erste Beschreibung eines Computer gest tzten Systems zur Verfolgung der Spermienbewegung stammt aus dem Jahr 1979 Dott und Foster die Erstbeschreibung des Einsatzes beim Hund erfolgte 1993 G nzel Apel et al Trotz aller Objektivit t ist es problematisch dass die verschiedenen Systeme unterschiedliche Termino
26. Viability assessment of mammalian sperm using SYBR 14 and propidium iodide Biol Reprod 53 2 276 284 Gill H P Kaufman C F Foote R H Kirk R W 1970 Artificial insemination of beagle bitches with freshly collected liquid stored and frozen stored semen Am J Vet Res 31 10 1807 1813 Goodman M F Cain J L 1993 Retrospective evaluation of artificial insemination with chilled extended semen in the dog J Reprod Fertil 47 Suppl 554 Abstract Griveau J F Dumont E Renard P Callegari J P Le Lannou D 1995 Reactive oxygen species lipid peroxidation and enzymatic defence systems in human spermatozoa J Reprod Fertil 103 1 17 26 Gr pper B 2004 Einfl sse unterschiedlicher Verfahren zur Sperma Tiefgefrierkonservierung auf Motilitat und Membranintegrit t von Hundespermien Einsatz moderner spermatologischer Analyseverfahren Hannover tierarztl Hochsch Diss 155 Gunzel A R 1986 Zur Spermagewinnung beurteilung und konservierung sowie Samenubertragung beim Hund Tierarztl Prax 14 2 275 282 233 Literaturverzeichnis Gunzel Apel A R 2007 Kunstliche Besamung beim Hund in Busch W Waberski D Hrsg K nstliche Besamung bei Haus und Nutztieren Verlag Schattauer Stuttgart 262 281 Gunzel Apel A R Gunther C Terhaer P Bader H 1993 Computer assisted analysis of motility velocity and linearity of dog spermatozoa J Reprod F
27. Webseite www rainin com Tel 49 0 721 5606 0 Fax 49 0 721 5606 149 E Mail info carlroth de Webseite www carlroth de Tel 49 0 2293 305 0 Fax 49 0 2293 305 282 E Mail info sarstedt com Webseite www sarstedt com Tel 1 914 831 2200 Fax 1 914 831 2201 Webseite www us schott com Tel 05137 8238 0 Fax 05137 8238 120 E Mail riedel sial com Webseite www sigmaaldrich com Tel 07329 97 0 Fax 07329 97 2160 E Mail Deorders sial com Webseite www sigmaaldrich com Anhang 9 7 Verd nner zur Flussigkonservierung von caninem Sperma 9 7 1 Milchverd nner Tab A1 Name Zusammensetzung pH Wert und Osmolaritat von milchbasierten Verd nnern f r die Fl ssigkonservierung von Hundesperma bzw NFDMS G Non Fat Dried Milk Solid Glucose Verd nner Glukose 49 g Natriumbikarbonat 13 g Aqua bidest ad 1000 ml Verd nner Zusammensetzung pH Wert Osmolarit t Quellen mOsmol l Magermilch 100 ml Magermilch erhitzt auf 6 46 0 02 277 4 Foote 1964b Verd nner 92 95 C f r 10 Minuten und Seager und abgek hlt Fletcher 1972 Penicillin 500 1000 IU ml Christiansen Streptomycin 1 mg ml 1984a Antibiotikazusatz nur bei Province et al Foote 1964b und Province et 1984 al 1984 Niedrig Fett homogenisierte sterilisierte Christiansen Milchverd nner Milch mit 2 Fett 1984a Vollmilch homogenisierte pasteurisierte Harr
28. glich der CASA Gesamtmotilitat miteinander verglichen wurden ist dem Anhang zu entnehmen Tab A10 A14 Kap 9 8 4 3 1 3 Mittels CASA gemessene Vorw rtsbeweglichkeit Abb 15 und Tab 19 zeigen den Prozentsatz an vorw rtsbeweglichen Samenzellen CASA Vorw rtsbeweglichkeit in den verschiedenen Verd nnern bei Fl ssigkonservierung bei 4 C f r zehn Tage Wie bei Betrachtung der CASA Gesamtmotilitat konnte auch bez glich der CASA Vorw rtsbeweglichkeit bereits unmittelbar nach dem Verd nnen ein signifikanter Unterschied zwischen den mit CP und den mit Up 1 aufgearbeiteten Ejakulaten festgestellt werden siehe Kap 4 2 2 3 Auch hier lag der in den mit Up 1 verd nnten Proben bestimmte 127 Ergebnisse Mittelwert ber dem der in den mit CP verd nnten Proben bestimmt wurde Die mit den anderen Verdunnern aufgearbeiteten Ejakulate unterschieden sich an Tag 0 nicht signifikant voneinander Ebenfalls wie schon bei der CASA Gesamtmotilitat beobachtet lag die durchschnittliche CASA Vorwartsbeweglichkeit in den mit Up 1 verd nnten Proben bis einschlie lich Tag 2 ber der mittleren CASA Vorw rtsbeweglichkeit der restlichen Proben An Tag 3 zeigten die mit CP TE und Up 1 verd nnten Ejakulate dann hnliche Mittelwerte rund 60 w hrend die CASA Vorw rtsbeweglichkeit in den mit Up 1 2 verd nnten Ejakulaten an Tag 3 bereits auf 36 3 27 7 abgesunken war Ab Tag 5 war auch in den mit Up 1 verd nnten Ejakulaten ein st rkerer
29. hrend der ersten 24 Stunden der Lagerung und somit ein erh hter Glukoseverbrauch wird auch von Verstegen et al 2005 als Grund f r den von ihnen beobachteten raschen initialen Abfall der Glukosekonzentration in den fl ssigkonservierten Ejakulaten angesehen Ebenso konnten Ponglowhapan et al 2004 im ersten Zeitabschnitt der Fl ssigkonservierung Tag 1 bis 3 einen signifikant h heren Zuckerverbrauch ermitteln als in den folgenden Zeitabschnitten Die mittleren Werte f r VAP VSL und VCL stiegen dabei im Vergleich zum gepoolten Nativsperma in den ersten drei Tagen nach der Verd nnung und K hlung signifikant an was darauf hindeutet dass Zuckerzus tze in Verd nnern die Spermiengeschwindigkeit anregen Ponglowhapan et al 2004 Zwar konnte in der vorliegenden Arbeit verglichen mit dem Nativsperma kein unmittelbarer Anstieg der durchschnittlichen Spermiengeschwindigkeiten beobachtet werden daf r jedoch nach 24 Stunden f r die Parameter VAP im Verd nner TE und VCL in den Verd nnern CP TE und Up 1 Der durch die Stoffwechselsteigerung erh hte Verbrauch an Sauerstoff N hrstoffen und Energie sowie die Anh ufung von Laktat und das Absinken des pH Wertes k nnten dann den sich anschlie enden Motilit tsabfall verursachen Schafer et al 1997 Im Verd nner Up 1 2 konnte trotz Substratzufuhr keine Zunahme der Motilit t beobachtet werden Urs chlich hierf r k nnte die im Vergleich zu Up 1 h here Glycerolkonzentration des Verd
30. miteinander verpaart werden k nnen Harrop 1956 Kibble 1969 Christiansen 1984a Silva et al 1996 England und Millar 2008 M glichkeit zur Kreuzung von Tieren die auf nat rliche Weise aufgrund von Gr enunterschieden nicht ohne Schwierigkeiten miteinander verpaart werden k nnten Heape 1897 Kibble 1969 bzw von Tieren mit leicht unterschiedlicher Saisonalit t Thomassen und Farstad 2009 Zuchtnutzung von Tieren die aus verhaltensbedingten Gr nden nicht zur Zucht eingesetzt werden k nnen Kibble 1969 England und Millar 2008 M glichkeit der Aufteilung eines Ejakulates sodass mehrere H ndinnen 1 5 mit dem Ejakulat eines R den besamt werden k nnen Heape 1897 Rota et al 1999a England und Millar 2008 Thomassen und Farstad 2009 hocheffiziente Vereinfachung des genetischen Fortschritts England und Millar 2008 g nstige und schnelle Zuchtmethode England und Millar 2008 Erh hung der Zuchthygiene Thomassen und Farstad 2009 und Kontrolle einiger infekti ser Krankheiten durch die Vermeidung des physischen Kontaktes zwischen den Tieren bzw durch die M glichkeit zur Behandlung des Spermas vor der Insemination Harrop 1956 Seager und Platz 1977a Christiansen 1984a Silva et al 1996 England und Millar 2008 M glichkeit zur Untersuchung der Spermaqualit t vor der Besamung und somit falls n tig die Auswahl eines alternativen Zuchtr den England und Millar 2008 Verhinderung von Inzucht in kl
31. nner und Zeit zum Vergleich der Verd nner TE und Up 1 im Zeitverlauf Tag 0 10 der Fl ssigkonservierung bei 4 C f r 10 Tage n 18 283 290 Danksagung 10 Danksagung An erster Stelle danke ich Herrn Prof Dr A Wehrend f r die berlassung des interessanten Themas und f r das entgegengebrachte Vertrauen Mein besonderer Dank gilt Frau Dr S Goericke Pesch f r die gute und freundliche Betreuung w hrend aller Phasen der Dissertation insbesondere aber f r ihre tatkr ftige Unterst tzung bei der Durchf hrung der Versuche f r ihre unerm dlichen Hilfestellungen bei der Anfertigung dieser Arbeit f r ihre guten Ratschl ge und f r die vielen motivierenden Worte Auch allen Mitarbeiterinnen und Mitarbeitern der Klinik f r Geburtshilfe Gyn kologie und Andrologie der Gro und Kleintiere mit Tier rztlicher Ambulanz der Justus Liebig Universit t Gie en die stets hilfsbereit waren m chte ich danken Ebenso danke ich meinen Mitdoktorandinnen f r die gegenseitigen Hilfen und Aufmunterungen w hrend der vielen gemeinsamen Laborstunden Herrn Dr K Failing und Frau M Sparenberg von der Arbeitsgruppe Biomathematik und Datenverarbeitung des Fachbereichs Veterin rmedizin der Justus Liebig Universit t Gie en danke ich f r ihre Mithilfe bei der statistischen Auswertung meiner Ergebnisse und f r die Betreuung bei statistischen Fragen Au erdem m chte ich mich bei allen R denbesitzern f r die
32. nner bez glich der subjektiv gesch tzten Vorw rtsbeweglichkeit miteinander verglichen wurden ist dem Anhang zu entnehmen Tab A10 A14 Kap 9 8 124 Ergebnisse Tab 19 Motilitatswerte subjektiv geschatzte Vorwartsbeweglichkeit CASA Gesamtmotilitat CASA Vorwartsbeweglichkeit bei 4 C fl ssigkonservierter Hundespermien in den verschiedenen Verd nnern im Zeitverlauf Uber zehn Tage angegeben als Ver nderungen der Mittelwerte SD Verd nner n Tag subjektiv gesch tzte CASA CASA Vorw rts Vorw rts Gesamtmotilitat beweglichkeit beweglichkeit 30 0 77 84 11 4 68 3 13 7 59 8 17 1 1 81 0 12 8 72 5 13 5 64 4 16 3 2 79 3 12 3 71 5 14 5 63 6 17 0 3 76 5 13 8 70 4 14 6 61 2 18 2 5 73 0 17 7 68 9 16 8 59 4 20 2 7 66 2 18 7 65 3 18 6 56 0 20 5 10 58 2 22 1 59 1 21 7 48 2 23 3 30 0 77 2 14 3 71 0 13 3 61 1 18 6 1 80 2 12 1 73 8 13 3 64 0 17 6 2 76 7 13 2 71 9 14 2 61 6 18 7 3 74 0 15 9 70 3 15 9 60 1 18 2 5 69 2 18 4 67 6 17 6 57 4 20 8 7 60 7 20 3 62 9 19 4 52 1 21 9 10 49 3 23 9 54 5 22 1 42 7 23 5 12 0 73 8 18 0 63 5 16 5 52 6 20 5 1 73 3 22 0 62 7 19 4 52 2 23 3 2 60 4 28 0 52 6 24 4 42 3 25 0 3 47 9 30 0 46 7 25 8 36 3 27 7 5 34 5 30 3 38 9 21 6 27 9 21 8 7 13 5 14 3 22 2 13 9 10 8 12 5 10 3 5 4 6 12 1 5 6 2 5 4 0 18 0 75 8 13 8 75 5 11 8 68 2 13 7 1 77 8 10 9 79 3 9 5 7
33. r die Gesamtmotilitat die Vorw rtsbeweglichkeit und andere Motilitatsparameter gefunden werden Bei Smith und England 2001 lie en sich f r die mittels Hobson Sperm Tracker in verdunnten Nativejakulaten ermittelten Motilitats parameter den in der vorliegenden Arbeit bestimmten Werten hnliche oder niedrigere Werte finden Wie bereits erw hnt konnten nur wenige Arbeiten gefunden werden in denen die Motilitatsparameter in den Nativejakulaten ohne vorherige Verd nnung gemessen wurden Bei Mogas et al 1998 kam hierf r der Sperm Class Analyzer zum Einsatz Die ermittelten Werte waren mit Ausnahme der Gesamtmotilitat jedoch deutlich niedriger als die in der vorliegenden Arbeit bestimmten Messwerte Ob und inwieweit dies im Zusammenhang mit der nicht erfolgten Verd nnung vor den CASA Messungen zu sehen ist bleibt offen da auch eine geringere Spermaqualit t der genutzten R den in Betracht gezogen werden muss wogegen allerdings die gute Gesamtmotilitat der Ejakulate spricht Bei Rota et al 2001 erfolgte die Motilit tsmessung in den Nativejakulaten mit dem Hamilton Thorne Motility Analyzer ebenfalls ohne vorherige Verd nnung Die ermittelten Werte f r die Gesamtmotilitat und die Vorw rtsbeweglichkeit waren ann hernd identisch mit den in der vorliegenden Arbeit bestimmten Werten Dagegen zeigten die von Ponglowhapan et al 2004 in gepooltem unverd nntem Sperma mittels Str mberg Mika Cell Motion Analyzer gemessenen Motilitatsparamet
34. t des mit den verschiedenen Verd nnern aufgearbeiteten Spermas zu untersuchen F r die Beurteilung der Befruchtungsf higkeit von Spermien in vitro kommen mehrere Tests in Frage Hier sind der ZP Bindungstest der Hemizona Bindungstest der ZP Penetrationstest sowie die IVF zu nennen Strom Holst et al 2000 2001 Rijsselaere et al 2005 Allerdings lassen in vitro Tests die Interaktion zwischen den Spermien und dem weiblichen Genitale au er Acht Daher ist der beste Weg zur Untersuchung der Fertilitat bzw zur Untersuchung von Verd nnern f r die Spermakonservierung der Vergleich von Konzeptionsraten nach KB Oettle 1993 Rota et al 1995 Da dies unter experimentellen Bedingungen beim Hund normalerweise nicht m glich ist werden wie auch in vorliegenden Arbeit Spermiencharakteristika die wichtig f r die Befruchtungsf higkeit sind in vitro untersucht Rota et al 1995 Vor allem der Motilitat wird bei der vergleichenden Untersuchung von Verd nnern viel Bedeutung zugemessen Tsutsui et al 2003b und in einigen Untersuchungen wird sogar ausschlie lich die Motilitat beurteilt Foote und Leonard 1964 219 Diskussion Province et al 1984 Bouchard et al 1990 Verstegen et al 2005 konnten jedoch deutlich zeigen dass offensichtlich erkennbare Motilitat oder Immotilitat kein verlassliches Kriterium ist um das Fertilit tspotenzial von caninem Sperma zu beurteilen Deshalb sollte in zuk nftigen Untersuchungen bestim
35. zum Vergleich der Verd nner CP und TE mit dem Nativsperma n 30 unmittelbar nach dem Verd nnen an Tag O lie en sich f r alle CASA 112 Ergebnisse Motilitatsparameter mit Ausnahme von STR und LIN signifikante Unterschiede feststellen Tab A8 Kap 9 8 4 2 3 Einfluss der Verdunner auf die Viabilit t an Tag 0 Unmittelbar nach der Aufarbeitung der Nativejakulate mit den verschiedenen Verd nnern konnten weder im Eosinausstrich noch mittels CASA nach SYBR 14 Pl Farbung beim Vergleich mit dem Nativsperma signifikante Ver nderungen der Viabilit t in den verd nnten Ejakulaten beobachtet werden Auch zwischen den mit den verschiedenen Verd nnern aufgearbeiteten Ejakulaten untereinander bestanden keine signifikanten Unterschiede 4 2 3 1 Anteil lebender Samenzellen im Eosinausstrich Der durchschnittliche Anteil an lebenden Samenzellen im Eosinausstrich in der spermienreichen Fraktion vor und unmittelbar nach dem Verdunnen Tag 0 mit den verschiedenen Verd nnern ist in Abb 10 dargestellt Nach Zugabe der verschiedenen Verd nner zu den Nativejakulaten blieben die im Eosinausstrich bestimmten prozentualen Anteile an lebenden Spermien beim Vergleich mit dem Nativsperma im Durchschnitt relativ konstant In den mit CP TE und Up1 2 aufgearbeiteten Ejakulaten war keine deutliche Verringerung des Anteils an lebenden Spermien im Eosinausstrich zu erkennen und in den mit Up 1 verd nnten Proben zeigte sich im Mittel sogar eine Versch
36. 0 015 jedoch unterschieden sich die Zeitverl ufe nicht signifikant voneinander Bis einschlie lich Tag 3 war der Anteil an morphologisch ver nderten Samenzellen in den mit CP verd nnten Proben niedriger als in den mit TE verd nnten Proben Von Tag 5 bis Tag 10 unterschieden sich die Anteile morphologisch ver nderter Samenzellen in den mit CP und TE verd nnten Proben dann kaum noch Zwischen den mit CP und den mit Up1 2 verd nnten Ejakulaten lie sich kein signifikanter Niveauunterschied ermitteln Allerdings unterschieden sich die Zeitverl ufe zwischen den Verd nnern CP und Up 1 2 signifikant pw 0 032 Dabei war der Anteil an morphologisch ver nderten Samenzellen in den mit Up 1 2 verd nnten Proben bis einschlie lich Tag 2 h her als in den mit CP verd nnten Proben An den Tagen 3 und 5 kam es dann in den mit Up 1 2 verd nnten Proben zu einer Verringerung des durchschnittlichen Anteils an morphologisch ver nderten Samenzellen w hrend dieser in den mit CP verd nnten Proben jedoch weiter anstieg An den Tagen 7 und 10 war der Anteil an morphologisch ver nderten 141 Ergebnisse Samenzellen schlie lich in den mit Up 1 2 verd nnten Proben niedriger als in den mit CP verd nnten Proben Zwischen den mit CP und Up1 verd nnten Ejakulaten konnte ber den Untersuchungszeitraum kein signifikanter Unterschied ermittelt werden Auch zwischen den mit TE und Up1 2 aufgearbeiteten Ejakulaten sowie zwischen den mit TE und Up 1
37. 0001 ALH 0 0001 0 0014 0 68 BCF 0 021 0 0003 0 066 STR 0 94 0 70 0 27 LIN 0 96 0 51 0 0092 WOB 0 83 0 30 0 0099 Lebende Eosinausstrich 0 57 lt 0 0001 0 42 CASA Viabilit t lt 0 0001 lt 0 0001 0 019 Pathomorphologie gesamt 0 53 0 0007 0 032 Kopfver nderungen 0 24 0 53 0 73 Halsver nderungen 0 83 0 84 0 48 Schwanzver nderungen 0 032 0 0082 0 0034 aufgerollte Schw nze 0 2 0 018 0 46 Knickschw nze 0 85 0 62 0 26 schleifenf rmige Schw nze 0 0103 lt 0 0001 0 12 lose K pfe 0 45 0 63 0 58 Plasmatropfen 0 16 0 42 0 95 Kopfkappenver nderungen gesamt 0 99 0 062 0 35 abgel ste Kopfkappen 0 59 0 29 0 77 schiefe Kopfkappen 0 0997 0 14 0 99 sonstige Ver nderungen 0 22 0 18 0 065 280 Anhang Tab A12 Resultate der zweifaktoriellen Varianzanalysen mit Messwiederholungen bez glich der Faktoren Verd nner und Zeit zum Vergleich der Verd nner CP und Up 1 im Zeitverlauf Tag 0 10 der Fl ssigkonservierung bei 4 C fur 10 Tage n 18 Parameter Haupteffekte Wechselwirkung p Wert p Wert Verdunner Zeit Verdunner x Zeit geschatzte Vorwartsbeweglichkeit lt 0 0001 lt 0 0001 lt 0 0001 CASA Gesamtmotilitat lt 0 0001 lt 0 0001 lt 0 0001 CASA Vorw rtsbeweglichkeit 0 0001 lt 0 0001 lt 0 0001 DAP lt 0 0001 lt 0 0001 lt 0 0001 DCL lt 0 0001 lt 0 0001 lt 0 0001 D
38. 1 und TE 2 mit dem Nativsperma 0 unmittelbar nach dem Verd nnen Tag 0 n 30 bei signifikantem Resultat wurde anschlie end ein Student Newman Keuls Test zum paarweisen Vergleich der Mittelwerte durchgef hrt die Ergebnisse werden getrennt nach den jeweils getesteten Paaren angegeben n s nicht signifikant p lt 0 01 signifikant mit p lt 0 01 p lt 0 05 signifikant mit p lt 0 05 Parameter Haupteffekt p Wert Student Newman Keuls Test Verd nner DAP 0 0002 0 1 p lt 0 01 0 2 p lt 0 01 1 2 n s DCL lt 0 0001 0 1 p lt 0 01 0 2 p lt 0 01 1 2 n s DSL 0 0026 0 1 p lt 0 05 0 2 p lt 0 01 1 2 n s VAP 0 0001 0 1 p lt 0 01 0 2 p lt 0 01 1 2 n s VCL lt 0 0001 0 1 p lt 0 01 0 2 p lt 0 01 1 2 n s VSL 0 0022 0 1 p lt 0 05 0 2 p lt 0 01 1 2 n s ALH 0 024 0 1 p lt 0 05 0 2 n s 1 2 n s BCF lt 0 0001 0 1 p lt 0 01 0 2 p lt 0 01 1 2 n s STR 0 25 LIN 0 21 WOB 0 0094 0 1 p lt 0 01 0 2 n s 1 2 n s 272 Anhang Tab A9 CASA Motilitatsparameter DAP DCL DSL VAP VCL VSL ALH BCF STR LIN und WOB n x SD Min Max in den verschiedenen Verdunnern im Zeitverlauf Parameter Verd nner n Tag x SD Min Max DAP um CP 30 0 38 8 6 8 23 2 48 9 1 38 5 5 6 26 0 45 7 2 38 2 6 0 22 5 46 7 3 37 1 5 7 22 8 44 6 5 36 9 5 1 23 4 42 7 7 35 6 4 6 25 3 42 2 10 32 327 8 0 0 40 8 TE 30 0 3 326 5 22 6 51 0 1 31 979
39. 11 13 geben die durchschnittlichen mittels CASA bestimmten Werte der Motilit tsparameter VAP VCL und VSL der Ejakulate vor und unmittelbar nach dem Verdunnen Tag 0 wieder Aus Tab 11 ist ersichtlich dass die verd nnten Ejakulate im Vergleich mit dem Nativsperma alle eine Abnahme der Mittelwerte des Motilit tsparameters VAP zeigten Dabei konnte in den mit CP verd nnten Proben die geringste Abnahme beobachtet werden und in den mit Up 1 2 verd nnten Proben die st rkste Tab 11 CASA Motilitatsparameter VAP n x SD Min Max im Nativsperma und in den verschiedenen Verd nnern an Tag 0 Verd nner n x SD um s Min um s Max um s keiner Nativsperma 30 97 4 20 4 55 2 123 7 CP 30 90 9 16 0 54 1 113 0 TE 30 87 8 15 4 51 2 119 5 Up1 2 12 72 2 12 6 52 7 89 5 Up 1 18 83 8 10 4 53 9 94 6 107 Ergebnisse Unmittelbar nach dem Verd nnen Tag 0 konnte in der einfaktoriellen Varianzanalyse mit Messwiederholungen bez glich des Faktors Verd nner f r VAP ein signifikanter Unterschied zwischen dem Nativsperma den mit CP TE sowie Up 1 2 aufgearbeiteten Ejakulaten ermittelt werden n 12 p 0 0004 Beim paarweisen Vergleich mit dem Student Newman Keuls Test ergaben sich hinsichtlich des Parameters VAP signifikante Unterschiede zwischen dem Nativsperma und den mit Up 1 2 verd nnten Ejakulaten p lt 0 01 zwischen den mit CP und den mit Up 1 2 verd nnten Pr
40. 3 2 1 Bedeutung der k nstlichen Besamung f r die Hundezucht 3 2 1 1 Vor nd Nachleler nen are 3 2 1 2 Technik der Samenubertragung 2 2 2 ccccesesseseeceeeeeeeeeeseeesesereees 6 2 1 3 BESAMUNGSOOSIS 2 run a ae 9 2 1 2 VErl lgstalen ee EN E a aE e a EEE 9 2 2 Gewinnung des Byakulatese 220er en 12 2 2 1 Indikationen f r die Spermagewinnung 2224444nsenennnnn ernennen 12 2 2 2 Voraussetzungen und Methoden 244244444444HHnn nennen nennen 12 2 3 Spermauntersuchung uses ia 15 2 3 1 Konventionelle Spermauntersuchung cceeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeee 16 2 3 1 1 Makroskopische Untersuchung seeeeeeesssseeereerresssrerreene 16 2 3 1 2 Chemisch physikalische Untersuchung 18 2 3 1 3 Mikroskopische Untersuchung 24444444rHnn rss 18 2 3 2 Hypoosmotischer Schwelltest HOS Test uu ssrssrs sr 23 2 3 3 Computer assisted sperm analysis CASA uusseserssssssnennnnnnn 25 2 3 3 1 Konzentrationsbestimmung uussssersessssnnnnnnnnennnnnn nenn 28 2 3 9 2 Mo tilit lsanalyse a ur em nr 29 2 3 3 3 Viabilit tsanalyse 22 2220 smm nn 32 2 4 Spermakonsewierung aussetzen ehren 33 2 4 1 Fl ssigkonservierung uumrssn Henne snnnnannarn een 35 2 4 1 1 Herstellung von fl ssigkonserviertem Sperma 36 2 4 1 2 Lagerung bzw Versand
41. 6 24 2 46 3 2 36 8 5 5 22 2 44 8 3 35 9 5 1 23 5 44 3 5 35 8 4 4 22 4 43 4 7 33 7 6 1 10 3 40 5 10 31 0 6 7 9 0 38 8 Up1 2 12 0 31 5 5 4 23 8 40 3 1 30 5 4 7 22 7 37 5 2 29 0 4 5 21 5 35 7 3 25 6 5 7 17 5 33 0 5 24 7 5 4 12 8 29 3 7 18 6 6 7 0 0 24 2 10 13 3 3 2 7 5 19 3 Up 1 18 0 35 4 4 6 22 7 40 3 1 35 4 6 3 21 6 54 0 2 33 3 27 2 17 2 51 6 3 34 2 10 1 15 3 57 4 5 33 7 9 4 20 8 53 8 7 29 0 8 9 19 6 47 3 10 18 9 4 6 11 1 28 3 DCL um CP 301 0 54 4 6 9 39 6 65 6 1 55 8 5 2 41 7 63 5 2 55 3 6 1 37 8 64 3 3 54 4 6 4 38 0 69 2 5 54 5 7 4 31 7 71 6 7 54 1 5 9 37 3 70 0 10 53 1 12 1 0 0 70 9 TE 30 0 54 0 7 7 36 9 70 3 1 56 0 4 9 42 8 64 7 2 55 1 6 3 37 6 66 9 3 54 1 5 9 32 8 65 6 5 54 4 5 8 39 6 65 9 7 52 5 10 0 12 7 73 3 10 50 3 11 8 8 9 73 5 Up1 2 12 0 47 7 5 6 41 1 56 5 1 46 4 4 4 38 7 52 5 2 43 8 5 1 35 3 51 6 3 40 0 6 5 29 3 48 8 273 Anhang 5 39 1 10 4 13 6 51 7 7 30 0 11 8 0 0 41 8 10 19 9 6 9 9 7 34 4 Up 1 18 0 52 2 6 7 33 5 60 9 1 53 5 6 1 38 6 66 9 2 51 3 8 4 28 5 63 2 3 51 1 9 0 36 8 72 5 5 50 7 11 4 39 3 79 8 7 44 5 11 0 33 2 71 3 10 32 9 8 2 12 8 45 3 DSL um CP 30 0 32 4 6 8 16 8 44 6 1 31 5 5 9 18 3 41 2 2 31 4 6 0 18 8 43 2 3 30 5 5 4 19 7 41 0 5 30 6 t 4 7 20 1 39 0 7 29 4 34 7 20 0 37 8 10 26 4 7 0 0 0 36 0 TE 30 0 30 4 6 3 17 4 44 9 1
42. 73 3 n 22 wei zu 23 3 n 7 wei lich und zu 3 3 n 1 wei lich r tlich Alle Ejakulate wiesen einen tierartspezifischen Geruch ohne besonderen Befund auf Die Konsistenz der spermienreichen Fraktion war bei 10 0 n 3 der Proben sahnig bei 50 0 n 15 milchig bei 36 7 n 11 molkig und bei 3 3 n 1 w ssrig Im Ejakulat eines R den 3 3 lie sich eine Beimengung in Form von Blut finden 4 1 2 Chemisch physikalische Untersuchung Der pH Wert lag bei allen untersuchten Ejakulaten innerhalb des Referenzbereiches von 6 2 bis 7 2 Hoffmann 2003d und betrug im Durchschnitt 6 4 0 1 Min 6 2 Max 6 7 4 1 3 Mikroskopische Untersuchung Die gesch tzte Vorw rtsbeweglichkeit der Ejakulate lag im Mittel bei 80 8 9 5 Min 50 0 Max 90 0 Der prozentuale Anteil lebender Spermien im Ejakulat betrug nach Anwendung der Arcus Sinus Transformation im Mittel 87 4 80 6 92 9 Min 70 0 Max 96 0 Durchschnittlich wurden 10 3 SF 1 66 Min 4 0 Max 37 0 morphologisch ver nderte Samenzellen gefunden Hierbei handelte es sich bei 0 3 SF 1 52 Min 0 0 Max 1 5 um Kopfver nderungen bei 0 4 SF 1 96 Min 0 0 Max 2 5 um Halsveranderungen bei 5 9 SF 2 09 Min 1 5 Max 34 5 um Schwanzver nderungen bei 1 8 SF 2 57 Min 0 0 Max 8 5 um lose K pfe und bei 0 6 SF 2 30 Min 0 0 Max 5 0 um Plasmatropfen 99 Ergebnisse Die mittlere Dichte der spermienreichen Frak
43. 81 0 4 9 69 0 91 0 5 81 8 5 6 69 0 91 0 7 81 6 5 5 66 0 90 0 10 81 5 5 9 64 0 90 0 Up 1 2 12 0 83 2 45 6 73 0 92 0 1 80 6 4 2 73 0 88 0 2 81 8 4 8 75 0 93 0 3 79 7 3 8 72 0 88 0 5 81 0 3 0 77 0 87 0 7 73 9 23 5 0 0 86 0 10 82 6 8 1 65 0 93 0 Up 1 18 0 78 8 4 9 71 0 86 0 1 77 1 6 4 68 0 95 0 2 76 9 6 1 68 0 93 0 3 80 2 7 2 73 0 96 0 5 81 0 6 9 72 0 94 0 277 Anhang 7 81 3 5 2 73 0 92 0 10 79 8 4 5 71 0 91 0 LIN CP 30 0 59 3 49 2 39 0 77 0 1 56 6 9 5 33 0 73 0 2 56 8 9 1 37 0 76 0 3 56 0 8 5 40 0 70 0 5 56 6 8 9 36 0 76 0 7 54 5 8 8 33 0 68 0 10 48 2 12 8 0 0 70 0 TE 30 0 56 2 9 4 37 0 69 0 1 53 8 10 5 32 0 74 0 2 54 0 9 1 37 0 73 0 3 54 0 8 8 37 0 72 0 5 54 1 7 8 36 0 67 0 7 53 1 8 9 33 0 71 0 10 51 8 11 1 29 0 88 0 Up1 2 12 0 55 0 8 5 42 0 68 0 1 52 9 6 2 43 0 62 0 2 54 2 5 8 46 0 66 0 3 50 9 6 1 43 0 61 0 5 53 1 8 5 40 0 74 0 7 47 2 16 7 0 0 71 0 10 58 1 11 1 41 0 74 0 Up 1 18 0 53 8 6 4 43 0 65 0 1 50 9 9 0 40 0 76 0 2 50 1 9 7 38 0 76 0 3 53 4 12 6 27 0 77 0 5 54 0 9 8 38 0 73 0 7 52 8 8 3 37 0 69 0 10 47 6 10 5 32 0 79 0 WOB CP 30 0 70 9 7 3 54 0 82 0 1 68 7 7 7 50 0 81 0 2 68 7 7 6 52 0 84 0 3 68 0 7 3 52 0 80 0 5 67 7 6 8 52 0 80 0 7 65 7 6 9 50 0 78 0 10 58 8 13 5 0 0 79 0 TE 30 0 68 6 7 4 53 0 79 0 1 66 6 8 1 50 0 81 0 2 66 4 7 3 52 0 79 0 3 66 1
44. 9 3 0 7 3 7 5 3 0 9 3 1 7 6 10 5 2 1 3 0 0 7 5 TE 30 0 5 4 0 9 3 4 7 5 1 5 7 0 8 3 7 7 1 2 5 6 0 8 3 9 7 4 3 5 4 0 8 3 2 7 2 5 5 4 0 8 3 5 7 3 7 5 3 1 0 1 9 7 5 10 5 2 0 9 3 4 7 5 Up1 2 12 0 4 4 0 6 3 4 5 4 1 4 8 0 6 3 6 5 7 2 4 6 0 6 3 2 5 4 3 4 6 0 5 3 9 5 4 5 4 6 0 4 3 6 5 2 7 4 0 1 4 0 0 5 9 10 4 2 0 8 27 5 6 Up1 18 0 5 5 0 8 3 8 6 7 1 5 7 0 8 3 4 6 8 2 5 5 1 1 2 2 7 0 3 5 2 0 8 2 9 6 0 5 5 2 0 5 4 3 5 9 7 4 9 0 5 4 2 6 0 10 4 3 0 7 2 4 5 3 BCF Hz CP 30 0 24 0 2 7 19 7 30 6 1 22 3 3 0 18 7 31 3 2 22 6 3 0 18 8 32 8 276 Anhang 3 22 8 2 9 18 6 30 4 5 23 1 2 8 18 8 31 0 7 23 0 42 8 18 9 31 9 10 22 2 34 7 0 0 29 9 TE 30 0 23 1 2 4 19 7 29 7 1 21 8 2 6 18 7 29 7 2 22 3 2 8 18 7 31 7 3 22 6 2 9 19 0 32 3 5 23 2 3 4 19 4 35 4 7 22 3 3 6 7 5 29 2 10 22 2 3 7 6 3 28 6 Up 1 2 12 0 24 9 3 1 21 2 31 2 1 21 8 1 4 20 1 24 4 2 21 5 1 5 20 0 24 5 3 20 3 1 7 16 6 22 1 5 20 0 6 4 0 0 24 0 7 18 6 7 9 0 0 29 9 10 15 9 6 0 6 1 24 8 Up 1 18 0 23 6 2 7 19 5 29 1 1 21 8 3 2 19 7 33 0 2 21 7 2 7 19 5 28 7 3 22 9 4 0 19 7 34 7 5 23 VE3 2 20 0 30 5 7 22 7 2 8 18 5 29 3 10 20 7 4 7 10 2 33 0 STR CP 30 0 82 9 5 3 72 0 94 0 1 81 4 6 0 66 0 93 0 2 81 8 5 4 70 0 92 0 3 81 8 5 0 70 0 92 0 5 82 7 5 8 68 0 94 0 7 82 4 5 9 67 0 93 0 10 78 5 15 9 0 0 92 0 TE 30 0 81 1 6 1 68 0 90 0 1 80 0 6 7 64 0 93 0 2 80 5 5 8 69 0 91 0 3
45. Befruchtungsf higkeit der Samenzellen haben sind weitere Studien notwendig um den Erhalt der Befruchtungsf higkeit w hrend der Langzeit Fl ssigkonservierung in vivo und in vitro n her zu charakterisieren 223 Summary 7 Summary Evaluation of different extenders for chilling of canine semen The importance of artificial insemination in dog breeding has significantly increased during the last decade Using chilled semen higher pregnancy rates and litter sizes can be achieved compared to the use of cryopreserved semen even after vaginal deposition provided that there is an optimal insemination management Furthermore with regard to production and shipping chilling of semen is easier to perform and cheaper than cryopreservation However the limited life span of sperm cells after chilling is limiting the use of extended semen In the present study three different extenders were compared using split sample technique for chilling of canine semen and storage at 4 C It concerned the commercial extender CaniPRO Chill 10 CP and two non commercial extenders TRIS fructose egg yolk extender TE and Uppsala Equex 2 system With the two phase Uppsala Equex 2 system two test parts have to be distinguished In part of the experiment both extenders Up 1 2 were used for dilution whereas in part Il of the experiment only extender 1 was used Up 1 The aim of this study was to determine the most suitable extender for chilling of
46. C 2007 Induced immotility during long term storage at 5 C does not prolong survival of dog spermatozoa Theriogenology 68 6 920 933 245 Literaturverzeichnis Silva L D M Verstegen J P 1995 Comparisons between three different extenders for canine intrauterine insemination with frozen thawed spermatozoa Theriogenology 44 4 571 579 Silva L D M Onclin K Snaps F Verstegen J 1995 Laparoscopic intrauterine insemination in the bitch Theriogenology 43 3 615 623 Silva L D M Onclin K Lejeune B Verstegen J P 1996 Comparisons of intravaginal and intrauterine insemination of bitches with fresh or frozen semen Vet Rec 138 7 154 157 Silva A R Cardoso R C S Uchoa D C Silva L D M 2002 Effect of tris buffer egg yolk and glycerol on canine semen freezing Vet J 164 3 244 246 Silva A R Cardoso R C S Silva L D M 2006 Influence of temperature during glycerol addition and post thaw dilution on the quality of canine frozen semen Reprod Dom Anim 41 1 74 78 Sirivaidyapong S Cheng F P Marks A Voorhout W F Bevers M M Colenbrander B 2000 Effect of sperm diluents on the acrosome reaction in canine sperm Theriogenology 53 3 789 802 Sirivaidyapong S Ursem P Bevers M M Colenbrander B 2001 Effect of prostatic fluid on motility viability and acrosome integrity of chilled and frozen thawed dog spermatozoa J
47. CP verd nnten Ejakulaten durch das Gentamicin gehemmt wurde was die bessere Konservierung der Motilit t erkl ren k nnte Letztlich k nnen ber die Wirksamkeit von Gentamicin gegen sch dliche bakterielle Effekte jedoch keine Aussagen gemacht werden da keine mikrobiologischen Untersuchungen der Ejakulate erfolgten Eine negative Beeinflussung der Spermienfunktion durch Gentamicin Aurich und Spergser 2007 konnte in der vorliegenden Arbeit jedoch nicht beobachtet werden die Gentamicinkonzentration im Verd nner CP war allerdings unbekannt Ebenso konnte anhand der mit TE verd nnten Ejakulate jedoch gezeigt werden dass eine akzeptable Spermaqualit t ber einen l ngeren Zeitraum auch ohne den Einsatz von Antibiotika aufrecht erhalten werden kann 5 3 3 2 Viabilit t Nach Burgess et al 2001 hat die Zugabe von TRIS basierten Verd nnern zu den Ejakulaten keine unmittelbaren oder verz gerten signifikanten Effekte auf den Anteil an lebenden Samenzellen Auch die anschlie ende K hlung bt keinen unmittelbaren signifikanten Effekt auf diesen Anteil aus jedoch kann von einem 202 Diskussion verz gerten negativen Effekt der K hlung auf den Anteil an lebenden Samenzellen ausgegangen werden Burgess et al 2001 In der vorliegenden Untersuchung kam es in allen verd nnten Ejakulaten w hrend der Fl ssigkonservierung bei 4 C ber zehn Tage zu einer signifikanten Abnahme der Viabilitat p lt 0 0001 was sowohl mit den Metho
48. Chemikalien Rezepte sowie die Herstellerangaben sind dem Anhang Kap 9 zu entnehmen Spermagewinnung Spermabeurteilung 1 Makroskopische Untersuchung 2 Chemisch physikalische Untersuchung 3 Mikroskopische Untersuchung 4 Spermac F rbung 5 Hypoosmotischer Schwelltest 6 Untersuchung mittels CASA SpermVision Abb 3 Vorgehensweise bei der Spermabeurteilung 77 Material und Methoden 3 3 1 Klassische Spermatologie 3 3 1 1 Makroskopische Untersuchung Die makroskopische Untersuchung stand am Anfang der Spermabeurteilung Von jedem gewonnenen Ejakulat wurden dabei fur alle drei Fraktionen Volumen Farbe Geruch Konsistenz und etwaige Beimengungen z B Blut oder Eiter erfasst Hoffmann 2003b Das Volumen wurde durch Ablesen der Graduierung an den Samenauffangglasern festgestellt und in Millilitern ml angegeben 3 3 1 2 Chemisch physikalische Untersuchung Bei allen drei Fraktionen wurde eine pH Wert Messung mittels Indikatorpapier pH 5 4 7 0 Spezialindikator Merck KGaA Darmstadt durchgef hrt Freshman 2002 indem ein 10 ul gro er Tropfen der entsprechenden Fraktion mittels Eppendorf Pipette Eppendorf AG Hamburg auf das Indikatorpapier gegeben und das Ergebnis Farb nderung des Indikatorpapiers mithilfe einer Referenzfarbskala abgelesen wurde 3 3 1 3 Mikroskopische Untersuchung Die mikroskopische Untersuchung beinhaltete die Sch tzung der Vorw rtsbeweglichkeit der Samenzellen die Ermitt
49. Diese diente der Erfassung der durch das Verd nnen auftretenden Effekte Die unmittelbar nach dem Verd nnen der spermienreichen Fraktion untersuchten Parameter waren die gleichen wie bei Untersuchung der Nativejakulate Dadurch wurde ein direkter Vergleich zwischen den verschiedenen Verd nnern hinsichtlich ihres Einflusses auf die Spermaqualit t m glich 101 Ergebnisse 4 2 1 Dichten der verd nnten Ejakulate 4 2 1 1 Neubauer Z hlkammer Die durchschnittlichen mittels der Neubauer Z hlkammer bestimmten Dichten der verd nnten Ejakulate sind in Tab 8 wiedergegeben Tab 8 Durchschnittliche mittels Neubauer Z hlkammer bestimmte Dichten der mit den verschiedenen Verd nnern aufgearbeiteten Ejakulate nach Anwendung der Wurzeltransformation dargestellt durch Angabe von modifiziertem Mittelwert x modifiziertem 1 s Bereich 1 s Bereich Minimum Min und Maximum Max Verd nner n Xr 1 s Bereich Min Max x10 ml x 10 ml x 10 ml x 10 ml CP 30 76 0 43 0 118 3 20 0 150 0 TE 30 80 6 45 3 126 0 25 0 160 0 Up1 2 12 84 7 52 2 125 1 35 0 135 0 Up 1 18 127 3 86 1 176 6 60 0 205 0 4 2 1 2 CASA Die durchschnittlichen mittels CASA bestimmten Dichten der verd nnten Ejakulate sind in Tab 9 wiedergegeben Tab 9 Durchschnittliche mittels CASA SpermVision System bestimmte Dichten der mit den verschiedenen Verd nnern aufgearbeiteten Ejakulate nach Anwend
50. E R 2 NOMIC aE a E T 213 5 343 Vabilitalsssesunssss lee 214 5 3 4 4 Spermaparamete ccccccccccecccecececcceceeeceeeceeeceeeeeeeeeees 215 5 4 Schlussbetrachtung und Fazit f r die Praxis 24444ssennnn nennen 217 5 5 Offene Fragestellingen 0222 eke re ie 219 Zusammenfassung 44444444nnnnnnnnnennnnnnnnnnnannnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn 221 Inhaltsverzeichnis 8 Literatufverzeichnis einen ale aan 227 9 Anhang ar erteilen 250 9 1 GCI ALC e len decanted pt haart tea ueokin sat suandia tania cael 250 9 2 Analyseeinstellungen des SpermVision Systems 44 251 9 3 Verbrauchsmaterialien ccccccccccccecccecccecececeeeceeecececeeeceeeeeeeeeceeeeeeeess 252 9 4 Chemikallenzns ss einen 253 9 5 Rezepte der verwendeten Medien cccccccccccecceeceeeceeeceeeeeeeeeeeeeees 254 9 5 1 Rezepte der Verd nner uu000000 nn nnnnnnnnnnnnnnnnennn nenn 254 9 5 1 1 TRIS Fruktose Eigelb Verd nner uusserseseeeennnnen 254 9 5 1 2 Uppsala Verd nner Uppsala Equex 2 System 254 9 5 2 Zusammensetzung des Verd nners CaniPRO Chill 10 255 9 5 3 Rezepte diverser Gebrauchsl sungen 4444sssennnnn nenn 255 9 5 3 1 E0SIH F rbel sungan ur sen re anna 255 9 5 3 2 Hypoosmotische L sung 4 4424444444HR nenn 255 9 5 3 3 F rbel sung f r die Viabilit
51. Einbringen des Spermas wird ein feiner semiflexibler Harnkatheter aus Kunststoff verwendet 7 Literatur Wilson 2001 Das Endoskop wird an der stehenden Hundin in die Vagina eingefuhrt und unter Sichtkontrolle bis zum externen Ostium vorgeschoben Dann wird der Katheter in die ffnung eingef hrt und unter st ndigen Drehbewegungen durch den Zervikalkanal bis in den Uterus vorw rts bewegt wo schlie lich das Sperma deponiert wird Wilson 2001 Vorteile dieser Methode sind insbesondere die Visualisierung aber auch die M glichkeit zur intrauterinen Untersuchung und Probenentnahme Wilson 2001 Thomassen und Farstad 2009 Auch die Anwendung dieser Technik ist nach einiger bung bei H ndinnen in Standhitze i d R ohne Sedierung m glich Wilson 2001 Nachteilig sind vor allem die hohen Anschaffungskosten f r das Equipment Wie einfach das externe Ostium einer H ndin zu katheterisieren ist h ngt von der L nge der Vagina der Weite des parazervikalen Bereiches und der Lage der externen Zervikal ffnung ab Wilson 1993 2001 Bei der chirurgischen Besamung lassen sich die laparoskopische und die laparotomische intrauterine Besamung unterscheiden Die Technik der laparoskopischen intrauterinen Besamung wurde beim Hund erstmals von Silva et al 1995 beschrieben Das genutzte Laparoskop hat einen Durchmesser von 8mm besteht aus einer 0 Winkeloptik und ist mit einer elektrischen Lichtquelle sowie einer Kamera verbunden Das
52. Hundespermien nach einer Lagerungsdauer von ein oder zwei Tagen kryokonserviert werden k nnen ohne dass es zu einer signifikanten Verschlechterung der Motilitat subjektive Sch tzung unter dem Phasenkontrastmikroskop nach der Gewinnung und vor dem Einfrieren Messung mit CASA nach dem Auftauen der akrosomalen Integrit t FITC PNA Fluoresceinisothiocyanat Peanut Agglutinin Pl Farbung oder der Plasmamembranintegritat CFDA PI F rbung nur nach dem Auftauen nach dem Auftauen kommt verglichen mit der Kryokonservierung unmittelbar nach der Samengewinnung wobei der Uppsala Equex 2 Verd nner dem TRIS Eigelb Fruktose Verd nner berlegen ist Betrachtet man die Motilit t der Proben vor dem Einfrieren im Uppsala Equex 2 Verd nner nur UE 2 1 so verschlechtert sich diese von 81 7 2 9 unmittelbar nach der Verd nnung auf 60 0 10 0 nach 24 Stunden Lagerung und auf 30 0 17 3 nach 48 Stunden Im TRIS Eigelb Fruktose Verd nner nur EYT 1 liegt die Motilit t nach 24 Stunden bei 60 0 0 und nach 48 Stunden bei 40 0 17 3 Der Anteil an intakten Akrosomen betr gt im Uppsala Equex 2 Verdunner nur UE 2 1 unmittelbar nach dem Verd nnen 96 5 1 6 und sinkt nach 24 Stunden auf 91 2 2 5 im Uppsala Equex 2 Verd nner nur UE 2 1 bzw auf 84 7 4 1 im TRIS Eigelb Fruktose Verd nner nur EYT 1 und nach 48 Stunden auf 86 5 0 58 im Uppsala Equex 2 Verd nner nur UE 2 1 bzw auf 89 2 35 5 im TRIS Eigelb Fruktose Verd nner nur EYT 1
53. Reduktion der Mittelwerte im Vergleich mit dem Nativsperma gesehen werden allerdings erwies sich diese nur in den mit CP p lt 0 05 und Up1 2 p lt 0 01 verd nnten Ejakulaten als signifikant Ungeachtet dessen konnten in den mit CP 181 Diskussion und TE aufgearbeiteten Ejakulaten auch fur ALH signifikant hohere Werte nachgewiesen werden als in den mit Up 1 2 aufgearbeiteten Ejakulaten jeweils mit p lt 0 01 Bez glich des Parameters BCF konnte erneut in allen verd nnten Ejakulaten eine tendenzielle Reduktion der Mittelwerte unmittelbar nach der Verd nnung beobachtet werden welche in den mit CP TE und Up1 aufgearbeiteten Ejakulaten als signifikant zu beurteilen war jeweils mit p lt 0 01 Die mit den verschiedenen Verd nnern aufgearbeiteten Ejakulate untereinander zeigten f r BCF jedoch keine signifikanten Unterschiede Die Motilitatsreduktion nach Zugabe der verschiedenen Verdunner zu den Nativejakulaten ist zwar bereinstimmend mit den Ergebnissen anderer Ver ffentlichungen Province et al 1984 Oettle 1986 Rota et al 1995 Yildiz et al 2000 Beccaglia et al 2009a Varela Junior et al 2009 allerdings kommt es nach Meinung anderer Autoren durch die VerdUnnung der Ejakulate zu keiner Beeinflussung der Motilitat Rota et al 1997 Sirivaidyapong et al 2001 Nach Oettle 1986 nimmt die Motilitat durch die Verd nnung mit einem TRIS Zitrat Eigelb Verd nner bereits um etwa 4 ab und durch die anschlie ende
54. Schaden am Akrosom verursacht als die Verdunnung Im Gegensatz zu den mit CP TE und Up 1 verd nnten Ejakulaten konnte in den mit Up1 2 verd nnten Ejakulaten uber den Untersuchungszeitraum keine signifikante Zunahme des Anteils an Spermien mit akrosomalen Ver nderungen nachgewiesen werden hier war der durchschnittliche prozentuale Anteil an Tag 10 4 0 sogar niedriger als an Tag 0 6 6 Letzteres war ebenso wie die zwischenzeitlichen Abnahmen in den mit CP verd nnten Ejakulaten an den Tagen 3 und 5 in den mit TE verd nnten Ejakulaten an Tag 3 und in den mit Up1 2 verd nnten Ejakulaten an den Tagen 2 3 5 und 10 nicht nachvollziehbar Einzig in den mit Up 1 verd nnten Ejakulaten waren keine zwischenzeitlichen Abnahmen zu beobachten Nach Sirivaidyapong et al 2001 wird die akrosomale Integrit t weder durch die Verd nnung noch durch die K hlung auf 4 C beeinflusst Auch Rota et al 1995 konnten in mit TRIS Fruktose Eigelb Verd nner fl ssigkonservierten Ejakulaten ber einen Untersuchungszeitraum von vier Tagen mittels Spermac F rbung keine signifikanten Zunahmen des Anteils an akrosomalen Ver nderungen in Form von vesikulierten oder geschwollenen Akrosomen sowie Verlust des Akrosoms nachweisen Dies entspricht den Ergebnissen von Rijsselaere et al 2002a 2004b nach denen eine drei bzw viert gige Fl ssigkonservierung bei 4 C in TRIS Fruktose Eigelb bzw TRIS Glukose Eigelb Verd nner keine signifikante Reduktion
55. Seager und Platz 1977b Pe a et al 2006 insbesondere der Spermiengesamtzahl SGZ im Ejakulat Boucher et al 1958 Die verwendete H ndin muss sich nicht zwangsl ufig im strus befinden Auch die Anwesenheit einer unterw rfigen H ndin in einem beliebigen Zyklusstadium oder sogar die eines kastrierten R den kann n tzlich sein Kutzler 2005 Weiterhin besteht die M glichkeit die H ndin mit synthetischen Pheromonen Methyl p hydroxybenzoat Aldrich Chemical Milwaukee WI USA zu pr parieren oder Vaginalsekret von gesunden Brucella negativen strischen H ndinnen aus fr heren Untersuchungen auf Gazetupfern aufzufangen und in einem handels blichen Gefrierschrank bei 20 C f r den zuk nftigen Gebrauch aufzubewahren Kutzler 2005 Im Idealfall sollte die verwendete H ndin ann hernd die Gr e des R den besitzen Freshman 2002 12 Literatur Hinsichtlich der Absamungsfrequenz empfehlen Boucher et al 1958 und Christiansen 1984b eine Spermagewinnung maximal jeden zweiten Tag Olar et al 1983 sogar nur alle vier bis f nf Tage da bei einer h heren Frequenz durch eine Depletion der epididymalen Spermareserven die SGZ im Ejakulat vermindert sein kann Boucher et al 1958 Allerdings kann zur Vermehrung der Spermaausbeute an einem bestimmten Tag um bis zu 70 eine zweite Absamung vorgenommen werden wobei nur Volumen Konzentration und SGZ geringere Werte zeigen w hrend Motilitat und Morphologie der Samenze
56. Seminaphthorhodafluor Computer assisted sperm analysis engl f r Computer gestutzte Spermienanalyse Carboxyfluoresceindiacetat Verd nner CaniPRO Chill 10 distance average path engl f r Durchschnittsstrecke um distance curved line engl f r Kurvenstrecke um Dimethylsulfoxid deoxyribonucleic acid engl f r Desoxyribonukleins ure distance straight line engl f r geradlinige Strecke um Ethylendiamintetraessigs ure Ethylendiamintetraacetat et alii lat f r und andere Equex STM Paste Ethidiumhomodimer Fluoresceinisothiocyanat Peanut Agglutinin Fluoresceinisothiocyanat Pisum Sativum Agglutinin Abkurzungsverzeichnis g H202 HCI HEPES HOS Test HTR Ceros 12 1 HTR IVOS 12 21 i d R Kap KB KGGA LDL LIN Max Min Mio mM Mrd n NFDMS G Verd nner Nr n s O7 Pverd Pzeit Pw PBS pH g Kraft g Beschleunigung chemische Summenformel fur Wasserstoffperoxid chemische Summenformel fur Salzsaure 2 4 2 Hydroxyethyl 1 piperazinyl ethansulfonsaure hypoosmotischer Schwelltest Hamilton Thorne sperm analyzer Ceros Version 12 1 Hamilton Thorne sperm analyzer IVOS Version 12 21 in der Regel Kapitel Kunstliche Besamung Klinik fur Geburtshilfe Gynakologie und Andrologie der Gro und Kleintiere mit Tierarztlicher Ambulanz der Justus Liebig Universit t Gie en Low density Lipoprotein VSL VCL linearity engl f r Linearit t Maximum Minimum Millionen mmol Li
57. Spermas Des Weiteren erfolgten eine Motilitats sowie eine Viabilit tsanalyse mithilfe des SpermVision Systems 93 Material und Methoden Spermagewinnung Spermabeurteilung l Aufteilung in drei Aliquote l Aufarbeitung mit den verschiedenen Verd nnern l Untersuchung des verd nnten Spermas unmittelbar nach der Herstellung Tag 0 Vorw rtsbeweglichkeit Lebend Tot F rbung Pathomorphologie Spermac F rbung HOS Test Dichtebestimmung SpermVision Motilitat und Viabilit t Abb 6 Vorgehensweise bei der Beurteilung des verd nnten Spermas 3 6 Untersuchung der Halteproben Eine graphische bersicht der Vorgehensweise bei der Untersuchung der Halteproben ist in der Schemazeichnung Abb 7 dargestellt Die Untersuchung der Halteproben erfolgte nach Anw rmen eines Aliquotes der jeweiligen Probe im Wasserbad Typ WNB 45 Memmert GmbH amp Co KG Schwabach f r f nf Minuten bei 37 C Dazu wurden nach mehrmaligem Schwenken der Plastikr hrchen mit einer Eppendorf Pipette Eppendorf AG Hamburg jeweils 100 ul des verd nnten Spermas entnommen und in beschriftete Eppendorf Reaktionsgef e 1 5 ml Eppendorf AG Hamburg berf hrt Die Eppendorf Reaktionsgef e wurden dann in einen St nder im Wasserbad verbracht und dort f r f nf Minuten belassen Die so erw rmten Proben wurden f r die Dauer der Untersuchungen auf der Heizplatte bei 37 C gelagert 94 Material und M
58. VAP nicht signifikant voneinander siehe Tab A8 Kap 9 8 Die durchschnittlichen mittels CASA bestimmten Werte des Motilit tsparameters VCL der Ejakulate vor und unmittelbar nach dem Verd nnen Tag 0 werden in Tab 12 dargestellt Auch hier lie sich im Vergleich mit dem Nativsperma in allen verd nnten Ejakulaten unmittelbar nach Zugabe der Verd nner eine Abnahme der Mittelwerte des Motilit tsparameters VCL beobachten In den mit CP und mit TE 108 Ergebnisse verd nnten Ejakulaten war die Reduktion am geringsten ausgepr gt in den mit Up 1 2 verd nnten Ejakulaten am st rksten Tab 12 CASA Motilit tsparameter VCL n x SD Min Max im Nativsperma und in den verschiedenen Verd nnern an Tag 0 Verd nner n x SD um s Min um s Max um s keiner Nativsperma 30 144 9 27 5 97 9 199 9 CP 30 127 0 16 5 90 2 153 7 TE 30 126 8 18 7 85 8 167 8 Up1 2 12 109 1 13 8 90 3 131 4 Up 1 18 123 1 15 7 79 4 144 9 In den einfaktoriellen Varianzanalysen und den paarweisen Vergleichen nach Student Newman Keuls konnten f r VCL signifikante Unterschiede zwischen dem Nativsperma und den mit den verschiedenen Verd nnern aufgearbeiteten Ejakulaten nachgewiesen werden jeweils mit p lt 0 05 bzw p lt 0 01 Auch zwischen den mit CP und den mit Up 1 2 verd nnten Proben sowie zwischen den mit TE und den mit Up1 2 verd nnten Proben konnten signifikante Unterschiede ermittelt we
59. Verd nnern an Tag 0 Verd nner n x SD Min Max keiner Nativsperma 30 80 8 9 5 50 0 90 0 CP 30 77 8 11 4 50 0 90 0 TE 30 77 2 314 3 40 0 90 0 Up1 2 12 73 8 18 0 40 0 90 0 Up 1 18 75 8 13 8 40 0 90 0 An Tag 0 unmittelbar nach dem Verd nnen konnte in der einfaktoriellen Varianzanalyse mit Messwiederholungen bez glich des Faktors Verd nner bei Betrachtung der subjektiv gesch tzten Vorw rtsbeweglichkeit kein signifikanter den mit CP TE sowie Up1 2 aufgearbeiteten Ejakulaten ermittelt werden n 12 p 0 43 Auch Unterschied zwischen dem Nativsperma zwischen dem Nativsperma den mit CP und den mit TE verd nnten Proben lie sich kein signifikanter Unterschied nachweisen n 30 p 0 084 Lediglich zwischen dem Nativsperma den mit CP TE und Up 1 aufgearbeiteten Ejakulaten konnte ein signifikanter Unterschied bez glich der mittleren subjektiv gesch tzten Vorw rtsbeweglichkeit beobachtet werden n 18 p 0 03 Beim anschlie enden paarweisen Vergleich der Mittelwerte Student Newman Keuls Test zeigte sich dass sich nur die gesch tzte Vorw rtsbeweglichkeit in den mit Up 1 verd nnten Ejakulaten signifikant von der in den Nativejakulaten unterschied p lt 0 05 Die Unterschiede der anderen Verd nner zum Nativsperma und auch der Verd nner untereinander waren nicht signifikant 103 Ergebnisse 4 2 2 2 Mittels CASA gemessene Gesamtmotilitat Die durchschnitt
60. Verd nnung und der Zusammensetzung des verwendeten Verd nnermediums signifikant beeinflusst Iguer Ouada und Verstegen 2001a Smith und England 2001 Amann und Katz 2004 Das Verd nnermedium sollte keine Partikel enthalten die eine hnliche Gr e wie die Spermienk pfe besitzen z B nicht gekl rtes Eigelb oder Vollmilch Verd nner da diese sonst nicht von unbeweglichen Samenzellen unterschieden werden k nnen Verstegen et al 2002 Demnach kommen Seminalplasma physiologische Kochsalzl sung isoosmolar mit dem Seminalplasma Methylcellulose 0 3 mg isovisk s mit dem Seminalplasma PBS autologes oder gepooltes Prostatasekret TRIS Verd nner HEPES TALP Medium Eigelb TRIS Glukose Verd nner gefilterter Eigelb TRIS Fruktose Verd nner oder gefilterter Magermilch Verd nner in Frage G nzel Apel et al 1993 Smith und England 2001 Rijsselaere et al 2003 Sch fer Somi und Aurich 2007 Zusammenfassend kann gesagt werden dass die ausgew hlten Computerparameter die genutzte Software die mikroskopischen Bedingungen und die Behandlung des Spermas zu einer neuen Quelle der Subjektivit t f hren k nnen Rijsselaere et al 2003 Eine Standardisierung der technischen 27 Literatur Einstellungen ware w nschenswert Rijsselaere et al 2003 da die Nutzung von CASA Systemen nach Standardisierung theoretisch einen Vergleich zwischen verschiedenen Laboren erm glicht G nzel Apel et al 1993 Iguer Ouada und Verst
61. al 2001 Motilit t ist ein Ausdruck f r die strukturelle und funktionelle Kompetenz Pe a Martinez 2004 sowie f r die Viabilit t der Samenzellen Verstegen et al 2002 Aufgrund der Tatsache dass die Motilit t nicht immer gut mit der akrosomalen Integrit t korreliert sind jedoch weitere Untersuchungsparameter zur Beurteilung der Spermaqualit t n tig Oettle 1986 Verglichen mit der Untersuchung unmittelbar nach dem Verd nnen lie sich in den Verd nnern CP TE und Up 1 sowohl bei subjektiver Beurteilung als auch bei Messung mittels CASA nach 24 Stunden ein tendenzieller Anstieg der Motilitat nachweisen Die im Vergleich zu Tag 0 h heren Motilitatswerte konnten in den verschiedenen Verd nnern f r mindestens einen Tag CP TE Up1 und f r l ngstens f nf Tage CASA Gesamtmotilitat und CASA Motilit tsparameter DCL 194 Diskussion und VCL im Verdunner CP CASA Motilitatsparameter DCL und VCL im Verd nner TE aufrechterhalten werden Eine tendenzielle Motilitatssteigerung 24 Stunden nach Verd nnerzugabe ber ca zwei Tage konnte auch bei Verstegen et al 2005 beobachtet werden M glicherweise bewirkte die Substratzufuhr durch die Verd nner eine Stoffwechselsteigerung der Spermien Sch fer et al 1997 und somit eine Steigerung der Motilit t Auch nach Weitze und Petrunkina 2007 reagieren S ugersamenzellen nach Verd nnung mit einer gesteigerten Aktivit t Eine hohe Stoffwechselaktivit t der Samenzellen w
62. an Tag 27 ist jedoch keine Motilitatsstimulation mehr m glich Verstegen et al 2005 Die Mechanismen welche die Reaktivierung und Verl ngerung der Motilit t bewirken sind m glicherweise durch den erneuten Zusatz von Glukose und frischem Eigelb sowie durch die Entfernung sch dlicher Metaboliten aus dem Medium bedingt Verstegen et al 2005 Zusammenfassend besteht durch Verd nneraustausch also die M glichkeit die Konservierung der Motilitat von Fl ssigsperma auf bis zu drei Wochen auszudehnen Verstegen et al 2005 Inwieweit dies auch auf die Befruchtungsf higkeit zutrifft ist unbekannt Allerdings konnte eindeutig gezeigt werden dass offensichtliche Motilit t oder Immotilitat kein verl ssliches Kriterium zur Einsch tzung des Fertilitatspotenzials von caninem Sperma darstellt da nicht motile Spermien durch Hinzuf gen eines ad quaten Mediums ihre Motilit t wiedererlangen und fertil bleiben k nnen Verstegen et al 2005 Interessant ist zudem die Option Hundesperma nach einer K hllagerung f r die Dauer von ein oder zwei Tagen zu kryokonservieren ohne signifikante Verschlechterung der Motilitat nach dem Auftauen und der akrosomalen bzw der Plasmamembranintegrit t verglichen mit der Kryokonservierung unmittelbar nach der Spermagewinnung F r diese Vorgehensweise ist der Uppsala Equex 2 Verd nner besser geeignet als der TRIS Eigelb Verd nner Hermansson und Linde Forsberg 2006 2 4 2 Kryokonservierung Bedingt d
63. anhand des arithmetischen Mittelwertes x der Standardabweichung SD des Minimums Min und des Maximums Max in der Form x SD Min Max Zur Pr fung ob ein quantitatives Merkmal ber die zu vergleichenden Messwiederholungen hinweg ann hernd normalverteilt ist wurden unter Verwendung des Programms BMDP1R die Residuen berechnet welche dann mittels des Wahrscheinlichkeitsplots auf Normalverteilung berpr ft wurden Lag keine Normalverteilung vor wurden die Originaldaten numerisch transformiert um 96 Material und Methoden dann mit diesen transformierten Werten die gleiche Prozedur zu wiederholen Auf diese Art konnten die am besten geeigneten Datentransformationen identifiziert werden Zum Einsatz kamen die Wurzeltransformation die Arcus Sinus Transformation und die logarithmische Transformation der Daten Bei nicht normalverteilten Merkmalen bei denen die Originaldaten durch die Wurzeltransformation numerisch transformiert wurden Dichte Neubauer Zahlkammer CASA Dichte sowie bei nicht normalverteilten Merkmalen bei denen die Originaldaten durch die Arcus Sinus Transformation numerisch transformiert wurden Anteil lebender Spermien im Eosinausstrich CASA Viabilitat wurden die r cktransformierten Mittelwerte x modifizierter Mittelwert die r cktransformierten Mittelwerte minus bzw plus der Standardabweichung vor R cktransformation x SD x SD modifizierter 1 s Bereich Minimum Mi
64. bei 4 C 92 Material und Methoden erfolgte Zur langsameren Temperaturanpassung an die K hlschranktemperatur sowie zur Vermeidung von Temperaturschwankungen durch Offnen des K hlschrankes w hrend der Lagerung wurden die Plastikrohrchen in ein Becherglas 250 ml Duran Schott Elmsford USA mit Leitungswasser von Raumtemperatur verbracht welches dann in den K hlschrank gestellt wurde Dabei wurden die drei zusammengeh rigen R hrchen mit dem Sperma eines R den zusammen in einem Becherglas gelagert Die R hrchen waren mit dem entsprechenden Verd nner dem Namen des R den und dem Datum der Herstellung beschriftet Der K hlschrank Typ KD 14505 Miele amp Cie KG G tersloh war auf eine Temperatur von 4 C eingestellt F r die Dauer der Untersuchungen wurde die Temperatur t glich mittels Thermometer kontrolliert Die gemessenen Werte schwankten zwischen 3 und 5 C 3 5 Untersuchung des verd nnten Spermas Eine graphische bersicht der Vorgehensweise bei der Untersuchung des verd nnten Spermas ist in Abb 6 dargestellt Das verd nnte Sperma wurde unmittelbar nach der Herstellung Tag 0 untersucht Folgende Parameter wurden dabei bestimmt Vorw rtsbeweglichkeit im Deckglaspr parat Verh ltnis lebender zu toter Spermien Eosinausstrich Pathomorphologie Eosinausstrich Anteil an Kopfkappenver nderungen Spermac F rbung Anteil an membrandefekten Samenzellen HOS Test Dichte des verd nnten
65. bzw durch das Auswechseln des Verd nners zu verl ngern Einleitung und Fragestellung Fur die Flussigkonservierung von caninem Sperma bei 4 C wird eine Vielzahl verschiedener Verdunner eingesetzt Dabei k nnen grunds tzlich kommerzielle und nichtkommerzielle d h selbst im Labor hergestellte Verd nner unterschieden werden In beiden Gruppen handelt es sich meist um TRIS oder milchbasierte Verd nner In der vorliegenden Arbeit wurden mittels Splitsample Verfahren drei verschiedene Verd nner f r die Fl ssigkonservierung von caninem Sperma bei 4 C vergleichend untersucht Dabei handelte es sich um den kommerziellen Verd nner CaniPRO Chill 10 Minitub GmbH Tiefenbach und zwei nichtkommerzielle Verd nner TRIS Fruktose Eigelb Verd nner und Uppsala Equex 2 System Diese Verd nner wurden ausgew hlt da sie kommerziell erworben werden k nnen bzw einfach herzustellen sind und deshalb in der klinischen Praxis weitverbreitet eingesetzt werden Das Uppsala Equex 2 System bei dem es sich eigentlich um einen gebr uchlichen Verd nner f r die Kryokonservierung von Hundesperma handelt wurde in diese Arbeit mit aufgenommen da es bei der Kryokonservierung gute Auftauergebnisse liefert und gepr ft werden sollte inwieweit dies auch f r die Fl ssigkonservierung zutrifft Ziel der vorliegenden Untersuchungen war somit zum einen die Kl rung der Frage welcher der drei genannten Verd nner am besten zur Fl ssigkonservierung von ca
66. daher die Ejakulate grunds tzlich nur noch im Verh ltnis 1 2 verd nnt wurden siehe Kap 5 2 4 2 Grund f r die Abweichungen der Dichten der mit CP TE und Up1 2 aufgearbeiteten Ejakulate vom angestrebten Wert war m glicherweise ein zu hohes Verd nnungsverh ltnis bei der Herstellung der fl ssigkonservierten Ejakulate aufgrund einer bersch tzung der Spermienkonzentration in den Nativejakulaten bei der manuellen Dichtebestimmung Als andere denkbare Ursache k nnte eine Sedimentation der Spermien in den Nativejakulaten vor Entnahme der entsprechenden Aliquote zur Herstellung der fl ssigkonservierten Ejakulate in Frage kommen Dagegen spricht allerdings dass das Gef mit dem Sperma vor Entnahme der zu verd nnenden Aliquote stets mehrmals geschwenkt wurde um eben eine solche Sedimentation der Samenzellen auszuschlie en Weiterhin k nnte auch eine Sedimentation der Spermien in den verd nnten Ejakulaten vor der Entnahme des Spermas zur Dichtebestimmung und somit eine fehlerhafte Untersch tzung der Spermienkonzentration urs chlich f r die geringeren Dichten sein Auch hiergegen spricht jedoch das mehrmalige Schwenken der Gef e vor der Entnahme des Spermas Letztlich blieb der Grund f r die abweichenden Werte ungekl rt was f r die vorliegenden Untersuchungen auch nicht weiter von Bedeutung war Aufgrund dieser Beobachtungen sollte aber in der Praxis bei der Herstellung von fl ssigkonserviertem Sperma welches zur Verwendung bei me
67. den einzelnen R den stets im Normbereich Der Ern hrungs ebenso wie der Pflegezustand war bei allen Tieren als gut zu beurteilen Mit Ausnahme eine Hundes Nr 24 Hodentumor rechts wiesen die Probanden keine adspektorisch oder palpatorisch nachweisbaren Erkrankungen der u eren Geschlechtsorgane auf 3 2 Spermagewinnung Von jedem der 30 R den wurde jeweils ein Ejakulat gewonnen Die Samengewinnung fand immer in gleicher Weise in einem separaten Raum in Anwesenheit einer l ufigen bzw einer mit synthetischem Pheromon Methyl 4 hydroxybenzoat in alkoholischer L sung Sigma Aldrich Laborchemikalien GmbH Seelze pr parierten Beagle H ndin zur sexuellen Stimulation statt Ausnahmen Hund Nr 3 keine H ndin Hund Nr 22 laufige Rhodesian Ridgeback H ndin Sie erfolgte mit behandschuhten H nden durch manuelle Stimulation des Penis Die Hunde wurden dabei aufgrund ihrer Gr e auf dem Boden belassen Zun chst wurde der Bulbusschwellk rper durch das Pr putium hindurch kr ftig massiert bis es zu einer partiellen Erektion kam die am beginnenden Aufknoten des Bulbus glandis zu erkennen war Nun wurde der Penis z gig aus der Pr putialh hle vorgelagert und mit Zeigefinger und Daumen der linken Hand hinter dem Bulbusschwellk rper ein Ring gebildet wobei der Handr cken zur Bauchwand des Hundes zeigte In der rechten Hand wurde das Tulpenglas zum Auffangen des Sekrets gehalten und mit der linken Hand erfolgte eine rhythmische M
68. den initialen Werten als bezeichnend f r die Hyperaktivierung angesehen Rota et al 1999b Verstegen et al 2002 Pe a Martinez 2004 Rota et al 1999b konnten in fl ssigkonservierten Ejakulaten anhand von Chlortetracyclinf rbung und Analyse der Bewegungsmuster der Samenzellen kapazitationsartige Ver nderungen nachweisen was darauf hindeutet dass die Fl ssigkonservierung kapazitationsartige Ver nderungen initiiert und beschleunigt Eine Hyperaktivierung in vitro resultiert wahrscheinlich in einer Ersch pfung der Energiereserven der Spermien Akkumulation von Metaboliten im Verd nner und folgendem Zelltod Nizanski et al 2009 Auf Basis der SpermVision Kriterien zur Klassifizierung als hyperaktive Samenzellen VCL gt 118 um s ALH gt 6 5 um und LIN lt 0 5 sowie nach den von Verstegen et al 2002 genannten Kennzeichen fur eine Hyperaktivierung VCL 270 um s ALH gt 7 um und niedrige LIN ergaben sich in der vorliegenden Arbeit in den mit den verschiedenen Verdunner aufgearbeiteten Ejakulaten jedoch zu keinem Zeitpunkt Hinweise auf ein hyperaktives Motilitatsmuster Die in den mit Up 1 verdunnten Ejakulaten bestimmten Motilitatswerte waren zu Beginn des Untersuchungszeitraums gut und auch besser als die in den mit Up 1 2 verd nnten Ejakulaten jedoch zeigte sich hier ab Tag 5 ebenfalls ein drastischer Motilitatsabfall sodass die Konservierungsergebnisse von Tag 5 an nicht mehr zufriedenstellend waren Die anfangs gute Motili
69. der Anteil an morphologisch ver nderten Samenzellen in den mit CP und TE verd nnten Ejakulaten niedriger war als im Nativsperma Tendenziell war in allen verd nnten Ejakulaten eine Verringerung des Gesamtanteils an morphologisch ver nderten Spermien im Vergleich mit dem Nativsperma zu beobachten Zwischen den verschiedenen Verd nnern untereinander konnten keine signifikanten Unterschiede ermittelt werden Die beobachteten Abnahmen des Gesamtanteils an morphologisch ver nderten Samenzellen in den verd nnten Ejakulaten unmittelbar nach dem Verd nnen waren nicht nachvollziehbar Gegen eine zufallsbedingte Beobachtung spricht die Tatsache dass es in allen verd nnten Ejakulaten unabh ngig vom Verd nner zu einer Verringerung des durchschnittlichen Anteils an morphologisch ver nderten 187 Diskussion Spermien kam M glicherweise k nnen diese Abnahmen ebenfalls durch eine Agglutination der Spermien im Eosinausstrich erkl rt werden Burgess et al 2001 da auch hier agglutinierte Spermien nicht zur Beurteilung herangezogen wurden Eine andere Ursache k nnte die Sedimentation von morphologisch ver nderten Spermienformen in den verd nnten Proben vor der Entnahme des Spermas zur Anfertigung der Eosinausstriche und somit eine fehlerhafte Untersch tzung der morphologisch ver nderten Samenzellen sein Dagegen spricht jedoch das mehrmalige Schwenken der Gef e vor der Entnahme des Spermas Weiterhin ist denkbar dass die Abnahme an mo
70. der Energiereserven verbunden ist bei pH Werten lt 5 2 kommt es zu einer deutlichen Minderung der Motilitat Hoffmann 2003d Isotonie zum Seminalplasma 250 300 mosm l Farstad 1996 Hoffmann 2003d um einen physiologischen osmotischen Druck bzw das osmotische Gleichgewicht aufrechtzuerhalten Concannon und Battista 1989 Hoffmann 2003d isotone und leicht hypertone Verd nnermedien bieten bessere Konservierungsbedingungen als hypotone Medien mit gleicher Zusammensetzung Wales und White 1958 Weitze und Petrunkina 2007 physiologische Elektrolytkonzentration Concannon und Battista 1989 Schutz der Samenzellen vor einem K lteschock w hrend des K hlungsprozesses Concannon und Battista 1989 durch Schutzkolloide Hoffmann 2003d dieser Zusatz ist bei Langzeitkonservierung oder im Rahmen der Fl ssigkonservierung bei 4 C notwendig und hat zum Ziel Sch den an der Spermienmembran durch den Aufbereitungsprozess weitestgehend zu vermeiden Hoffmann 2003d Vermeidung von Gefriersch digungen der Samenzellen bei der Langzeit konservierung durch den Zusatz von Kryoprotektiva Concannon und Battista 1989 Hoffmann 2003d Verhinderung des Wachstums von Bakterien Concannon und Battista 1989 durch den Zusatz von Antibiotika Hoffmann 2003d Verh tung von akrosomalen Ver nderungen dabei sollte die F higkeit der Spermien zum geeigneten Zeitpunkt eine physiologische AR zu durchlaufen erhalten bleiben die Konzentrationen von C
71. der Verd nner neben dem zugesetzten Eigelb Reinstwasser Natriumzitrat TRIS Glukose Fruktose herstellereigene Bestandteile und Gentamicin Was unter den herstellereigenen Bestandteilen zu verstehen war blieb offen Auch gab es keine exakten Mengenangaben zu den einzelnen Inhaltsstoffen Nur die Menge des Eigelbs war bekannt 20 da dieses selbst hinzugef gt werden musste Aufgrund dessen k nnen hinsichtlich der Effekte der einzelnen Inhaltsstoffe auf die Versuchsergebnisse nur begrenzt Aussagen gemacht werden Eine Gemeinsamkeit der drei getesteten Verd nner bestand in den verwendeten Puffersubstanzen Alle drei Verd nner enthielten TRIS der Verd nner TE und der Uppsala Equex 2 System Verd nner in gleichen Mengen Beim Verd nner CP konnte wie oben bereits erw hnt bez glich der enthaltenen Menge an TRIS keine Aussage gemacht werden Der Verd nner TE und der Uppsala Equex 2 System Verd nner beinhalteten zus tzlich Zitronens ure ebenfalls in gleichen Mengen wohingegen im Verd nner CP Natriumzitrat als zweite Puffersubstanz Verwendung fand Weiterhin waren alle drei Verd nner eigelbhaltig und besa en einen Eigelbanteil von 20 Nachteilig an Eigelb ist dass es sich um ein biologisch riskantes Produkt tierischen Ursprungs handelt Bergeron und Manjunath 2006 Farstad 2009 dessen Zusammensetzung extrem variabel ist Bergeron und Manjunath 2006 Beccaglia et al 2009a Daher kann die Gleichf rmigkeit der mit 171 D
72. des Eigelbs 60 Literatur aufgeschlossen und die Plasmamembran direkt beeinflusst Nizanski et al 2009 Aus diesem Grund muss SDS immer zusammen mit Eigelb verwendet werden damit es seine Wirkung aus ben kann Pursel et al 1978 Bencharif et al 2010 Weiterhin ist die protektive Wirkung von SDS gr er wenn die Samenzellen erst unmittelbar vor dem Einfrieren mit dem Detergens in Kontakt gebracht werden anstatt bereits w hrend der quilibrierungsperiode Pe a und Linde Forsberg 2000 was darauf hindeutet dass SDS einen nachteiligen Effekt besitzt wenn die Kontaktdauer zu lange ist Bencharif et al 2010 Bez glich der Effekte des Zusatzes von Equex STM Paste bzw Orvus ES Paste zu Verd nnern f r die Kryokonservierung von caninem Sperma l sst sich in der Literatur eine Vielzahl von Untersuchungen finden Rota et al 1997 1999a Str m Holst et al 2000 2001 Tsutsui et al 2000 Hermansson et al 2006 Hori et al 2006 Alhaider und Watson 2009 Zusammenfassend verbessert der Zusatz von Equex STM Paste zu einem konventionellen TRIS Gefrierverd nner die Viabilit t und die Langlebigkeit der Spermien nach dem Auftauen Rota et al 1997 f hrt zu einer h heren Gesamt und Vorw rtsbeweglichkeit nach dem Auftauen Rota et al 1999a Alhaider und Watson 2009 und hat eine positive Auswirkung auf die ZP Bindungsf higkeit von kryokonservierten Spermien Str m Holst et al 2000 2001 ber die Auswirkungen
73. dog semen over a storage period of ten days at 4 C In addition it should be tested how long an acceptable semen quality can be maintained in the diluted samples Therefore from each of 30 males one fractionated ejaculate was collected and the sperm rich fraction was examined by means of classical and modern spermatological investigation methods CASA system SpermVision for motility subjectively estimated progressive motility VW total motility determined by CASA GMcasa progressive motility determined by CASA VWcasa viability live dead ratio in eosin stained smears Lebende viability determined by CASA after staining with SYBR 14 PI Viacasa pathomorphology eosin stained smears Patho acrosomal changes staining with Spermac AV and functional integrity of the plasma membrane percentage of sperm cells with membrane defects in the HOS test HOS Subsequently the sperm rich fractions were divided into three equal aliquots and processed with the different extenders Immediately after dilution day 0 the same parameters were examined in the diluted ejaculates as in the native semen samples After 1 2 3 5 7 and 10 days of storage at 4 C aliquots of 100 ul of the diluted ejaculates were pre warmed at 37 C in the water bath for five 224 Summary minutes and subsequently examined for VW GMcasa VWeasa Lebende Viacasa Patho and AV In the fresh ejaculates the investigated parameters varied between different
74. ergeben als Untersuchungen bei 38 C lguer Ouada und Verstegen 2001a Die Motilitatsbeurteilung in den Nativejakulaten sowie in den fl ssigkonservierten Ejakulaten unmittelbar nach deren Herstellung wurde stets von zwei Personen durchgef hrt wobei es sich bei einer Person um einen erfahrenen Untersucher handelte Dieses Vorgehen sollte die Subjektivit t der Motilit tssch tzung reduzieren Der Anteil an lebenden Samenzellen wurde nach Supravitalf rbung mit Eosin als alleinigem Farbstoff beurteilt Riesenbeck et al 2001 Hoffmann 2003b Ebenso wurden die morphologischen Ver nderungen der Samenzellen nach F rbung mit Eosin bestimmt Hoffmann 2003b Diese F rbung wurde gew hlt da sie eine ausreichend gute Differenzierung der morphologischen Ver nderungen gestattet und einfach sowie schnell durchzuf hren ist und daher auch in der Routinepraxis gut eingesetzt werden kann Nachteilig an der Eosinf rbung ist dass die in der F rbel sung enthaltenen Salze in den getrockneten Ausstrichen zu 161 Diskussion Kristallbildungen neigen welche die Samenzellen verdecken und so deren Beurteilung verhindern Pe a Martinez 2004 In der vorliegenden Arbeit konnten Kristallbildungen in den Ausstrichen jedoch nur gelegentlich und auch nur in geringem Ausma beobachtet werden sodass eine Beurteilung der Samenzellen immer m glich war Zur Beurteilung der akrosomalen Integrit t wurde die Spermac F rbung eingesetzt welche sich beim
75. erw hnt liegt das gr te Problem bei der Fl ssigkonservierung von Sperma in der begrenzten berlebensdauer der konservierten Samenzellen Ponglowhapan et al 2004 Shahiduzzaman und Linde Forsberg 2007 Die Zugabe des Verd nners verursacht zwar keine signifikanten ultrastrukturellen Ver nderungen an den Spermien die K hlung aber resultiert in einem unmittelbaren Anstieg des Prozentsatzes an akrosomalen Sch digungen und einem darauffolgenden Abfall der Viabilit t Die Auswirkungen der K hlung auf die Ultrastruktur der Spermien k nnen unmittelbar oder verz gert auftreten Die unmittelbaren Effekte f hren zum Tod oder zur Befruchtungsunf higkeit der Samenzellen durch akrosomale Sch digungen die verz gerten Effekte reduzieren die Langlebigkeit der Spermien durch eine Ver nderung der Plasmamembranstruktur Burgess et al 2001 Nach Linde Forsberg 1991 kann fl ssigkonserviertes Hundesperma eine gute Ausgangsqualit t vorausgesetzt seine Befruchtungsf higkeit f r mindestens 12 bis 24 Stunden erhalten gew hnlich auch deutlich l nger sodass es f r nationale sowie f r viele internationale Transporte genutzt werden kann Allerdings lassen sich hinsichtlich der genauen Dauer der Erhaltung der Befruchtungsf higkeit in der Literatur keine konkreten Angaben finden Es besteht jedoch kein Zweifel daran dass die Qualit t von gek hltem Sperma mit steigender Lagerungsdauer abnimmt England und Ponzio 1996 Ponglowhapan et al 200
76. geduldige Bereitstellung ihrer Hunde ganz herzlich bedanken Bei meiner Freundin Jule m chte ich mich ganz besonders f r ihre freundschaftliche Hilfe f r ihr immer offenes Ohr f r ihre konstruktive Kritik und f r die vielen sch nen gemeinsamen Stunden w hrend der gesamten Zeit des Studiums und der Doktorarbeit bedanken Ebenfalls danke ich meinem Freund Beni f r alles Verst ndnis f r das geduldige Zuh ren und f r die technische Unterst tzung bei diversen Computerproblemen Auch bei allen anderen Freundinnen und Freunden die hier aus Platzgr nden keine Erw hnung fanden m chte ich mich f r ihre Unterst tzung bedanken Zuletzt danke ich von ganzem Herzen meiner Mutter die mir durch ihre umfassende Unterst tzung in allen Bereichen meines bisherigen Weges mein Studium und diese Arbeit erm glicht hat 291 Ich erklare Ich habe die vorgelegte Dissertation selbstandig und ohne unerlaubte fremde Hilfe und nur mit den Hilfen angefertigt die ich in der Dissertation angegeben habe Alle Textstellen die w rtlich oder sinngem aus ver ffentlichten oder nicht ver ffentlichten Schriften entnommen sind und alle Angaben die auf m ndlichen Ausk nften beruhen sind als solche kenntlich gemacht Bei den von mir durchgef hrten und in der Dissertation erw hnten Untersuchungen habe ich die Grunds tze guter wissenschaftlicher Praxis wie sie in der Satzung der Justus Liebig Universitat Gie en zur Sicherung guter wi
77. gemessene Vorw rtsbeweglichkeit x SD im Nativsperma und in den verschiedenen Verdunnern an Tag 0 CP Verd nner CaniPRO Chill 10 TE TRIS Fruktose Eigelb Verdunner Up 1 2 Uppsala Equex 2 System Verd nner 1 und Verd nner 2 Up 1 Uppsala Equex 2 System nur Verdunner 1 n Probenanzahl An Tag 0 konnte in der einfaktoriellen Varianzanalyse mit Messwiederholungen bez glich des Faktors Verd nner bei Betrachtung der durchschnittlichen CASA Vorwartsbeweglichkeit kein signifikanter Unterschied zwischen dem Nativsperma den mit CP TE sowie Up 1 2 aufgearbeiteten Ejakulaten ermittelt werden n 12 p 0 12 Auch zwischen dem Nativsperma den mit CP und den mit TE verd nnten Proben lie sich kein signifikanter Unterschied nachweisen n 30 p 0 15 Zwischen dem Nativsperma den mit CP TE und Up 1 verd nnten Ejakulaten konnte ein signifikanter Unterschied der im Mittel durch CASA gemessenen Vorw rtsbeweglichkeit nachgewiesen werden n 18 p 0 022 Der im Anschluss an die Varianzanalyse durchgef hrte paarweise Vergleich nach Student Newman Keuls zeigte einen signifikanten Unterschied zwischen den mittleren CASA Vorw rtsbeweglichkeiten in den mit CP und Up 1 verd nnten Ejakulaten auf p lt 0 05 wobei der Mittelwert in Up 1 68 2 13 7 Uber dem in CP 59 8 17 1 lag Zwischen den Nativejakulaten und den verschiedenen Verd nnern sowie zwischen den Verd nnern CP und TE bzw TE und Up 1 lie en sich keine wei
78. ist werden in Tab A2 Kap 9 7 2 die Rezepte verschiedener TRIS gepufferter Eigelb Verd nner dargestellt Der gr te Unterschied zwischen den einzelnen Verd nnern besteht in den eingesetzten Zuckerkomponenten und deren Konzentrationen Die diversen Effekte von Glukose und Fruktose sowie der Einfluss verschiedener Zuckerkonzentrationen wurden bereits in Kap 2 5 2 1 beschrieben Ein weiterer Unterschied ist beim Zusatz von Glycerol zu erkennen Nur wenige der 64 Literatur dargestellten Verd nner enthalten Glycerol da Glycerol zur Fl ssigkonservierung von Hundesperma normalerweise nicht empfohlen wird Province et al 1984 2 5 3 3 Sonstige Verd nner In Tab A3 Kap 9 7 3 werden die Rezepte verschiedener sonstiger Verd nner wiedergegeben welche sich nicht in die Kategorien Milchverd nner oder TRIS gepufferte Eigelb Verd nner einreihen lassen Hier sind insbesondere die TRIS Lecithin Verd nner hervorzuheben da diese als einzige der genannten Verd nner keine Substanzen tierischer Herkunft enthalten Beccaglia et al 2009a Kmenta et al 2011 2 5 3 4 Kommerzielle Verd nner Es gibt eine Vielzahl kommerziell erhaltlicher Verd nner zur Fl ssigkonservierung von caninem Sperma Allerdings ist deren quantitative Zusammensetzung oftmals unbekannt da sie von den Herstellern nicht offengelegt wird Linde Forsberg 1995 Iguer Ouada und Verstegen 2001b In Tab A4 Kap 9 7 4 erfolgt die Darstellung ve
79. males The average values were VW 80 8 9 5 GMcasa 70 9 18 1 VWeasa 65 0 19 9 Lebende 87 4 80 6 92 9 Viacasa 82 7 71 0 91 9 Patho 10 3 DF 1 66 AV 2 7 DF 2 63 and HOS 3 1 DF 2 34 With the exception of HOS CP 5 0 DF 2 23 TE 4 7 DF 2 12 Up 1 2 8 0 DF 2 16 Up1 4 3 DF 1 69 the investigated parameters were not substantially influenced by the dilution with the different extenders day 0 However overall semen quality of the diluted semen samples decreased continuously during the observation period of ten days Chilling of ejaculates caused a significant reduction of motility VW GMcasa VWeasa a significant slowing down of sperm velocity and a significant decrease in viability Lebende Viacasa whereas in almost all diluted ejaculates there was a slight but significant increase in pathomorphology and a significant augmentation in the proportion of sperm cells with acrosomal changes Starting from an initial VW of 77 8 11 4 CP 77 2414 3 TE 73 8418 0 Up1 2 75 8 13 8 Up 1 immediately after dilution day 0 after ten days there was still a VW of 58 2 22 1 CP 49 3423 9 TE 3 5 4 6 Up1 2 16 2 12 1 Up 1 Viacasa on day 0 was 84 3 71 4 93 8 CP 83 6 69 6 93 9 TE 75 2 57 0 89 6 Up 1 2 85 1 76 5 92 0 Up 1 and decreased during the observation period to 58 8 41 7 74 9 CP 59 7 40 8 77 3 TE 37 7 22 2 54 6
80. mit Eosin als alleinigem Farbstoff Bei toten Samenzellen ist die Plasmamembran permeabel f r den Farbstoff Eosin weshalb im Eosinausstrich rotgef rbte Spermien zum Zeitpunkt der F rbung tot waren Hoffmann 2003b Der Prozentsatz an toten eosingef rbten Spermien im Ejakulat bei Raumtemperatur variiert von 15 in der zweiten Fraktion bis 20 im Gesamtejakulat Bartlett 1962a Christiansen 1984b Seager und Fletcher 1972 konnten Prozents tze von 61 bis 99 lebenden Spermien mit einem Mittelwert von 84 3 ermitteln und auch nach Morton und Bruce 1989 betr gt die durchschnittliche Anzahl lebender Spermien 88 9 Ein gesunder R de sollte daher ber 84 lebende Spermien aufweisen Seager und Fletcher 1972 c Morphologie Die Morphologie der Samenzellen kann mittels konventioneller Lichtmikroskopie oder Phasenkontrastmikroskopie mit oder ohne F rbung untersucht werden Root Kustritz et al 1998 Grunds tzlich kommen f r die morphologische Untersuchung von Hundespermien folgende F rbungen in Betracht F rbung nach Papanicolaou Seager und Platz 1977b Eosin Hoffmann 2003b Eosin Nigrosin Seager und Platz 1977b Toluidinblau Seager und Platz 1977b Diff Quick Johnston 1991 Freshman 2002 Spermac Oettl und Soley 1988 Oettl 1993 Riesenbeck et al 2001 Hoffmann 2003b und Formolzitrat Riesenbeck et al 2001 Hoffmann 2003b blicherweise wird die Eosin Nigrosin F rbung verwendet die Beurteilun
81. nach einer Trachtigkeitsdauer von 62 Tagen zur Geburt von drei Welpen f hrte Heape 1897 Diese KB war jedoch eher experimenteller Natur und erst seit 1940 wird diese Reproduktionstechnik beim Hund angewendet um Anpaarungen zu erreichen die auf naturliche Weise unm glich gewesen waren Harrop 1956 Die erste Beschreibung einer erfolgreichen KB mit flussigkonserviertem Sperma beim Hund stammt aus dem Jahr 1954 Harrop 1954 mit Tiefgefriersoerma TG Sperma aus dem Jahr 1969 Seager 1969 Wahrend die KB bei einigen Haustierspezies insbesondere Rind und Schwein seit langer Zeit ein wichtiges Instrument der modernen Tierzucht darstellt Andersen 1980 kam der Durchbruch dieser Reproduktionstechnologie beim Hund erst in den letzten 20 Jahren was auch an der Anzahl der Publikationen und Inseminationen deutlich wird Linde Forsberg 1991 Farstad 2000 Wilson 2001 Pena et al 2006 England und Millar 2008 Wahrend die Nachfrage fur Reproduktionstechnologien generell signifikant gestiegen ist Pe a et al 2006 gibt es dennoch nationale Unterschiede in den ethischen und gesetzlichen Rahmenbedingungen die den Einsatz der KB beim Hund regeln Pesch et al 2007 England und Millar 2008 2 1 1 Vor und Nachteile Als Vorteile der KB k nnen folgende Aspekte angesehen werden Literatur Zuchtnutzung von R den oder H ndinnen die aus physischen Gr nden anatomische Abweichungen oder pathologische Zust nde nicht nat rlich
82. nner 1 n Probenanzahl Im Zeitverlauf der Flussigkonservierung kam es in allen verd nnten Ejakulaten zu einer signifikanten Reduktion der mittels CASA gemessenen Viabilitat jeweils mit Pzet lt 0 0001 In den mit CP aufgearbeiteten Ejakulaten konnte Uber den Untersuchungszeitraum bez glich der CASA Viabilit t kein signifikanter Niveauunterschied zu den mit TE aufgearbeiteten Ejakulaten ermittelt werden und auch die Zeitverl ufe zeigten keinen signifikanten Unterschied zwischen den Verd nnern CP und TE Hingegen konnte ein signifikanter Niveauunterschied zwischen den mit CP und den mit Up 1 2 Pvera lt 0 0001 sowie zwischen den mit CP und den mit Up1 pvera 0 019 aufgearbeiteten Ejakulaten nachgewiesen werden Auch die Zeitverl ufe unterschieden sich signifikant zwischen den mit CP und den mit Up 1 2 pw 0 019 sowie zwischen den mit CP und den mit Up 1 pw 0 042 aufgearbeiteten Ejakulaten Dabei konnten in den mit Up1 2 verd nnten Proben ber den gesamten Untersuchungszeitraum durchschnittlich niedrigere Werte f r die CASA Viabilit t und in den mit Up 1 verd nnten Proben ab Tag 5 durchschnittlich h here Werte als in den mit CP verd nnten Proben beobachtet werden In den mit TE verd nnten Ejakulaten konnte ein signifikanter Niveauunterschied zu den mit Up 1 2 verd nnten Ejakulaten ermittelt werden Pverd 0 0001 die Zeitverl ufe zeigten jedoch keinen signifikanten Unterschied 139 Ergebnisse Dabei waren
83. r Blut im Ejakulat sind Prostataleiden und traumatische Sch digung der stark vaskularisierten Schleimhautoberfl che des Penis Soderberg 1986 Freshman 2002 Klare und farblose Ejakulate lassen sich bei Azoospermie finden Johnston 1991 Root Kustritz 2007 c Konsistenz Die physiologische Konsistenz bzw Tr bung von Hundesperma ist milchig bis sahnig Seager und Fletcher 1972 Seager und Platz 1977b Allerdings k nnen auch Eiter Akkumulation von Proteinen oder berm ig viele Epithelzellen ein verdicktes Seminalplasma verursachen und dessen Lichtdurchl ssigkeit mindern In physiologischem Sperma ist die Tr bung ein direkter Indikator der Spermienkonzentration Seager und Fletcher 1972 wobei eine undurchsichtige Probe i d R auf eine hohe Spermienkonzentration hindeutet Seager und Platz 1977b 17 Literatur d Geruch Bei der Beurteilung des Geruchs ist unter physiologischen Bedingungen allenfalls ein geschlechtsspezifischer Geruch wahrzunehmen Geruchliche Abweichungen k nnen in Verbindung mit Blut oder Eiterbeimengungen im Ejakulat auftreten Hoffmann 2003b e Etwaige Beimengungen Makroskopische Beimengungen in Form von Partikeln sind physiologischerweise nicht im Ejakulat erkennbar Das Vorhandensein von Schmutzpartikeln deutet auf eine sekund re Verunreinigung durch unsaubere Samengewinnung hin Hoffmann 2003b 2 3 1 2 Chemisch physikalische Untersuchung Die chemisch physikalische Untersuc
84. sieben Tage gute Werte erzielt werden k nnen Auch diese in der Literatur gefundene Aussage konnte in der vorliegenden Arbeit durch die beim Uppsala Equex 2 System Verd nner erfolgte Aufteilung in die Versuchsteile I und II gut berpr ft werden siehe Kap 5 3 2 und Kap 5 3 3 da nur Verd nner 2 des Uppsala Equex 2 System Verd nners Equex enthielt und somit nur in Versuchsteil Effekte eines Zusatzes von Equex auftreten konnten 5 2 4 2 Unterschiede bez glich der Aufarbeitung Die Aufarbeitung der Nativejakulate mit den drei verschiedenen Verd nnern erfolgte im Anschluss an die Spermauntersuchung parallel Dabei wurde f r die Verd nner CP und TE stets nach dem gleichen Schema verfahren siehe Kap 3 4 2 Die entsprechenden Aliquote wurden je nach der Dichte des Nativspermas ohne weitere Vorbehandlung mit den einphasigen Verd nnern versetzt und anschlie end im K hlschrank auf 4 C abgek hlt Im Gegensatz dazu wurde f r die Aufarbeitung mit dem zweiphasigen Uppsala Equex 2 System Verd nner das gleiche Protokoll verwendet wie es in der Literatur f r den Kryokonservierungs prozess beschrieben wird Rota et al 1997 1999a Pe a und Linde Forsberg 2000 Linde Forsberg 2001 Pe a et al 2003b Hermansson und Linde Forsberg 2006 nur ohne folgende Kryokonservierung siehe Kap 3 4 2 Wesentliche Unterschiede verglichen mit der Aufarbeitung der Ejakulate mit den anderen beiden einphasigen Verd nnern waren dabei die Zentrifu
85. soll im Folgenden ausschlie lich auf die SYBR 14 PI F rbung eingegangen werden SYBR 14 ist ein fluoreszierender membranpenetrierender Nukleins ure Farbstoff der bei Anregung mit Licht einer Wellenl nge von 488 nm maximal absorbiert und bei 518nm emittiert wenn er an die DNA gebunden ist Mikroskopische Untersuchungen haben ergeben dass SYBR 14 die Zellkerne lebender Zellen hellgr n f rbt was durch simultane Untersuchung von Fluoreszenz und Motilitat bestimmt werden konnte Im Gegensatz dazu f rbt der Farbstoff PI nur nicht motile Spermien die ihre Membranintegrit t verloren haben da er membranimpermeabel ist und somit nur in gesch digte permeable Zellen eindringen kann PI bindet ebenfalls an die zellulare DNA und emittiert bei 32 Literatur Anregung mit Licht einer Wellenlange von 488 nm rote Fluoreszenz Harrison und Vickers 1990 Garner und Johnson 1995 Vorteil von SYBR 14 gegen ber den enzymbasierten F rbungen ist zum einen dass die Farbungszeit nicht so kritisch ist und zum anderen dass eine Hintergrundfarbung so gut wie nicht existent ist Garner und Johnson 1995 Die Auswertung der Fluoreszenzfarbungen erfolgt entweder flowzytometrisch oder fluoreszenzmikroskopisch durch Auszahlen der Spermien Waberski et al 1999 wobei Letzteres m hsam zeitbeanspruchend und subjektiv ist und zudem nur eine geringe Anzahl an Zellen pro Probe untersucht werden kann Pe a et al 1998b Die M glichkeit eine gro
86. spontane Dismutation aus Hyperoxidanionen O2 entsteht scheint dabei aufgrund seiner F higkeit Membranen frei zu berqueren und Enzymaktivit ten sowie zellul re Funktionen zu hemmen die toxischste Substanz zu sein Griveau et al 1995 Durch den Einfluss von ROS kommt es ber die Peroxidation von Membranphospholipiden zu einer Erh hung der Lipidhydroperoxidkonzentration einer Verminderung der F higkeit zur lonophor induzierten AR einer Reduktion der Motilit t und einem Verlust von mehrfach unges ttigten Fetts uren aus der Membran Griveau et al 1995 Eine Inhibition des Energiemetabolismus durch H202 k nnte die reversible Immobilisation der Samenzellen erkl ren Griveau et al 1995 Um sich gegen Sch digungen durch ROS zu sch tzen besitzen die Spermien folgende drei antioxidative enzymatische Systeme Superoxiddismutase Katalase und das Glutathionperoxidase Reduktase System Griveau et al 1995 Farstad 2009 Diese Verteidigungssysteme kontrollieren in vivo das Gleichgewicht zwischen ROS Produktion und Neutralisierung Farstad 2009 W hrend einer l ngeren Lagerung k nnen die endogenen antioxidativen Kapazit ten des Spermas jedoch ungen gend sein Ceylan und Serin 2007 Ein Anstieg der Konzentration von ROS im Seminalplasma oder im Verd nner w hrend der Lagerung ist verantwortlich f r Zellmembransch den und f r die Verschlechterung der Spermaqualit t Beccaglia et al 2009a Zus tzlich k nnen ROS indire
87. st hat Um das genaue Volumen an Eigelb zu bestimmen kann eine Einwegspritze verwendet werden Linde Forsberg 1991 54 Literatur Ungl cklicherweise ist Eigelb ein biologisch riskantes Produkt tierischen Ursprungs Bergeron und Manjunath 2006 Farstad 2009 dem ein potentielles Risiko mikrobieller Kontamination innewohnt Hoffmann 2003d Bergeron und Manjunath 2006 Beccaglia et al 2009b welche f r eine anschlie ende Endotoxinproduktion mit Schadigung der Befruchtungsfahigkeit der Spermien verantwortlich sein kann Beccaglia et al 2009a und wodurch die M glichkeit einer Krankheits bertragung besteht Farstad 1996 Beccaglia et al 2009a Dies kann insbesondere beim internationalen Handel mit Sperma ein Problem darstellen Farstad 1996 Beccaglia et al 2009b weshalb Eigelb von spezifisch pathogenfreien H hnern Farstad 1996 oder aus Eigelb gewonnene Phospholipide oder Lecithin zum Ersatz genutzt werden Farstad 2009 Sch fer Somi 2009 Varela Junior et al 2009 setzten aus H hnereiern gewonnenes gereinigtes LDL bei der Konservierung von Hundesperma ein und konnten zeigen dass LDL in einem TRIS Glukose Verd nner das Eigelb ersetzen kann und es dadurch zu einer Verbesserung der Spermienmotilitat und der Membranintegritat kommt Dabei konnte kein signifikanter Effekt der LDL Konzentration beobachtet werden sogar die geringste getestete Konzentration 6 sch tzt fl ssigkonserviertes Hundesperma gegen ein
88. test Its employment as an assay to evaluate the functional integrity of the frozen thawed bovine sperm membrane Theriogenology 42 2 351 360 229 Literaturverzeichnis Cortes C J Codelia V A Manosalva l de Lange J De Los Reyes M Moreno R D 2006 Proacrosin acrosin quantification as an indicator of acrosomal integrity in fresh and frozen dog spermatozoa Anim Reprod Sci 93 1 2 165 175 Dahlbom M Andersson M Vierula M Alanko M 1997 Morphometry of normal and teratozoospermic canine sperm heads using an image analyzer Work in progress Theriogenology 48 4 687 698 De los Reyes M Palomino J de Lange J Anguita C Barros C 2009 In vitro sperm penetration through the zona pellucida of immature and in vitro matured oocytes using fresh chilled and frozen canine semen Anim Reprod Sci 110 1 2 37 45 Doak R L Hall A Dale H E 1967 Longevity of spermatozoa in the reproductive tract of the bitch J Reprod Fertil 13 1 51 58 Dott H M Foster G C A 1979 The estimation of sperm motility in semen on a membrane slide by measuring the area change frequency with an image analysing computer J Reprod Fertil 55 1 161 166 Dunphy B C Kay R Barrat C L R Cooke I D 1989 Quality control during the conventional analysis of semen an essential exercise J Androl 10 5 378 385 Eder S Franz C Mueller K 2009 Computer assisted mot
89. und Methanol und 2 die Zellmembran nicht penetrierende Substanzen wie Proteine verschiedene Zucker und Polyvinylpyrrolidone England 1993 Weitze 2001 Der Zusatz kryoprotektiver Agentien bringt die Zellen in Kontakt mit einer hypertonen Umgebung Anfangs verursacht dies dass die Zellen schrumpfen Wenn das Kryoprotektivum dann aber in die Zellen eindringt gewinnen sie ihr normales Volumen wieder Beim Vorgang des Einfrierens schrumpfen die Zellen 56 Literatur erneut wahrend Wasser aus ihrem Inneren ausstromt und sich im extrazellularen Raum Eiskristalle bilden Abh ngig von der K hlrate k nnen sich auch innerhalb der Zellen Eiskristalle bilden Intrazellul re Eisbildung f hrt blicherweise zu Sch digungen der Zellmembran welche ihre semipermeablen Eigenschaften verliert was wiederum zum Zelltod f hrt Eilts 2005b Glycerol ist das am h ufigsten verwendete Kryoprotektivum f r Hundesperma Concannon und Battista 1989 Martins Bessa et al 2006 Rota et al 2006 Futino et al 2010 Es handelt sich um ein intrazellul res Kryoprotektivum Silva et al 2002 das den Gefrierpunkt in einer glycerolhaltigen L sung herabsetzt was zu h heren Anteilen der nichtgefrorenen Fraktion in der L sung und zu einer niedrigeren Salzkonzentration f hrt Weitze und Petrunkina 2007 Glycerol vermindert Zellsch den indem es die Hyperosmolarit t im umgebenden Medium reduziert Weitze und Petrunkina 2007 Trotz seiner p
90. und diese bei 21 C im Gefrierfach gelagert Vor Gebrauch wurde die L sung aufgetaut und auf 37 C angewarmt Zu den 2 5ul F rbel sung wurden dann mithilfe einer Eppendorf Pipette Eppendorf AG Hamburg 10ul Sperma hinzugegeben Nach kr ftigem Sch tteln des Reaktionsgef es erfolgte anschlie end eine Inkubation der Proben f r zehn Minuten bei 37 C b Messung Nach zehnmin tiger Inkubationszeit wurde die Leja Messkammer f r die Messung mit SpermVision wie oben beschrieben bef llt und dann durch manuelle Steuerung mittels Joystick unter das Mikroskopobjektiv gebracht Am zuvor auf Fluoreszenzmikroskopie umgestellten Mikroskop 200 fache Vergr erung wurde die Blende ge ffnet sodass das Fluoreszenzlicht sichtbares Licht mit einer Wellenl nge von 488 nm auf das Pr parat fiel Das Mikroskopbild wurde auf den Monitor bertragen F r die Messung der verschiedenen Felder musste das Pr parat mittels Joystick vom Untersucher auf die verschiedenen Positionen bewegt werden Es wurde immer die gleiche Positionsreihenfolge eingehalten Das Messsystem erkannte gr ne Spermien als intakt und rote als defekt Es erfolgte eine farbliche Identifizierung der Samenzellen mittels Overlay und die Messwerte selbst Anteile an intakten und gesch digten Spermien in Prozent 89 Material und Methoden erschienen auf dem Bildschirm neben dem Mikroskopbild und wurden zugleich in der Datenbank des Systems gespeichert von wo aus sie spater
91. unterschieden Seager und Platz 1977a G nzel 1986 blicherweise werden 0 5 ml Pailletten welche auch als Midi Pailletten Minit b 84184 Tiefenbach Deutschland bezeichnet werden verwendet Andersen 1980 Linde Forsberg 1991 Pesch et al 2007 Nach fr hestens zw lf Stunden sollte von jeder einzelnen Charge eine Samenprobe auf ihre Qualit t untersucht werden Dazu wird eine Paillette im Wasserbad bei 37 C ber 20 Sekunden aufgetaut und direkt im Anschluss werden die in Tab 2 genannten Parameter bewertet Der prozentuale Verlust an vorw rtsbeweglichen Samenzellen sollte 20 nicht berschreiten Pesch et al 2007 Der Anteil an morphologisch ver nderten Spermien kann durch das Auftreten zus tzlicher terti rer Ver nderungen welche insbesondere lose K pfe darstellen bis auf 30 erh ht sein Hoffmann 2003d Generell sollte das Sperma immer in der Weise aufgetaut werden wie sie von der herstellenden Person empfohlen wird da die Methode des Auftauens von der Methode des Einfrierens abh ngig ist Schnelles Einfrieren erfordert schnelles Auftauen und umgekehrt Linde Forsberg 1991 2 4 3 Vergleich von Fl ssig und Kryokonservierung Das gesteigerte Interesse an fl ssigkonserviertem Sperma ist auf die besseren Erfolgsraten der KB mit fl ssigkonserviertem Sperma im Vergleich zu gefrorenem Sperma zur ckzuf hren Concannon und Battista 1989 siehe Tab 1 Kap 2 1 4 Gr nde hierf r sind 1 Sch digungen durch Kryo
92. verd nnten Ejakulaten im Vergleich zu den Nativejakulaten zu einem signifikanten Anstieg des Anteils an Samenzellen mit nicht intakten bzw biochemisch nicht aktiven Membranen CP TE Up1 2 mit p lt 0 01 Up1 mit p lt 0 05 Dies ist bereinstimmend mit Rota et al 1995 bei deren Untersuchungen es durch die Zugabe verschiedener Verd nner ebenfalls zu einer tendenziellen Zunahme des Anteils an Samenzellen mit nicht intakter Plasmamembran kam wenn auch dieser nicht als signifikant zu beurteilen war Der geringste Anstieg war in mit Up 1 verd nnten Ejakulaten zu beobachten der st rkste in mit Up 1 2 verd nnten Proben jedoch konnten keine signifikanten Unterschiede zwischen den Verd nnern untereinander ermittelt werden Diese Ergebnisse k nnten darauf hindeuten dass es bereits durch die Verd nnung an sich zu einer Beeinflussung der funktionellen Merkmale der Samenzellen kommt und nicht erst durch die nachfolgende K hlung In jedem Fall wurden die Membranen bereits durch die Verd nnung gesch digt oder inaktiviert Allerdings muss beachtet werden dass die mit Up 1 2 verd nnten Proben welche den st rksten Anstieg des Anteils an Samenzellen mit nicht aufgerolltem Schwanz zeigten zum Zeitpunkt der Untersuchung bereits f r eine Stunde bei 4 C gek hlt worden waren Dadurch l sst sich eine k hlungsbedingte Verst rkung des durch die Verd nnung entstandenen Effektes nicht ausschlie en Des Weiteren muss auch die Zusammensetzung der Ve
93. verd nnten Proben ihre initiale Motilit t ber 24 Stunden Lagerung bei Raumtemperatur Die l ngste Konservierung eines gewissen Ma es an Vorw rtsbeweglichkeit betrug 32 Stunden und konnte mit dem Eigelb Zitrat Verd nner erzielt werden Zusammenfassend wurde die Motilitat der Samenzellen bei Raumtemperatur im Eigelb Zitrat und im Sterilmilch Verd nner besser erhalten als im Eigelb Phosphat Verd nner Bartlett 1962a Von Foote und Leonard 1964 wurden verschiedene Verd nner mit variierenden Gehalten an Natriumzitrat Natriummonohydrogenphosphat Kaliumdihydrogen phosphat Glycin und Eigelb untersucht und au erdem die Auswirkung eines Zusatzes von 8 Glycerol und diverser Glukosekonzentrationen zu den unterschiedlichen Verd nnern getestet Zus tzlich erfolgte ein Vergleich zwischen einem Vollmilch Verdunner und den Zitrat Glycin Verd nnern mit 20 Eigelbzusatz bzw zwischen einem Sahne Verd nner mit 9 Fett und einem Zitrat Glycin Glukose Verd nner mit ebenfalls 20 Eigelbzusatz Der Untersuchungszeitraum betrug 8 bzw 13 Tage Glycerol f hrte zu einer geringgradig reduzierten berlebensdauer der Spermien Der Zitrat Puffer war dem Phosphat Puffer und dem Glycin berlegen und 20 Eigelb dem Zusatz von 50 Eigelb Der Zusatz von Glycin zum Zitrat Puffer erschien n tzlich und ein weiterer Zusatz von Glukose zum Verd nner f hrte zu einer signifikant l ngeren Erhaltung der Motilitat der Spermien Der Vollmilch Verd nner liefe
94. von Equex zu Verdunnern f r die Fl ssigkonservierung von caninem Sperma ungeeignet ist Nizanski et al 2009 Die von Nizanski et al 2009 durch den Equex Zusatz beobachteten Ver nderungen der Motilitatsparameter in Richtung einer Hyperaktivierung signifikante Erh hung von VAP VCL VSL und ALH in den ersten drei Tagen der Fl ssigkonservierung bei gleichzeitiger Verminderung von LIN konnten in der vorliegenden Arbeit jedoch nicht nachgewiesen werden Im Gegenteil kam es in den mit Up1 2 verd nnten Ejakulaten ab Tag O zu einer kontinuierlichen Abnahme aller Geschwindigkeitsparameter w hrend die Parameter ALH und LIN sich nur geringf gig ver nderten Die Hyperaktivierung tritt physiologischerweise w hrend des Prozesses der Kapazitation im weiblichen Eileiter auf Rota et al 1999b Nizanski et al 2009 und wird als eine kr ftige nicht progressive und nicht lineare Spermienbewegung beschrieben Verstegen et al 2002 W hrend der Hyperaktivierung kommt es zu drastischen Ver nderungen des Bewegungsmusters der Spermien welches dann 198 Diskussion durch eine gro e Amplitude der lateralen Bewegungen des Kopfes und des Schwanzes verbunden mit einer langsamen oder nicht progressiven Motilitat sowie einem Flagellenschlag mit niedriger Frequenz charakterisiert ist Verstegen et al 2002 Im Allgemeinen werden signifikante Zunahmen der Parameter VCL und ALH sowie eine gleichzeitige Abnahme des Parameters LIN im Vergleich mit
95. von der enthaltenen Spermienzahl mit einem Verd nner resuspendiert G nzel 1986 Die Verd nner f r die Kryokonservierung hneln in ihrer Zusammensetzung denen f r die Fl ssigkonservierung Concannon und Battista 1989 Pesch et al 2007 enthalten aber immer zus tzlich ein Kryoprotektivum Linde Forsberg 1991 Pesch et al 2007 blicherweise setzen sich Verd nner f r die Kryokonservierung von Hundesperma aus TRIS als Puffersubstanz Zitronens ure Glukose oder Fruktose als Energiequelle Eigelb als Membranprotektivum und Glycerol als Kryoprotektivum zusammen Pena et al 2006 wobei gerade der Zusatz eines Kryoprotektivums essentiell ist Linde Forsberg 1991 Pesch et al 2007 Die Aufarbeitung kann nach einer Vielzahl ein oder zweistufiger Zugabe von zwei verschiedenen Verd nnern mit zwischenzeitlicher quilibrierung Protokolle erfolgen allen gemeinsam ist eine initiale Abk hlung auf 4 C bzw 5 C bevor das Sperma zun chst ber Stickstoffdampf und dann in fl ssigem Stickstoff gelagert wird Gill et al 1970 Silva und Verstegen 1995 England und Ponzio 1996 Linde Forsberg et al 1999 Rota et al 1999a Pe a und Linde Forsberg 2000 Linde Forsberg 2001 Eilts 2005b Hermansson und Linde Forsberg 2006 Martins Bessa et al 2006 Pe a et al 2006 Pesch et al 2007 Hinsichtlich der Konfektionierung werden Glasampullen R hrchen mit einem Volumen von 43 Literatur 0 25 bis 1 ml und Pellets
96. vorw rtsbeweglichen Spermien nach ihren Bewegungsmerkmalen wie Hyperaktivitat und Linearit t unterteilt und die zur ckgelegten Wegstrecken ebenfalls farblich markiert Die Messwerte selbst erschienen auf dem Bildschirm neben dem Mikroskopbild und wurden zugleich in der Datenbank des Systems gespeichert von wo aus sie sp ter zur weiteren Bearbeitung nach Microsoft Excel exportiert werden konnten Das vorangehend beschriebene Monitorbild ist in Abb 4 zu sehen 86 Material und Methoden SpermYision Registered to Minitube Germany ABFULL UND LABORTECH Local Database Connection ORTEN Px Analysis T Databases Q Reports Toots N Live Video Help Viability test Af Los ort gt Motility Analysis Lovis me CZE xee Dilution Ratio 1 fo iv Hold for viability Analysis type gt Motiity list Statistics Note Field 1 Field 2 Field 3 Field 4 Field 5 Field6 Field Field 8 I Save images for this field Totals Standard Deviation Cels 13 1495 Median Concentration 70 2000 85 4000 12 150 89 500 Motility 8749 13 152 88 1 Progressive motility 80 87 2 833 81 1 Local motility 17 19 6 62 2 026 72 Immotile 16 3 12 5 13 152 12 8 J Field info Progressive Info Cell Detail it 137 16 353 337 Curvalinear 85 1152 Frame 1 of 30 Light Meter Z IV Display curved line 2 Ei Saeed Pe Display average path X Analyze New Chamber Clear Field C
97. werden Johnston 1991 Auch prim re Spermatozyten welche auf eine Malfunktion des Spermatogeneseprozesses hindeuten k nnen vorkommen Seager und Platz 1977b Des Weiteren sollten auch Spermienagglutinationen ber cksichtigt werden Diese betreffen allerdings nicht das Anhaften an Eigelbpartikeln des Verd nners an Debris oder an Luftblasen Freshman 2002 2 3 2 Hypoosmotischer Schwelltest HOS Test Dieser urspr nglich von Jeyendran et al 1984 f r die Humanmedizin entwickelte Test untersucht die funktionale Integrit t der Spermienplasmamembran indem deren Reaktion unter hypoosmotischen Bedingungen beobachtet wird Jeyendran et al 1992 England und Plummer 1993 sowie Kumi Diaka 1993 wendeten ihn erstmals f r die Untersuchung von caninem Sperma an Im hypoosmotischen Milieu kommt es ber die intakte Zellmembran zu einem Fl ssigkeitstransport bis ein Gleichgewicht zwischen dem Inneren der Zelle und der Umgebung erreicht ist 23 Literatur Aufgrund des Einstroms von Fl ssigkeit vergr ert sich die Zelle wodurch eine Ausw lbung der Plasmamembran verursacht wird Die Fibers axonemaler Komplex des Spermienschwanzes sind normalerweise von der Plasmamembran eng umschlossen Wenn die Plasmamembran nun unter hypoosmotischen Bedingungen anschwillt so tritt ein Einrollen und Verbiegen der Schwanzfibers innerhalb der Plasmamembran ein Diese Schwanzver nderungen k nnen mithilfe eines Phasenkontrastmikroskops einfac
98. werden Pze 0 0014 bis lt 0 0001 In den mit CP verd nnten Ejakulaten konnten ber den Untersuchungszeitraum f r ALH signifikante Niveauunterschiede zu den mit TE Pvera 0 0007 und Up 1 2 Pvera 0 0001 aufgearbeiteten Ejakulaten nachgewiesen werden Die Zeitverl ufe unterschieden sich zwischen den mit CP und den mit TE verd nnten Ejakulaten nicht signifikant und auch zwischen den mit CP und den mit Up 1 2 verd nnten Ejakulaten konnte f r ALH kein signifikanter Unterschied der Zeitverl ufe ermittelt werden Allerdings unterschied sich der Zeitverlauf der mit CP verd nnten Ejakulate signifikant von dem der mit Up 1 verd nnten Ejakulate pw lt 0 0001 Die mit TE verd nnten Ejakulate zeigten bez glich des Parameters ALH signifikante Niveauunterschiede zu den mit Up1 2 pvera 0 0001 sowie zu den mit Up1 Pverd 0 028 verd nnten Ejakulaten und auch die Zeitverl ufe zwischen den mit TE und den mit Up 1 verd nnten Ejakulaten unterschieden sich f r ALH signifikant pw 0 0006 Zwischen den Zeitverl ufen der mit TE und Up 1 2 verd nnten Ejakulate konnte kein signifikanter Unterschied verifiziert werden Tab A10 A14 Kap 9 8 132 Ergebnisse Bei Betrachtung des Parameters BCF zeigten sich ber den Untersuchungszeitraum in allen verd nnten Ejakulaten tendenzielle Abnahmen der Mittelwerte Dabei war die Differenz zwischen Tag 0 und Tag 10 in den mit Up 1 2 aufgearbeiteten Ejakulaten am gr ten Im Gegensatz dazu k
99. zwischen Tag O und Tag 10 festgestellt werden wobei die Mittelwerte bis einschlie lich Tag 7 in den mit CP verd nnten Ejakulaten jedoch trotzdem h her lagen als in den mit TE Up1 2 und Up 1 verd nnten Ejakulaten Die durchschnittlichen Werte in den mit TE verd nnten Ejakulaten lagen bis einschlie lich Tag 3 Uber denen in den mit Up 1 2 und Up 1 verd nnten Ejakulaten an den Tagen 5 und 7 nur Uber denen in mit Up1 2 verd nnten Ejakulaten und an Tag 10 nur ber dem in mit Up 1 verd nnten Ejakulaten Der h chste durchschnittliche Wert f r WOB an Tag 10 konnte ebenfalls wieder in den mit Up1 2 verd nnten Ejakulaten beobachtet werden Im Zeitverlauf der Fl ssigkonservierung waren in den mit CP TE und Up1 aufgearbeiteten Ejakulaten signifikante Abnahmen der Mittelwerte des Parameters WOB nachweisbar jeweils mit Pze lt 0 0001 Die mit CP verd nnten Ejakulate zeigten im Zeitverlauf bez glich WOB einen signifikanten Niveauunterschied zu den mit Up1 verd nnten Ejakulaten Pvera 0 0005 Die Zeitverl ufe lie en zwischen den mit CP und den mit TE pw 0 0035 sowie zwischen den mit CP und den mit Up1 2 pw 0 0099 verd nnten Ejakulaten signifikante Unterschiede erkennen Die mit TE aufgearbeiteten Ejakulate zeigten f r WOB einen signifikanten Niveauunterschied zu den mit Up 1 aufgearbeiteten Ejakulaten 135 Ergebnisse Pvera 0 0078 wobei kein signifikanter Unterschied der Zeitverl ufe ermittelt werden konnte Tab A
100. 0 8 12 6 2 77 5 8 8 74 6 14 6 65 1 18 0 3 72 2 11 4 69 9 12 2 58 4 16 0 5 65 3 411 7 62 9 10 0 52 7 11 8 7 44 9 17 4 49 2 15 5 37 4 16 4 10 16 2 12 1 24 2 11 5 12 3 10 1 4 3 1 2 Mittels CASA gemessene Gesamtmotilitat Abb 14 und Tab 19 zeigen den Prozentsatz an motilen Samenzellen CASA Gesamtmotilitat in den verschiedenen Verd nnern bei Fl ssigkonservierung bei 4 C f r zehn Tage An Tag 0 unmittelbar nach dem Verd nnen konnte bez glich der CASA Gesamtmotilitat bereits ein signifikanter Unterschied zwischen den mit CP und den mit Up1 verd nnten Ejakulaten festgestellt werden siehe Kap 125 Ergebnisse 4 2 2 2 wobei der Mittelwert in den mit Up 1 verdunnten Ejakulaten Uber dem in den mit CP verd nnten Ejakulaten lag Die mit den anderen Verd nnern aufgearbeiteten Ejakulate unterschieden sich an Tag 0 nicht signifikant voneinander Wie auch in der graphischen Darstellung Abb 14 erkennbar war die durchschnittliche CASA Gesamtmotilitat in den mit Up 1 verd nnten Proben bis einschlie lich Tag 2 h her als die mittlere CASA Gesamtmotilitat in den brigen Proben An Tag 3 zeigten die mit CP TE und Up 1 aufgearbeiteten Ejakulate nahezu gleiche Mittelwerte Nur in den mit Up 1 2 verd nnten Proben lie sich bereits ab Tag 1 ein starker Abfall der CASA Gesamtmotilitat beobachten sodass der Mittelwert an Tag 3 bereits deutlich unter dem der mit den anderen Verd nnern aufgearbeiteten Ejakulate lag Im w
101. 01 Der wichtigste Effekt von Zuckerkomponenten in Verd nnern zur Fl ssig konservierung ist die Aufrechterhaltung der Spermienmotilitat Ponglowhapan et al 2004 Zucker sind als externe Energiequelle essentiell f r die Erhaltung der Motilit t weshalb die Motilit t einen bedeutenden Indikator f r die Zuckernutzung durch die Spermien darstellt Ponglowhapan et al 2004 Werden Spermien in Abwesenheit jeglicher externer Energiequellen inkubiert so k nnen sie ihre Motilit t bis zu 60 Minuten erhalten wobei sich allerdings die Motilit tsmuster ver ndern Die interne Energiequelle die dabei genutzt wird k nnte Glykogen sein welches in caninen Spermien in erheblichen Mengen vorhanden ist Rigau et al 2001 Zuckerzusatz in Form von Glukose 1 zu einem Eigelb Zitrat Glycin Verd nner erh ht die Motilitat nach einer Lagerungsdauer von 13 Tagen signifikant verglichen mit einer Kontrolle ohne Glukose 40 versus 28 Foote und Leonard 1964 In Verd nnern mit Zuckerzusatz in einer Konzentration von 70mM sind die durchschnittliche Gesamtmotilit der Anteil an vorw rtsbeweglichen Spermien und die Werte des Motilitatsparameters VAP signifikant erh ht und es k nnen Werte von 270 Gesamtmotilit t ber eine 48 Literatur Lagerungsdauer von bis zu acht Tagen aufrechterhalten werden Ponglowhapan et al 2004 Die mittleren Werte fur VAP VSL und VCL steigen im Vergleich zu frischem Sperma in der ersten Lagerungsperiode
102. 1 Weitere wichtige Aspekte bei der Verwendung von CASA Systemen sind die Temperaturkontrolle die Nutzung eines geeigneten Phasenkontrastmikroskops 26 Literatur die Probenvorbereitung Amann und Katz 2004 und die Analysezeit periode Smith und England 2001 Empfohlen werden eine konstante Untersuchungstemperatur von 37 38 C entsprechend der caninen K rper und Uterustemperatur Iguer Ouada und Verstegen 2001a Amann und Katz 2004 und Inkubationszeiten lt 1 Minute Smith und England 2001 Niedrigere Temperaturen sowie l ngere Inkubationszeiten f hren zu einer negativen Beeinflussung der Spermaqualit t bzw der Motilitat Iguer Ouada und Verstegen 2001a Smith und England 2001 Aufgrund der hohen Dichte der zweiten Fraktion caniner Ejakulate ist f r die Untersuchung mittels CASA blicherweise eine Verd nnung notwendig Verstegen et al 2002 Rijsselaere et al 2003 Sch fer Somi und Aurich 2007 Hier werden Konzentrationen von 50x 10 Spermien pro ml Rijsselaere et al 2003 bzw von 100 x 10 Spermien pro ml G nzel Apel et al 1993 Iguer Ouada und Verstegen 2001a Sch fer Somi und Aurich 2007 oder eine Verd nnung von 1 20 Smith und England 2001 empfohlen Durch die Verd nnung des Spermas werden verschiedene Motilitatsparameter Smith und England 2001 Rijsselaere et al 2003 Schafer Somi und Aurich 2007 und die Membranintegrit t Sch fer Somi und Aurich 2007 in Abh ngigkeit vom Grad der
103. 1 Zusammenfassend ist die Verwendung von fl ssigkonserviertem Sperma i d R die Methode der Wahl da sie einfacher und g nstiger ist und bessere Ergebnisse liefert Linde Forsberg 1991 Mit guter Planung die bereits dann beginnen sollte wenn die H ndin in den strus kommt sollte das Problem der Organisation der Spermagewinnung und des Samentransportes nicht allzu schwierig zu berwinden sein Linde Forsberg 1991 Im Gegensatz dazu sollte TG Sperma empfohlen 45 Literatur werden wenn lange Transportzeiten zu erwarten sind Sperma fur mehrere Hundinnen gefragt ist die Personen die in den Prozess involviert sind am geeigneten Tag fur die Besamung einer bestimmten Hundin nicht greifoar sind und nat rlich wenn eine Sameneinlagerung fur einen zuk nftigen Gebrauch angestrebt wird Linde Forsberg 1991 2 5 Verd nner zur Fl ssigkonservierung von caninem Sperma Durch die Zugabe eines geeigneten Verd nners zum Ejakulat kann die Lebensdauer der Samenzellen verl ngert werden Hoffmann 2003d Der Verd nner stabilisiert die Zellmembran Eilts 2005b wodurch diese vor Sch digungen durch Temperaturver nderungen und Ersch tterungen beim Transport gesch tzt wird Linde Forsberg 1995 Gleichzeitig stellt er Energie bereit und h lt den pH Wert sowie den osmotischen Druck konstant Linde Forsberg 1995 Farstad 1996 blicherweise finden als Verd nnerbestandteile N hr Puffer und Schutzsubstanzen Verwendung G nzel
104. 1 190 199 Thomassen R Farstad W Krogenaes A Fougner J A Andersen Berg K 2001 Artificial insemination with frozen semen in dogs A retrospective study J Reprod Fertil 57 Suppl 341 346 Thomassen R Sanson G Krogenaes A Fougner J A Berg K A Farstad W 2006 Artificial insemination with frozen semen in dogs A retrospective study of 10 years using a non surgical approach Theriogenology 66 6 7 1645 1650 Tsutsui T Hase M Hori T Ito T Kawakami E 2000 Effects of Orvus ES paste on canine spermatozoal longevity after freezing and thawing J Vet Med Sci 62 5 533 535 Tsutsui T Hori T Yamada A Kirihara N Kawakami E 2003a Intratubal insemination with fresh semen in dogs J Vet Med Sci 65 5 659 661 247 Literaturverzeichnis Tsutsui T Tezuka T Mikasa Y Sugisawa H Kirihara N Hori T Kawakami E 2003b Artificial insemination with canine semen stored at a low temperature J Vet Med Sci 65 3 307 312 Varela Junior A S Corcini C D Ulguim R R Alvarenga M V Bianchi l Correa M N Lucia T Jr Deschamps J C 2009 Effect of low density lipoprotein on the quality of cryopreserved dog semen Anim Reprod Sci 115 1 4 323 327 Verstegen J Iguer Ouada M Onclin K 2002 Computer assisted semen analyzers in andrology research and veterinary practice Theriogenology 57 1 149 179 Verstegen J P
105. 10 A14 Kap 9 8 4 3 2 Einfluss der Verdunner auf die Viabilitat im Zeitverlauf Die Viabilitat der mit den verschiedenen VerdUnnern aufgearbeiteten Ejakulate verminderte sich w hrend der Fl ssigkonservierung bei 4 C ber zehn Tage Dies konnte sowohl mit den Methoden der klassischen Spermatologie Eosinausstrich als auch mittels CASA nach SYBR 14 PI F rbung nachgewiesen werden wobei im Durchschnitt jedoch die mittels CASA gemessenen Werte insbesondere gegen Ende des Untersuchungszeitraumes deutlich niedriger waren als die durch Ausz hlung des Eosinausstrichs ermittelten Werte F r den Anteil an lebenden Samenzellen im Eosinausstrich wie auch f r die CASA Viabilit t nach SYBR 14 Pl Farbung galt tendenziell dass in den mit Up 1 aufgearbeiteten Ejakulaten ber den gesamten Zeitverlauf die h chsten Mittelwerte beobachtet werden konnten und die mit CP und TE aufgearbeiteten Ejakulate einen einander hnlichen Verlauf aufwiesen wobei die Mittelwerte leicht unter denen in den mit Up 1 aufgearbeiteten Ejakulaten lagen Die Mittelwerte in den mit Up1 2 aufgearbeiteten Ejakulaten waren ber den gesamten Untersuchungszeitraum deutlich niedriger 4 3 2 1 Anteil lebender Samenzellen im Eosinausstrich Abb 16 zeigt den prozentualen Anteil lebender Samenzellen im Eosinausstrich in den verschiedenen Verd nnern bei Fl ssigkonservierung bei 4 C f r zehn Tage W hrend an Tag 0 unmittelbar nach dem Verd nnen bez glich des Anteils an lebe
106. 1986 Eine weitere M glichkeit zur Konservierung von Hundesperma ist die Mikroeinkapselung des Spermas in Gel 33 Literatur Mikrokapseln 0 75 oder 1 Natriumalginat oder polykationische Mikrokapseln zusatzlich Poly L Lysin und deren anschlieRende Lagerung bei 4 C Bei polykationischer Mikroeinkapselung mit einer Alginatkonzentration von 1 lasst sich canines Sperma erfolgreich kuhl lagern und erhalt seine Motilitat und Viabilitat f r bis zu sieben Tage Shah et al 2010 Auf die letztgenannte Konservierungsform wird im Rahmen dieser Arbeit jedoch nicht weiter eingegangen Unabhangig davon welche Konservierungsform angestrebt wird sollte das Sperma nach der Gewinnung so schnell wie m glich weiterverarbeitet werden Kibble 1969 W hrend die Initialmotilitat in unverd nntem Sperma ann hernd identisch mit der in verd nntem Sperma ist G nzel 1986 sinkt bei unverd nntem Sperma das bei 4 C aufbewahrt wird die durchschnittliche Motilitat nach einer Lagerungsdauer von zwei Tagen auf Werte lt 20 wobei der Anteil an Samenzellen mit morphologischen Ver nderungen rapide ansteigt Tsutsui et al 2003b Im Vergleich hierzu reduziert sich die erzielte Konzeptionsrate von 80 nach einem Tag Lagerung auf 30 nach zwei Tagen was durch eine Verdopplung der Inseminationsdosis von 200 auf 400x 10 Spermien kompensiert werden kann Konzeptionsrate 70 Tsutsui et al 2003b Generell ist die Nutzung von unverd nntem Sper
107. 1993 Iguer Ouada und Verstegen 2001a Rijsselaere et al 2003 Sch fer Somi und Aurich 2007 um eine bessere Vergleichbarkeit der Ergebnisse zu gew hrleisten da durch die Verd nnung die Motilit t und die Membranintegrit t der Spermien beeinflusst werden Sch fer Somi und Aurich 2007 Diese Beeinflussung ist abh ngig vom Grad der Verd nnung und dem verwendeten Verd nnermedium lgquer Ouada und Verstegen 2001a Smith und England 2001 Amann und Katz 2004 Das Verd nnermedium sollte keine Partikel enthalten die in ihrer Gr e hnlich den Dimensionen der Spermienk pfe sind z B nicht gekl rtes Eigelb oder Vollmilch Verd nner da diese bei Anwendung von CASA Systemen sonst nicht von unbeweglichen Samenzellen unterschieden werden k nnen Verstegen et al 2002 was zu einer bersch tzung des Anteils an immotilen Spermien f hren kann Ponglowhapan et al 2004 Bei der Verd nnung der Nativejakulate f r die Messungen mittels CASA wurde diese Forderung eingehalten indem auf 37 C angew rmtes Auftaumedium verwendet wurde welches keine Partikel enthielt Die fl ssigkonservierten Ejakulate die f r die CASA Messungen nur vereinzelt verd nnt werden mussten einige Halteproben von mit Up1 verd nnten Ejakulaten enthielten hingegen von vornherein alle Eigelb da alle getesteten Verd nner eigelbhaltig waren Allerdings war die Unterscheidung des SpermVision Systems zwischen Eigelbpartikeln und Spermienk pfen bei allen
108. 2 28 6 Kenney s 5 3 60 0 andere Verd nner 10 4 40 0 Gesamt 269 126 47 3 2 5 3 1 Als Verd nner auf Milchbasis f r die Fl ssigkonservierung von Hundeejakulaten Milchverd nner kommen gekochte Magermilch Thacker und Almquist 1953 Foote 1964b Christiansen 1984a Province et al 1984 Weitze 2001 homogenisierte sterilisierte Milch mit 2 Fett Christiansen 1984a homogenisierte gekochte Vollmilch Thacker und Almquist 1953 Harrop 1954 Bartlett 1962a Foote 1964b Weitze 2001 und sterilisierte Sahne mit 9 Fett Foote und Leonard 1964 in Frage Ebenso k nnen Kombinationen aus Milch und anderen Komponenten z B Milch Zitrat und Milch Eigelb Weitze 2001 oder eine Mischung aus 80 homogenisierter pasteurisierter Sahne 12 Fett und 20 Eigelb Linde Forsberg 1991 eingesetzt werden Das vorherige Aufkochen f r zehn Minuten bei 92 94 C Harrop 1954 Province et al 1984 dient der Zerst rung toxischer Substanzen Weitze 2001 63 Literatur Als kommerzieller Verd nner auf Milchbasis ist der NFDMS G Non Fat Dried Milk Solid Glucose Verd nner welcher bereits 1975 von Kenney beschrieben wurde zu nennen Bouchard et al 1990 Der Kenney Verd nner Fa Hamilton Thorn Research Beverly MA USA der zur Kurzzeitkonservierung von Hengstsperma routinem ig verwendet wird stellt eine L sung aus Trockenmagermilch Glukose und Natriumbikarbonat dar Sch fer et al 1997 u
109. 2005 Artificial insemination in Proceedings ESAVS Reproduction in companion exotic and laboratory animal Nantes 2005 Linde Forsberg C Forsberg M 1989 Fertility in dogs in relation to semen quality and the time and site of insemination with fresh and frozen semen J Reprod Fertil 39 Suppl 299 310 Linde Forsberg C Forsberg M 1993 Results of 527 controlled artificial inseminations in dogs J Reprod Fertil 47 Suppl 313 323 237 Literaturverzeichnis Linde Forsberg C Strom Holst B Govette G 1999 Comparison of fertility data from vaginal vs intrauterine insemination of frozen thawed dog semen A retrospective study Theriogenology 52 1 11 23 Lopes B V Cunha C N Silva J F S Vidal Junior M V Vianna A P 2008 Canine chilled semen Influence of latex and air in Proceedings of the 6th International Symposium on Canine and Feline Reproduction amp 6th Biannual European Veterinary Society for Small Animal Reproduction Congress Vienna 2008 Internet URL http www ivis org International Veterinary Information Service Ithaca New York USA Lopes G Sim es A Ferreira P Martins Bessa A Rocha A 2009a Differences in preservation of canine chilled semen using different transport containers Anim Reprod Sci 112 1 2 158 163 Lopes K R F Costa L L M Lima G L Souza A L P Silva A R 2009b Dimethylformamide is no better than gly
110. 30 2 6 1 17 6 42 0 2 29 8 5 6 18 8 40 6 3 29 2 34 9 20 0 39 4 5 29 4 34 4 19 5 38 7 7 27 6 5 6 9 2 35 2 10 25 3 5 8 7 9 33 9 Up1 2 12 0 26 5 5 8 17 4 37 2 1 24 8 4 6 16 6 32 5 2 23 9 4 1 16 2 31 0 3 20 6 5 1 12 4 28 1 5 20 1 4 5 10 2 25 0 7 15 0 5 3 0 0 19 3 10 10 8 2 1 6 9 14 5 Up 1 18 0 28 0 434 3 19 2 34 8 1 27 6 7 2 17 0 51 8 2 25 8 7 93 13 5 48 2 3 28 1 10 9 11 7 53 9 5 27 9 10 3 16 0 49 6 7 24 0 9 0 15 4 43 6 10 15 1 3 9 10 0 24 0 VAP um s CP 30 0 90 9 16 0 54 1 113 0 1 90 2 13 6 58 6 106 5 2 89 4 14 1 52 2 105 0 3 87 2 13 7 52 8 103 1 5 86 4 12 2 54 4 99 3 7 83 2 10 4 58 3 97 1 10 LO 0217 9 0 0 94 7 TE 30 0 87 8 15 4 51 2 119 5 1 88 1 13 2 55 7 105 4 2 86 2 12 9 52 3 102 3 3 84 0 12 3 53 3 104 5 5 83 8 10 4 51 8 98 3 T 79 0 13 9 25 6 92 3 274 Anhang 10 73 1 14 1 32 0 88 4 Up1 2 12 17 0 72 2 12 6 52 7 89 5 1 70 4 11 1 52 9 85 2 2 66 9 11 1 50 4 82 5 3 59 6 13 0 41 4 76 6 5 57 2 12 4 26 4 66 6 7 43 7 15 8 0 0 55 8 10 34 7 6 3 23 0 45 5 Up 1 18770 83 8 10 4 53 9 94 6 1 83 6 13 9 51 5 123 8 2 78 5 16 6 37 2 117 0 3 80 1 22 6 34 3 131 0 5 79 1 20 9 49 3 126 5 7 68 1 19 1 47 1 107 4 10 45 4 10 1 30 9 66 1 VCL um s CP 30 0 127 0 16 5 90 2 153 7 1 130 3 13 1 94 4 151 7 2 129 0 14 8 87 2 152 2 3 127 4 15 7 87 5 164 6 5 127 3 18 5 69 3 171 5 7 126 4 13 9 86 1 165 5 10 123 8 2
111. 4 und auch die Befruchtungsf higkeit der Samenzellen aufgrund oxidativer Sch digung verringert wird Lopes et al 2008 Die zeitliche Abnahme der Befruchtungsfahigkeit von flussigkonserviertem Sperma ist aber schwierig einzusch tzen da sie offensichtlich nur bedingt mit der Abnahme der Motilitat korreliert Pesch et al 39 Literatur 2007 So sinkt das Befruchtungspotential von Spermien bereits circa eine Woche vor einem zu beobachtenden Motilitatsabfall deutlich ab Pe a et al 2006 Aus diesem Grund wird trotz Erhalt von Motilitat und Membranintegritat Uber mindestens f nf bis sieben Tage Pena et al 2006 empfohlen fl ssigkonserviertes Sperma innerhalb von zwei bis drei Tagen nach der Gewinnung zu verwenden G nzel 1986 Pe a et al 2006 Pesch et al 2007 Bei Nutzung von l nger gelagertem Fl ssigsperma sinken die Befruchtungschancen da sich die Anzahl fertiler Samenzellen mit zunehmender Lagerungsdauer rasch reduziert G nzel 1986 Nach Nizanski 2009 bleibt die Befruchtungsf higkeit von flussigkonserviertem Sperma f r mehrere Tage erhalten und die mit diesem Sperma erzielten Tr chtigkeitsraten sind zufriedenstellend aber abh ngig von der Lagerungsdauer Tsutsui et al 2003b konnten nach einer Lagerungsdauer von vier Tagen in einem TRIS Fruktose Eigelb Zitrat Verd nner bei intravaginaler Besamung mit einer Besamungsdosis von 4x 10 Samenzellen eine Konzeptionsrate von 83 3 mittlere Wurfgr e 3 2
112. 4 2 2 3 Mittels CASA gemessene Vorw rtsbeweglichkeit Die durchschnittliche mittels CASA bestimmte Vorwartsbeweglichkeit der Nativejakulate und der mit den verschiedenen Verdunnern aufgearbeiteten Ejakulate unmittelbar nach dem Verd nnen Tag 0 ist in Abb 9 dargestellt Wie bei der CASA Gesamtmotilitat kam es auch bei der CASA Vorw rtsbeweglichkeit beim Vergleich der Messwerte der verd nnten Ejakulate mit denen des Nativspermas in den mit CP und Up 1 2 aufgearbeiteten Ejakulaten zu einer Reduktion der Motilit t Ebenso konnte in den mit TE aufgearbeiteten Ejakulaten ein Motilit tsabfall unmittelbar nach dem Verd nnen beobachtet werden Die st rkste Abnahme der CASA Vorw rtsbeweglichkeit fand in den mit Up1 2 verd nnten Ejakulaten statt In den mit Up 1 aufgearbeiteten Ejakulaten lie sich dagegen eine tendenzielle Zunahme der CASA Vorw rtsbeweglichkeit feststellen Auch hier konnten jedoch keine statistischen Signifikanzen f r die beobachteten Ver nderungen nachgewiesen werden 105 Ergebnisse ONativsperma n 30 BCP n 30 BTE n 30 BUp 1 2 n 12 Up 1 n 18 uw lt gt SH Sv OD 2 OD SOE RR 0000088 AAE ES RAR a aces R xX 2 x c 2 eK Ba a N E E o gt RK 25 2 Oo POLY sa amp bes amp be Abb 9 Prozentsatz an vorw rtsbeweglichen Samenzellen mittels Computer assisted sperm analysis CASA SpermVision System
113. 7 6 52 0 80 0 5 65 7 6 2 52 0 77 0 7 64 4 7 5 49 0 79 0 10 63 1 10 1 46 0 100 0 Up 1 2 12 0 65 5 6 4 57 0 74 0 1 65 1 5 3 57 0 71 0 2 65 9 4 5 58 0 71 0 3 63 5 5 6 54 0 70 0 5 65 1 10 5 51 0 93 0 7 58 3 19 9 0 0 84 0 10 69 6 8 2 56 0 80 0 278 Anhang Up 1 18 0 67 7 4 1 60 0 75 0 1 65 5 6 4 56 0 80 0 2 64 4 7 5 53 0 81 0 3 65 7 10 6 36 0 81 0 5 65 7 7 4 52 0 77 0 7 64 5 6 6 51 0 76 0 10 59 0 10 1 40 0 86 0 Tab A10 Resultate der zweifaktoriellen Varianzanalysen mit Messwiederholungen bez glich der Faktoren Verd nner und Zeit zum Vergleich der Verd nner CP und TE im Zeitverlauf Tag 0 10 der Fl ssigkonservierung bei 4 C f r 10 Tage n 30 Parameter Haupteffekte Wechselwirkung p Wert p Wert Verdunner Zeit Verdunner x Zeit geschatzte Vorwartsbeweglichkeit lt 0 0001 lt 0 0001 lt 0 0001 CASA Gesamtmotilitat 0 32 lt 0 0001 lt 0 0001 CASA Vorw rtsbeweglichkeit 0 011 lt 0 0001 lt 0 0001 DAP lt 0 0001 lt 0 0001 0 89 DCL 0 011 0 0021 0 037 DSL lt 0 0001 lt 0 0001 0 7 VAP lt 0 0001 lt 0 0001 0 88 VCL 0 033 0 0012 0 059 VSL lt 0 0001 lt 0 0001 0 72 ALH 0 0007 lt 0 0001 0 062 BCF 0 0006 0 054 0 35 STR 0 24 0 28 0 073 LIN 0 016 lt 0 0001 0 0012 WOB 0 094 lt 0 0001 0 0035 Lebende Eosinausstrich 0 97 lt 0 0001 0 41 CASA
114. 8 verglichen mit dem in den mit Up 1 2 verd nnten Ejakulaten 6 6 und lag auch unter den in den mit CP 4 2 und TE 3 9 verd nnten Ejakulaten ermittelten Werten Ab Tag 3 lag der mittlere Anteil an Kopfkappenveranderungen in den mit Up 1 2 verd nnten Ejakulaten stets unter dem Anteil in den mit den anderen Verd nnern aufgearbeiteten Ejakulaten und betrug an Tag 10 durchschnittlich 4 0 144 Ergebnisse 20 0 oS 18 0 OS 160 JIa 2 140 ces CP n 30 558 120 n 30 Qu 10 0 TE n 30 lt 58 80 SB ten Up 1 2 n 12 g 6 aa SA 20 Abb 19 Ver nderungen des prozentualen Anteils an Samenzellen mit Kopfkappenver nderungen Spermac F rbung in den verschiedenen Verd nnern im Zeitverlauf der Fl ssigkonservierung bei 4 C ber zehn Tage dargestellt als geometrischer Mittelwert und Streufaktor x SF CP Verd nner CaniPRO Chill 10 TE TRIS Fruktose Eigelb Verd nner Up1 2 Uppsala Equex 2 System Verd nner 1 und Verd nner 2 Up1 Uppsala Equex 2 System nur Verd nner 1 n Probenanzahl In den mit CP TE und Up1 verd nnten Ejakulaten kam es im Zeitverlauf der Fl ssigkonservierung zu einem signifikanten Anstieg des Anteils an Samenzellen mit Kopfkappenver nderungen Ppzeit 0 0006 bis lt 0 0001 In den mit CP aufgearbeiteten Ejakulaten konnten ber den Untersuchungszeitraum bez glich des Anteils an Samenzellen mit Kopfkappenver nderungen keine signifikanten Unter
115. 8 qeoog Ie Je NSnsL wnijey 9 Ulud Iu oZ ysepiq Bo Bei Byz u 6wu uloXAwojdesjsoupAuiq WW g9 900Z Ie 38 eyad W L 000 UIIouad 0Z Ww 02 vsa WwW 002 lu OOL 600Z Ie 39 INSUEZIN 0 pe WwW og Ww 09 WwW 002 Bayzi 7002 6 1 0 yeunsumkwoldeujs u 001 esoyn 9 le ye uedeymoj uod oee g0 9 6 LQ umolued AZueg eN 02 pe d 62 6 Gzo e 6 L97 L 200z Bseqsso4 epulq 6 1 9 uloAwojdesjsoupAulg Iu 001 9soyn g pun uewezznpiyeys gzE 89 6 90 0 unolued kzusg 0Z pe Q By Bgzo e 6002 eo JOIUNF EISIEA c002 Je Je uo alsloN Bw ool qLooz uo als on yeyinsusAwo densoipAyIg pun epeno senb LgE z8 9 Bw QOL umpolued Azueg 02 u 001 Baz 62 6 szo e jwyBw yeyinsurdAw0 de 3S ju 001 786 Ie Je soulnoJd ZOFLOE Z0 0 SG 9 IW AI OOS 1U8d 02 pe Bzeio Boe B pyc 6 1 o yeyINSUIDAWO da S 0102 6002 NI 000001 800Z Ie 10 PLYN ulpolued AZueg eN Iu oZ lu 08 68 0 By Byz 900z Bueqsio4 epulq 6 1 9 ulsAwojde 3s Jw 22 pun uossueulsH S98 ZL 9 6 90 0 umpolued Azueg W OZ ue pe TA 62 6 szo e eyg6L u suegsuyo 0 8 abejpung jw Bw uloXAwojdesjsoupAuiq 0264 eo w NI 0001 ued uoz wes uzizy Bo Bei Byz y owsoW Jsop yespAyouow yespAyouow us ENO yelEIIWSO YoM Hd EYNNOIQIJUY q JO1B0A F enby 9SO01 X9q 9SOYYNIZ SSONNIH JEIIZWNWIEN BINESUSUOJNZ SINL eWJadsepunH UOA BunJaiAsesuoyBissnj4 sip 1n JBuunp4sA qje g se
116. 8 5 0 0 168 2 TE 30 0 126 8 18 7 85 8 167 8 1 131 2 12 6 97 9 152 7 2 128 8 15 2 87 8 159 2 3 126 5 14 4 77 5 156 5 5 127 1 14 5 87 4 155 6 7 123 0 23 4 32 1 176 2 10 117 9 26 8 31 5 177 0 Up1 2 12 0 109 1 13 8 90 3 131 4 1 106 8 10 8 89 9 122 5 2 100 5 13 2 79 8 120 0 3 92 6 15 1 68 6 114 2 5 90 0 23 9 28 2 116 1 7 69 6 27 4 0 0 94 3 10 50 9 14 5 28 9 80 5 Up1 18 0 123 1 15 7 79 4 144 9 1 126 2 14 2 91 0 154 4 2 120 7 20 6 61 8 147 2 3 119 6 20 2 86 9 168 5 5 118 9 25 5 92 7 182 5 7 104 2 23 6 79 8 162 4 10 77 9 17 3 35 5 102 8 VSL um s CP 301 0 76 2 15 7 39 2 101 7 1 74 1 13 8 43 2 96 0 2 73 7 13 8 44 1 97 1 3 71 8 12 7 45 6 94 5 5 71 8 10 7 47 1 88 0 7 69 1 10 6 48 4 86 3 10 61 8 16 0 0 0 84 9 TE 30 0 71 8 14 8 40 3 105 5 275 Anhang 1 71 3 14 2 41 0 95 4 2 70 0 12 8 43 6 92 7 3 68 5 11 7 45 4 91 9 5 68 9 10 1 45 2 87 9 7 64 9 12 4 22 8 80 6 10 59 8 12 2 27 9 77 4 Up1 2 12 0 60 7 13 1 40 9 82 5 1 57 2 10 7 38 7 73 9 2 55 1 9 7 38 1 71 4 3 48 0 11 7 30 2 63 8 5 46 7 10 2 21 1 56 0 7 35 2 12 4 0 0 43 8 10 28 5 3 7 21 2 34 2 Up 1 18 0 66 3 9 4 45 8 79 7 1 65 4 15 9 40 6 118 6 2 61 1 16 4 29 4 109 4 3 65 8 24 4 26 4 123 2 5 65 7 23 1 38 1 116 7 7 56 4 19 4 37 1 98 5 10 36 5 8 5 26 2 55 9 ALH um CP 30 0 5 2 0 8 3 6 6 8 1 5 5 0 8 3 5 7 1 2 5 4 0 8 3 5 7 0 3 5 4 0 7 3 5 7 1 5 5 3 0
117. 9 0 40 53801 556 22331 Hamburg Deutschland E Mail eppendorf eppendorf de Webseite www eppendorf de FertilPro N V Tel 32 50 791805 Industriepark Noord 32 Fax 32 50 791799 8730 Beernem Belgien E Mail info fertipro com Webseite www fertipro com Glaswarenfabrik Karl Hecht GmbH amp Co KG Tel 49 0 9779 808 0 Stettener Str 22 24 Fax 49 0 9779 808 88 97647 Sondheim Deutschland E Mail info hecht assistent de Webseite www hecht assistent de Heidolph Instruments GmbH amp Co KG Tel 49 0 9122 9920 0 Walpersdorfer Str 12 Fax 49 0 9122 9920 65 91126 Schwabach Deutschland E Mail sales heidolph de Webseite www heidolph instruments de Heraeus Holding GmbH Tel 49 0 6181 35 0 Heraeusstr 12 14 Fax 49 0 6181 35 35 50 Postfach 1561 E Mail pr heraeus com 63450 Hanau Deutschland Webseite www heraeus de Heinz Herenz Medizinalbedarf GmbH Tel 49 0 40 739204 0 Rudorffweg 10 Fax 49 0 40 7304148 21031 Hamburg Deutschland E Mail hhh herenz de Webseite www herenz de 257 Anhang Helmut Hund GmbH Wilhelm Will Str 7 35580 Wetzlar Deutschland Interessengemeinschaft der Laborfachhandler GmbH amp Co KG Robert Bosch Str 3 61130 Nidderau Deutschland Inter ovo GmbH Am Schloss 3 71686 Remseck Deutschland Invitrogen Molecular Probes 29851 Willow Creek Road Eugene OR 97402 USA Leica Microsystems GmbH Ernst Leitz Str 17 37 35578 Wetzlar D
118. 90 Um Temperaturen unter 0 C zu umgehen sollte das das Sperma enthaltende Gef vor direktem Kontakt mit Eiswurfeln oder K hlakkus gesch tzt werden was beispielsweise durch Einwickeln in ein St ck Stoff erreicht werden kann bevor es in das Versandbeh ltnis verbracht wird Linde Forsberg 2001 Als Versandbeh ltnis k nnen eine Thermosflasche vorzugsweise mit weiter ffnung Linde Forsberg 1991 eine Styroporbox mit einem K hlakku Linde Forsberg 2001 oder der Equitainer Lopes et al 2009a zum Einsatz kommen Lopes et al 2009a verglichen drei verschiedene Transportcontainer zum Versand von fl ssigkonserviertem Hundesperma eine Styroporbox Minit b eine mit crushed Eis gef llte Thermosflasche und den Equitainer Minit b W hrend 38 Literatur nach 24 Stunden Lagerung alle drei Beh ltnisse hnliche Ergebnisse bez glich der Erhaltung der Spermaqualitat lieferten war nach 72 Stunden die Spermaqualitat der Proben die im Equitainer gelagert wurden deutlich besser Eine tierarztliche Bescheinigung die alle n tigen Informationen ber den Zuchtr den einschlie lich Gesundheitsstatus Qualit t und Charakteristika des Spermas enth lt sollte dem Sperma beim Versand beigef gt werden Pena et al 2006 Vor der Verwendung zur KB sollte das fl ssigkonservierte Sperma langsam auf Raumtemperatur angew rmt werden Linde Forsberg 1995 2 4 1 3 berlebensdauer Wie bereits zu Beginn dieses Kapitels
119. 97 406 Amann R P Katz D F 2004 Reflections on CASA after 25 years J Androl 25 3 317 325 Andersen K 1975 Insemination with frozen dog semen based on a new insemination technique Zuchthygiene 10 1 1 4 Andersen K 1980 Artificial insemination and storage of canine semen in Morrow D A Hrsg Current therapy in theriogenology Diagnosis treatment and prevention of reproductive diseases in animals Verlag Saunders Philadelphia London 661 665 Aurich C Spergser J 2007 Influence of bacteria and gentamicin on cooled stored stallion spermatozoa Theriogenology 67 5 912 918 Abstract Bartlett D J 1962a Studies on dog semen Morphological characteristics J Reprod Fertil 3 2 173 189 227 Literaturverzeichnis Bartlett D J 1962b Studies on dog semen Il Biochemical characteristics J Reprod Fertil 3 2 190 205 Beccaglia M Anastasi P Chigioni S Luvoni G C 2009a TRIS lecithin extender supplemented with antioxidant catalase for chilling of canine semen Reprod Dom Anim 44 Suppl 2 345 349 Beccaglia M Anastasi P Luvoni G C 2009b Freezing of canine semen in an animal free protein extender Vet Res Commun 33 Suppl 1 77 80 Beletti M E da Fontoura Costa L Viana M P 2005 A spectral framework for sperm shape characterization Comput Biol Med 35 6 463 473 Bencharif D Amirat Briand L Garand A Anton M Schmitt E
120. 999 Thomassen et al 2001 2006 Pretzer et al 2006 11 Literatur 2 2 Gewinnung des Ejakulates 2 2 1 Indikationen f r die Spermagewinnung Die Spermagewinnung beim Hund kann aus verschiedenen Indikationen erfolgen 1 zur Verwendung f r die KB oder zur Herstellung von konserviertem Sperma 2 im Rahmen von Zuchttauglichkeitsuntersuchungen oder 3 als Untersuchungs grundlage f r diagnostische Zwecke aufgrund von andrologischen Erkrankungen Johnston 1991 Kutzler 2005 Die Spermagewinnung im Rahmen einer andrologischen Untersuchung dient dabei sowohl zur Beurteilung der Potentia coeundi Begattungsf higkeit als auch der Gewinnung eines vollst ndigen Ejakulates das als Beurteilungsgrundlage f r die Potentia generandi Befruchtungsf higkeit genutzt wird G nzel 1986 2 2 2 Voraussetzungen und Methoden Die Spermagewinnung sollte in ungest rter Umgebung ggf ohne wei en Kittel mit einer minimalen Anzahl an Personen und unter ruhiger Handhabung der Tiere weitgehend ohne Zwangsma nahmen stattfinden Macpherson und Penner 1967 Seager und Platz 1977b Christiansen 1984b G nzel 1986 Linde Forsberg 1991 Kutzler 2005 Die Anwesenheit einer l ufigen H ndin w hrend der Spermagewinnung ist nicht erforderlich verbessert aber die Erfolgschancen Seager und Platz 1977b G nzel 1986 vor allem bei nerv sen oder unerfahrenen R den Kutzler 2005 und f hrt zu einer Verbesserung der Qualit t
121. A gemessenen Viabilit t r 0 743 p lt 0 001 wobei der Anteil lebender Samenzellen durchschnittlich 12 5 10 8 h her war als die CASA Viabilit t Bei getrennter Betrachtung der Nativejakulate und der mit den verschiedenen Verd nnern aufgearbeiteten Ejakulate konnten wie auch schon bei der Motilit t beobachtet in den verd nnten Ejakulaten engere Korrelationen nachgewiesen werden als in den Nativejakulaten siehe Kap 4 4 3 1 In der Literatur konnten bez glich der Viabilit t weitere bereinstimmungen zwischen konventionellen und modernen spermatologischen Analysemethoden gefunden werden Pena et al 1998b 2001 konnten beim Vergleich von durchflusszytometrischer Untersuchung CFDA PI gef rbter Proben mikroskopischer Beurteilung CFDA PI gef rbter Proben unter Epifluoreszenz beleuchtung und Untersuchung Eosin Nigrosin gef rbter Proben mittels Phasenkontrastmikroskop f r frisch verd nntes Sperma hohe Korrelationen zwischen allen drei Methoden nachweisen Auch Sch fer Somi und Aurich 2007 konnten in mit TRIS Puffer verd nnten Ejakulaten eine signifikante Korrelation der mittels SpermVision nach SYBR 14 Pl F rbung gemessenen Membranintegritat und der nach CFDA F rbung mittels fluoreszenzmikroskopischer Ausz hlung bestimmten Membranintegrit t nachweisen Beim Vergleich der SYBR 14 Pl Farbung Beurteilung unter dem Fluoreszenz mikroskop mit der Nigrosin Eosin F rbung sehen Rijsselaere et al 2002a die F rbung mit SYBR 14 P
122. A Vorw rtsbeweglichkeit unterschieden sich die mit Up 1 2 aufgearbeiteten Ejakulate am deutlichsten von den mit den anderen Verd nnern aufgearbeiteten Ejakulaten Im Durchschnitt lagen die Motilit tswerte der mit Up 1 2 aufgearbeiteten Ejakulate an nahezu jedem Untersuchungstermin merklich niedriger als die Werte der mit den anderen Verd nnern aufgearbeiteten Ejakulate Dieser Unterschied war bei fast allen genannten Parametern als signifikant zu beurteilen 122 Ergebnisse 4 3 1 1 Subjektiv gesch tzte Vorwartsbeweglichkeit Die durchschnittliche subjektiv geschatzte Vorwartsbeweglichkeit der mit den verschiedenen Verdunnern aufgearbeiteten Ejakulate bei Flussigkonservierung bei 4 C fur zehn Tage ist in Abb 13 und Tab 19 dargestellt An Tag 0 unmittelbar nach dem Verd nnen konnte bez glich der subjektiv gesch tzten Vorw rtsbeweglichkeit kein signifikanter Unterschied zwischen den mit den verschiedenen Verd nnern aufgearbeiteten Ejakulaten nachgewiesen werden siehe Kap 4 2 2 1 Erst im weiteren Zeitverlauf zeigten sich signifikante Unterschiede zwischen den einzelnen Verd nnern welche insbesondere gegen Ende des Untersuchungszeitraumes deutlich zu erkennen waren Insgesamt wurde die subjektiv gesch tzte Vorw rtsbeweglichkeit in den mit CP verd nnten Ejakulaten ber den Untersuchungszeitraum hinweg am besten konserviert In den mit Up1 2 verd nnten Ejakulaten war ab Tag 2 ein drastischer Motilitatsabfall zu beobachten d
123. Abfall der CASA Vorwartsbeweglichkeit erkennbar als in den mit CP und TE verd nnten Ejakulaten sodass in den mit Up 1 verd nnten Proben an Tag 10 nur noch eine durchschnittliche CASA Vorw rtsbeweglichkeit von 12 3 10 1 vorhanden war w hrend in den mit CP und TE verd nnten Proben nach zehn Tagen Fl ssigkonservierung noch Werte von gt 40 CP 48 2 23 3 TE 42 7 23 5 beobachtet werden konnten CP n 30 TE n 30 Up 1 2 n 12 Up 1 n 18 x Fa 2 D o Q N c 10 e a lt N lt O Abb 15 Ver nderungen der Mittelwerte SD des Prozentsatzes an vorw rtsbeweglichen Samenzellen mittels Computer assisted sperm analysis CASA SpermVision System gemessene Vorw rts beweglichkeit in den verschiedenen Verdunnern im Zeitverlauf der Flussigkonservierung bei 4 C ber zehn Tage CP Verd nner CaniPRO Chill 10 TE TRIS Fruktose Eigelb Verdunner Up 1 2 Uppsala Equex 2 System Verd nner 1 und Verd nner 2 Up 1 Uppsala Equex 2 System nur Verd nner 1 n Probenanzahl Im Zeitverlauf der Fl ssigkonservierung konnte in allen verd nnten Ejakulaten eine signifikante Reduktion der durchschnittlichen mittels CASA bestimmten Vorw rtsbeweglichkeit nachgewiesen werden jeweils mit Pze lt 0 0001 Die mit 128 Ergebnisse CP aufgearbeiteten Ejakulate zeigten uber den Untersuchungszeitraum bez glich der CASA Vorwartsbeweglichkeit einen signifikanten Niveauun
124. Beobachtungen anderer Autoren deckt In der vorliegenden Arbeit kam es insbesondere zwischen Tag 7 und Tag 10 zu einem Anstieg der akrosomalen Veranderungen CP TE Up 1 Daher ist davon auszugehen dass auf Basis der akrosomalen Integritat in flussigkonservierten Ejakulaten eine gute Spermaqualitat fur mindestens sieben Tage aufrechterhalten werden kann Jedoch waren auch die durchschnittlichen Werte nach zehn Tagen in allen getesteten Verd nnern als gut zu bewerten W hrend in den Verd nnern CP TE und Up 1 im Mittel 7 6 8 5 und 8 2 der Samenzellen akrosomale Ver nderungen aufwiesen war dies im Verdunner Up 1 2 nur bei 4 0 der Samenzellen der Fall Aufgrund der vorliegenden Ergebnisse kann zum einen best tigt werden dass die Zentrifugation keine ung nstigen Auswirkungen auf den Anteil an akrosomintakten Samenzellen hat G nzel 1986 und zum anderen dass durch Prostatasekret die akrosomale Integrit t von fl ssigkonservierten Samenzellen auch ber eine Lagerungsdauer von zehn Tagen nicht nachteilig beeinflusst wird Sirivaidyapong et al 2001 Letzteres widerlegt die f r Tag 0 aufgestellte Hypothese siehe Kap 5 3 2 5 und widerspricht den Aussagen von Rijsselaere et al 2002a und Rota et al 1995 dass Prostatasekret Seminalplasma f r die Fl ssigkonservierung von Hundesperma bei 4 C ungeeignet ist 5 3 4 Korrelationen der untersuchten Parameter 5 3 4 1 Dichten Nach G nzel Apel et al 1993 sind die mittels kon
125. CASA Gesamtmotilitat lt 0 0001 lt 0 0001 lt 0 0001 CASA Vorw rtsbeweglichkeit lt 0 0001 lt 0 0001 lt 0 0001 DAP lt 0 0001 lt 0 0001 lt 0 0001 DCL lt 0 0001 lt 0 0001 lt 0 0001 DSL lt 0 0001 lt 0 0001 lt 0 0001 VAP lt 0 0001 lt 0 0001 lt 0 0001 VCL lt 0 0001 lt 0 0001 lt 0 0001 VSL lt 0 0001 lt 0 0001 lt 0 0001 ALH 0 0001 0 0003 0 70 BCF 0 042 0 0024 0 012 STR 0 95 0 69 0 092 LIN 0 70 0 51 0 17 WOB 0 84 0 36 0 38 Lebende Eosinausstrich 0 38 lt 0 0001 0 045 CASA Viabilit t 0 0001 lt 0 0001 0 063 Pathomorphologie gesamt 0 096 0 13 0 24 Kopfver nderungen 0 24 0 94 0 40 Halsver nderungen 0 50 0 78 0 76 Schwanzver nderungen 0 0028 0 30 0 028 aufgerollte Schw nze 0 098 0 13 0 32 Knickschw nze 0 18 0 25 0 42 schleifenf rmige Schw nze 0 0022 lt 0 0001 0 26 lose K pfe 0 13 0 41 0 83 Plasmatropfen 0 37 0 44 0 16 Kopfkappenver nderungen gesamt 0 16 0 057 0 56 abgel ste Kopfkappen 0 84 0 62 0 21 schiefe Kopfkappen 0 97 0 14 0 50 sonstige Ver nderungen 0 64 0 73 0 37 282 Anhang Tab A14 Resultate der zweifaktoriellen Varianzanalysen mit Messwiederholungen bez glich der Faktoren Verd nner und Zeit zum Vergleich der Verd nner TE und Up 1 im Zeitverlauf Tag 0 10 der Fl ssigkonservierung bei 4 C fur 10 Tage n 18 Parameter Hau
126. DSL um 30 4 6 3 17 4 44 9 VAP um s 87 8 15 4 51 2 119 5 VCL um s 126 8 18 7 85 8 167 8 267 Anhang VSL um s 71 8 14 8 40 3 105 5 ALH um 5 4 0 9 3 4 7 5 BCF Hz 23 1 2 4 19 7 29 7 STR VSL VAP 81 1 6 1 68 0 90 0 LIN VSL VCL 56 2 9 4 37 0 69 0 WOB VAP VCL 68 6 7 4 53 0 79 0 Up1 2 DAP um 31 5 5 4 23 8 40 3 n 12 DCL um 47 7 5 6 41 1 56 5 DSL um 26 5 5 8 17 4 37 2 VAP um s 72 2 12 6 52 7 89 5 VCL um s 109 1 13 8 90 3 131 4 VSL um s 60 7 13 1 40 9 82 5 ALH um 4 4 0 6 3 4 5 4 BCF Hz 24 9 3 1 21 2 31 2 STR VSL VAP 83 2 5 6 73 0 92 0 LIN VSL VCL 55 0 48 5 42 0 68 0 WOB VAP VCL 65 5 6 4 57 0 74 0 Up 1 DAP um 35 4 4 6 22 7 40 3 n 18 DCL um 52 2 6 7 33 5 60 9 DSL um 28 0 4 3 19 2 34 8 VAP um s 83 8 10 4 53 9 94 6 VCL um s 123 1 15 7 79 4 144 9 VSL um s 66 3 9 4 45 8 79 7 ALH um 5 920 6 3 8 6 7 BCF Hz 23 6 2 7 19 5 29 1 STR VSL VAP 78 8 4 9 71 0 86 0 LIN VSL VCL 53 8 6 4 43 0 65 0 WOB VAP VCL 67 7 4 1 60 0 75 0 Tab A6 Resultate der einfaktoriellen Varianzanalyse mit Messwiederholungen bez glich des Faktors Verd nner zum Vergleich der Verdunner CP 1 TE 2 und Up1 2 3 mit dem Nativsperma 0 unmittelbar nach dem Verd nnen Tag 0 n 12 bei signifikantem Resultat wurde anschlie end ein Student Newman Ke
127. Da jedoch alle anderen untersuchten Parameter der Norm entsprachen wurde das Ejakulat in der vorliegenden Studie verwendet Zudem handelte es sich hierbei um einen Fall der durchaus auch in der Praxis auftreten kann und wie zu Beginn dieses Abschnittes erw hnt sollte in der vorliegenden Arbeit die Situation im klinischen Alltag widergespiegelt werden 5 2 2 Spermagewinnung Die Methodik der Spermagewinnung durch manuelle Stimulation entspricht der blichen Verfahrensweise beim Hund G nzel 1986 Linde Forsberg 1991 Freshman 2002 Hoffmann 2003a Kutzler 2005 Bei R den kleiner Rassen kann die Spermagewinnung auf einem Tisch erfolgen Freshman 2002 bei gro en R den wird sie vorzugsweise auf dem Fu boden durchgef hrt Linde Forsberg 1991 Letzteres war aufgrund der ausschlie lichen Verwendung mittlerer und gro er Hunderassen bei der vorliegenden Untersuchung die bliche Vorgehensweise Die Anwesenheit einer l ufigen bzw einer mit synthetischem Pheromon pr parierten H ndin zur sexuellen Stimulation welche nach G nzel 1986 die Erfolgschancen verbessert und gleichzeitig zu einer Steigerung der Spermaqualitat f hrt Seager und Platz 1977b Pena et al 2006 war in der vorliegenden Studie mit einer Ausnahme Hund Nr 3 durch die klinikseigenen H ndinnen immer gew hrleistet Dies kann in der Praxis z T jedoch nicht immer sichergestellt werden Allerdings ist eine Spermagewinnung auch ohne die Anwesenheit einer H n
128. Desherces S Delhomme G Langlois M L Barri re P Destrumelle S Vera Munoz O Tainturier D 2010 Freezing canine sperm Comparison of semen extenders containing Equex and LDL Low Density Lipoproteins Anim Reprod Sci 119 3 4 305 313 Bergeron A Manjunath P 2006 New insights towards understanding the mechanisms of sperm protection by egg yolk and milk Mol Reprod Dev 73 10 1338 1344 Bergeron A Brindle Y Blondin P Manjunath P 2007 Milk caseins decrease the binding of the major bovine seminal plasma proteins to sperm and prevent lipid loss from the sperm membrane during sperm storage Biol Reprod 77 1 120 126 Bouchard G F Morris J K Sikes J D Youngquist R S 1990 Effect of storage temperature cooling rates and two different semen extenders on canine spermatozoal motility Theriogenology 34 1 147 157 Boucher J H Foote R H Kirk R W 1958 The evaluation of semen quality in the dog and the effects of frequency of ejaculation upon semen quality libido and depletion of sperm reserves Cornell Vet 48 67 86 228 Literaturverzeichnis Brittain D Concannon P W Flanders J A Flahive W J Lewis B L Meyers Wallen V Moise N S 1995 Use of surgical intrauterine insemination to manage infertility in a colony of research German Shepherd dogs Lab Anim Sci 45 4 404 407 Brochart M Coulomb J 1952 Recherches sur la di
129. Diaka J 1993 Subjecting canine semen to the hypo osmotic test Theriogenology 39 6 1279 1289 Kumi Diaka J Badtram G 1994 Effect of storage on sperm membrane integrity and other functional characteristics of canine spermatozoa In vitro bioassay for canine semen Theriogenology 41 7 1355 1366 236 Literaturverzeichnis Kuster C 2005 Sperm concentration determination betweeen hemacytometric and CASA systems Why they can be different Theriogenology 64 3 614 617 Kutzler M A 2005 Semen collection in the dog Theriogenology 64 3 747 754 Lechniak D Kedzierski A Stanislawski D 2002 The use of HOS test to evaluate membrane functionality of boar sperm capacitated in vitro Reprod Dom Anim 37 6 379 380 Linde Forsberg C 1991 Achieving canine pregnancy by using frozen or chilled extended semen Vet Clin North Am Small Anim Pract 21 3 467 485 Linde Forsberg C 1995 Artificial insemination with fresh chilled extended and frozen thawed semen in the dog Seminars Vet Med Surg Small Anim 10 1 48 58 Linde Forsberg C 2001 Regulations and recommendations for international shipment of chilled and frozen canine semen in Concannon P W England G Verstegen J Linde Forsberg C Hrsg Recent Advances in Small Animal Reproduction Internet URL http www ivis org International Veterinary Information Service Ithaca New York USA Linde Forsberg C
130. EVALUIERUNG VERSCHIEDENER VERDUNNER ZUR FLUSSIGKONSERVIERUNG VON CANINEM SPERMA DANIELA KLAUS INAUGURAL DISSERTATION zur Erlangung des Grades eines Dr med vet beim Fachbereich Veterin rmedizin der Justus Liebig Universit t Gie en ri VVB LAUFERSWEILERVERLAG Das Werk ist in allen seinen Teilen urheberrechtlich gesch tzt Jede Verwertung ist ohne schriftliche Zustimmung des Autors oder des Verlages unzul ssig Das gilt insbesondere f r Vervielf ltigungen bersetzungen Mikroverfilmungen und die Einspeicherung in und Verarbeitung durch elektronische Systeme 1 Auflage 2012 All rights reserved No part of this publication may be reproduced stored in a retrieval system or transmitted in any form or by any means electronic mechanical photocopying recording or otherwise without the prior written permission of the Author or the Publishers 1 Edition 2012 2012 by VVB LAUFERSWEILER VERLAG Giessen Printed in Germany T he VVB LAUFERSWEILER VERLA STAUFENBERGRING 15 D 35396 GIESSEN Tel 0641 5599888 Fax 0641 5599890 email redaktion doktorverlag de www doktorverlag de Aus dem Klinikum Veterinarmedizin Klinik fur Geburtshilfe Gynakologie und Andrologie der Gro und Kleintiere mit Tierarztlicher Ambulanz der Justus Liebig Universit t Gie en Betreuer Prof Dr A Wehrend EVALUIERUNG VERSCHIEDENER VERD NNER ZUR FL SSIGKONSERVIERUNG VON CANINEM SPERMA INAUGURAL DISSERTATIO
131. Ejakulate betroffen sein m ssten Daher k nnen die Aussagen von G nzel 1986 und Rijsselaere et al 2002a dass die Zentrifugation weder auf die Gesamtmotilitat noch auf die Vorwartsbeweglichkeit einen nachteiligen Einfluss besitzt best tigt werden Auch Koderle et al 2009 konnten bei mit Up 1 2 verd nnten Ejakulaten keine signifikanten Unterschiede bez glich der Motilit t zwischen zentrifugierten und nicht zentrifugierten Proben finden was ebenso gegen einen unmittelbaren Effekt durch die Zentrifugation spricht Bei Sch fer Somi et al 2006 kam es durch die Zentrifugation zwar zu keiner Beeinflussung der gesch tzten Motilitat jedoch war der ohnehin beobachtete signifikante Abfall der CASA Vorw rtsbeweglichkeit nach Verd nnung noch st rker ausgepr gt wenn die Ejakulate vor der Verd nnung zentrifugiert worden waren was in den vorliegenden Untersuchungen zumindest an Tag 0 jedoch nicht nachgewiesen werden konnte Nach Rota et al 1995 ist Seminalplasma f r die Konservierung von caninem Sperma bei 4 C ungeeignet Durch die vorliegenden Ergebnisse lie sich jedoch kein unmittelbarer nachteiliger Effekt von Seminalplasma auf die Motilit t von fl ssigkonservierten Samenzellen nachweisen da die fl ssigkonservierten Ejakulate welche nicht zentrifugiert wurden CP TE teils sogar bessere Motilit tswerte zeigten als die zuvor zentrifugierten Ejakulate Dies ist bereinstimmend mit Sirivaidyapong et al 2001 nach denen P
132. Fl ssigkonservierung bei 4 C f r zehn Tage bewirkte in der vorliegenden Untersuchung in allen verd nnten Ejakulaten eine signifikante Abnahme der Motilit t eine signifikante Verlangsamung der Spermiengeschwindigkeit und eine signifikante Verminderung der Viabilit t w hrend f r die Pathomorphologie und den Anteil an Samenzellen mit akrosomalen Ver nderungen in fast allen verd nnten Ejakulaten signifikante Zunahmen nachgewiesen wurden Demgegen ber ver nderten sich die Gradlinigkeit der Spermienbewegung STR sowie die Anteile an Kopf und Halsver nderungen der Samenzellen durch die Fl ssigkonservierung nicht signifikant Eine zus tzliche nachteilige Beeinflussung der Spermaqualitat in den fl ssigkonservierten Ejakulaten durch geringe Blutbeimengungen war bereinstimmend mit Rijsselaere et al 2004b nicht zu beobachten Insgesamt konnte in den fl ssigkonservierten Ejakulaten beurteilt anhand der Motilit t je nach Verd nner eine akzeptable Spermaqualit t ber mindestens ein bis zwei Up 1 2 bzw f nf Up 1 bzw zehn Tage CP TE aufrechterhalten werden Hingegen lie sich hinsichtlich der Viabilit t der Pathomorphologie und des Anteils an Samenzellen mit akrosomalen Ver nderungen in fast allen verd nnten Ejakulaten CP TE Up 1 bis Tag 10 eine akzeptable Spermaqualit t konservieren Dieser Zeitraum erscheint ein gutes Besamungsmanagement vorausgesetzt ausreichend f r den nationalen sowie f r den internationalen Ver
133. Gefrierfach bei 21 C gelagert Allerdings wurde auch hier abweichend vom Rezept auf den Zusatz antibiotischer Wirkstoffe verzichtet Vor Gebrauch wurde die entsprechende Menge Verd nner aufgetaut und auf der Heizplatte auf 37 C angew rmt Verd nner 1 bzw im K hlschrank auf eine Temperatur von 4 C Verd nner 2 gebracht 90 Material und Methoden c Der Verd nner CaniPRO Chill 10 Minit b GmbH Tiefenbach CP wurde gem der mitgelieferten Anleitung mit der entsprechenden Menge an Eigelb versetzt und anschlie end portioniert in 5 ml Spritzen B Braun Melsungen AG Melsungen verschlossen mit Parafilm Pechiney Plastic Packaging Menasha USA im Gefrierfach bei 21 C gelagert Vor Gebrauch wurde die entsprechende Menge Verd nner aufgetaut und auf der Heizplatte auf 37 C angew rmt Die Zusammensetzung des Verd nners wie sie in der Anleitung aufgef hrt ist ist dem Anhang Kap 9 5 2 zu entnehmen 3 4 2 Aliquotierung und Verd nnung des Spermas Eine graphische bersicht der Vorgehensweise bei der Aliquotierung und Verd nnung des Spermas ist in der Schemazeichnung Abb 5 dargestellt Spermagewinnung Spermabeurteilung l Aufteilung in drei Aliquote Aliquot 1 Aliquot 2 Aliquot 3 Verd nnung mit Verd nnung mit Verd nnung mit CaniPRO TRIS Fruktose Uppsala Equex 2 Chill 10 Eigelb Verd nner System Verd nner 1 und 2 Versuchsteil I Verd nnung mit Uppsala Equex 2 System nur Verd nn
134. Gesamtmotilitat Vorw rtsbeweglichkeit und Viabilit t immer geringere Messwerte als bei den genannten Autoren Auch verglichen mit den Ergebnissen weiterer Autoren G nzel Apel et al 1993 Rijsselaere et al 2003 Verstegen et al 2005 Nizanski 2006 Shahiduzzaman und Linde Forsberg 2007 Pinto und Kozink 2008 waren die in der vorliegenden Studie ermittelten Messwerte f r die Gesamtmotilitat deutlich niedriger unabh ngig davon welches CASA System 177 Diskussion HTR Ceros 12 1 HTR IVOS 10 und 12 bzw 12 21 Str mberg Mika Cell Motion Analyzer von den genannten Autoren genutzt wurde Hingegen entsprach die in der vorliegenden Arbeit mittels CASA nach SYBR 14 Pl Farbung bestimmte Viabilitat in den Nativejakulaten ann hernd den bei Rijsselaere et al 2002a und Nizanski 2006 gefundenen Werten f r canines Nativsperma welche allerdings nach Verd nnung durch manuelles Ausz hlen der mit SYBR 14 PI gef rbten Proben unter dem Fluoreszenzmikroskop Rijsselaere et al 2002a bzw flowzytometrisch Nizanski 2006 ermittelt wurden Weiterhin konnten bei Iguer Ouada und Verstegen 2001a welche mit dem HTR IVOS 10 arbeiteten hnliche Werte f r die Vorw rtsbeweglichkeit und weitere Motilit tsparameter bei Rigau et al 2001 welche den Sperm Class Analyzer einsetzten ein nahezu identischer Wert fur die Gesamtmotilitat und bei Ellington et al 1993 welche den Hamilton Thorne Motility Analyzer nutzten hnliche Werte f
135. Hermansson und Linde Forsberg 2006 F r die Fl ssigkonservierung ber zwei Tage scheint nach diesen Ergebnissen also der TRIS Eigelb Fruktose Verd nner nur EYT 1 etwas besser geeignet zu sein als der Uppsala Equex 2 Verd nner nur UE 2 1 In einer weiteren Studie untersuchten Hermansson et al 2006 die Auswirkungen der Lagerung von mit Uppsala Equex 2 Verd nner nur UE 2 1 konserviertem Sperma auf die ZP Bindungsf higkeit nach ein und zwei Tagen Lagerungsdauer bei 4 C Die Ergebnisse f r die Parameter Motilit t subjektive Sch tzung und Messung mit CASA akrosomale Integrit t FITC PNA PI F rbung und 70 Literatur Plasmamembranintegrit t CFDA PI F rbung sind in der folgenden Tabelle Tab 4 dargestellt Tab 4 Motilitat akrosomale Integrit t und Plasmamembranintegritat im Nativsperma und in mit UE 2 1 Teilverd nner 1 des Uppsala Equex 2 Verdunners fur ein oder zwei Tage bei 4 C flussigkonserviertem Sperma Hermansson et al 2006 Spermabehandlung Motilitat intakte intakte Akrosome Plasmamembranen Nativsperma 91 54 2 6 93 7 3 8 84 2 3 0 1 Tag fl ssigkonserviert 84 8 8 7 94 0 2 0 72 6 11 2 2 Tage fl ssigkonserviert 78 5 5 8 92 8 1 0 72 2 11 2 Hieraus ist ersichtlich dass bei Fl ssigkonservierung mit dem Uppsala Equex 2 Verd nner nur UE 2 1 ber zwei Tage zufriedenstellende Ergebnisse erzielt werden k nnen Shahiduzzaman u
136. I als die sensitivere Methode an da durch diese Fluoreszenztechnik selbst kleinste durch die Zentrifugation verursachte Membransch den erkannt werden k nnen indem drei Zellpopulationen lebende tote und moribunde Samenzellen identifiziert werden Letztere lassen sich durch die konventionelle Nigrosin Eosin F rbung nicht nachweisen Rijsselaere et al 2002a Nizanski und Klimowicz 2005 wiesen in nativem Sperma signifikante Korrelationskoeffizienten zwischen dem durchflusszytometrisch bestimmten Prozentsatz an gr n und rot fluoreszierenden Spermien nach SYBR 14 PI 214 Diskussion Farbung und dem mikroskopisch ermittelten Prozentsatz an lebenden oder toten Spermien in Nigrosin Eosin Ausstrichen nach In flussigkonserviertem Sperma waren die Korrelationskoeffizienten niedriger W hrend der Fl ssigkonservierung bei 5 C f r zehn Tage war der Prozentsatz an gr n fluoreszierenden Spermien nach SYBR 14 PI F rbung stets niedriger als der Prozentsatz an lebenden Spermien in den Nigrosin Eosin Ausstrichen Nizanski und Klimowicz 2005 Letzteres war in hnlicher Weise auch in den vorliegenden Untersuchungen zu beobachten M glicherweise kann auch hierf r der von Rijsselaere et al 2002a beschriebene Erkl rungsansatz herangezogen werden siehe oben 5 3 4 4 Spermaparameter Die Berechnung verschiedener Korrelationen sollte zur Aufkl rung m glicher Zusammenh nge zwischen einzelnen Parametern beitragen Sowohl f r die subj
137. IN und WOB lie en im Zeitverlauf in den mit CP TE und Up 1 aufgearbeiteten Ejakulaten signifikante Abnahmen erkennen Lediglich f r den Parameter STR waren ber den Untersuchungszeitraum keine signifikanten Ver nderungen nachweisbar Eine Motilit tsabnahme war zu erwarten und wurde f r Lagerungszeitr ume von 2 bis 23 Tagen bereits von verschiedenen anderen Autoren gezeigt Foote und Leonard 1964 Province et al 1984 G nzel 1986 Bouchard et al 1990 Kumi Diaka 1993 Rota et al 1995 England und Ponzio 1996 Iguer Ouada und Verstegen 2001b Rijsselaere et al 2002a Tsutsui et al 2003b Ponglowhapan et al 2004 Nizanski und Klimowicz 2005 Verstegen et al 2005 Hermansson und Linde Forsberg 2006 Hermansson et al 2006 Shahiduzzaman und Linde Forsberg 2007 Beccaglia et al 2009a Nizanski et al 2009 Michael et al 2009 2010 Kmenta et al 2011 Die Verminderung der Motilitat ist ein wichtiger Effekt des Kalteschocks Weitze und Petrunkina 2007 Nach Ponglowhapan et al 2004 k nnte sie durch verschiedene Subpopulationen unter den Samenzellen mit unterschiedlich ausgepr gter Sensitivit t f r Umgebungsver nderungen insbesondere f r reduzierte Temperaturen verursacht werden Das Ausma der Motilitatsreduktion variiert allerdings zwischen den verschiedenen Literaturquellen W hrend einige Autoren nach drei Tagen Fl ssigkonservierung in TRIS Glukose Eigelb Verd nnern bereits Motilitats abnahmen auf etw
138. Insgesamt betrachtet war der Verd nner CP der am besten geeignete Verd nner f r die Fl ssigkonservierung von caninem Sperma bei 4 C ber eine Lagerungsdauer von zehn Tagen was insbesondere durch die gute Erhaltung der Motilit t zum Ausdruck kam Jedoch erwies sich auch der Verd nner TE f r die Fl ssigkonservierung von Hundesperma ber einen Zeitraum von zehn Tagen als brauchbar Eindeutige Vorteile des Verd nners CP gegen ber dem Verd nner TE sind seine schnelle Verf gbarkeit und die einfache Handhabung Die Fl ssigkonservierung mit dem Verd nner Up1 2 kann aufgrund der vorliegenden Ergebnisse nicht empfohlen werden da die Resultate f r die Motilit t und die Viabilit t absolut nicht zufriedenstellend waren Im Gegensatz dazu muss von der Verwendung von Verd nner Up1 zur Fl ssigkonservierung caniner Ejakulate nicht prinzipiell abgeraten werden da mit diesem Verd nner ber mindestens f nf Tage durchaus gute Ergebnisse erzielt werden konnten Eine Kryokonservierung entsprechend aufgearbeiteter Ejakulate nach Fl ssig konservierung f r ein oder zwei Tage ohne signifikanten Qualit tsverlust nach dem Auftauen verglichen mit der sofortigen Kryokonservierung ist m glich Hermansson und Linde Forsberg 2006 Da f r die Auswahl von geeigneten Verd nnern f r die Fl ssigkonservierung die objektive Beurteilung der Spermaqualit tsparameter von entscheidender Bedeutung ist kam in der vorliegenden Arbeit zus tzlich zu den sub
139. Laboren erlauben und konstantere Ergebnisse liefern k nnte als sie mit selbst hergestellten Verd nnern erreicht werden k nnen Silva und Verstegen 1995 Die Herstellung der Verd nner im eigenen Labor ist zeitaufw ndig Pinto et al 1999 und ggf fehleranf llig da es durch die Rezeptangabe in Gramm zu Fehlern beim finalen pH Wert und oder der Osmolarit t kommen kann Pena et al 2006 Durch Angabe der millimolaren Mengen im Rezept k nnen solche Arten von Fehlern vermieden werden Pena et al 2006 62 Literatur Hinsichtlich der Konzeptionsraten die bei Verwendung der verschiedenen Verdunner erzielt werden konnen lassen sich in der Literatur nur wenige Angaben finden Die nachfolgende Tabelle Tab 3 gibt die Trachtigkeitsergebnisse fur verschiedene Verd nner wieder Linde Forsberg 1995 Hieraus ist ersichtlich dass die besten Trachtigkeitsraten mit TRIS basierten Verd nnern 62 5 und 57 1 und mit dem Sahne Eigelb Verd nner 51 1 erreicht werden konnten wenngleich die Anzahl an KBs deutlich variierte Linde Forsberg 1995 Tab 3 Tr chtigkeitsergebnisse f r verschiedene VerdUnner zur konservierung von Hundesperma von 1990 bis 1993 Linde Forsberg 1995 Fl ssig Verd nner Anzahl an KBs Tr chtigkeiten Anzahl Prozentsatz Sahne Eigelb 137 70 51 1 unbekannt 44 16 36 4 Sahne 26 12 46 2 kein Verd nner 17 5 29 4 TRIS Eigelb 16 10 62 5 TRIS 7 4 57 1 Milch 7
140. Messungen als gut zu beurteilen sodass hieraus vermutlich keine bersch tzung des Anteils an unbeweglichen Samenzellen resultierte Fraglich ist jedoch ob und wie das f r die Verd nnung der Nativejakulate verwendete Auftaumedium die gemessenen Motilit tswerte beeinflusst hat Im Vergleich zu physiologischer Kochsalzl sung welche keine Energiesubstrate enth lt Rijsselaere et al 2003 beinhaltete das Auftaumedium Fruktose als Energiesubstrat Andererseits wird Auftaumedium normalerweise kryokonserviertem Sperma nach dem Auftauen zugesetzt um dessen Motilitat zu steigern und es kann auch frischem oder 167 Diskussion flussigkonserviertem Sperma vor der Verwendung zur KB beigegeben werden um dort den gleichen Effekt zu erzielen Vor diesem Hintergrund ist der Einsatz von Auftaumedium zur Verd nnung der Ejakulate f r die CASA Messungen praxisorientiert und daher auch in der vorliegenden Arbeit zu vertreten 5 2 3 2 1 Konzentrationsbestimmung Nach Iguer Ouada und Verstegen 2001a kommt es durch CASA Systeme meist zu einer bersch tzung der Spermienkonzentration welche mit steigender Verd nnung zunimmt Im Gegensatz dazu konnten Rijsselaere et al 2003 eine Untersch tzung der Spermienkonzentration durch CASA beobachten welche mit steigenden Spermienkonzentrationen gr er wurde In der vorliegenden Arbeit wurde die Konzentration der Ejakulate durch das SpermVision System w hrend der Motilitatsanalyse bestimmt Tende
141. N zur Erlangung des Grades eines Dr med vet beim Fachbereich Veterin rmedizin der Justus Liebig Universit t Gie en eingereicht von Daniela Klaus Tier rztin aus Weinheim Gie en 2012 Mit Genehmigung des Fachbereichs Veterinarmedizin der Justus Liebig Universit t Gie en Dekan Prof Dr Dr h c Martin Kramer Gutachter Prof Dr A Wehrend Prof Dr M Bergmann Tag der Disputation 06 07 2012 Meinen Eltern Teilergebnisse der vorliegenden Arbeit wurden bereits in Form von zwei Abstracts auf der 44 Jahrestagung Physiologie und Pathologie der Fortpflanzung gleichzeitig 36 Veterinar Humanmedizinische Gemeinschaftstagung vom 16 18 Februar 2011 in Hannover und dem 57 Jahreskongress der Deutschen Gesellschaft fur Kleintiermedizin DGK DVG vom 10 13 November 2011 in Berlin publiziert Klaus D Wehrend A Goericke Pesch S 2011 Comparison of two different extenders for chilling of canine semen Reprod Dom Anim 46 Suppl 1 23 Abstract Goericke Pesch S Klaus D Wehrend A 2011 Vergleich zweier verschiedener Verdunner zur Flussigkonservierung von caninem Sperma in Proceedings des 57 Jahreskongresses der Deutschen Gesellschaft fur Kleintiermedizin DGK DVG Berlin 2011 368 369 Abstract Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung und Fragestellung 4 44444ossnnsn nen eeeeeeaeeeeeeeeeeeeeeeeaaaes 1 2 2 Literatur sr ee ee anal
142. Office Exel 2007 Microsoft Corporation verwaltet Die statistische Auswertung der Daten erfolgte in Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe Biomathematik und Datenverarbeitung des Fachbereichs Veterin rmedizin der Justus Liebig Universit t Gie en Dabei wurden folgende Programme des Statistikprogrammpaketes BMDP Dynamic Release 8 1 1993 BMDP Statistical Software Inc verwendet BMDP1D einfache Datenbeschreibung BMDP1R Wahrscheinlichkeitsplots zur Prufung auf Normalverteilung BMDP2V ein bzw zweifaktorielle Varianzanalysen mit Messwiederholungen und BMDP6D Korrelationsanalysen Des Weiteren kam fur den Student Newman Keuls Test ein Eigenprogramm der Arbeitsgruppe Biomathematik und Datenverarbeitung des Fachbereichs Veterin rmedizin der Justus Liebig Universit t Gie en zum Einsatz Die graphischen Abbildungen der gewonnenen Daten wurden ebenfalls mit dem Programm Microsoft Office Exel 2007 Microsoft Corporation erstellt Bei qualitativen Merkmalen Farbe Geruch Konsistenz makroskopische Beimengungen Agglutinationen mikroskopische Beimengungen wurde die Merkmalsauspr gung als prozentualer Anteil bezogen auf alle Nativejakulate und als totale Anzahl n angegeben Bei quantitativen ann hernd normalverteilten Merkmalen Volumen pH Wert subjektiv gesch tzte Vorw rtsbeweglichkeit CASA Gesamtmotilitat CASA Vorw rtsbeweglichkeit DAP DCL DSL VAP VCL VSL ALH BCF STR LIN WOB erfolgte die einfache Datenbeschreibung
143. P verd nnten Ejakulaten f r alle drei Parameter ber den gesamten Untersuchungszeitraum stets geringgradig h here Mittelwerte beobachtet werden als in den mit TE verd nnten Ejakulaten Im Zeitverlauf der Fl ssigkonservierung waren in allen verd nnten Ejakulaten signifikante Abnahmen der Mittelwerte f r die Geschwindigkeitsparameter VAP VCL und VSL nachzuweisen pzeit 0 0012 bis lt 0 0001 Die mit CP verd nnten Ejakulate zeigen ber den Untersuchungszeitraum bez glich aller Geschwindigkeitsparameter signifikante Niveauunterschiede zu den mit TE Pverd 0 033 bis lt 0 0001 Up 1 2 jeweils mit Pvera lt 0 0001 und Up 1 jeweils mit Pverd lt 0 0001 verd nnten Ejakulaten W hrend sich dabei die Zeitverlaufe der mit CP und der mit TE verd nnten Ejakulate f r keinen der genannten Parameter signifikant unterschieden konnten zwischen den Zeitverl ufen der mit CP und der mit Up1 2 sowie zwischen den Zeitverl ufen der mit CP und der mit Up 1 verd nnten Ejakulate f r alle drei Parameter signifikante Unterschiede ermittelt werden pw 0 0019 bis lt 0 0001 In den mit TE verd nnten Ejakulaten lie en sich bez glich der Parameter VAP VCL und VSL signifikante Niveauunterschiede zu den mit Up1 2 jeweils mit Pvera lt 0 0001 sowie zu den mit Up1 Pvera 0 0002 bis lt 0 0001 verd nnten Ejakulaten nachweisen und auch die Zeitverl ufe zwischen den mit TE und den mit Up 1 2 sowie zwischen den mit TE und den mit Up 1 verd nnte
144. PI F rbung wird durch die nachfolgenden Punktwolke Abb 22 veranschaulicht 151 Ergebnisse Regressionsgerade y 0 56802x 0 59747 1 40 1 20 Transformation _ O O 0 80 Anteil lebender Samenzellen Eosinausstrich nach Arcus Sinus 0 0 0 20 0 40 0 60 0 80 1 00 1 20 1 40 CASA Viabilit t nach Arcus Sinus Transformation Abb 22 Korrelation zwischen dem im Eosinausstrich bestimmten Anteil lebender Spermien und der durch Computer assisted sperm analysis CASA SpermVision System ermittelten Viabilitat nach SYBR 14 PI F rbung in den Nativejakulaten und in allen verd nnten Ejakulaten zu allen Untersuchungszeitpunkten n zeitgleiche Variablenpaare 660 Die Korrelationsanalyse ergab einen Korrelationskoeffizienten von r 0 743 bei einer Signifikanz von p lt 0 001 Die Korrelation zwischen den mit den verschiedenen Methoden bestimmten Werten war somit als statistisch signifikant zu beurteilen Der mittels Eosinausstrich bestimmte Anteil lebender Samenzellen war im Mittel 12 5 10 8 h her als die durch CASA gemessene Viabilitat 4 4 4 Zusammenh nge zwischen verschiedenen Spermaparametern 4 4 4 1 Korrelationen nach Verd nnern getrennt Die Ergebnisse der Korrelationsanalysen zur Untersuchung der Zusammenh nge zwischen verschiedenen ausgew hlten Untersuchungsparametern sind in Tab 23 dargestellt 192 Ergebnisse Tab 23 Korrelationen zwischen verschiedenen Untersuchungsparametern
145. R den f r diesen Zweck bereits bew hrt hat Riesenbeck et al 2001 Ebenso erwies sich die Spermac F rbung f r die Erfassung von Ver nderungen am Akrosom welche w hrend des Verarbeitungsprozesses bei der Konservierung von caninem Sperma auftreten k nnen als vorteilhaft Oettle 1986 Bei dieser F rbung handelt es sich um ein kommerziell erh ltliches F rbeset zur selektiven Anf rbung der Bestandteile einer Samenzelle einschlie lich des Akrosoms Durch die selektive Anf rbung des Akrosoms konnten Ver nderungen an letzterem gezielt beurteilt werden was im Eosinausstrich nicht m glich gewesen w re Daher stellte die Spermac F rbung eine geeignete Erg nzung zur F rbung mit Eosin dar Nachteilig war allerdings dass die Beurteilung der mit Spermac gef rbten Ausstriche bei den fl ssigkonservierten Ejakulaten teilweise durch st rende berlagerungen mit gr n gef rbten Partikeln erschwert wurde Vermutlich handelte es sich hierbei um angef rbte Eigelbpartikel aus den verschiedenen Verd nnern obwohl nach Oettl 1986 der Verdunner die Farbaffinitat der Spermac F rbung nicht zu beeinflussen scheint Zudem war die Ausz hlung der mit Spermac gef rbten Ausstriche bei stark verd nnten Ejakulaten sehr zeitaufwendig Zus tzlich wurde der HOS Test durchgef hrt um die funktionale Integrit t der Spermienplasmamembran zu untersuchen Zwar untersucht auch die Supravitalf rbung Lebend Tot F rbung die Membranintegrit t j
146. S Fruktose Eigelb Verdunner Up1 2 Uppsala Equex 2 System Verdunner 1 und Verdunner 2 Up 1 Uppsala Equex 2 System nur Verdunner 1 n Probenanzahl In allen verd nnten Ejakulaten kam es im Zeitverlauf der Fl ssigkonservierung zu einer signifikanten Reduktion der durchschnittlichen subjektiv gesch tzten Vorw rtsbeweglichkeit jeweils mit Pzeit lt 0 0001 Die mit CP verd nnten Ejakulate zeigten ber den gesamten Untersuchungszeitraum signifikant h here Werte f r die subjektiv gesch tzte Vorw rtsbeweglichkeit als die mit TE Up 1 2 und Up 1 verd nnten Ejakulate jeweils mit Pvera lt 0 0001 und auch der Zeitverlauf der mit CP verd nnten Ejakulate unterschied sich signifikant von den Zeitverl ufen der mit TE Up1 2 und Up 1 verd nnten Ejakulate jeweils mit pw lt 0 0001 In den mit TE aufgearbeiteten Ejakulaten lie en sich bez glich der subjektiv gesch tzten Vorw rtsbeweglichkeit ber den Untersuchungszeitraum wiederum signifikant h here Werte feststellen als in den mit Up1 2 und Up1 aufgearbeiteten Ejakulaten jeweils mit Pvera lt 0 0001 und auch der Zeitverlauf der mit TE aufgearbeiteten Ejakulate unterschied sich signifikant von den Zeitverl ufen der mit Up 1 2 und Up 1 aufgearbeiteten Ejakulate jeweils mit pw lt 0 0001 Eine ausf hrliche Darstellung der Ergebnisse der zweifaktoriellen Varianzanalysen mit Messwiederholungen bez glich der Faktoren Verd nner und Zeit in denen jeweils zwei Verd
147. SA bestimmten und der gesch tzten Motilitat bedingen G nzel Apel et al 1993 Im Gegensatz zu den eigenen Ergebnissen lag die durch SpermVision ermittelte Gesamtmotilitat bei Sch fer Somi und Aurich 2007 immer ber der gesch tzten Motilit t bereinstimmend mit den eigenen Untersuchungen wiesen auch Gr pper 2004 und Rota et al 2001 niedrigere Motilitatswerte mittels CASA im Vergleich mit der subjektiven Beurteilung nach M glicherweise kommen Unterschiede der mit den verschiedenen Methoden bestimmten Motilitatswerte durch eine schlechte Unterscheidung zwischen Eigelbpartikeln aus den Verd nnern und unbeweglichen Samenzellen seitens des CASA Systems zustande wenn die Partikel eine hnliche Gr e besitzen wie die Spermienk pfe Verstegen et al 2002 So k nnte es zu einer Erh hung des gemessenen Anteils an unbeweglichen Samenzellen gekommen sein was letztlich in einer Untersch tzung der wahren Motilitat resultierte Allerdings wurde die Spermienerkennung w hrend der CASA Messungen in der vorliegenden Untersuchung stets verfolgt und es konnten kaum Fehlerkennungen beobachtet 213 Diskussion werden Eine vorherige Filtration der Verdunner zur Eliminierung der Eigelbpartikel kann diese Fehlerquelle ausschlie en G nzel Apel et al 1993 5 3 4 3 Viabilit t Die vorliegenden Ergebnisse zeigten eine signifikante Korrelation des mittels Eosinausstrich bestimmten Anteils an lebenden Samenzellen mit der mittels CAS
148. SL lt 0 0001 lt 0 0001 0 0013 VAP lt 0 0001 lt 0 0001 lt 0 0001 VCL lt 0 0001 lt 0 0001 lt 0 0001 VSL lt 0 0001 lt 0 0001 0 0019 ALH 0 17 lt 0 0001 lt 0 0001 BCF 0 41 0 0092 0 14 STR 0 0097 0 11 0 012 LIN 0 0015 lt 0 0001 0 054 WOB 0 0005 lt 0 0001 0 26 Lebende Eosinausstrich 0 019 lt 0 0001 0 23 CASA Viabilit t 0 019 lt 0 0001 0 042 Pathomorphologie gesamt 0 17 lt 0 0001 0 85 Kopfver nderungen 0 98 0 096 0 93 Halsver nderungen 0 13 0 054 0 98 Schwanzver nderungen 0 75 lt 0 0001 0 44 aufgerollte Schw nze 0 45 0 74 0 81 Knickschw nze 0 24 0 0010 0 85 schleifenf rmige Schw nze 0 82 lt 0 0001 0 52 lose K pfe 0 59 0 1005 0 31 Plasmatropfen 0 032 0 013 0 18 Kopfkappenver nderungen gesamt 0 021 lt 0 0001 0 92 abgel ste Kopfkappen 0 80 0 0018 0 038 schiefe Kopfkappen 0 043 lt 0 0001 0 30 sonstige Ver nderungen 0 0025 lt 0 0001 0 03 281 Anhang Tab A13 Resultate der zweifaktoriellen Varianzanalysen mit Messwiederholungen bez glich der Faktoren Verd nner und Zeit zum Vergleich der Verd nner TE und Up 1 2 im Zeitverlauf Tag 0 10 der Fl ssigkonservierung bei 4 C f r 10 Tage n 12 Parameter Haupteffekte Wechselwirkung p Wert p Wert Verdunner Zeit Verdunner x Zeit geschatzte Vorwartsbeweglichkeit lt 0 0001 lt 0 0001 lt 0 0001
149. Sperma wird bei dieser Methode mittels eines Katheters der proximal der Bifurkation in Richtung des Ovars eingef hrt wird in den Uterus eingebracht Silva et al 1995 Diese Technik ist im Vergleich zur laparotomischen intrauterinen Besamung weniger traumatisierend hat ein geringeres Infektionsrisiko da die Bauchh hle nicht vollst ndig ge ffnet wird und erm glicht eine schnellere Erholung der Patienten Silva et al 1995 Bei der laparotomischen intrauterinen Besamung wird das Sperma nach Inzision des Uterusk rpers ber einen Katheter in Richtung des Ovars im Uteruslumen deponiert Brittain et al 1995 Die Methoden der chirurgischen Besamung sind invasiv und verlangen eine Allgemeinan sthesie der H ndin weswegen sie h ufig kontrovers diskutiert werden In einigen L ndern vor allem in den USA Farstad 2000 Thomassen und Farstad 2009 werden sie jedoch trotzdem weitl ufig eingesetzt wohingegen sie in anderen L ndern wie z B Schweden und Niederlande verboten sind England und Millar 2008 Nachteilig bei diesen Methoden sind das damit verbundene Literatur Narkose und Operationsrisiko sowie die Tatsache dass nur eine einmalige Besamung realistisch und ethisch vertretbar ist Wilson 2001 2 1 3 Besamungsdosis Gill et al 1970 sehen bei Verwendung von nativem von frisch verdunntem und von verd nntem gelagertem Sperma zur intrauterinen Besamung eine Besamungsdosis von 200 Mio Spermien pro Inseminati
150. Untersuchungszeitraum in den mit Up 1 2 verd nnten Proben im Mittel geringer als in den mit CP verd nnten Proben und betrug an Tag 10 durchschnittlich 6 1 SF 2 76 Weiterhin konnte auch zwischen den mit TE und den mit Up1 2 verd nnten Ejakulaten ein signifikanter Niveauunterschied Pverd 0 0028 sowie ein signifikanter Unterschied der Zeitverl ufe pw 0 028 nachgewiesen werden wobei der Anteil an Schwanzver nderungen ber den Untersuchungszeitraum wieder in den mit Up 1 2 verd nnten Proben durchschnittlich geringer war als in den mit TE verd nnten Proben Zwischen den mit CP und Up 1 sowie zwischen 142 Ergebnisse den mit TE und Up 1 aufgearbeiteten Ejakulaten bestanden hinsichtlich des Anteils an Schwanzveranderungen keine signifikanten Unterschiede Innerhalb der Schwanzveranderungen konnten uber den Untersuchungszeitraum in allen verdunnten Ejakulaten signifikante Zunahmen des Anteils an schleifenf rmigen Schw nzen beobachtet werden pzeit 0 0003 bis lt 0 0001 w hrend die Anteile an aufgerollten Schw nzen und an Knickschw nzen nur teilweise signifikant zunahmen Bez glich des Anteils an schleifenf rmigen Schw nzen konnten zwischen den mit CP und TE Pverd 0 014 zwischen den mit CP und Up1 2 Pvera 0 0103 zwischen den mit TE und Up1 2 Pvera 0 0022 sowie zwischen den mit TE und Up 1 verd nnten Ejakulaten Pvera 0 045 signifikante Niveauunterschiede nachgewiesen werden die Zeitverl ufe unter
151. VCL VSL STR LIN WOB und im Vergleich mit den mit TE verd nnten Ejakulaten f r die subjektiv gesch tzte Vorw rtsbeweglichkeit die CASA Vorw rtsbeweglichkeit sowie die CASA Motilitatsparameter DAP DCL DSL VAP VCL VSL BCF und LIN auch statistisch signifikant belegt werden konnte Weiterhin zeigte sich jedoch auch in den mit TE verd nnten Ejakulaten eine gute Konservierung der Motilitat welche ebenfalls im Vergleich mit den mit Up1 2 200 Diskussion verdunnten Ejakulaten fur die subjektiv geschatzte Vorwartsbeweglichkeit die CASA Gesamtmotilitat die CASA Vorwartsbeweglichkeit sowie verschiedene CASA Motilitatsparameter DAP DCL DSL VAP VCL VSL ALH BCF und im Vergleich mit den mit Up1 verd nnten Ejakulaten fur die subjektiv gesch tzte Vorwartsbeweglichkeit die CASA Gesamtmotilitat die CASA Vorw rts beweglichkeit sowie verschiedene CASA Motilitatsparameter DAP DCL DSL VAP VCL VSL ALH STR LIN WOB signifikant besser war Ein Unterschied zwischen den Verd nnern CP und TE der m glicherweise fur die bessere Konservierung der Motilitat in den mit CP verd nnten Ejakulaten verantwortlich war k nnte die im Verd nner CP zus tzlich zur Fruktose enthaltene Glukose sein Allerdings wird nach Rigau et al 2001 in frischem Sperma durch die Zuckerkomponente lediglich das Bewegungsmuster der Samenzellen beeinflusst w hrend der Prozentsatz an motilen Spermien weder durch Fruktose noch durch Glukose ver nder
152. Verd nner mit einer Fruktosekonzentration von 70mM als am besten geeignet f r die Langzeitkonservierung von Fl ssigsperma ansehen wurden in der vorliegenden Arbeit Verd nner mit einer Fruktosekonzentration von etwa 70 mM Verd nner TE Uppsala Equex 2 System Verd nner gew hlt Ein wesentlicher Unterschied zwischen den drei getesteten Verd nnern bestand im Zusatz von Glycerol W hrend die Verd nner CP und TE kein Glycerol enthielten war im Uppsala Equex 2 System Verd nner Glycerol enthalten Dies lie sich dadurch erkl ren dass es sich bei diesem Verd nner eigentlich um einen Verd nner f r die Kryokonservierung von caninem Sperma handelt und daher der Zusatz eines Kryoprotektivums essentiell ist Glycerol ist das am h ufigsten verwendete Kryoprotektivum f r Hundesperma Concannon und Battista 1989 Martins Bessa et al 2006 Rota et al 2006 Futino et al 2010 Verd nner 1 des Uppsala Equex 2 System Verd nners enthielt 3 Glycerol und Verd nner 2 einen Anteil von 7 was eine Endkonzentration von 5 Glycerol im Uppsala Equex 2 System Verd nner ergab Diese Konzentration entspricht den in der Literatur 172 Diskussion verwendeten Endkonzentrationen in Verd nnern f r die Kryokonservierung von caninem Sperma Rota et al 1999a 2006 Allerdings wird Glycerol Ublicherweise nicht in Verd nnern fur die Fl ssigkonservierung von Hundesperma eingesetzt da es in niedrigen Konzentrationen 3 keinen vorteilhaften Eff
153. Viabilit t lt 0 0001 0 24 Pathomorphologie gesamt 0 015 lt 0 0001 0 26 Kopfver nderungen 0 68 0 92 0 4 Halsver nderungen 0 19 0 47 0 34 Schwanzver nderungen 0 012 lt 0 0001 0 43 aufgerollte Schw nze 0 33 0 0072 0 72 Knickschw nze 0 99 0 03 0 85 schleifenf rmige Schw nze 0 014 lt 0 0001 0 27 lose K pfe 0 75 0 23 0 67 Plasmatropfen 0 83 0 72 0 7 Kopfkappenver nderungen gesamt 0 66 0 0006 0 81 abgel ste Kopfkappen 0 14 0 001 0 0068 schiefe Kopfkappen 0 14 0 0013 0 11 sonstige Ver nderungen 0 031 lt 0 0001 0 91 279 Anhang Tab A11 Resultate der zweifaktoriellen Varianzanalysen mit Messwiederholungen bez glich der Faktoren Verd nner und Zeit zum Vergleich der Verd nner CP und Up 1 2 im Zeitverlauf Tag 0 10 der Fl ssigkonservierung bei 4 C f r 10 Tage n 12 Parameter Haupteffekte Wechselwirkung p Wert p Wert Verdunner Zeit Verdunner x Zeit geschatzte Vorwartsbeweglichkeit lt 0 0001 lt 0 0001 lt 0 0001 CASA Gesamtmotilitat lt 0 0001 lt 0 0001 lt 0 0001 CASA Vorw rtsbeweglichkeit lt 0 0001 lt 0 0001 lt 0 0001 DAP lt 0 0001 lt 0 0001 lt 0 0001 DCL lt 0 0001 lt 0 0001 lt 0 0001 DSL lt 0 0001 lt 0 0001 lt 0 0001 VAP lt 0 0001 lt 0 0001 lt 0 0001 VCL lt 0 0001 lt 0 0001 lt 0 0001 VSL lt 0 0001 lt 0 0001 lt 0
154. a und anderer Komponenten des Verd nnermediums beeinflussen den akrosomalen Status hohe Ca Konzentrationen f rdern die AR niedrige hemmen sie Sirivaidyapong et al 2000 47 Literatur 2 5 2 Inhaltsstoffe 2 5 2 1 Zuckerkomponenten Zuckerkomponenten geh ren zu den Hauptbestandteilen von Verd nnern zur Spermakonservierung Ponglowhapan et al 2004 und erf llen verschiedene Funktionen In glykolisierbarer Form Glukose Fruktose Mannose oder Arabinose dienen sie den Spermien als Energiesubstrat Weitze 2001 indem sie in Glykolyse und Krebszyklus verstoffwechselt werden Rigau et al 2001 Au erdem werden sie in Form von Glykogen gespeichert um eine mittel bis langfristige Energiereserve f r die Erhaltung der Motilit t aufzubauen f r den Fall dass keine externen Energiequellen verf gbar sind Rigau et al 2001 Des Weiteren tragen die Zuckerkomponenten wesentlich zur Osmolaritat des Verd nnermediums bei Weitze 2001 Der letztgenannte Punkt ist abh ngig von der F higkeit der Zucker die Zellmembran zu durchdringen welche wiederum temperaturabh ngig ist Aus diesem Grund werden einige Zucker bei h heren andere bei tieferen Temperaturen bevorzugt z B sind Glukose Fruktose Mannose und Sukrose zur Konservierung von Schafspermien besser geeignet bei 37 C hingegen Ribose Xylose Arabinose und Galaktose bei 5 C Weitze 2001 Weiterhin k nnen Zucker eine kryoprotektive Wirkung entfalten Weitze 20
155. a 20 Province et al 1984 bzw etwa 40 55 Michael et al 2009 2010 der Ausgangswerte beobachten konnten waren hnliche Motilit tsreduktionen bei Tsutsui et al 2003b und Nizanski et al 2009 erst nach zehn Tagen in TRIS Glukose Eigelb Verd nnern nachweisbar Demgegen ber 196 Diskussion stehen Publikationen in denen nach zehn Tagen Lagerungsdauer bei 4 bzw 5 C in TRIS Glukose Eigelb Verd nnern noch ann hernd 80 90 der Initialmotilit t festgestellt werden konnten Iguer Ouada und Verstegen 2001b Ponglowhapan et al 2004 Verstegen et al 2005 Shahiduzzaman und Linde Forsberg 2007 W hrend dann bei Iguer Ouada und Verstegen 2001b an Tag 15 schlie lich nur noch etwa 17 und bei Verstegen et al 2005 sogar nur noch circa 3 der Ausgangsmotilitat nachgewiesen werden konnten waren bei Ponglowhapan et al 2004 zum gleichen Zeitpunkt immer noch rund 50 und bei Shahiduzzaman und Linde Forsberg 2007 sogar noch etwa 75 der Initialmotilit t zu beobachten Erst nach 23 Tagen Lagerungsdauer war die Gesamtmotilitat auf etwa 23 Shahiduzzaman und Linde Forsberg 2007 bzw circa 2 Ponglowhapan et al 2004 des Ausgangswertes abgesunken Diese Variationen der Motilit tsraten k nnen durch verschieden Faktoren bedingt sein 1 Unterschiedliche Ausgangsmotiit t in den Nativejakulaten 2 Unterschiedliche Verd nnerzusammensetzung 3 Unterschiede bez glich der Konservierungstechnik K hlungsrate Entfernung v
156. ab Tab Tab Tab Tab A4 A5 AG AT A8 AQ A10 Name Zusammensetzung pH Wert und Osmolaritat einiger kommerzieller Verd nner f r die Fl ssigkonservierung von H ndespeimaas HE een 265 CASA Motilitatsparameter DAP DCL DSL VAP VCL VSL ALH BCF STR LIN und WOB n x SD Min Max im Nativsperma und in den verschiedenen Verd nnern an Tag 0 ecccceeeeeeeeeeeeetteeeeeeeeeeeeeee 267 Resultate der einfaktoriellen Varianzanalyse mit Messwiederholungen bez glich des Faktors Verd nner zum Vergleich der Verdunner CP TE und Up 1 2 mit dem Nativsperma unmittelbar nach dem Verd nnen Tag 0 n 12 bei signifikantem Resultat wurde anschlie end ein Student Newman Keuls Test zum paarweisen Vergleich der Mittelwerte d rch luhtteu usse tree eek 268 Resultate der einfaktoriellen Varianzanalyse mit Messwiederholungen bez glich des Faktors Verd nner zum Vergleich der Verd nner CP TE und Up 1 mit dem Nativsperma unmittelbar nach dem Verd nnen Tag 0 n 18 bei signifikantem Resultat wurde anschlie end ein Student Newman Keuls Test zum paarweisen Vergleich der Mittelwerte durchgefuhrt nein 270 Resultate der einfaktoriellen Varianzanalyse mit Messwiederholungen bez glich des Faktors Verd nner zum Vergleich der Verd nner CP und TE mit dem Nativsperma unmittelbar nach dem Verd nnen Tag 0 n 30 bei signifikantem Resultat wurde anschlie end ein Student Newman Keuls Tes
157. aere et al 2003 kamen in der vorliegenden Arbeit sog Leja Messkammern welche aus einem Objekttr ger mit jeweils vier Kammern mit einer standardisierten Tiefe von 20 um bestehen zum Einsatz Dies entsprach dem vom Hersteller empfohlenen Zubeh r f r die Nutzung des SpermVision Systems auch von anderen Autoren werden 20 um tiefe Messkammern verwendet Sch fer Somi et al 2006 Sch fer Somi und Aurich 2007 Weiterhin ist die Einhaltung einer konstanten Analysetemperatur von 37 C ein zu beachtender Faktor Amann und Katz 2004 auf dessen Bedeutung bereits zuvor eingegangen wurde Kap 5 2 3 1 Ferner wurde darauf geachtet die Messung innerhalb einer Minute nach Beschickung der Messkammer abzuschlie en da nach Smith und England 2001 Inkubationszeiten von mehr als einer Minute zu einer negativen Beeinflussung der Spermaqualit t f hren 166 Diskussion Aufgrund der hohen Dichte der zweiten Ejakulatfraktion ist fur die Untersuchung mittels CASA blicherweise eine Verd nnung notwendig Verstegen et al 2002 Rijsselaere et al 2003 Schafer Somi und Aurich 2007 In der vorliegenden Arbeit wurden jedoch nur die Nativejakulate verd nnt bei denen das SpermVision System wegen zu hoher Dichte eine Fehlermeldung machte Besser w re es allerdings gewesen alle Ejakulate auf eine einheitliche Konzentration 50 100 x 10 Spermien pro ml zu verd nnen wie es auch in der Literatur empfohlen wird G nzel Apel et al
158. akulate bereits zu Beginn und auch bis Ende des Untersuchungszeitraumes deutlich niedrigere Werte erkennen lie en Im weiteren Zeitverlauf lagen die Mittelwerte in den mit Up 1 aufgearbeiteten Proben dann jedoch stets ber denen die in den mit den anderen Verd nnern aufgearbeiteten Proben bestimmt wurden w hrend die mit CP und TE verd nnten Ejakulate weiterhin einen hnlichen Verlauf zeigten An Tag 10 konnte in den mit Up1 2 verd nnten Ejakulaten nur noch eine durchschnittliche CASA Viabilitat von 37 7 bestimmt werden w hrend in den mit den anderen Verdunnern aufgearbeiteten Ejakulaten die mittlere CASA Viabilit t noch rund 60 CP 58 8 TE 59 7 bzw fast 70 Up 1 68 0 betrug 138 Ergebnisse CP n 30 TE n 30 Up 1 2 n 12 Up 1 n 18 a F 2 E gt lt p lt O Abb 17 Ver nderungen des Prozentsatzes an lebenden Samenzellen mittels Computer assisted sperm analysis CASA SpermVision System gemessene Viabilitat nach SYBR 14 Pl Farbung in den verschiedenen Verdunnern im Zeitverlauf der Flussigkonservierung bei 4 C uber zehn Tage dargestellt als r cktransformierter Mittelwert x modifizierter Mittelwert mit negativem und positivem Fehlerbalken modifizierter 1 s Bereich CP Verdunner CaniPRO Chill 10 TE TRIS Fruktose Eigelb Verdunner Up 1 2 Uppsala Equex 2 System Verd nner 1 und Verdunner 2 Up1 Uppsala Equex 2 System nur Verd
159. am es in den mit CP TE und Up1 aufgearbeiteten Ejakulaten ber den Untersuchungszeitraum hinweg nur zu einer geringen Reduktion der Mittelwerte Insgesamt waren die in den mit CP TE und Up1 verd nnten Ejakulaten gemessenen Werte ab Tag 2 stets h her als die in den mit Up 1 2 verd nnten Ejakulaten Die mit CP und TE verd nnten Ejakulate zeigten an Tag 10 leicht h here Mittelwerte als die mit Up 1 verd nnten Ejakulate Die im Zeitverlauf der Fl ssigkonservierung beobachteten Reduktionen der Mittelwerte des Parameters BCF waren in den mit Up 1 2 pzeit 0 0003 und in den mit Up 1 Pze 0 0092 verd nnten Ejakulaten als signifikant zu beurteilen In den mit CP aufgearbeiteten Ejakulaten konnten ber den Untersuchungszeitraum f r BCF signifikante Niveauunterschiede zu den mit TE Pvera 0 0006 und den mit Up 1 2 Pvera 0 021 aufgearbeiteten Ejakulaten nachgewiesen werden Die Zeitverl ufe unterschieden sich zwischen den mit CP und den mit TE sowie zwischen den mit CP und den mit Up 1 2 aufgearbeiteten Ejakulaten f r den Parameter BCF nicht signifikant Die mit CP aufgearbeiteten Ejakulate unterschieden sich bez glich BCF nicht signifikant von den mit Up1 aufgearbeiteten Ejakulaten Die mit TE verd nnten Ejakulate zeigten bez glich BCF einen signifikanten Niveauunterschied zu den mit Up1 2 verd nnten Ejakulaten Pvera 0 042 und auch die Zeitverl ufe zwischen den mit TE und den mit Up 1 2 verd nnten Ejakulaten unterschieden si
160. and und Millar 2008 M glichkeit der Verwechslung der Abstammung England und Millar 2008 2 1 2 Technik der Samenubertragung F r die erfolgreiche Anwendung der KB ist es wichtig diese zum optimalen Zeitpunkt durchzuf hren Sperma guter Qualit t zu verwenden und dieses an der idealen Stelle f r die Befruchtung zu deponieren Linde Forsberg 1991 Thomassen und Farstad 2009 Zur Bestimmung des optimalen Besamungszeitpunktes kommen mehrere Verfahren in Betracht wobei die Messung der Serum Progesteronkonzentration und die Vaginalzytologie die relevantesten sind Morton und Bruce 1989 Pena et al 2006 Der Reproduktionstrakt der H ndin weist im Vergleich zu anderen Haustierspezies einige Besonderheiten auf deren ausf hrliche Darstellung bei Wilson 2001 zu finden ist Zusammenfassend gestaltet sich die Katheterisierung der Zervix beim Hund durch die lange Vagina den aufgrund der dorsomedialen Falte engen parazervikalen Raum die Position des externen Ostiums und die Winkelung sowie den schmalen Durchmesser des Zervikalkanals als relativ schwierig Wilson 2001 Es gibt verschiedene Techniken f r die k nstliche Samen bertragung beim Hund wobei das Sperma entweder tief intravaginal oder intrauterin deponiert wird Bei der intrauterinen Samendeponierung sind die transzervikale intrauterine Besamung mithilfe eines starren Katheters Norwegischer Katheter bei transabdominaler Fixation der Zervix die transzervikale intraut
161. ang zu entnehmen Tab A10 A14 Kap 9 8 4 4 Korrelationen der untersuchten Parameter In diesem Kapitel werden zum einen die Zusammenh nge zwischen den subjektiv bestimmten und den objektiv mittels CASA SpermVision System gemessenen Werten und zum anderen die Zusammenh nge zwischen verschiedenen ausgew hlten Spermaparametern dargestellt Dabei wurden zun chst Korrelationsanalysen nach Nativsperma und nach den einzelnen Verd nnern getrennt durchgef hrt bei denen aber alle Untersuchungstermine gemeinsam betrachtet wurden und des Weiteren Korrelationsanalysen bei denen die Nativejakulate und alle Verdunner sowie alle Untersuchungszeitpunkte einbezogen wurden explorativ 4 4 1 Zusammenhang zwischen den mittels Neubauer Z hlkammer bestimmten und den durch CASA gemessenen Dichten 4 4 1 1 Korrelationen nach Verd nnern getrennt Die Ergebnisse der Korrelationsanalysen zur Untersuchung des Zusammenhanges zwischen den mittels Neubauer Z hlkammer bestimmten und den durch CASA gemessenen Dichten sind in Tab 20 dargestellt 147 Ergebnisse Tab 20 Korrelationen zwischen den mittels Neubauer Zahlkammer bestimmten und den durch CASA SpermVision System gemessenen Dichten in den Nativejakulaten und in den mit den verschiedenen Verd nnern aufgearbeiteten Ejakulaten n Anzahl der getesteten zeitgleichen Variablenpaare r Korrelationskoeffizient nach Pearson p p Wert Verdunner n r p keiner Nativs
162. anie p ynnym Use of fluorescent staining SYBR 14 propidium iodide and flow cytometry in evaluating the quality of chilled dog semen Med weter 61 9 1022 1028 Ni a ski W Klimowicz M Partyka A Savic M Dubiel A 2009 Effects of the inclusion of Equex STM into Tris based extender on the motility of dog spermatozoa incubated at 5 C Reprod Dom Anim 44 Suppl 2 363 365 N thling J O Gerstenberg C Volkmann D H 1997 Semen quality after thawing Correlation with fertility and fresh semen quality in dogs J Reprod Fertil 51 Suppl 109 116 Oettl E E 1986 Changes in acrosome morphology during cooling and freezing of dog semen Anim Reprod Sci 12 2 145 150 Oettl E E 1993 Sperm morphology and fertility in the dog J Reprod Fertil 47 Suppl 257 260 Oettl E E Soley J T 1988 Sperm abnormalities in the dog A light and electron microscopic study Vet Med Rev 59 28 70 Ohl D A Denil J Cummins C Menge A C Seager S W 1994 Electroejaculation does not impair sperm motility in the beagle dog A comparative study of electroejaculation and collection by artificial vagina J Urol 152 3 1034 1037 Olar T T Amann R P Pickett B W 1983 Relationships among testicular size daily production and output of spermatozoa and extragonadal spermatozoal reserves of the dog Biol Reprod 29 5 1114 1120 Pe a A I Barrio F Quintela L A He
163. anine semen by the Hamilton Thorne analyzer Theriogenology 62 7 1292 1306 Rijsselaere T Van Soom A Maes D Verberckmoes S de Kruif A 2004b Effect of blood admixture on in vitro survival of chilled and frozen thawed canine spermatozoa Theriogenology 61 7 8 1589 1602 Rijsselaere T Van Soom A Tanghe S Coryn M Maes D de Kruif A 2005 New techniques for the assessment of canine semen quality A review Theriogenology 64 3 706 719 Rodriguez Gil J E Montserrat A Rigau T 1994 Effects of hypoosmotic incubation on acrosome and tail structure on canine spermatozoa Theriogenology 42 5 815 829 Rohloff D Laiblin C Heidrich S 1978 Untersuchungen uber die Gefrierschutzwirkung von Glycerin und DMSO bei der Tiefgefrierung von Rudensperma Berl M nch Tierarztl Wschr 91 2 31 33 Root Kustritz M V 2007 The value of canine semen evaluation for practitioners Theriogenology 68 3 329 337 Root Kustritz M V Olson P N Johnston S D Root T K 1998 The effects of stains and investigators on assessment of morphology of canine spermatozoa J Am Anim Hosp Assoc 34 4 348 352 243 Literaturverzeichnis Rota A Strom B Linde Forsberg C 1995 Effects of seminal plasma and three extenders on canine semen stored at 4 C Theriogenology 44 6 885 900 Rota A Strom B Linde Forsberg C Rodriguez Martinez H 1997 Effects of Equex STM past
164. asmamembran m glichst gering zu halten hat sich der Zusatz von Eigelb zum Verd nner als Schutzkolloid ber alle Spezies hinweg bew hrt Hoffmann 2003d und ist weitverbreitet Beccaglia et al 2009a Farstad 2009 Die Mehrheit der Verd nner enth lt Eigelb als Haupt Membranprotektivum Kmenta et al 2011 Eigelb ist keine definierte Substanz sondern ein komplexes biologisches Produkt Beccaglia et al 2009a Farstad 2009 welches durch eine extrem hohe Variabilit t in seiner Zusammensetzung gekennzeichnet ist Bergeron und Manjunath 2006 Beccaglia et al 2009a Es enth lt Proteine Vitamine Phospholipide Glukose antibakterielle Stoffe und Antioxidantien welche alle potentiell n tzlich f r die Integrit t der Zellmembran sind Farstad 2009 Eigelb ist eine Quelle f r Lipoproteine und Komponenten mit hohem Molekulargewicht Beccaglia et al 2009a welche die Samenzellen bzw deren Zellmembranen gegen einen Kalteschock schutzen Beccaglia et al 2009a Farstad 2009 bzw diesen reduzieren Concannon und Battista 1989 Die Antioxidantien sch tzen die Zellen vor oxidativen Sch digungen durch die Bildung reaktiver Sauerstoffspezies Farstad 2009 Die Mechanismen durch die das Eigelb den Schutz gegen Kalteschockschaden vermittelt sind nicht genau bekannt Iguer Ouada und Verstegen 2001b Es wird angenommen dass die aktiven Schutzkomponenten des Eigelbs die Phospholipide einer Low density Lipoprotein LDL Fraktion sin
165. assage des Penis Den Umsteigeversuchen des R den wurde entgegengekommen indem der Penis um 180 nach kaudoventral gedreht wurde um so das H ngen zu imitieren Nach der Abgabe einer ausreichenden Menge an Prostatasekret wurde die Stimulation durch L sen der Fixation des Penis beendet und die R den wurden noch solange beobachtet bis der Penis wieder vollst ndig eingeschachtet war Hoffmann 2003a Kutzler 2005 76 Material und Methoden Die Ejakulate wurden fraktioniert in sterilen auf 37 C angewarmten graduierten Tulpengl sern Minitub GmbH Tiefenbach aufgefangen und bis zur Untersuchung im Wasserbad bei 37 C aufbewahrt Die Trennung der verschiedenen Ejakulatfraktionen erfolgte durch Gl serwechsel bei makroskopisch sichtbarer Farb und Konsistenz nderung des Sekrets in Vorsekret Fraktion 1 klar spermienreiche Fraktion Fraktion 2 tr b milchig und Nachsekret Fraktion 3 spermienarme Fraktion Prostatasekret klar w ssrig Linde Forsberg 1991 Kutzler 2005 Im Anschluss an die Samengewinnung wurde das Ejakulat unverz glich ins Labor gebracht wo eine Beurteilung des gewonnenen Spermas sowie dessen Weiterverarbeitung erfolgte 3 3 Spermabeurteilung Das gewonnene Sperma wurde sowohl nach den Methoden der klassischen Spermatologie als auch mittels CASA SpermVision System untersucht Eine graphische bersicht der Vorgehensweise ist in Abb 3 dargestellt Alle verwendeten Ger te Verbrauchsmaterialien
166. ation der Anzahl der zu besamenden H ndinnen oder der Gr e der H ndinnen abh ngig Pena et al 2006 Eine zu hohe Verd nnung kann die Motilitat negativ beeinflussen Linde Forsberg 1995 2 4 1 2 Lagerung bzw Versand blicherweise erfolgt die Lagerung des fl ssigkonservierten Spermas bei 4 C Andersen 1980 Rota et al 1995 Iguer Ouada und Verstegen 2001b Hermansson und Linde Forsberg 2006 Pesch et al 2007 Michael et al 2010 bzw bei 5 C Foote 1964a Foote und Leonard 1964 Province et al 1984 Kumi Diaka und Badtram 1994 Linde Forsberg 2001 Ponglowhapan et al 2004 Shahiduzzaman und Linde Forsberg 2007 Beccaglia et al 2009a Nizanski et al 2009 da diese Temperaturen h heren Lagerungstemperaturen berlegen sind Bouchard et al 1990 Einzig auf den Anteil an akrosomreagierten Spermien wirkt sich die Temperatur von 5 C nachteilig aus Kumi Diaka und Badtram 1994 Beim Versand ist nach Linde Forsberg 1991 fur die meisten Transportdistanzen jedoch eine Temperatur von 10 bis 15 C ausreichend 37 Literatur Fur die Aufbewahrung kann ein steriles Plastikrohrchen mit Schraubverschluss Linde Forsberg 1991 2001 Iguer Ouada und Verstegen 2001b Pe a et al 2006 Pesch et al 2007 oder eine Spritze Lopes et al 2008 verwendet werden welche verglichen mit Glasrohrchen Tsutsui et al 2003b beim Transport nicht zerbrechen k nnen Linde Forsberg 1991 2001 Das verd nnte Sper
167. aufgearbeiteten Ejakulaten lie en sich keine signifikanten Unterschiede verifizieren Bei getrennter Betrachtung der einzelnen morphologischen Ver nderungen fiel auf dass f r die Anteile an Kopf und Halsver nderungen weder signifikante Zunahmen im Zeitverlauf noch signifikante Unterschiede zwischen den mit den verschiedenen Verd nnern aufgearbeiteten Ejakulaten nachgewiesen werden konnten Hingegen zeigte der Anteil an Schwanzver nderungen im Zeitverlauf in fast allen verd nnten Ejakulaten einen signifikanten Anstieg Pzeit 0 0082 bis lt 0 0001 Zudem konnte bez glich dieses Anteils ein signifikanter Niveauunterschied zwischen den mit CP und den mit TE verd nnten Ejakulaten ermittelt werden Pvera 0 012 die Zeitverl ufe lie en keinen signifikanten Unterschied erkennen In den mit TE verd nnten Proben konnte bis einschlie lich Tag 7 stets ein h herer Anteil an Schwanzver nderungen beobachtet werden als in den mit CP verd nnten Proben An Tag 10 war jedoch der mittlere Anteil an Schwanzver nderungen in den mit CP verd nnten Proben 7 5 SF 2 24 h her als in den mit TE verd nnten Proben 7 1 SF 2 65 Auch zwischen den mit CP und den mit Up 1 2 verd nnten Ejakulaten konnte bez glich des Anteils an Schwanzver nderungen ein signifikanter Niveauunterschied ermittelt werden Pvera 0 032 und ebenso ein signifikanter Unterschied der Zeitverl ufe pw 0 0034 Hier war der Anteil an Schwanzver nderungen ber den
168. bH G nzel Apel Tiefenbach 2007 Germany Canine EXT Chilled Pulver in Aqua Livestock www livestockcon Semen Extender bidest aufl sen und Concepts cepts com 20 ml Eigelb Inc hinzuf gen Hawarden lowa USA CLONE Cryogenetic Glukose keine CLONE 6 9 Linde Forsberg Laboratory Of New Fruktose und Cryogenetic 2001 England Chilled wahrscheinlich Laboratory of Shahiduzzaman Semen Kit Eigelb und New und Linde Antibiotika England Forsberg 2007 Semen Enhancer Inc www cloneusa co und Semen Chester m Activator Springs PA USA Fresh Express patentrechtlich Synbiotics Goodman und 10 ml gesch tzt Corporation Cain 1993 San Diego Nishiyama et al CA USA 1999 Linde Forsberg 2001 www synbiotics co m Fresh phos IMV 6 82 1220 Iguer Ouada und Verd nner Technologies 6 69 mit 1156 mit Verstegen 2001b L Aigle 20 20 Eigelb France Eigelb zusatz zusatz 265 Anhang Fresh Plus Verd nner Eigelb Zitrat Edwards Agri 6 3 255 Bouchard et al Verd nner Sales Inc 1990 kommerzielles Baraboo WI Puder aufgel st in USA dest Wasser und 3 5 frischem Eigelb Green Verd nner IMV 6 77 425 Iguer Ouada und Technologies 6 84 mit 392 mit Verstegen 2001b L Aigle 20 20 Eigelb France Eigelb zusatz zusatz INSEMIN AID Semen Camelot www camelotfarm Extender Farms s com College Station Texas USA IVT Illinois Variable Christiansen Tempera
169. bei 400 facher Vergr erung mit positivem Phasenkontrast f nf Erythrozytenz hlfelder mit jeweils 16 Kleinstquadraten ausgez hlt Dabei wurden nur Spermien gez hlt deren K pfe innerhalb der Kleinstquadrate oder auf deren linken oder unteren Begrenzungslinie lagen Zur Berechnung der Dichte fand die Formel nach Neubauer Anwendung siehe Formel 1 Aus der so bestimmten Dichte wurde in Verbindung mit dem bereits zuvor bestimmten Ejakulatvolumen die SGZ berechnet siehe Formel 2 Christiansen 1984b Hoffmann 2003b Formel 1 Dichteberechnung N Z x 4000 x V 80 N Dichte durchschnittliche Spermienzahl pro ul Sperma Z Gesamtzahl der ausgez hlten Spermien in 80 Kleinstquadraten 1 4000 ul Referenzvolumen Tiefe 0 1 mm x Fl che 0 0025 mm V Verd nnungsfaktor Formel 2 Berechnung der SGZ im Ejakulat SGZ N x Ejakulatvolumen in ul 81 Material und Methoden 3 3 2 Spermac Farbung Zur Beurteilung der akrosomalen Integritat Kopfkappe wurde eine Spermac F rbung FertilPro N V Beernem Belgien angefertigt Bei dieser F rbung handelt es sich um ein kommerziell erhaltliches Farbeset zur selektiven Anfarbung der Bestandteile einer Samenzelle einschlie lich des Akrosoms Die F rbemethode stammt aus der Humanmedizin und besteht aus einer Fixierl sung und drei Farbl sungen deren genaue Zusammensetzung jedoch unbekannt ist Zun chst wurde ein 10ul gro er Tropfen Sperma auf einen angew rmten Objekttr ger 37 C
170. cerol for cryopreservation of canine semen Theriogenology 72 5 650 654 Macpherson J W Penner P 1967 Canine reproduction l Reaction of animals to collection of semen and insemination procedures Can J Comp Med Vet Sci 31 3 62 64 Martikainen P Sannikka E Suominen J Santti R 1980 Glucose content as a parameter of semen quality Arch Androl 5 4 337 343 Martins Bessa A Rocha A Mayenco Aguirre A 2006 Comparing ethylene glycol with glycerol for cryopreservation of canine semen in egg yolk TRIS extenders Theriogenology 66 9 2047 2055 Michael A J Alexopoulos C Pontiki E A Hadjipavlou Litina D J Saratsis P Ververidis H N Boscos C M 2008 Quality and reactive oxygen species of extended canine semen after vitamin C supplementation Theriogenology 70 5 827 835 238 Literaturverzeichnis Michael A J Alexopoulos C Pontiki E A Hadjipavlou Litina D J Saratsis P Ververidis H N Boscos C M 2009 Effect of antioxidant supplementation in semen extenders on semen quality and reactive oxygen species of chilled canine spermatozoa Anim Reprod Sci 112 1 2 119 135 Michael A J Alexopoulos C Pontiki E A Hadjipavlou Litina D J Saratsis P Ververidis H N Boscos C M 2010 Effect of N acetyl L cysteine supplementation in semen extenders on semen quality and reactive oxygen species of chilled canine spermatozoa Reprod Do
171. ch signifikant pw 0 012 Zwischen den mit TE und den mit Up1 verd nnten Ejakulaten bestand kein signifikanter Unterschied Tab A10 A14 Kap 9 8 Bez glich des Parameters STR konnten im Zeitverlauf in den mit TE Up 1 2 und Up 1 aufgearbeiteten Ejakulaten keine wesentlichen Ver nderungen beobachtet werden Lediglich in den mit CP aufgearbeiteten Ejakulaten kam es ber den Untersuchungszeitraum zu einer tendenziellen Reduktion der Mittelwerte Insgesamt lagen die Werte f r STR in den mit den verschiedenen Verd nnern aufgearbeiteten Ejakulaten nah beieinander Der geringste Wert an Tag 10 konnte in den mit CP verd nnten Proben nachgewiesen werden gefolgt von den mit Up 1 133 Ergebnisse und den mit TE verd nnten Proben Der h chste Wert an Tag 10 war in den mit Up 1 2 verd nnten Proben zu beobachten Im Zeitverlauf der Fl ssigkonservierung lie en sich in allen verd nnten Ejakulaten keine signifikanten Ver nderungen f r STR nachweisen Die mit CP verd nnten Ejakulate zeigten ber den Untersuchungszeitraum f r STR einen signifikanten Niveauunterschied zu den mit Up 1 verd nnten Ejakulaten Pvera 0 0097 und auch die Zeitverl ufe der mit CP und der mit Up1 verd nnten Ejakulate unterschieden sich signifikant voneinander pw 0 012 Mit Ausnahme von Tag 10 waren in den mit CP verd nnten Proben stets h here Werte zu beobachten als in den mit Up1 verd nnten Proben Zu den mit TE und Up1 2 verd nnten Ejakulaten ko
172. chafer Somi und Aurich 2007 mittels SpermVision und verschiedenen Verd nnermedien bestimmten Motilitatswerten waren die in der vorliegenden Arbeit ermittelten Ergebnisse zwar f r einige Motilit tsparameter hnlich berwiegend jedoch niedriger insbesondere die Gesamtmotilitat und die Vorw rtsbeweglichkeit lagen deutlich niedriger als bei Sch fer Somi und Aurich 2007 Ausnahmen bildeten die Parameter ALH und WOB welche geringgradig h here Werte zeigten Ebenso war die durch CASA bestimmte Viabilit t in der vorliegenden Arbeit deutlich niedriger als bei Sch fer Somi und Aurich 2007 Insgesamt sprach dies f r eine tendenziell geringere Spermaqualit t der Nativejakulate in der vorliegenden Untersuchung welche jedoch wahrscheinlich durch das gr ere und heterogene Probandenkollektiv bedingt war wohingegen Sch fer Somi und Aurich 2007 ausschlie lich Ejakulate von sechs klinikseigenen Beagle R den im Alter von zwei bis vier Jahren verwendeten Bez glich der Viabilit t muss zudem der Unterschied in der Methodik sowie die teils schlechte Spermienerkennung durch das SpermVision System ber cksichtigt werden siehe Kap 5 2 3 2 3 Im Vergleich mit den mittels SpermVision gemessenen Ergebnissen von Sch fer Somi et al 2006 Eulenberger et al 2009 und Koderle et al 2009 waren die in der vorliegenden Arbeit gemessenen Werte f r die Nativejakulate zwar f r viele Motilit tsparameter hnlich jedoch zeigten auch hier
173. charose L sung Pinto und Kozink 2008 Der vorl ufige Referenzbereich f r normosperme R den liegt bei 80 bis 96 aufgerollten Schw nzen curled tail Riesenbeck et al 2001 24 Literatur nc 1 2 3 4 5 no curled gesch digt Abb 1 Schematische Darstellung der Schwanzver nderungen von Rudenspermien beim hypoosmotischen Schwelltest HOS Test Spermien mit Schwanzver nderungen im Stadium 1 4 schwarz intakte Zellmembran Spermien mit Schwanzver nderungen im Stadium 5 und not curled nc grau defekte Plasmamembran Riesenbeck et al 2001 Der HOS Test ist simpel konomisch klinisch leicht anwendbar und schnell durchzuf hren weshalb er eine n tzliche Erg nzung zur Standardsperma untersuchung darstellt Jeyendran et al 1992 Pinto und Kozink 2008 Im Gegensatz zu den gebr uchlichen F rbungen f r die Untersuchung der Membran wie z B der Eosin Nigrosin F rbung die nur die strukturelle Integrit t der Membran anzeigen kann mit dem HOS Test der funktionelle Status der Plasmamembran untersucht werden Funktionelle und strukturelle Integrit t der Plasmamembran sind entscheidend f r die Viabilit t der Spermien Lechniak et al 2002 Mithilfe dieses Tests k nnen R den identifiziert werden die trotz eines normalen Spermiogramms subfertil sind Kumi Diaka 1993 2 3 3 Computer assisted sperm analysis CASA Die Abk rzung CASA steht f r Computer aided semen analysis Iguer Ouada und
174. chkeit und mittels CASA bestimmte Vorw rtsbeweglichkeit Anteil lebender Spermien im Eosinausstrich und mittels CASA gemessene Viabilit t nach SYBR 14 Pl F rbung zun chst nach Verd nnern getrennt und dann ohne Trennung nach Verd nnern explorativ vergleichend untersucht Weiterhin wurden auch zur Beurteilung der Zusammenh nge zwischen verschiedenen Spermaparametern Korrelationsanalysen durchgef hrt Auch hier erfolgten die Analysen zun chst nach Verd nnern getrennt und dann ohne Trennung nach Verd nnern explorativ Der durch die Korrelationsanalysen ermittelte Korrelationskoeffizient nach Pearson r stellt eine Ma zahl fur die Straffheit des linearen Zusammenhangs zwischen zwei quantitativen Merkmalen dar oder anders formuliert eine Ma zahl die angibt wie eng der lineare Zusammenhang zwischen den Messwerten ist Die Bewertung der statistischen Signifikanzen erfolgte unter Zugrundelegung des Signifikanzniveaus a 0 05 was bedeutet dass Ergebnisse mit p lt 0 05 als statistisch signifikant angesehen wurden 98 Ergebnisse 4 Ergebnisse 4 1 Untersuchungsergebnisse der Nativejakulate In diesem Kapitel werden die Untersuchungsergebnisse der Nativejakulate n 30 wiedergegeben Dabei bezieht sich die Bezeichnung Ejakulat auf die spermienreiche Fraktion 4 1 1 Makroskopische Untersuchung Das mittlere Volumen der spermienreichen Fraktion betrug 2 9 1 3 ml Min 1 5 ml Max 7 0 ml Die Farbe der Ejakulate war zu
175. cial insemination in the dog N Z Vet J 19 8 178 184 Fontbonne A Badinand F 1993 Canine artificial insemination with frozen semen Comparison of intravaginal and intrauterine deposition of semen J Reprod Fertil 47 Suppl 325 327 Foote R H 1964a The effects of electrolytes sugars glycerol and catalase on survival of dog sperm stored in buffered yolk mediums Am J Vet Res 25 32 36 Foote R H 1964b The influence of frequency of semen collection fractionation of the ejaculate and dilution rate on the survival of stored dog sperm Cornell Vet 54 89 97 Foote R H Leonard E P 1964 The influence of pH osmotic pressure glycine and glycerol on the survival of dog sperm in buffered yolk extenders Cornell Vet 54 78 89 232 Literaturverzeichnis Fougner J A Aamdal J Andersen K 1973 Intrauterine insemination with frozen semen in the blue fox Nord Vet Med 25 3 144 149 Freshman J L 2002 Semen collection and evaluation Clin Tech Small Anim Pract 17 3 104 107 Froman D P Amann R P Riek P M Olar T T 1984 Acrosin activity of canine spermatozoa as an index of cellular damage J Reprod Fertil 70 1 301 308 Futino D O Mendes M C Matos W N Mondadori R G Lucci C M 2010 Glycerol methylformamide and dimethylformamide in canine semen cryopreservation Reprod Dom Anim 45 2 214 220 Garner D L Johnson L A 1995
176. d Watson und Morris 1987 Weitze und Petrunkina 2007 wobei insbesondere dem Phosphatidylcholin eine gro e Bedeutung zukommt Watson und Morris 1987 Eine m gliche Erkl rung ist dass diese Phospholipide an die Spermienmembran binden und so deren Schutz bewirken Weitze und Petrunkina 2007 Phosphatidylcholin scheint seine Wirkung ber eine Membranstabilisierung auszu ben wobei es die Membranzusammensetzung allerdings nicht permanent modifiziert Watson und Morris 1987 Weiterhin k nnten die Phospholipide den 53 Literatur Phospholipidverlust aus der Membran verhindern oder die bereits verloren gegangenen Phospholipide ersetzen Farstad 2009 Ein anderer Erklarungsansatz wird von Bergeron und Manjunath 2006 postuliert LDL im Eigelb schutzt beim Bullen die Spermienfunktion indem es die Bindung der Spermien an die Hauptseminalplasmaproteine und dadurch gleichzeitig die von letzteren modulierte Stimulation des Lipidverlustes aus der Plasmamembran verhindert LDL bildet dabei mit den Seminalplasmaproteinen stabile Komplexe wobei seine Bindungskapazitat sehr hoch ist Da diese Seminalplasmaproteine bei Saugern ubiquitar vorkommen und homologe Proteine ebenfalls an LDL binden k nnten auch die Mechanismen der protektiven Funktion von Eigelb bei allen S ugern die gleichen sein Bergeron und Manjunath 2006 Iguer Ouada und Verstegen 2001b konnten zeigen dass Eigelb einen positiven Effekt auf die Konservierung der Spermi
177. d nnern aufgearbeiteten Ejakulate untereinander zeigten keine signifikanten Unterschiede Tab A6 A8 Kap 9 8 Bei den durch CASA berechneten Motilit tsparametern STR LIN WOB war im Vergleich mit dem Nativsperma bei den verd nnten Ejakulaten teils eine Zunahme und teils eine Abnahme der Mittelwerte feststellbar F r alle drei Parameter konnte in den mit CP verd nnten Proben eine Zunahme bzw Konstanz der durchschnittlichen Werte gesehen werden In den mit TE verd nnten Proben kam es verglichen mit den Nativejakulaten bei den Parametern STR und LIN zu einer Abnahme der Durchschnittswerte und beim Parameter WOB zu einer Zunahme In den mit Up1 2 aufgearbeiteten Ejakulaten kam es beim Parameter STR zu keiner nderung durch die Zugabe des Verd nners und bei den Parametern LIN und WOB zu einer Abnahme der Mittelwerte gegen ber dem Nativsperma In den mit Up 1 verd nnten Proben konnte bez glich der Parameter STR und LIN eine 111 Ergebnisse Abnahme der Mittelwerte gesehen werden und bezuglich des Parameters WOB eine Zunahme Die durchschnittlichen mittels CASA berechneten Werte f r den Motilitatsparameter LIN VSL VCL der Ejakulate vor und unmittelbar nach dem Verdunnen Tag 0 sind in Tab 16 dargestellt Beim Vergleich mit dem Nativsperma konnte in den mit CP verdunnten Proben eine Zunahme der Linearit t festgestellt werden und in den mit TE Up 1 2 sowie Up 1 verd nnten Proben eine Abnahme Die st rkste Abnahme der L
178. d mit Verd nner 1 aufgearbeitet werden um sie im Anschluss in fl ssigkonserviertem Zustand an eine Einrichtung zu versenden die dann die weitere Aufarbeitung und Kryokonservierung durchf hrt Vor diesem Hintergrund wurden die Aliquote in 175 Diskussion Versuchsteil II nur mit Verd nner 1 des Uppsala Equex 2 Systems fl ssigkonserviert Nachteilig an dieser Vorgehensweise war dass die verd nnten Ejakulate wie bereits in Kap 5 2 3 2 erw hnt f r die CASA Messungen z T nochmals verd nnt werden mussten Insgesamt m ssen diese Unterschiede in den Endverd nnungen der fl ssigkonservierten Ejakulate insbesondere f r die Interpretation der durch CASA bestimmten Messwerte ber cksichtigt werden da bekannt ist dass verschiedene Motilitatsparameter in Abh ngigkeit vom Grad der Spermaverd nnung beeinflusst werden Iguer Ouada und Verstegen 2001a Smith und England 2001 5 3 Diskussion der Ergebnisse 5 3 1 Nativejakulate 5 3 1 1 Klassische Spermatologie Die in den Nativejakulaten untersuchten Spermaparameter variierten zwischen den verschiedenen R den so wie es auch im klinischen Alltag der Fall ist entsprachen dabei aber gr tenteils den in der Literatur beschriebenen physiologischen Referenzwerten f r R densperma G nzel 1986 England 1999 Riesenbeck et al 2001 Hoffmann 2003b G nzel Apel 2007 Ausnahmen bildeten einzelne Parameter in den Ejakulaten der Hunde Nr 1 2 6 7 9 11 und 24 wobei es sich
179. den der klassischen Spermatologie als auch mittels CASA verifiziert werden konnte Eine Reduktion der Viabilit t war absehbar und wurde f r Lagerungszeitr ume von 2 bis 23 Tagen bereits von verschiedenen anderen Autoren nachgewiesen Rota et al 1995 England und Ponzio 1996 Rijsselaere et al 2002a Tsutsui et al 2003b Ponglowhapan et al 2004 Nizanski und Klimowicz 2005 Hermansson et al 2006 Shahiduzzaman und Linde Forsberg 2007 Michael et al 2009 2010 Kmenta et al 2011 An Tag 0 konnten hinsichtlich der Viabilitat keine signifikanten Unterschiede zwischen den mit den verschiedenen Verd nnern aufgearbeiteten Ejakulaten ermittelt werden siehe Kap 5 3 2 3 Demgegen ber war der Anteil an lebenden Samenzellen im Eosinausstrich in den mit Up 1 aufgearbeiteten Ejakulaten ber den gesamten Untersuchungszeitraum jedoch signifikant h her als in den mit den anderen Verd nnern aufgearbeiteten Ejakulaten Die mit CP TE und Up1 2 aufgearbeiteten Ejakulate unterschieden sich bez glich des Anteils an lebenden Samenzellen nicht signifikant voneinander Auch bei Betrachtung der CASA Viabilitat waren die mit Up1 verd nnten Ejakulate den mit CP verd nnten Ejakulaten im Zeitverlauf signifikant berlegen nicht jedoch den mit TE verd nnten Ejakulaten Die mit CP und die mit TE verd nnten Ejakulate unterschieden sich bez glich der CASA Viabilit t nicht signifikant voneinander zeigten aber beide ber den gesamten Untersuchungszeit
180. dene Klassifikationsm glichkeiten f r das Spermiogramm des Hundes Beispielhaft sei das Klassifikationsschema von Oettl Oettl und Soley 1988 Oettl 1993 angef hrt 1 Akrosomale Ver nderungen Hauptdefekte lippenartig zystisch anormale Verteilung Nebendefekte akrosomreagiert geschwollen schwere Sch digung abgel st 2 Kopfveranderungen Hauptdefekte makrozephal mikrozephal pyriform Kranzdefekte andere Kernvakuolen gefurchte Spermien Doppelformen starke Pleiomorphie bizarre Formen Nebendefekte schmale K pfe schmale Kopfbasis aber nicht pyriform andere Kopfbasisdefekte abaxiale Implantation abgel ste K pfe nukleare Kondensation 3 Mittelst ckver nderungen Hauptdefekte Zytoplasmatropfen gebrochene Mittelst cke Pseudoplasmatropfen abgeknickte Mittelst cke Nebendefekte distale Zytoplasmatropfen 21 Literatur 4 Schwanzveranderungen Hauptdefekte dag Defekt Doppelschwanze Nebendefekte einfach gekrummte oder aufgerollte Schwanze terminal aufgerollte Schwanze 5 Andere Zellen Leukozyten Spermienvorstufen 6 Spermienagglutination Kopf an Kopf Kopf an Schwanz Schwanz an Schwanz Agglutination an andere Zellen Ein Nachteil dieses und anderer Schemata ist die Unfahigkeit zur Erfassung multipler Defekte einer Samenzelle Oettle 1993 Wenn eine Samenzelle mehr als einen Defekt aufweist wird sie entsprechend der wichtigsten Veranderung kategorisiert od
181. des Prozentsatzes an Samenzellen mit intaktem Akrosom bestimmt nach Fluoreszenzf rbung mit FITC PSA induziert Ebenso kam es bei Iguer Ouada und Verstegen 2001b w hrend der Fl ssigkonservierung in TRIS Glukose Eigelb und TRIS Fruktose Eigelb Verd nnern nur zu einer leichten Zunahme des Prozentsatzes an Samenzellen mit Verlust des Akrosoms bestimmt nach Chlortetracyclinf rbung nach neun Tagen lagen die durchschnittlichen Werte in beiden Verd nnern unter 10 Auch bei Ponglowhapan et al 2004 war in mit TRIS Eigelb Verd nnern mit Glukose oder Fruktosezusatz fl ssig konservierten Ejakulaten in den ersten drei Tagen nach Herstellung kein signifikanter Anstieg des Prozentsatzes an Samenzellen mit Verlust des Akrosoms bestimmt nach FITC PNA Fluoreszenzf rbung nachweisbar meist kam es erst nach mindestens zehn Tagen zu einem signifikanten Anstieg Es konnten weder zwischen den verschiedenen Zuckerkomponenten Glukose oder Fruktose noch 210 Diskussion zwischen verschiedenen Zuckerkonzentrationen 10 mM oder 70 mM signifikante Unterschiede bez glich des Prozentsatzes an Spermien mit Akrosomverlust nachgewiesen werden Ponglowhapan et al 2004 Insgesamt machen die vorliegenden Ergebnisse deutlich dass im Verlauf der Flussigkonservierung mit einer Zunahme akrosomaler Veranderungen gerechnet werden muss Allerdings ist deren Ausma in den ersten Lagerungstagen als gering zu beurteilen was sich mit den oben beschriebenen
182. des Zusatzes von Equex STM zu Verd nnern f r die Fl ssigkonservierung ist in der Literatur nur eine Arbeit zu finden Nizanski et al 2009 In dieser wurde die Verwendung von Equex STM Minit b GmbH Tiefenbach Germany in einem TRIS Eigelb Verd nner zur Fl ssigkonservierung von caninem Sperma bei 5 C getestet Dabei konnte gezeigt werden dass der Zusatz von Equex STM die Lebensdauer der Spermien bei Inkubation bei 5 C verk rzt Der zugrunde liegende Mechanismus ist eine initiale Aktivierung gefolgt von einem schnellen Abfall der Motilit t Nizanski et al 2009 CASA Messungen zeigen deutlich dass der Zusatz von Equex STM die Spermienmotilitatsparameter in einer hnlichen Weise ver ndert wie sie bei der Hyperaktivierung von Samenzellen gesehen werden kann welche mit dem Kapazitationsprozess der im weiblichen Eileiter induziert wird assoziiert ist Die Hyperaktivierung wird als kr ftige nicht progressive nicht lineare Spermienbewegung verbunden mit der Kapazitation beschrieben Es ist wahrscheinlich dass aus der in vitro Hyperaktivierung eine Ersch pfung der Energiereserven eine Akkumulation von 61 Literatur Metaboliten im Verd nner und schlie lich der Zelltod resultiert Nizanski et al 2009 2 5 3 Einzelne Verd nner Es wurden bereits viele verschiedene Verd nner f r die Fl ssigkonservierung von caninem Sperma getestet Concannon und Battista 1989 Linde Forsberg 1991 Pena et al 2006 Dabei sind d
183. die Glycerol enthalten etwas geringer W hrend kurzer Lagerungsperioden f hren bis zu 8 Glycerolzusatz zu 57 Literatur einem Eigelb Zitrat Glycin Verd nner allerdings nur zu einer leichten Reduktion der Motilit t Foote und Leonard 1964 Dennoch sprechen sich Province et al 1984 gegen die Verwendung von Glycerol zur Fl ssigkonservierung von Hundesperma aus da der Zusatz von Glycerol keinen vorteilhaften Effekt auf die Motilit t aus bt Neben Glycerol werden in der Literatur weitere Gefrierschutzsubstanzen wie DMSO Rohloff et al 1978 Ethylenglycol Martins Bessa et al 2006 Rota et al 2006 2010 und Methylformamid bzw Dimethylformamid Lopes et al 2009b Futino et al 2010 zur Kryokonservierung von Rudensperma beschrieben Da diese im Versuchsaufbau der vorliegenden Arbeit nicht von Bedeutung sind soll hier nicht weiter auf ihre Eignung eingegangen werden 2 5 2 5 Antibiotika Die Vermehrung von Bakterien ist im Verlauf der Konservierung ein zu beachtender Faktor weshalb der Zusatz von Antibiotika zum Verd nner unerl sslich erscheint Dieser Zusatz kann die Konservierung zweifellos noch verbessern Brochart und Coulomb 1952 und ist insbesondere bei der Fl ssigkonservierung Hoffmann 2003d bzw bei der Verwendung von eigelbhaltigen Verd nnern angebracht da Eigelb das bakterielle Wachstum beg nstigt Linde Forsberg 1995 Bei der Langzeitkonservierung bei der mit der Vermehrung eventuell im Ejaku
184. die Mittelwerte in den mit TE verd nnten Proben stets h her als in den mit Up1 2 verd nnten Proben Zwischen den mit TE und den mit Up 1 verd nnten Ejakulaten konnte weder ein signifikanter Niveauunterschied noch ein signifikanter Unterschied im Zeitverlauf nachgewiesen werden Tab A10 A14 Kap 9 8 4 3 3 Einfluss der Verd nner auf den Anteil an morphologisch ver nderten Samenzellen im Zeitverlauf Abb 18 zeigt den mittleren prozentualen Anteil an morphologisch ver nderten Samenzellen im Eosinausstrich in den mit den verschiedenen Verd nnern aufgearbeiteten Ejakulaten bei Fl ssigkonservierung bei 4 C f r zehn Tage Es ist ersichtlich dass sich die Verlaufe der mit den verschiedenen Verd nnern aufgearbeiteten Ejakulate zu Beginn des Untersuchungszeitraumes bis Tag 3 starker unterschieden als Uber den restlichen Untersuchungszeitraum Ab Tag 3 zeigten die mit CP TE und Up 1 verd nnten Ejakulate sehr hnliche Verlaufe w hrend sich im Vergleich dazu in den mit Up1 2 verd nnten Ejakulaten im Mittel stets leicht niedrigere Anteile an morphologisch ver nderten Samenzellen feststellen lie en Insgesamt stieg der Anteil an morphologisch ver nderten Samenzellen w hrend der Fl ssigkonservierung bei 4 C ber zehn Tage in allen verd nnten Ejakulaten leicht an Der geringste Anstieg war dabei in den mit Up 1 aufgearbeiteten Proben zu erkennen wobei hier allerdings der Ausgangswert an Tag O unmittelbar nach dem Verd nnen h her lag al
185. difizierter Mittelwert mit negativem und positivem Fehlerbalken modifizierter 1 s Bereich CP Verd nner CaniPRO Chill 10 TE TRIS Fruktose Eigelb Verdunner Up 1 2 Uppsala Equex 2 System Verd nner 1 und Verd nner 2 Up 1 Uppsala Equex 2 System nur Verd nner 1 n Probenanzahl In allen verd nnten Ejakulaten kam es im Zeitverlauf der Flussigkonservierung zu einer signifikanten Abnahme des Anteils lebender Samenzellen im Eosinausstrich jeweils mit Pzeit lt 0 0001 Die mit CP verdunnten Ejakulate zeigten Uber den Untersuchungszeitraum bez glich des Anteils lebender Samenzellen keinen signifikanten Niveauunterschied zu den mit TE oder Up1 2 verd nnten Ejakulaten und auch der Zeitverlauf der mit CP verd nnten Ejakulate unterschied sich nicht signifikant von dem der mit den brigen Verd nnern verd nnten Ejakulate Lediglich zwischen den mit CP und den mit Up 1 verd nnten Ejakulaten konnte bez glich des Anteils an lebenden Samenzellen ein signifikanter Niveauunterschied ermittelt werden Pvera 0 019 wobei die durchschnittlichen Werte in den mit CP verd nnten Proben stets niedriger waren als in den mit Up 1 verd nnten Proben Auch f r die mit TE aufgearbeiteten Ejakulate lie sich kein signifikanter Niveauunterschied zu den mit Up 1 2 aufgearbeiteten Ejakulaten nachweisen wobei sich jedoch die Zeitverl ufe der beiden Verd nner signifikant unterschieden pw 0 045 Dabei war die Abnahme des Anteils lebender 137
186. din m glich G nzel 1986 was durch Hund Nr 3 best tigt werden konnte Da es sich bei diesem Hund jedoch um einen erfahrenen Zuchtr den handelte bleibt offen inwieweit die Spermagewinnung bei einem 160 Diskussion unerfahrenen R den ohne die Anwesenheit einer H ndin erfolgreich durchgef hrt werden kann 5 2 3 Verwendete spermatologische Untersuchungsmethoden Die Ejakulate wurden sowohl nach den Methoden der klassischen Spermatologie als auch mittels CASA System SpermVision der Minit b GmbH Tiefenbach untersucht 5 2 3 1 Klassische Spermatologie Die Methodik der einzelnen Untersuchungen stimmte mit den in der Literatur f r die Standardspermatologie beschriebenen Untersuchungsmethoden berein G nzel 1986 Johnston 1991 Freshman 2002 Hoffmann 2003b Die Beurteilung der Motilitat in den Nativejakulaten erfolgte wie von Johnston 1991 und Freshman 2002 empfohlen sofort im Anschluss an die Spermagewinnung um einer zeitverz gerungsbedingten Abnahme der Motilitat und damit einer Verfalschung der Ausgangswerte vorzubeugen Das fl ssigkonservierte Sperma wurde wie von Linde Forsberg 1991 empfohlen vor der Untersuchung immer auf 37 C angew rmt Dies geschah vor dem Hintergrund dass die K rpertemperatur der H ndin und somit auch die Temperatur im Uterus etwa 38 C betr gt Iguer Ouada und Verstegen 2001a und zudem bekannt ist dass Untersuchungen bei 30 C signifikant niedrigere Motilit tswerte
187. dinavische Methode bezeichnet Thomassen et al 2001 wurde urspr nglich f r die Besamung des Blaufuchses entwickelt Fougner et al 1973 und beim Hund erstmals von Andersen 1975 beschrieben Der Metallkatheter Norwegischer Katheter Andersen 1975 welcher in drei Gr en L ngen von 20 bis 50 cm verf gbar ist Linde Forsberg 1991 wird an der stehenden H ndin unter manueller Kontrolle durch das externe Ostium zur Samendeponierung in den Uterusk rper vorgeschoben Andersen 1975 G nzel 1986 Linde Forsberg 1991 Das Hochhalten des Hinterteils der H ndin ist auch hier im Anschluss blich Linde Forsberg 1991 Mit einiger bung kann diese Technik bei den meisten H ndinnen schnell einfach und ohne Sedation durchgef hrt werden Linde Forsberg et al 1999 Thomassen und Farstad 2009 Bei nerv sen oder adip sen Tieren ist diese Methode allerdings unpraktisch da die Manipulation der Zervix durch das Abdomen schwierig oder gar unm glich sein kann Silva et al 1995 Bei der transzervikalen intrauterinen endoskopischen Besamung welche auch als Neuseel ndische endoskopische Methode bezeichnet wird Wilson 2001 handelt es sich um eine Weiterentwicklung der vorgenannten Methode durch Wilson 1993 Die Ausr stung besteht aus einem starren Zystourethroskop mit einer 30 Winkeloptik einem Adapter mit Arbeitskanal durch welchen der Katheter gef hrt wird einer Kaltlichtquelle und optional einem Monitor F r das
188. duelles gefrorenes Ejakulat eine akzeptable Fertilit t aufweist Eilts 2005a Dennoch kann eine Samenuntersuchung nicht die Potentia generandi garantieren sondern lediglich infertile Tiere und solche mit herabgesetzter Fertilit t identifizieren um sie von der Nutzung zur Spermagewinnung oder zur Zucht auszuschlie en Amann und Hammerstedt 1993 Riesenbeck et al 2001 Die Best tigung der Fertilit t kann nur durch einen Nachweis der Konzeption oder durch einen eingetretenen Zuchterfolg erbracht werden Riesenbeck et al 2001 Nach Amann und Hammerstedt 1993 ist die Fertilitat von Sperma sehr hoher oder sehr niedriger Qualit t relativ voraussagbar wohingegen es bei Sperma mittlerer Qualit t schwieriger ist da es keine einzelnen Spermieneigenschaften gibt die hoch und pr zise mit der Fertilitat in vivo korreliert sind Erschwerend ist dass jede 15 Literatur Spermaprobe zudem eine heterogene Population an Samenzellen Subpopulationen enth lt die nicht dasselbe Befruchtungspotenzial besitzen Traditionelle Ann herungen an die Untersuchung der Spermaqualit t ignorieren diese Heterogenit t und betrachten eher den Mittelwert eines jeden Merkmals Amann und Hammerstedt 1993 Hinzu kommt dass basierend auf einer gro en Anzahl von Verpaarungen eine schlechte Spermaqualitat zwar die durchschnittlichen Tr chtigkeitsraten und die durchschnittliche Anzahl an Welpen beeinflusst aber auf individueller Ebene dennoch zu Tr chti
189. duzierte berlebensdauer und Gefriertoleranz kontrovers diskutiert Andersen 1980 Sirivaidyapong et al 2001 Rijsselaere et al 2002a Pena et al 2006 Koderle et al 2009 Strzezek und Fraser 2009 Die Gegner der Prostatabeimengungen postulieren verschiedene Zentrifugationsprotokolle zur Entfernung des Prostatasekrets Rota et al 1995 Linde Forsberg 2001 Sirivaidyapong et al 2001 Rijsselaere et al 2002a Ponglowhapan et al 2004 Hermansson und Linde Forsberg 2006 G nzel Apel 2007 Shahiduzzaman und Linde Forsberg 2007 Beccaglia et al 2009a Lopes et al 2009a Nizanski et al 2009 Michael et al 2010 Shah et al 2010 Ein Nachteil des Zentrifugierens von verd nntem Sperma ist dass ein Teil der Samenzellen im berstand verloren geht wenn relativ niedrige Zentrifugationsgeschwindigkeiten von 180xg oder 720xg verwendet werden Rijsselaere et al 2002a Tendenziell nimmt der Anteil an verlorenen Spermien mit steigender Zentrifugationsgeschwindigkeit und steigender initialer Spermienkonzentration ab jedoch f hren zu hohe Geschwindigkeiten wie 1620 xg und 2880xg zu einer Sch digung der Spermienmembran sodass ein Zentrifugationsprotokoll von f nf Minuten bei 720xg als optimal angesehen wird Rijsselaere et al 2002a Obwohl nach G nzel 1986 und Rijsselaere et al 20022 die Zentrifugation weder auf die Gesamtmotilitat und die Vorw rtsbeweglichkeit noch auf die akrosomale Integrit t einen nachteiligen Ein
190. e Anzahl an fluoreszenzmarkierten Spermien mittels Durchflusszytometrie zu analysieren ist als gr ter Vorteil der Fluoreszenzf rbetechniken anzusehen Pe a et al 1998b Waberski et al 1999 Rijsselaere et al 2005 Ein weiterer Vorteil besteht darin dass fluorenzenzgef rbte Spermien auf ihre funktionellen und morphologischen Aspekte hin untersucht werden k nnen ohne dass es zu einer Interferenz mit extrazellul ren Medien kommt was insbesondere bei konserviertem Sperma von Bedeutung ist Pena Martinez 2004 Garner und Johnson 1995 konnten mittels SYBR 14 PI F rbung folgende drei Spermienpopulationen beobachten lebende Spermien SYBR 14 gef rbt tote Spermien Pl gef rbt und moribunde Spermien doppelt gef rbt da die Membranintegritat schwindet Beim Vergleich der Ergebnisse der Fluoreszenzf rbung mit SYBR 14 und PI mit den Ergebnissen einer konventionellen Eosin Nigrosin F rbung stellte die Fluoreszenzf rbung die sensitivere Methode dar da auch kleinste durch die Zentrifugation verursachte Membransch den erkannt werden konnten welche bei der Eosin Nigrosin F rbung nicht gefunden wurden Rijsselaere et al 2002a 2 4 Spermakonservierung Bei der Spermakonservierung unterscheidet man die Fl ssigkonservierung f r eine kurzzeitige Lagerung durch Verd nnung und K hlung auf 5 C und die Kryokonservierung welche eine zeitlich unbegrenzte Konservierung bei 196 C in fl ssigem Stickstoff erm glicht G nzel
191. e Beobachtung spricht die Tatsache dass es in den mit Up1 2 aufgearbeiteten Ejakulaten nicht zu einem Anstieg des Anteils an Samenzellen mit schleifenf rmigem Schwanz kam Zudem spiegelte sich die Zunahme des Anteils an schleifenf rmigen Schw nzen auch im Gesamtanteil an morphologisch ver nderten Samenzellen nicht wider weshalb von einer untergeordneten Bedeutung auszugehen ist Auf Basis des Gesamtanteils an morphologisch ver nderten Samenzellen kann in jedem Fall best tigt werden dass die Zugabe eines Verd nners keine signifikanten ultrastrukturellen Ver nderungen der Samenzellen verursacht Burgess et al 2001 Eine m gliche Beeinflussung der Spermienmorphologie durch die Zentrifugation WHO 2010 konnte in der vorliegenden Arbeit nicht nachgewiesen werden da sich der Anteil an morphologisch ver nderten Samenzellen in zentrifugierten Proben nicht signifikant von dem in unzentrifugierten Proben unterschied 5 3 2 5 Akrosomale Ver nderungen Vor der Gamenteninteraktion m ssen die Samenzellen im weiblichen Reproduktionstrakt die Kapazitation welche hyperaktive Motilit t und die AR einschlie t durchlaufen De los Reyes et al 2009 Das Akrosom ist ein sekretorisches Vesikel das etwa zwei Drittel der nukle ren Oberfl che bedeckt 189 Diskussion und zahlreiche Enzyme enthalt die dazu dienen der Samenzelle die Penetration der ZP der Eizelle zu erm glichen Die Sekretion dieser Enzyme aus dem Akrosom wird als AR be
192. e Spermienerkennung zu maximieren 165 Diskussion Tab 26 Vergleichende Darstellung der sonstigen verwendeten technischen Einstellungen mit den von Sch fer Somi und Aurich 2007 genutzten Einstellungen Abk rzungen siehe Abk rzungsverzeichnis Parameter verwendete Einstellung Sch fer Somi und Aurich 2007 Lichteinstellung bei 80 110 96 104 Motilit tsanalyse Volumen pro 2 5 ul 3 0 ul Messkammer Analysetemperatur 37 C 37 C Framerate Bildfrequenz 60 Frames s 60 Frames s Volumen von SYBR 14 PI 2 5 Ul 3 0 ul pro Tube 10 ul Sperma 100 ul Sperma Inkubationszeit 10 Minuten 10 Minuten Wie aus Tab 26 ersichtlich wurde in der vorliegenden Arbeit bereinstimmend mit Sch fer Somi und Aurich 2007 mit einer Framerate von 60 Frames s gearbeitet was ebenso den Empfehlungen anderer Autoren entsprach Iguer Ouada und Verstegen 2001a Rijsselaere et al 2003 Amann und Katz 2004 Die Framerate ist f r die genaue Identifizierung und Rekonstruierung der Bewegungsbahnen der einzelnen Samenzellen von Bedeutung und beeinflusst daher die verschiedenen Motilitatsparameter Verstegen et al 2002 Rijsselaere et al 2003 2005 Sch fer Somi und Aurich 2007 Neben den technischen Einstellungen sind auch die verwendeten Messkammern und insbesondere deren Tiefe von Bedeutung da durch sie die Motilitat der Samenzellen beeinflusst wird Verstegen et al 2002 In bereinstimmung mit Rijssel
193. e nicht mehr best tigt werden kann Ob jedoch das Glycerol urs chlich f r die Motilit tsreduktion war bleibt offen zumal die subjektiv und die mittels CASA bestimmten Werte z T kontr re Ergebnisse lieferten 185 Diskussion 5 3 2 3 Viabilitat Unmittelbar nach der Aufarbeitung mit den verschiedenen Verdunnern zeigten weder die im Eosinausstrich bestimmte Viabilitat noch die mittels CASA nach SYBR 14 Pl F rbung gemessene Viabilit t signifikante Ver nderungen im Vergleich zum Nativsperma und auch zwischen den verschiedenen Verd nnern untereinander konnten bez glich beider Parameter keine signifikanten Unterschiede ermittelt werden Die im Eosinausstrich bestimmten Werte blieben in den Verd nnern CP TE und Up 1 2 relativ konstant w hrend sich im Verd nner Up 1 tendenziell sogar durchschnittlich mehr lebende Samenzellen nachweisen lie en als in den Nativejakulaten Bei Bestimmung der Viabilit t mittels CASA zeigte sich im Verd nner Up1 2 unmittelbar nach dem Verd nnen eine tendenzielle Reduktion und in den Verd nnern CP TE und Up1 tendenzielle Zunahmen gegen ber dem Nativsperma Diese Ergebnisse best tigen die Aussagen von Burgess et al 2001 nach denen die Zugabe des Verd nners glycerolhaltiger TRIS Fruktose Eigelb Verd nner und die K hlung keine signifikanten unmittelbaren Effekte auf den nach Nigrosin Eosin F rbung ermittelten Prozentsatz an lebenden Samenzellen aus ben Auch die Inkubation von verd nntem S
194. e on viability of frozen thawed dog spermatozoa during in vitro incubation at 38 C Theriogenology 47 5 1093 1101 Rota A Iguer Ouada M Verstegen J Linde Forsberg C 1999a Fertility after vaginal or uterine deposition of dog semen frozen in a tris extender with or without Equex STM paste Theriogenology 51 6 1045 1058 Rota A Pe a A l Linde Forsberg C Rodriguez Martinez H 1999b In vitro capacitation of fresh chilled and frozen thawed dog spermatozoa assessed by the chloretetracycline assay and changes in motility patterns Anim Reprod Sci 57 3 4 199 215 Rota A Frishling A Vannozzi l Camillo F Romagnoli S 2001 Effect of the inclusion of skimmed milk in freezing extenders on the viability of canine spermatozoa after thawing J Reprod Fertil 57 Suppl 377 381 Rota A Milani C Cabianca G Martini M 2006 Comparison between glycerol and ethylene glycol for dog semen cryopreservation Theriogenology 65 9 1848 1858 Rota A Milani C Romagnoli S Zucchini P Mollo A 2010 Pregnancy and conception rate after two intravaginal inseminations with dog semen frozen either with 5 glycerol or 5 ethylene glycol Anim Reprod Sci 118 1 94 97 Schafer S Holzmann A Arbeiter K 1997 Untersuchungen zur Transmigrationsrate von kurzzeitkonserviertem Hundesperma Reprod Dom Anim 32 6 285 289 Schafer Somi S 2009 Use of chilled semen in dogs Reprod
195. edoch h her als die durch CASA gemessenen Dichten 4 4 2 Zusammenhang zwischen der subjektiv gesch tzten und der mittels CASA gemessenen Vorw rtsbeweglichkeit Die Vorw rtsbeweglichkeit der Samenzellen wurde in den einzelnen verd nnten Ejakulaten zu jedem Untersuchungstermin unter dem Phasenkontrastmikroskop subjektiv gesch tzt und daneben mittels CASA gemessen 4 4 2 1 Korrelationen nach Verd nnern getrennt Die Ergebnisse der Korrelationsanalysen zur Untersuchung des Zusammenhanges zwischen der subjektiv gesch tzten und der mittels CASA bestimmten Vorw rtsbeweglichkeit sind in Tab 21 dargestellt Tab 21 Korrelationen zwischen subjektiv gesch tzter und mittels CASA SpermVision System gemessener Vorw rtsbeweglichkeit in den Nativejakulaten und in den mit den verschiedenen Verd nnern aufgearbeiteten Ejakulaten n Anzahl der getesteten zeitgleichen Variablenpaare r Korrelationskoeffizient nach Pearson p p Wert Verd nner n r p keiner Nativsperma 30 0 564 0 001 CP 210 0 862 lt 0 001 TE 210 0 860 lt 0 001 Up1 2 84 0 946 lt 0 001 Up 1 126 0 871 lt 0 001 Es lie en sich sowohl in den Nativejakulaten als auch in den mit den verschiedenen Verd nnern aufgearbeiteten Ejakulaten statistisch signifikante Zusammenh nge zwischen der subjektiv gesch tzten und der mittels CASA bestimmten Vorw rtsbeweglichkeit nachweisen 149 Ergebnisse 4 4 2 2 Korrelation ohne Tre
196. edoch werden durch Supravitalf rbung und HOS Test verschiedene Aspekte des Verhaltens der Spermienmembran erfasst Erstere misst ob die Membran physikalisch gesch digt ist was ein Zeichen f r Zelltod darstellt Durch letzteren wird bestimmt ob eine intakte Membran biochemisch aktiv ist Verschiedene Vorg nge w hrend der Befruchtung wie z B Kapazitation AR und Gamentenfusion setzen eine aktive Spermienmembran voraus sodass die Befruchtung nicht stattfinden kann wenn die Membran zwar physikalisch intakt aber biochemisch inaktiv ist Deshalb liefert der HOS Test aussagekr ftigere Ergebnisse als die Supravitalf rbung Correa und Zavos 1994 Kumi Diaka und Badtram 1994 Weiterhin ist der HOS 162 Diskussion Test simpel konomisch klinisch leicht anwendbar und schnell durchzuf hren weshalb er eine n tzliche Erg nzung zur Standardspermauntersuchung darstellt Jeyendran et al 1992 Pinto und Kozink 2008 und daher auch in der vorliegenden Studie eingesetzt wurde Die klassische Spermatologie gestattet eine relativ schnelle Beurteilung der Spermaqualit t und ist f r den Praxisalltag gut geeignet da sie mit einfacher Laborausstattung durchgef hrt werden kann Allerdings ist die konventionelle mikroskopische Untersuchung insbesondere bei der Beurteilung der Motilitat und der Pathomorphologie sehr subjektiv Amann 1989 und wird stark von der Erfahrung des Untersuchers beeinflusst Verstegen et al 2002 Um diese Subj
197. eeeeeeeeees 161 5 2 3 2 Computer assisted sperm analysis CASA 163 5 2 3 2 1 Konzentrationsbestimmung r 168 5 2 3 2 2 Motilit tsanalyse uuuuuuun 222 168 5 2 3 2 3 Viabilit tsanalyse aussen eete 169 92 4 EAV Ro VIa ale eE ee aa erate eae 170 9 2 2 1 Inhaltssl lle ans tsa Sapte A ola hte eee eRe 171 5 2 4 2 Unterschiede bez glich der Aufarbeitung 174 5 3 Diskussion der Ergebnisse 32 ahve na 176 9 3 1 Nativejakul lfer uses ee 176 5 3 1 1 Klassische Spermatologie 444444444nHnnennnn nenne 176 9 3 F2 CASA Sr sense 176 5 3 2 Ergebnisse der weiterverarbeiteten Ejakulate unmittelbar nach dem Verd nnen an Tag unemesnsnsananaeseeeeensnnannnnnnennnennnnsnn 179 9 32 11 Diehlen au ansehen 179 9 3 2 2 M tilital ex as 180 93 23 Viabilllal seen ee 186 5 3 2 4 Pathomorphologie r een 187 5 3 2 5 Akrosomale Ver nderungen 224444 44m444H HH 189 5 3 2 6 Funktionelle Integrit t der Plasmamembran 192 5 3 3 Ergebnisse der Halteproben im Zeitverlauf 0 193 5 3 3 1 Motilitat etek colic sera 194 5 332 Viabilitat norne ee e rE OR E 202 5 3 3 3 PALMOMONDNOlOGIG ich 2 22 te 204 5 3 3 4 Akrosomale Veranderungen cccccccceeeeeeeenteteeeeeeeeeeeees 208 5 3 4 Korrelationen der untersuchten Parameter 211 9 3421 DiC Me Maree a ea 211
198. ef rbte Spermien waren demnach zum Zeitpunkt der F rbung tot Hoffmann 2003b Insgesamt wurden pro Ejakulat je 200 Spermien bei 400 facher Vergr erung mit negativem Phasenkontrast ausgez hlt Die ungef rbten Samenzellen wei e K pfe wurden als lebend die gef rbten rote K pfe als tot bewertet 79 Material und Methoden c Pathomorphologie Die Beurteilung der morphologisch ver nderten Samenzellen erfolgte an demselben Eosinausstrich Hierzu wurden ebenfalls 200 Spermien bei 400 facher Vergr erung und negativem Phasenkontrast ausgez hlt Es spielte dabei keine Rolle ob die ausgez hlten Spermien lebend oder tot waren Die morphologischen Ver nderungen wurden aufgegliedert in prim re Ver nderungen Kopfkappen Kopf Hals und Schwanzver nderungen sekundare tertiare Ver nderungen und Plasmatropfen Tab 6 und als prozentuder Anteil an der Gesamtspermienpopulation angegeben Waren an einer Samenzelle mehrere morphologische Abweichungen zu erkennen so wurde nur die Schwerwiegendste unter ihnen beachtet Tab 6 Einteilung der morphologischen Ver nderungen nach Hoffmann 2003c modifiziert l d R prim re Ver nderungen 1 Kopfkappenver nderungen abgel st schief sonstiges 2 Kopfver nderungen schmal lanzenf rmig Zwergk pfe Riesenk pfe sonstiges z B Doppelkopf 3 Halsver nderungen abaxialer Schwanzansatz paraaxialer Schwanzansatz retroaxialer Schwanzansatz sonst
199. egen 2001c Amann und Katz 2004 Entscheidender Nachteil der CASA Systeme sind die hohen Anschaffungskosten Verstegen et al 2002 Weitere nachteilige Auswirkungen sind dass die Untersucher dazu neigen die lebenden Spermien w hrend der klinischen Untersuchung nicht kritisch zu betrachten und die vorbehaltslose Akzeptanz dass CASA einen Golden Standard der Spermienbewegung darstellt Amann und Katz 2004 Das CASA System SpermVision Minit b Germany ist im Vergleich zu anderen CASA Systemen in der Lage zus tzlich zu den Motilitatsparametern die Zellmembranintegrit t objektiv zu beurteilen Sch fer Somi und Aurich 2007 Zudem konnte w hrend der Evaluation dieses CASA Systems bei standardisierten Bedingungen eine hohe Genauigkeit und Wiederholbarkeit f r fast alle untersuchten Parameter erzielt werden Sch fer Somi und Aurich 2007 2 3 3 1 Konzentrationsbestimmung Die exakte Bestimmung der Spermienkonzentration mithilfe von CASA Systemen stellt sich bei allen Spezies bei denen dieser Parameter untersucht wurde als problematisch dar Meist wird die Spermienkonzentration bersch tzt Eine m gliche Erkl rung hierf r ist das Ph nomen der Kollision von Samenzellen mit nachfolgender mehrfacher Z hlung derselben individuellen Zellen Die bersch tzung der Spermienkonzentration nimmt mit steigender Verd nnung zu Iguer Ouada und Verstegen 2001a Abweichungen zwischen den durch konventionelle Z hlkammern und den mi
200. eidolph Instruments GmbH amp Co KG Typ MR 2000 Memmert GmbH amp Co KG Memmert GmbH amp Co KG Typ WNB 45 Helmut Hund GmbH Typ HT 200 Minit b GmbH Typ HT 200 beheizte Arbeitsplatte und Mikroskopiertisch Heraeus Christ Labofuge Miele amp Cie KG Typ KD 14505 Bauknecht Hausger te GmbH Typ Bauknecht Schott North America Inc Minit b GmbH Erythrozytenmischpipette nach Thoma MAGV GmbH Neubauer Z hlkammer Heinz Herenz Medizinalbedarf GmbH Deckgl ser optisch plan geschliffen f r Hamozytometer 20 x 26 mm Gerhard Menzel Glasbearbeitungswerk GmbH amp Co KG Menzel Gl ser Zentrifugenr hrchen Pipetten Mikroskope Z hlger t SpermVision Schott North America Inc Eppendorf AG Eppendorf Pipette 20 ul Eppendorf AG Eppendorf Pipette 100 ul Eppendorf AG Eppendorf Pipette 1000 ul Rainin Instrument LLC Pipet Lite LTS 0 5 10 ul Leica Microsystems GmbH Leica CM E Helmut Hund GmbH hund H 500 Phasenkontrastmikroskop mit Heiztisch Karl Hecht GmbH amp Co KG Assistent Counter 345 15 Typ AC 15 PC Mikroskop Olympus Deutschland GmbH Standard Labormikroskop BX 41 Hochgeschwindigkeits schwarz wei Digitalkamera Farbbildkamera 250 Anhang Rechner Pentium 4D Dual Core Computer mit 3 0 GHz Prozessor und Betriebssystem Microsoft Windows XP Professional Vista comp Grafikkarte 19 TFT Monitor SpermVision
201. eil an Spermien mit Plasmatropfen f lschlicherweise untersch tzt wird hnliche Beobachtungen konnten auch von Root Kustritz et al 1998 gemacht werden Nach deren Meinung k nnen offensichtlich erkennbare Abnahmen bestimmter morphologischer Ver nderungen entweder durch eine Maskierung oder durch eine Entfernung des Defektes durch 188 Diskussion die entsprechende Technik verursacht werden Jedoch k nnen offensichtlich erkennbare Zunahmen bestimmter Ver nderungen auch entweder durch eine Betonung oder durch eine Erzeugung des Defektes durch die entsprechende Methode bedingt sein Root Kustritz et al 1998 Die in den mit CP TE und Up 1 aufgearbeiteten Ejakulaten im Vergleich zum Nativsperma beobachtete Zunahme des Anteils an Samenzellen mit schleifenformigem Schwanz k nnte einerseits eventuell ein Hinweis darauf sein dass es durch die Verd nnerzugabe bevorzugt zu eben diesen Ver nderungen an den Samenzellen kommt andererseits jedoch auch eine zuf llige Beobachtung sein M glicherweise verursacht die Zugabe des Verd nners eine Zunahme des Anteils an Samenzellen mit schleifenf rmigem Schwanz indem sie hnliche Reaktionen der Samenzellen ausl st wie sie auch beim HOS Test gesehen werden k nnen Dies w rde bedeuten dass die entsprechenden Verd nner nicht isoton zum Seminalplasma waren Da die Osmolaritat der Verd nner in der vorliegenden Arbeit jedoch nicht bestimmt wurde bleibt Letzteres ungeklart Fur eine zuf llig
202. einen Populationen England und Millar 2008 Steigerung und Ausweitung der Zuchtnutzung bew hrt wertvoller Vatertiere Harrop 1956 Seager und Platz 1977a Christiansen 1984a Kombination mit der Spermakonservierung ergeben sich weitere Vorteile durch Kryokonservierung die M glichkeit zur Konservierung und Lagerung wertvoller Gene m nnlicher Tiere f r nahezu unendliche Zeit England und Millar 2008 M glichkeit zur Zuchtnutzung eines R den ber dessen Tod hinaus Christiansen 1984a Kutzler 2005 England und Millar 2008 Literatur M glichkeit zum Transport von Sperma sodass genetisches Material auch au erhalb einer Zuchtkolonie verf gbar ist England und Millar 2008 bzw sodass geographische Barrieren kein Hindernis mehr darstellen Harrop 1956 Kibble 1969 G nzel 1986 Pinto et al 1999 M glichkeit zur berwindung von Quarant nerestriktionen Christiansen 1984a Linde Forsberg und Forsberg 1989 England und Millar 2008 der Transport von Tieren wird unn tig wodurch Transportstress Krankheitsrisiken Linde Forsberg und Forsberg 1989 Silva et al 1996 England und Millar 2008 und Transportkosten Seager und Platz 1977a Kutzler 2005 reduziert bzw eliminiert werden Etablierung von Samenbanken die einen genetischen Pool anbieten der f r geographisch isolierte kleine Populationen von Hunden genutzt werden kann um Inzucht zu vermeiden und der bei der Eliminierung von Erbkrankheiten hil
203. eiteren Zeitverlauf war auch in den mit Up 1 verd nnten Proben ein deutlicher Motilit tsabfall zu erkennen welcher zur Folge hatte dass an Tag 10 nur noch eine CASA Gesamtmotilitat von durchschnittlich 24 2 11 5 gemessen werden konnte Im Vergleich dazu war die Abnahme der CASA Gesamtmotilitat in den mit CP und TE verdunnten Proben nur gering Hier war an Tag 10 noch eine CASA Gesamtmotilitat von 59 1 21 7 CP bzw 54 5 22 1 TE vorhanden 90 0 80 0 70 0 0 CP n 30 TE n 30 k Up 1 2 n 12 lt Up 1 n 18 CASA Gesamtmotilitat in A oO oO Abb 14 Ver nderungen der Mittelwerte SD des Prozentsatzes an motilen Samenzellen mittels Computer assisted sperm analysis CASA SpermVision System gemessene Gesamtmotilitat in den verschiedenen Verd nnern im Zeitverlauf der Fl ssigkonservierung bei 4 C ber zehn Tage CP Verd nner CaniPRO Chill 10 TE TRIS Fruktose Eigelb Verdunner Up1 2 Uppsala Equex 2 System Verdunner 1 und Verdunner 2 Up 1 Uppsala Equex 2 System nur Verdunner 1 n Probenanzahl 126 Ergebnisse In allen verd nnten Ejakulaten kam es im Zeitverlauf der Fl ssigkonservierung zu einer signifikanten Abnahme der durchschnittlichen mittels CASA bestimmten Gesamtmotilitat jeweils mit Pzeit lt 0 0001 Die mit CP verd nnten Ejakulate zeigten uber den Untersuchungszeitraum bezuglich der CASA Gesamtmotilitat keinen signifikanten Niveauunterschied zu den mi
204. ekt auf die Motilitat aus bt und in h heren Konzentrationen 6 sogar zu einer Reduktion der Motilit t von fl ssigkonservierten Hundespermien f hrt Province et al 1984 Diese in der Literatur gefundene Aussage konnte in der vorliegenden Arbeit durch die beim Uppsala Equex 2 System Verd nner erfolgte Aufteilung in die Versuchsteile und Il gut verifiziert werden siehe Kap 5 3 2 2 und Kap 5 3 3 1 Weiterhin unterschieden sich die drei untersuchten Verd nner bez glich des Antibiotikazusatzes Im Verd nner CP war Gentamicin enthalten w hrend bei der Herstellung des Verd nners TE und des Uppsala Equex 2 System Verd nners abweichend vom Rezept bewusst auf den Zusatz von Penicillin und Streptomycin verzichtet wurde Obwohl nach Hoffmann 2003d bei der Fl ssigkonservierung der Zusatz von Antibiotika generell angebracht erscheint und auch nach Linde Forsberg 1995 insbesondere bei der Verwendung von eigelbhaltigen Verd nnern Antibiotika zugesetzt werden sollten da Eigelb das bakterielle Wachstum beg nstigt wurden in der vorliegenden Arbeit bei den selbst hergestellten Verd nnern keine Antibiotikazus tze verwendet Es sollte gezeigt werden dass auch ohne den Einsatz von Antibiotika eine angemessene Spermaqualit t ber einen l ngeren Zeitraum aufrecht erhalten werden kann Dies entspricht dem derzeitigen Bestreben in der Veterin rmedizin den Einsatz von Antibiotika auf das notwendige Minimum zu beschr nken Allerdings wurden kei
205. ektiv gesch tzte Vorw rtsbeweglichkeit r 0 501 p lt 0 001 und die CASA Vorw rtsbeweglichkeit r 0 538 p lt 0 001 als auch f r den Anteil an lebenden Samenzellen im Eosinausstrich r 0 672 p lt 0 001 und die CASA Viabilit t r 0 535 p lt 0 001 konnten signifikante negative Korrelationen mit dem Anteil an morphologisch ver nderten Samenzellen nachgewiesen werden Die negative Korrelation zwischen der CASA Vorw rtsbeweglichkeit und dem Anteil an morphologisch ver nderten Samenzellen war vergleichbar mit der von Ellington et al 1993 ermittelten signifikanten positiven Korrelation zwischen dem Prozentsatz an vorw rtsbeweglichen Samenzellen CASA und dem Prozentsatz an Samenzellen mit normaler Morphologie Wright Giemsa F rbung Hingegen ist nach Kumi Diaka 1993 die subjektiv gesch tzte Motilit t weder mit dem Anteil an Mittelst ckver nderungen der Samenzellen noch mit dem Anteil an Schwanzver nderungen signifikant korreliert Weiterhin waren subjektiv gesch tzte Vorw rtsbeweglichkeit r 0 525 p lt 0 001 die CASA Gesamtmotilitat r 0 523 p lt 0 001 sowie die CASA Vorw rtsbeweglichkeit r 0 552 p lt 0 001 negativ korreliert mit dem Anteil an Samenzellen mit nicht aufgerollter Gei el im HOS Test Dieser Zusammenhang erscheint plausibel da die Motilit t teils von Transportmechanismen der Membran und somit von der Integrit t der Plasmamembran und teils von anderen biochemischen Aktivit ten des Spermienme
206. ektivit t zumindest bei einzelnen Parametern Motilit t und Viabilit t zu umgehen wurden die Ejakulate in der vorliegenden Studie zus tzlich mittels CASA untersucht Dies ist in der Routinepraxis aufgrund der hohen Anschaffungskosten f r CASA Systeme jedoch nicht m glich 5 2 3 2 Computer assisted sperm analysis CASA Fur die CASA Untersuchungen kam das System SpermVision zum Einsatz welches die Beurteilung einer gro en Anzahl an Samenzellen in relativ kurzer Zeit erm glichte Nach Rijsselaere et al 2003 sind insbesondere die technischen Einstellungen wichtig um die Bewegungsbahnen der einzelnen Spermien zu identifizieren und zu rekonstruieren Sie beeinflussen die Datenausgabe von CASA Systemen in kritischer Weise Ellington et al 1993 Smith und England 2001 Amann und Katz 2004 Daher wurden in der vorliegenden Arbeit die vom Hersteller empfohlenen Analyseeinstellungen f r das SpermVision System gew hlt und nicht weiter modifiziert Diese Einstellungen waren z T bereinstimmend mit den von Schafer Somi und Aurich 2007 f r das SpermVision System verwendeten Einstellungen siehe Tab 25 und Tab 26 welche auch bereits mehrfach eingesetzt wurden Eulenberger et al 2009 Koderle et al 2009 Witte et al 2009 Kmenta et al 2011 Die Unterschiede in den technischen Einstellungen k nnten durch unterschiedliche Versionen des SpermVision Systems oder durch eine benutzerdefinierte Modifikation der Einstellun
207. elnen Hunden n 30 Nr Rasse Alter bisherige in Jahren Zuchtnutzung 1 Neufundl nder 3 Ja 2 Neufundl nder 8 Ja 3 Rhodesian Ridgeback 3 Ja 4 Beagle 1 5 Nein 5 Beagle 2 Nein 6 Gordon Setter 2 5 Ja 7 Rottweiler T Ja 8 Rottweiler 1 5 Nein 9 Presa Canario 3 Ja 10 Labrador Retriever 1 5 Nein 11 Labrador Retriever 1 5 Nein 12 Rhodesian Ridgeback Ja 13 Border Collie Mischling 1 5 Nein 14 Deutscher Sch ferhund 4 Ja 15 Riesenschnauzer 1 5 Nein 16 Bullmastiff 3 Ja 17 Rottweiler 2 Nein 18 Bernhardiner 3 Ja 19 Bernhardiner 1 Nein 20 Bullmastiff 3 Nein 21 Bearded Collie 2 Ja 22 Labrador Retriever 6 5 Nein 23 Rhodesian Ridgeback 7 Ja 24 Rhodesian Ridgeback 9 Ja 25 Golden Retriever 4 Ja 26 Golden Retriever 2 Nein 27 Deutscher Schaferhund 2 Nein 28 Belgischer Schaferhund 2 Nein 29 Deerhound 4 Ja 30 Neufundlander 3 Ja 75 Material und Methoden Die Hunde stammten mit Ausnahme der zwei Beagle Ruden die Eigentum der Klinik f r Kleintiere Innere Medizin der Justus Liebig Universitat Gie en sind aus privaten Haltungen Der aufgenommene Vorbericht beschrankte sich auf das Alter der Tiere die bisherige Zuchtnutzung und den Gesundheitsstatus Zum Zeitpunkt der Untersuchungen zeigten alle Probanden ein ungest rtes Allgemeinbefinden und auch die Vitalparameter lagen bei
208. en Iguer Ouada und Verstegen 2001b Bereits durch die Zugabe eines geeigneten Verd nners zum Ejakulat wird eine Verl ngerung der Lebensspanne der Samenzellen erreicht Hoffmann 2003d Der Verd nner stellt Energie bereit h lt den pH Wert und die Osmolarit t aufrecht und sch tzt die Plasmamembran sowie das Akrosom vor Sch digungen durch Temperaturschwankungen und Ersch tterungen beim Transport Linde Forsberg 1991 Shahiduzzaman und Linde Forsberg 2007 Eine dar ber hinausgehende Konservierung ergibt sich aus der Abk hlung des Spermas auf 4 5 C welche den Metabolismus der Samenzellen herabsetzt Linde Forsberg 1995 Hoffmann 2003d Shahiduzzaman und Linde Forsberg 2007 und dadurch deren Langlebigkeit erh ht Linde Forsberg 1995 Der Erhalt der Befruchtungsf higkeit der Spermien in verd nntem und gek hltem Sperma basiert somit auf drei Faktoren 1 geringerer Metabolismus der Spermien bei niedrigerer Temperatur 2 Schutz vor Kalteschock durch den Verdunner und 3 inh rente Resistenz von Hundespermien gegen Kalteschock Bouchard et al 1990 Zu Beginn der KB beim Hund wurde der Verd nnung und Konservierung von Sperma wenig Aufmerksamkeit geschenkt Harrop 1956 In letzter Zeit ist die KB mit flussigkonserviertem Sperma jedoch zu einem interessanten Instrument in der Hundezucht geworden Rota et al 1995 Pe a et al 2006 Kmenta et al 2011 Dieser Erfolg kann durch viele Grunde erklart werden Zum einen ist es relat
209. en Effektes auf die Spermienmotilitat besser Vinylhandschuhe verwendet werden Althouse et al 1991 Zun chst wird der Penis im Bereich des Bulbus glandis Bulbusschwellk rper durch das Pr putium hindurch kr ftig massiert bis es zu einer partiellen Erektion dem sogenannten Aufknoten des Bulbus kommt Nun wird das Pr putium z gig hinter den Bulbus verlagert und weiterhin ein konstanter fester Druck auf den 13 Literatur Penis ausgeubt indem dieser hinter dem Bulbus zwischen Zeigefinger und Daumen ringf rmig umschlossen wird Sofort nach Beginn des Aus bens von Druck an dieser Stelle setzt die Ejakulation ein W hrend der darauffolgenden Entwicklung einer vollst ndigen Erektion k nnen minimale bis starke Friktionsbewegungen auftreten Wenn der Hund versucht umzusteigen indem er sein Bein ber den Arm des Untersuchers hebt kann der Penis um 180 nach kaudal abgelenkt werden Kutzler 2005 Auf diese Weise wird das H ngen imitiert Hoffmann 2003a Das Ende der Ejakulation wird durch das pl tzliche Erschlaffen des Penis angek ndigt woraufhin dessen Fixation gel st wird Allerdings kann die Reflexkette auch schon vorzeitig durch L sen der Fixation des Penis abgebrochen werden Hoffmann 2003a Nach der Samengewinnung sollte der Hund nicht unbeaufsichtigt gelassen werden bis die Erektion vollst ndig zur ckgegangen ist und sich der Penis wieder komplett in der Pr putialh hle befindet Johnston 1991 Zur Infektion
210. en K lteschock Allerdings deuten die Ergebnisse der Studie darauf hin dass LDL in einer Konzentration von 8 am wirksamsten ist Eine weitere Alternative zu Eigelb die frei von tierischen Eiwei en ist ist die Verwendung von Sojabohnen Lecithin Beccaglia et al 2009a Sch fer Somi 2009 Kmenta et al 2011 in einer Konzentration von 0 04 Beccaglia et al 2009a bzw 0 8 Kmenta et al 2011 in einem TRIS Verd nner Nachteilig an der Verwendung von Eigelb als Verd nnerbestandteil ist dass Eier relativ teuer sind und ihre Handhabung bei der Herstellung des Verd nners m hsam und zeitaufw ndig ist Thacker und Almquist 1953 Weiterhin ist zu beachten dass Eigelb Partikel enth lt die in ihrer Gr e hnlich den Dimensionen der Spermienk pfe sind was bei Anwendung von CASA Systemen zu einer bersch tzung des Anteils an immotilen Spermien f hren kann Um dies zu vermeiden sollte der Verd nner durch Zentrifugation bei 3 310 xg f r 20 Minuten von den Partikeln befreit werden Ponglowhapan et al 2004 55 Literatur 2 5 2 3 2 Milch Milch enth lt ebenfalls Faktoren die f hig sind die Bindung der Seminalplasmaproteine an Bullenspermien zu verhindern und so den Lipidverlust aus der Membran zu reduzieren Da aber auch Magermilch die keine Lipide enth lt die Spermien sch tzt scheinen andere Faktoren als Lipide oder Lipoproteine f r den protektiven Effekt verantwortlich zu sein Bergeron und Manjunath 2006 Ber
211. en Spermien festzustellen und im Anschluss ab Tag 3 dann stets ein niedrigerer Anteil als in den mit CP aufgearbeiteten Ejakulaten Insgesamt war der Gesamtanteil an morphologisch ver nderten Samenzellen ber den Untersuchungszeitraum ab Tag 3 in den mit Up 1 2 verd nnten Ejakulaten niedriger als in den brigen Proben Die Zeitverl ufe der mit CP TE und Up 1 verd nnten Ejakulate unterschieden sich ab Tag 3 kaum voneinander Daher konnte bez glich der Pathomorphologie der Verd nner Up 1 2 als bester unter den getesteten Verd nnern angesehen werden wenn auch ein statistisch signifikanter Unterschied nur zum Verd nner CP nicht aber zum Verd nner TE nachgewiesen werden konnte Jedoch waren die Ergebnisse auch in den brigen Verd nnern als gut zu bewerten Dabei war der Verd nner CP dem Verd nner TE bis Tag 3 signifikant berlegen Gleiche Tendenzen wie f r den Gesamtanteil an morphologisch ver nderten Samenzellen lie en sich bei getrennter Betrachtung der einzelnen morphologischen Ver nderungen beobachten Auch hier war der Verd nner 206 Diskussion Up1 2 im Zeitverlauf den anderen Verd nnern berlegen Statistische Signifikanzen konnten f r den Anteil an Schwanzver nderungen sowie f r den Anteil an schleifenf rmigen Schw nzen ermittelt werden Ebenso war der Verd nner CP im Zeitverlauf wieder dem Verd nner TE berlegen Auch hier konnten statistische Signifikanzen f r den Anteil an Schwanzver nderungen sowie
212. en den verschiedenen Verd nnern untereinander konnten mit Ausnahme der verschiedenen CASA Motilit tsparameter kaum signifikante Unterschiede nachgewiesen werden Daher konnte an Tag 0 keiner der getesteten Verd nner statistisch abgesichert als bester Verd nner identifiziert werden Es waren lediglich tendenzielle Aussagen m glich nach welchen sich unmittelbar nach dem Verd nnen der Verd nner Up 1 als der am besten geeignetste Verd nner unter den gepr ften Verd nnern und der Verd nner Up 1 2 als der am schlechtesten geeignetste Verd nner darstellten Bez glich der CASA Motilit tsparameter erwiesen sich hingegen die Verd nner CP und TE an Tag 0 als signifikant berlegen 5 3 2 1 Dichten Die Spermienkonzentrationen Dichten der mit den verschiedenen Verd nnern aufgearbeiteten Ejakulate entsprachen nur teilweise dem angestrebten Wert von 100 000 Spermien pro pl bzw 100 x 10 Spermien pro ml In den mit CP TE und 179 Diskussion Up 1 2 verdunnten Ejakulaten lagen die durchschnittlichen Dichten sowohl bei manueller Bestimmung mit der Neubauer Zahlkammer als auch bei Bestimmung mittels CASA unter dem angestrebten Wert In den mit Up 1 aufgearbeiteten Ejakulaten konnten dagegen mit beiden Methoden h here Werte f r die mittleren Dichten ermittelt werden Letzteres lie sich durch die in Versuchsteil Il erfolgte nderung im Versuchsaufbau erkl ren wonach nur noch Verd nner 1 des Uppsala Equex 2 Systems zum Einsatz kam und
213. en jeweils getesteten Paaren angegeben n s nicht signifikant p lt 0 01 signifikant mit p lt 0 01 p lt 0 05 signifikant mit p lt 0 05 Parameter Haupteffekt p Wert Student Newman Keuls Test Verd nner DAP lt 0 0001 1 p lt 0 01 2 p lt 0 01 4 p lt 0 01 2 p lt 0 05 4 p lt 0 01 4 p lt 0 01 1 p lt 0 01 2 p lt 0 01 4 p lt 0 01 1 2 n s 1 4 n s 2 4 n s DSL lt 0 0001 0 1 p lt 0 05 0 2 p lt 0 01 0 4 p lt 0 01 1 2 n s 1 4 p lt 0 01 2 4 p lt 0 01 VAP lt 0 0001 0 1 p lt 0 01 0 2 p lt 0 01 0 4 p lt 0 01 1 2 n s 1 4 p lt 0 01 2 4 p lt 0 01 VCL lt 0 0001 0 1 p lt 0 01 0 2 p lt 0 01 0 4 p lt 0 01 1 2 n s 1 4 n s 2 4 n s DCL lt 0 0001 O O O N gt O O QO 270 Anhang VSL lt 0 0001 0 1 p lt 0 05 0 2 p lt 0 01 0 4 p lt 0 01 1 2 n s 1 4 p lt 0 01 2 4 p lt 0 01 ALH 0 18 BCF STR lt 0 0001 0 0006 0 1 p lt 0 01 0 2 p lt 0 01 0 4 p lt 0 01 1 2 n s 1 4 n s 2 4 n s 0 1 n s 0 2 n s 0 4 p lt 0 01 1 2 n s 1 4 p lt 0 01 2 4 p lt 0 05 LIN 0 0019 0 1 n s 0 2 n s 0 4 n s 1 2 n s 1 4 p lt 0 01 2 4 n s WOB 0 0003 0 1 p lt 0 01 0 2 n s 0 4 n s 1 2 n s 1 4 p lt 0 01 2 4 p lt 0 05 271 Anhang Tab A8 Resultate der einfaktoriellen Varianzanalyse mit Messwiederholungen bez glich des Faktors Verd nner zum Vergleich der Verdunner CP
214. en konnten in den einfaktoriellen Varianzanalysen keine weiteren signifikanten Unterschiede ermittelt werden 4 2 6 Einfluss der Verd nner auf den Anteil an membrandefekten Samenzellen im HOS Test an Tag 0 Der durchschnittliche Anteil an membrandefekten Samenzellen im HOS Test in der spermienreichen Fraktion der Nativejakulate und der mit den verschiedenen Verd nnern aufgearbeiteten Ejakulate unmittelbar nach dem Verd nnen Tag 0 ist in Abb 12 dargestellt In allen verd nnten Proben konnte im Vergleich zum Nativsperma ein signifikanter Anstieg des Prozentsatzes an Samenzellen mit nicht aufgerolltem Schwanz not curled beobachtet werden Dabei zeigte sich der geringste Anstieg in mit Up 1 verd nnten Ejakulaten der gr te in mit Up 1 2 verd nnten Proben 120 Ergebnisse ONativsperma n 30 GCP n 30 QTE n 30 Up 1 2 n 12 Up 1 n 18 N nicht aufgerolltem Schwanz not curled Anteil an Samenzellen mit Abb 12 Prozentsatz an Samenzellen mit nicht aufgerolltem Schwanz not curled im HOS Test im Nativsperma und in den verschiedenen Verd nnern an Tag 0 dargestellt als geometrischer Mittelwert und Streufaktor xg SF CP Verd nner CaniPRO Chill 10 TE TRIS Fruktose Eigelb Verdunner Up1 2 Uppsala Equex 2 System Verdunner 1 und Verdunner 2 Up 1 Uppsala Equex 2 System nur Verd nner 1 n Probenanzahl An Tag 0 konnte in der einfaktoriellen Varianzanalyse m
215. en mit der Ausgangsmotilitat schon nach drei Tagen Lagerung zu einer deutlichen Reduktion der Motilitat An Tag 10 lieferten nur noch die Verdunner CP und TE zufriedenstellende Werte w hrend demgegen ber die Konservierung der Motilitat in den Verd nnern Up1 2 und Up1 wesentlich schlechter war Die hinsichtlich der Motilit tskonservierung ermittelten Ergebnisse machen deutlich warum nach zw lf Probanden der Versuchsplan ge ndert und der Verd nner Up1 2 durch den Verd nner Up 1 ersetzt wurde Der Verd nner Up1 2 lieferte nur f r die ersten 24 Stunden der Fl ssigkonservierung zufriedenstellende Konservierungsergebnisse Danach kam es zu einem drastischen Motilitatsabfall wie er in hnlicher Weise von Nizanski et al 2009 in einem TRIS Glukose Eigelb Verd nner mit 1 Equex jedoch ohne Glycerol beobachtet wurde Nach einer initialen Aktivierung kam es nach 96 Stunden zu einem schnellen Abfall der Motilit t was die Autoren auf den Zusatz von Equex zur ckf hren Die initiale Aktivierung der Motilit t konnte in der vorliegenden Untersuchung bei mit Up1 2 verd nnten Ejakulaten zwar nicht festgestellt werden daf r aber der drastische Motilitatsabfall allerdings bereits nach 48 Stunden M glicherweise f hrte insbesondere der Zusatz von Glycerol wie in hnlicher Weise auch von G nzel Apel et al 1993 beschrieben zum fr heren Motilitatsabfall in den eigenen Untersuchungen Unabh ngig vom Glycerol best tige sich dass die Zugabe
216. enmotilitat sowie einen sch tzenden Effekt gegen spontane AR besitzt bzw die akrosomale Integrit t positiv beeinflusst Die Stabilisierung des Akrosoms k nnte durch einen direkten sch tzenden Effekt auf die akrosomale Membran vermittelt werden Iguer Ouada und Verstegen 2001b W hrend einer viert gigen Lagerung von fl ssigkonserviertem Sperma bei 5 C steigt der Prozentsatz kapazitierter Spermien signifikant an wenn ein TRIS Zitronens ure Fruktose Verd nner ohne Eigelbzusatz verwendet wird verglichen mit der Konservierung in demselben Verd nner mit Eigelbzusatz Schafer Somi 2009 Daher wird angenommen dass Eigelb die haupts chliche Komponente f r die Verhinderung der Kapazitation ist Sch fer Somi 2009 Witte et al 2009 weshalb es in Verd nnern f r die Fl ssigkonservierung immer enthalten sein sollte Sch fer Somi 2009 F r die Konservierung von Hundesperma wurden bisher verschiedene Eigelbkonzentrationen eingesetzt England 1993 wobei die blichen Konzentrationen zwischen 15 und 30 Vol liegen Weitze und Petrunkina 2007 Konzentrationen darunter oder dar ber f hren zu einer Verringerung des Anteils motiler Spermien Weitze und Petrunkina 2007 Auch Foote und Leonard 1964 konnten eine berlegenheit von 20 Eigelbzusatz gegen ber 50 zeigen Das Eigelb sollte vorsichtig vom Eiwei getrennt werden indem es auf ein Filterpapier gegeben und so lange behutsam abgerollt wird bis das Eiwei sich abgel
217. enspermien beim hypoosmotischen Schwelltest HOS Test Riesenbeck CF als ZBBT u 25 Schematische Abbildung der verschiedenen durch Computer assisted sperm analysis Systeme gemessenen Motilit tsparameter nach Eder et al 2009 Modiizier zes ass ess ce ceo ck agree 31 Vorgehensweise bei der Spermabeurteilung n 77 Monitorbild des Programms SpermVision nach der Motilitatsanalyse a Ree Tne een ee ER 87 Vorgehensweise bei der Weiterverarbeitung des Spermas 91 Vorgehensweise bei der Beurteilung des verdunnten Spermas 94 Vorgehensweise bei der Untersuchung der Halteproben 95 Prozentsatz an motilen Samenzellen mittels Computer assisted sperm analysis CASA SpermVision System gemessene Gesamtmotilitat x SD im Nativsperma und in den verschiedenen Verd nnern an Tag 0 Prozentsatz an vorwartsbeweglichen Samenzellen mittels Computer assisted sperm analysis CASA SpermVision System gemessene Vorwartsbeweglichkeit x SD im Nativsperma und in den verschiedenen Verd nnern an Tag_ uuusneeeessssnnnnnnnnnnnennnnnnnnnnnnn 106 Prozentualer Anteil lebender Samenzellen Eosinausstrich im Nativsperma und in den verschiedenen Verd nnern an Tag O 114 Prozentsatz an lebenden Samenzellen mittels Computer assisted sperm analysis CASA SpermVision System gemessene Viabilitat nach SYBR 14 PI F rbung im Nativsperma und in den verschiedenen Verd nner
218. enta et al 2011 da es Bestrebungen gibt Eigelb als Verd nnerbestandteil zu ersetzen weil es sich bei letzterem um ein biologisch riskantes Produkt tierischen Ursprungs handelt dem ein potentielles Risiko mikrobieller Kontamination innewohnt Hoffmann 2003d Bergeron und Manjunath 2006 Beccaglia et al 2009b Farstad 2009 und weil dessen Zusammensetzung extrem variabel ist Bergeron und Manjunath 2006 Beccaglia et al 2009a Hauptgr nde fur die Auswahl des kommerziellen Verd nners CP waren seine schnelle Verf gbarkeit und die einfache Handhabung Der Verd nner TE wurde aufgrund seines weitverbreiteten Einsatzes bei der Fl ssigkonservierung von caninem Sperma auch in der KGGA ausgew hlt Der Uppsala Equex 2 System Verd nner bei welchem es sich eigentlich um einen zweiphasigen Verd nner f r die Kryokonservierung von Hundesperma handelt wurde mit in diese Arbeit aufgenommen da er nach der Kryokonservierung gute Auftauergebnisse liefert Martins Bessa et al 2006 und getestet werden sollte ob dies auch f r die Messergebnisse nach Fl ssigkonservierung zutrifft Zur Verwendung dieses Verd nners f r die Kryokonservierung von caninem Sperma liegen in der Literatur zahlreiche Arbeiten vor z B Hermansson und Linde Forsberg 2006 Martins Bessa et al 2006 Sch fer Somi et al 2006 und auch in der KGGA wird er zur Kryokonservierung von Hundesperma eingesetzt Bez glich des Einsatzes des Uppsala Equex 2 System Verd n
219. enzellen mit intakten Akrosomen bei einigen der genannten Autoren wesentlich h her Michael et al konnten nach drei Tagen Fl ssigkonservierung nur noch einen Anteil von etwa 38 2009 bzw rund 24 2010 beobachten und England und Ponzio 1996 nach zehn Tagen einen Anteil von 18 33 Dagegen wiesen bei Shahiduzzaman und Linde Forsberg 2007 nach zehn Tagen noch etwa 53 der Samenzellen intakte Akrosome auf und nach 23 Tagen noch rund 20 Wie bereits zuvor erw hnt m ssen bei solch einem Vergleich jedoch Abweichungen bez glich der Zusammensetzung der Verd nner und Unterschiede in der Methodik ber cksichtigt werden Nach Burgess et al 2001 verursacht zwar die Verdunnerzugabe keine signifikanten ultrastrukturellen Ver nderungen der Samenzellen wohingegen aber die anschlie ende K hlung verglichen mit dem Nativsperma in einem sofortigen nicht signifikanten Anstieg der Anzahl an transmissionselektronenmikroskopisch erkennbaren akrosomalen Ver nderungen resultiert Dieser Anstieg wird haupts chlich durch Schwellung und Wellung der Akrosome verursacht Durch die Inkubation des zuvor gek hlten Spermas bei 39 C kommt es zu keinem nennenswerten weiteren Anstieg Burgess et al 2001 Demgegen ber kommt es bei Oettl amp 1986 sowohl durch die Verd nnung des Spermas als auch durch die 209 Diskussion nachfolgende Kuhlung zu einer Zunahme der akrosomalen Veranderungen in der Spermac Farbung wobei die Kuhlung relativ mehr
220. eptionsraten und der durchschnittlichen Wurfgr en bei nat rlicher Paarung k nstlicher Besamung KB mit Frischsperma KB mit fl ssigkonserviertem Sperma und KB mit Tiefgefriersperma TG Sperma Konzeptionsraten Durchschnittliche Quellen Wurfgr en Nat rliche 78 3 bis 92 4 9 bis 6 9 Gill et al 1970 Seager et al 1975 Farstad 1984 Tsutsui et Paarung al 2003b KB mit Frischsperma intravaginal 25 bis 94 5 0 bis 7 2 0 5 Seager und Fletcher 1972 Seager et al 1975 Farstad 1984 Linde Forsberg und Forsberg 1989 1993 Mickelsen et al 1993 Pinto et al 1999 Nizanski 2006 intrauterin 70 bis 100 5 1 bis 5 6 Gill et al 1970 Farstad 1984 Silva et al 1996 KB mit fl ssig konserviertem Sperma 24 h intravaginal 53 bis 90 3 4 0 6 Seager und Fletcher 1972 Goodman und Cain 1993 Linde bis 7 2 0 6 Forsberg und Forsberg 1993 Pinto et al 1999 Tsutsui et al 2003b intrauterin 80 Wurfrate 4 2 Gill et al 1970 KB mit TG Sperma intravaginal 10 bis 65 8 3 9 1 2bis6 0 Seager et al 1975 Fontbonne und Badinand 1993 Silva et al 1996 Linde Forsberg et al 1999 Thomassen et al 2001 2006 Nizanski 2006 intrauterin 51 1 bis 89 4 4 1 2 4 Farstad 1984 Farstad und i Andersen Berg 1989 Linde bis 6 9 2 7 Forsberg und Forsberg 1989 1993 Fontbonne und Badinand 1993 Wilson 1993 Silva et al 1996 Linde Forsberg et al 1
221. er und Zeit in denen jeweils zwei Verd nner bez glich des Anteils an morphologisch ver nderten Samenzellen im Eosinausstrich bzw bez glich der einzelnen morphologischen 143 Ergebnisse Veranderungen miteinander verglichen wurden ist im Anhang zu finden Tab A10 A14 Kap 9 8 4 3 4 Einfluss der Verdunner auf den Anteil an akrosomalen Ver nderungen im Zeitverlauf Der im Durchschnitt mittels Spermac F rbung ermittelte Anteil an Samenzellen mit akrosomalen Ver nderungen Kopfkappenver nderungen in den mit den verschiedenen Verd nnern aufgearbeiteten Ejakulaten bei Fl ssigkonservierung bei 4 C f r zehn Tage ist in Abb 19 dargestellt Tendenziell war in den mit CP TE und Up 1 aufgearbeiteten Ejakulaten im Zeitverlauf ein Anstieg des mittleren Anteils an Samenzellen mit Kopfkappenver nderungen zu erkennen w hrend diese Tendenz in den mit Up 1 2 aufgearbeiteten Ejakulaten nicht zu beobachten war Die Verl ufe der mit CP und TE verd nnten Ejakulate unterschieden sich dabei kaum und an Tag 10 konnte ein durchschnittlicher Anteil an Kopfkappenveranderungen von 7 6 CP bzw 8 5 TE ermittelt werden Im Gegensatz dazu konnten zwischen den mit Up 1 2 und den mit Up 1 verd nnten Ejakulaten gerade zu Beginn des Untersuchungszeitraumes deutliche Unterschiede gesehen werden Der Durchschnitt an Samenzellen mit ver nderter Kopfkappe war dabei an Tag 0 in den mit Up 1 verd nnten Ejakulaten wesentlich geringer 2
222. er 1 Versuchsteil II Abb 5 Vorgehensweise bei der Weiterverarbeitung des Spermas Die spermienreiche Fraktion wurde im Splitsample Verfahren in drei gleichgro e Volumenanteile Aliquote 1 2 und 3 aufgeteilt welche in auf 37 C vorgew rmte unten spitz zulaufende Zentrifugenr hrchen aus Glas gegeben wurden Aliquot 1 wurde entsprechend der Dichte des Nativspermas mit der entsprechenden Menge an CP verd nnt Aliquot 2 mit der entsprechenden Menge an TE und Aliquot 3 91 Material und Methoden wurde zunachst zentrifugiert um es dann nach dem Uppsala Verfahren Rota et al 1997 Linde Forsberg 2001 aufzuarbeiten Fur das Uppsala Equex 2 System konnten zwei verschiedene Versuchsteile unterschieden werden In Versuchsteil erfolgte die Verd nnung mit dem kompletten Uppsala Equex 2 System d h es wurde dem Sperma erst Verd nner 1 zugesetzt und nach der quilibrierungszeit noch Verd nner 2 Up 1 2 n 12 In Versuchsteil Il erfolgte die Verd nnung nur mit Verd nner 1 des Uppsala Equex 2 Systems Up 1 n 18 Die Zentrifugation Zentrifuge Heraeus Christ Labofuge I erfolgte bei 700xg 2000 U min f r sechs Minuten der Uberstand das Seminalplasma wurde vorsichtig abpipettiert und verworfen und das Sediment Spermienpellet im Konus des R hrchens wurde mit auf 37 C angew rmtem Uppsala Equex 2 System Verd nner 1 im Verh ltnis 1 2 ein Anteil Sperma zu zwei Anteilen Verd nner resuspendiert Versuchsteile u
223. er nderungen konnte ein signifikanter Unterschied zwischen den Verd nnern untereinander nachgewiesen werden In der einfaktoriellen Varianzanalyse zum Vergleich der mit CP und TE aufgearbeiteten Ejakulate mit dem Nativsperma lie sich hinsichtlich des Anteils an morphologisch ver nderten Samenzellen im Eosinausstrich ein signifikanter Unterschied ermitteln n 30 p 0 0022 Der daraufhin durchgef hrte paarweise Vergleich nach Student Newman Keuls zeigte signifikante Unterschiede zwischen dem Nativsperma und den mit CP verd nnten Proben p lt 0 01 und zwischen 117 Ergebnisse dem Nativsperma und den mit TE verdunnten Proben p lt 0 05 auf Die mit CP und die mit TE aufgearbeiteten Ejakulate unterschieden sich bez glich des Anteils an morphologisch ver nderten Samenzellen nicht signifikant voneinander Getrennt nach den einzelnen beobachteten morphologischen Ver nderungen lie en sich in der einfaktoriellen Varianzanalyse zwischen dem Nativsperma den mit CP und den mit TE aufgearbeiteten Proben signifikante Unterschiede f r den Anteil an Knickschw nzen n 30 p lt 0 0001 und f r den Prozentsatz an Plasmatropfen n 30 p 0 0005 feststellen Der anschlie ende paarweise Vergleich nach Student Newman Keuls zeigte f r beide Parameter signifikante Unterschiede sowohl zwischen dem Nativsperma und den mit CP verd nnten Ejakulaten jeweils mit p lt 0 01 als auch zwischen dem Nativsperma und den mit TE verd nnten Ejakulaten je
224. er Kammer begonnen und war circa innerhalb von 60 Sekunden nach Kammerbeschickung abgeschlossen Bei hoher Dichte des Ejakulates musste dieses f r die Messung verd nnt werden Dazu wurden 10 ul des Spermas in 90 ul auf 37 C angew rmtes Auftaumedium Rezept siehe Kap 9 5 1 2 gegeben woraus sich eine Verd nnung von 1 9 ergab Diese Verd nnung musste dann vor der Messung in das 85 Material und Methoden SpermVision System eingegeben werden um eine korrekte Berechnung der Dichte zu gewahrleisten Vor Beginn der Messung musste noch die Lichtstarke des Mikroskops eingestellt werden Hierzu wurde der im SpermVision System integrierte Lichtmesser verwendet Die Zahl unter dem Lichtmesser sollte f r eine optimale Spermienerkennung im Bereich zwischen 95 und 100 liegen Vor und w hrend der Messung wurden die Probengef e in einem Thermoblock auf der Heizplatte bei 37 C aufbewahrt 3 3 4 3 Motilitatsanalyse Durch den negativen Phasenkontrast erschienen die Spermien wei auf schwarzem Hintergrund Die Messung erfolgte bei 200 facher Vergr erung Agglutinierte Spermien wurden von der Beurteilung ausgeschlossen Die beurteilen Samenzellen wurden durch das Messsystem als unbewegliche lokalbewegliche oder vorwartsbewegliche Spermien klassifiziert und mittels Overlay farblich markiert Level 1 Klassifizierung siehe Kap 9 2 In einer zweiten Beurteilungsstufe Level 2 Klassifizierung siehe Kap 9 2 wurden Teilpopulationen der
225. er Spermiengeschwindigkeit und eine signifikante Verminderung der Viabilit t Lebende Viacasa wohingegen es in fast allen verd nnten Ejakulaten zu einer geringgradigen aber signifikanten Zunahme der Pathomorphologie und zu einem signifikanten Anstieg des Anteils an Samenzellen mit akrosomalen Ver nderungen kam Ausgehend von einer initialen VW von 77 8 11 4 CP 77 2 14 3 TE 73 8 18 0 Up1 2 75 8 13 8 Up1 unmittelbar nach der Herstellung Tag 0 war nach zehn Tagen noch eine VW von 58 2 22 1 CP 49 3 23 9 TE 3 5 4 6 Up 1 2 16 2 12 1 Up 1 nachweisbar Die Viacasa an Tag 0 betrug 84 3 71 4 93 8 CP 83 6 69 6 93 9 TE 75 2 57 0 89 6 Up 1 2 85 1 76 5 92 0 Up 1 und verminderte sich ber den Untersuchungszeitraum auf 58 8 41 7 74 9 CP 59 7 40 8 77 3 TE 37 7 22 2 54 6 Up 1 2 68 0 57 6 77 5 Up 1 an Tag 10 Demgegen ber nahm die Patho zwischen Tag 0 CP 7 4 SF 2 21 TE 82 SF 1 93 Up1 2 7 9 SF 2 08 Up 1 9 3 SF 1 72 und Tag 10 CP 10 7 SF 2 04 TE 10 7 SF 2 19 Up1 2 9 8 SF 2 26 Up1 10 6 SF 1 96 zu und auch f r die AV konnte mit Ausnahme der mit Up 1 2 verd nnten Ejakulate ein Anstieg zwischen Tag 0 CP 222 Zusammenfassung 4 2 SF 2 43 TE 3 9 SF 2 67 Up 1 2 6 6 SF 2 18 Up 1 2 8 SF 2 34 und Tag 10 CP 7 6 SF 2 57 TE 8 5 SF 2 14 Up 1 2 4 0 SF 2 72
226. er aber entsprechend der dominierenden Veranderung wenn die Defekte von gleicher Bedeutung sind Oettl und Soley 1988 Oettl 1993 Der Gesamtanteil an morphologisch ver nderten Samenzellen sollte bei Normospermie einen Wert von 20 nicht berschreiten Seager und Platz 1977b Johnston 1991 Riesenbeck et al 2001 Hoffmann 2003b Hunde k nnen jedoch trotz einer Vielfalt anormaler Spermien fertil sein d h in den vergangenen zw lf Monaten einen Wurf gezeugt haben Morton und Bruce 1989 Die Beziehung zwischen Spermienmorphologie und Fertilit t Soderberg 1986 bzw die jeweilige Bedeutung von verschiedenen Arten von Defekten in Bezug auf die Fertilitat Linde Forsberg 1991 wurden beim Hund noch nicht ausreichend untersucht Allerdings konnte Oettle 1993 feststellen dass der Grenzwert an morphologisch normalen Spermien unter welchem die Fertilit t nachteilig beeinflusst wird bei 60 liegt 61 versus 13 Fertilitat W hrend distale Plasmatropfen von Linde Forsberg 1991 als unbedeutend f r die Fertilit t angesehen werden konnten N thling et al 1997 jedoch eine negative Korrelation von proximalen oder distalen Zytoplasmatropfen und der Motilitat nach dem Auftauen nachweisen d Dichte und SGZ Die Dichte eines Ejakulates kann mittels H mozytometer Spektrophotometer automatischem Zellz hler Seager und Platz 1977b Christiansen 1984b Durchflusszytometrie oder Computer gest tzter Spermienanalyse K
227. er aided semen analysis within donors and between donors J Androl 22 5 773 780 Wilson M S 1993 Non surgical intrauterine artificial insemination in bitches using frozen semen J Reprod Fertil 47 Suppl 307 311 Wilson M S 2001 Transcervical insemination techniques in the bitch Vet Clin North Am Small Anim Pract 31 2 291 304 Witte T S Sch fer Somi S Kuchar A M stl E Iben C Aurich C 2009 Effect of hen s egg yolk on capacitation and acrosome reaction of diluted canine spermatozoa Anim Reprod Sci 110 3 4 293 305 Yamashiro H Narita K Sugimura S Han Y J Sugawara A Morohaku K Nakazato F Konno T Yoshida M Sato E 2007 Trehalose enhanced the freezability of poodle dog sperm collected by an artificial vagina AV Anim Reprod Sci 102 1 2 165 171 Yildiz C Kaya A Aksoy M Tekeli T 2000 Influence of sugar supplementation of the extender on motility viability and acrosomal integrity of dog spermatozoa during freezing Theriogenology 54 4 579 585 Yu l Leibo S P 2002 Recovery of motile membrane intact spermatozoa from canine epididymides stored for 8 days at 4 C Theriogenology 57 3 1179 1190 249 Anhang 9 Anhang 9 1 Ger te Waage Magnetr hrer W rmeschrank W rmebad W rmeplatte Heiztisch Zentrifuge K hlschr nke Bechergl ser Tulpengl ser Mettler Toledo GmbH Typ PJ 300 H
228. er tendenziell h here Werte f r die Gesamtmotilitat die Vorw rtsbeweglichkeit und die 178 Diskussion Parameter VAP und VSL als in der vorliegenden Arbeit Lediglich beim Parameter VCL wurden ahnliche Werte ermittelt Insgesamt schienen die mittels CASA bestimmten Untersuchungsergebnisse der Nativejakulate bezuglich der Gesamtmotilitat und der Vorwartsbeweglichkeit zwar unter den in der Literatur beschriebenen Durchschnittswerten zu liegen was jedoch fur die vorliegenden Untersuchungen nicht weiter von Bedeutung war da sie lediglich als Ausgangswerte hinsichtlich der zeitbedingten Ver nderungen der verschiedenen Parameter dienten 5 3 2 Ergebnisse der weiterverarbeiteten Ejakulate unmittelbar nach dem Verdunnen an Tag 0 W hrend unmittelbar nach dem Verd nnen in den weiterverarbeiteten Ejakulaten im Vergleich zum Nativsperma bez glich der Motilit t subjektiv gesch tzte Vorw rtsbeweglichkeit CASA Gesamtmotilitat CASA Vorw rtsbeweglichkeit und der Viabilit t nur wenige signifikante Ver nderungen nachgewiesen werden konnten gab es bei Betrachtung der verschiedenen CASA Motilit tsparameter der Pathomorphologie der akrosomalen Ver nderungen und der mittels HOS Test bestimmten Plasmamembranintegrit t einige signifikante Unterschiede zwischen den mit den verschiedenen Verd nnern aufgearbeiteten Ejakulaten und dem Nativsperma Insgesamt waren die Effekte der Verd nner an Tag O jedoch als gering zu beurteilen Auch zwisch
229. erck KGaA CgHg07 H20 M 210 14 g mol D Fruktose gt 99 5 fur die Biochemie Carl Roth GmbH amp Co KG C6H1206 M 180 16 g mol Art Nr 4981 1 Eosin B bl ulich C I 45400 Merck KGaA C20H6Br2N2Na209 M 624 10 g mol Equex Tierarztpraxis Dr K amp C Blendinger Frische Eier aus Freilandhaltung G teklasse A Gut Frielingshof Inter ovo GmbH Glycerol ReagentPlus 2 99 G7757 500 ml Sigma Aldrich Chemie GmbH LIVE DEAD Sperm Viability Kit L 7011 Invitrogen Molecular Probes COMPONENT A SYBR 14 dye reagent 100 ul 1 mM solution in DMSO COMPONENT B propidium iodide 5 ml 2 4 mM solution in water Spermac Stain Sperm Morphology Kit FertilPro N V 50 ml Fixative 3 x 50 ml Stain A B C TRIS Ultra Qualitat PUFFERAN 2 99 9 Carl Roth GmbH amp Co KG Tris hydroxymethyl aminomethan Art Nr 5429 3 C4H11NO3 M 121 14 g mol 253 Anhang 9 5 Rezepte der verwendeten Medien 9 5 1 Rezepte der Verd nner 9 5 1 1 9 5 1 2 TRIS Fruktose Eigelb Verd nner f r fl ssigkonservierten Hundesamen Linde Forsberg 2001 TRIS Zitronens ure Fruktose Aqua dest Eigelb Benzylpenicillin Dihydrostreptomycinsulfat 3 0259 1 79 1 25g ad 100 ml 20 ml 1 mg ml 1 mg ml Uppsala Verdunner fur die Kryokonservierung von Hundesamen Linde Forsberg 2001 Uppsala Equex 2 System Verdunner 1 TRIS Zitronensaure Fruktose Streptomycin Aqua dest Benzylpenicil
230. ergestellten TRIS Fruktose Eigelb Verd nner TE und den zweiphasigen Uppsala Equex 2 System Verd nner der ebenfalls selbst hergestellt wurde Bei Letzterem lie en sich zwei Versuchsteile unterscheiden siehe Kap 3 4 2 In Versuchsteil erfolgte die Verd nnung mit dem kompletten Uppsala Equex 2 System d h mit den Verd nnern 1 und 2 Up 1 2 und in Versuchsteil II nur mit Verd nner 1 Up1 Ziel der Untersuchungen war es die Auswirkungen der verschiedenen Verd nner auf die Spermaqualitat w hrend der Fl ssigkonservierung bei 4 C f r zehn Tage zu testen und so die Eignung der verschiedenen Verd nner zu berpr fen Die Beurteilung der Spermaqualit t erfolgte mithilfe klassischer und moderner spermatologischer Untersuchungs methoden Daher konnte zus tzlich gepr ft werden inwieweit beide Untersuchungsverfahren gleichwertige Ergebnisse liefern 5 1 Diskussion der Fragestellung Die KB mit fl ssigkonserviertem Sperma ist in der Hundezucht weitverbreitet Kmenta et al 2011 und gerade in den letzten Jahren deutlich angestiegen Concannon und Battista 1989 Pinto et al 1999 Pefa et al 2006 Ein Grund f r das gesteigerte Interesse an der Fl ssigkonservierung sind die besseren Konzeptionsraten bei KB mit fl ssigkonserviertem Sperma im Vergleich zur KB mit kryokonserviertem Sperma Concannon und Battista 1989 Zudem ist die Herstellung von fl ssigkonserviertem Sperma verglichen mit der von TG Sperma einfacher und kos
231. erine endoskopische Besamung sowie die chirurgische intrauterine Besamung zu unterscheiden Pesch et al 2007 Ferner besteht im Rahmen der chirurgischen Besamung die M glichkeit das Sperma direkt in die Eileiterampullen einzubringen was als intratubale Besamung bezeichnet wird Tsutsui et al 2003a Bei der intravaginalen Besamung wird das Sperma mit einem Uterus Einweg Plastikkatheter f r Rinder Seager und Fletcher 1972 dem Norwegischen Literatur Katheter Farstad 1984 oder dem sog Osiris Katheter Theret et al 1987 in die kraniale Vagina eingebracht Seager und Fletcher 1972 Linde Forsberg und Forsberg 1989 Das Anheben des Hinterteils der H ndin w hrend der Samendeponierung und fur die darauffolgenden zwei bis zehn Minuten in einem Winkel von 60 80 verhindert einen Ruckfluss des Spermas Seager und Fletcher 1972 1973 Seager und Platz 1977a Linde Forsberg und Forsberg 1989 wobei aber auch ein k rzeres Hochhalten nicht zu einer Verschlechterung der Konzeptionsraten f hrt Pinto et al 1998 Die intravaginale Technik ist nichtinvasiv einfach durchzuf hren Silva et al 1996 und bei Verwendung von nativem bzw fl ssigkonserviertem Sperma jedoch nicht bei TG Sperma geeignet gute Tr chtigkeitsergebnisse zu erzielen England und Millar 2008 Thomassen und Farstad 2009 Die Technik der transzervikalen intrauterinen Besamung mit transabdominaler Fixation der Zervix oft als Norwegische oder Skan
232. erma wurde vor Entnahme der Probe zur Messung mehrmals geschwenkt um eine Sedimentation der Spermien auszuschlie en Des Weiteren wurde darauf geachtet die Probe zentral zu entnehmen Das vorab eingestellte Volumen wurde entsprechend entnommen und die Messkammer direkt auf dem Mikroskoptisch bef llt Dazu wurde das in der Pipettenspitze befindliche Sperma kurz vor der zu beschickenden Kammer aus der Pipettenspitze ausgedr ckt sodass sich an der Spitze ein kleiner Tropfen bildete Dieser wurde dann auf der markierten Eingangsposition der jeweiligen Kammer so abgelegt dass die Spitze der Pipette solange auf dem Objekttr ger aufsa bis die Kammer vollst ndig gef llt war Die Kammer musste in einem Zug komplett bef llt werden wobei anschlie end keine Fl ssigkeit am Ein und Ausgang berstehen durfte Ziel war eine Bef llung der Kammer ausschlie lich durch Kapillarkr fte Durch ber oder Unterf llung der Messkammer z B durch Injizieren der Probenfl ssigkeit schr g unter den Deckglasrand kann es zu Abweichungen bei der Konzentrationsberechnung kommen Die vollst ndige und korrekte Bef llung der Kammer wurde sofort berpr ft Luftblasen oder eine unvollst ndige F llung der Kammer f hrten zum Ausschluss und zur Bef llung einer neuen Kammer Um eine Wanderung der Spermien an die Grenzen der Kammer und damit eine Innomogenit t der Probe in der Messkammer zu vermeiden wurde die Messung innerhalb von 20 Sekunden nach Beschickung d
233. ersch tzung der Viabilit t durch das SpermVision System Teilweise war dies durch eine schwache Fluoreszenz der Samenzellen bedingt welche auch durch erneute F rbung und Inkubation nicht verbessert werden konnte Eine sukzessive Abnahme der Intensit t der gr nen Fluoreszenz in mit TRIS Glukose Eigelb Verd nner mit Zusatz von 1 Equex STM aufgearbeiteten Ejakulaten konnte w hrend fortschreitender Inkubationsdauer bei 5 C auch von Nizanski und Klimowicz 2005 beobachtet werden Jedoch wurden in den eigenen Untersuchungen bei einigen Messungen auch bei ausreichender Fluoreszenz der Samenzellen nicht alle Spermien vom SpermVision System als solche identifiziert Der in der vorliegenden Studie durchgef hrte Vergleich der Ergebnisse der Viabilit tsanalyse mittels CASA nach SYBR 14 Pl F rbung mit denen der konventionellen Beurteilung des Lebend Tot Anteils im Eosinausstrich lieferte eine akzeptable bereinstimmung zwischen beiden Methoden siehe Kap 4 4 3 welche in Kap 5 3 4 3 n her beschrieben wird 5 2 4 Verd nner Die in der vorliegenden Arbeit getesteten Verd nner wurden ausgew hlt da sie kommerziell erworben werden k nnen bzw einfach herzustellen sind und deshalb in der klinischen Praxis z T weitverbreitet eingesetzt werden Der kommerzielle Verd nner CP bietet die Vorteile dass er schnell verf gbar und einfach anzuwenden ist Zudem ist eine Vorratshaltung m glich Bei k hler trockener und dunkler Lagerung zwische
234. ertil 47 Suppl 271 278 Hammerstedt R H Graham J K Nolan J P 1990 Cryopreservation of mammalian sperm What we ask them to survive J Androl 11 1 73 88 Hansen C Vermeiden T Vermeiden J P Simmet C Day B C Feitsma H 2006 Comparison of FACSCount AF system Improved Neubauer hemocytometer Corning 254 photometer SpermVision UltiMate and NucleoCounter SP 100 for determination of sperm concentration of boar semen Theriogenology 66 9 2188 2194 Harrison R A P Vickers S E 1990 Use of fluorescent probes to assess membrane integrity in mammalian spermatozoa J Reprod Fertil 88 1 343 352 Harrop A E 1954 Artificial insemination of a bitch with preserved semen Br Vet J 110 424 425 Harrop A E 1956 A review of canine artificial insemination J Am Vet Med Assoc 129 12 564 567 Heape W 1897 The artificial insemination of mammals and subsequent possible fertilisation or impregnation of their ova in Taylor R Hrsg Proceedings of the Royal society of London Cambridge University Press London Vol 61 52 63 Hermansson U Linde Forsberg C 2006 Freezing of stored chilled dog spermatozoa Theriogenology 65 3 584 593 Hermansson U Ponglowhapan S Linde Forsberg C Str m Holst B 2006 A short sperm oocyte incubation time ZBA in the dog Theriogenology 66 4 717 725 234 Literaturverzeichnis Hewitt D A Leahy R Sheldon I M
235. et darauf hin dass durch Konservierungsma nahmen kapazitationsartige Ver nderungen initiiert und beschleunigt werden Rota et al 1999b Auch nach Kumi Diaka und Badtram 1994 ist es wahrscheinlich dass die Lagerung von Sperma bei 5 C die AR initiiert bzw triggert Dabei hat die Zusammensetzung des Verd nnermediums insbesondere dessen Ca Konzentration einen entscheidenden Einfluss auf die Inzidenz der AR hohe Ca Konzentrationen f rdern die AR w hrend niedrige sie verz gern Sirivaidyapong et al 2000 Im Gegensatz dazu konnten Hermansson et al 2006 feststellen dass sowohl nach einer als auch nach vier Stunden Ko Inkubation die Anzahl der an die ZP gebunden Spermien pro Eizelle bei frischem Sperma h her ist als bei fl ssigkonserviertem Sperma Ponglowhapan et al 2004 konnten eine berlebensdauer der bei 5 C gelagerten Samenzellen von 23 Tagen beobachten 41 Literatur Die Langlebigkeit der Samenzellen kann durch neues Substrat d h durch Zentrifugieren des gek hlten verd nnten Samens Entfernen des Uberstandes und Zusatz von frischem Verdunner gesteigert werden So verlangert die Zugabe von frischem Verdunner an Tag 11 der Lagerung den Erhalt der Motilitat der Samenzellen bis zu Tag 21 verglichen mit Tag 16 bei Proben ohne Mediumaustausch Erfolgt an Tag 21 ein zweiter Austausch des Substrates so kann die Konservierung der Motilitat bis Tag 27 ausgedehnt werden Durch einen weiteren Mediumaustausch
236. ethoden Spermagewinnung J Spermabeurteilung 4 Aufteilung in drei Aliquote l Aufarbeitung mit den verschiedenen Verd nnern l Untersuchung des verd nnten Spermas unmittelbar nach der Herstellung Tag 0 l Untersuchung der Halteproben 24 Stunden nach Herstellung Tag 1 48 Stunden nach Herstellung Tag 2 72 Stunden nach Herstellung Tag 3 120 Stunden nach Herstellung Tag 5 168 Stunden nach Herstellung Tag 7 240 Stunden nach Herstellung Tag 10 jeweils untersuchte Parameter Vorw rtsbeweglichkeit Lebend Tot F rbung Pathomorphologie Spermac F rbung SpermVision Motilitat und Viabilitat Abb 7 Vorgehensweise bei der Untersuchung der Halteproben Die Untersuchungen der Halteproben erfolgten nach 24 Stunden Tag 1 nach 48 Stunden Tag 2 nach 72 Stunden Tag 3 nach 120 Stunden Tag 5 nach 168 Stunden Tag 7 und nach 240 Stunden Tag 10 nach Herstellung des verd nnten Spermas Folgende Parameter wurden dabei bestimmt Vorwartsbeweglichkeit im Deckglaspraparat Verhaltnis lebender zu toter Spermien Eosinausstrich Pathomorphologie Eosinausstrich Anteil an Kopfkappenveranderungen Spermac Farbung 95 Material und Methoden Des Weiteren erfolgten eine Motilitats sowie eine Viabilitatsanalyse mithilfe des SpermVision Systems 3 7 Statistische Methoden Die Datens tze wurden unter Verwendung des Tabellenkalkulationsprogramms Microsoft
237. euls Test paarweiser Mittelwertvergleich nach Student Newman Keuls verglichen 97 Material und Methoden Zur statistischen Pr fung des Verd nner und Zeiteinflusses auf die untersuchten Spermaparameter w hrend des Untersuchungszeitraumes von zehn Tagen auf Signifikanz wurden zweifaktorielle Varianzanalysen mit Messwiederholungen bez glich der Faktoren Verd nner drei bzw vier verschiedene Verd nner und Zeit Untersuchungszeitpunkte Tage 0 1 2 3 5 7 und 10 eingesetzt Es wurden alle Verd nner jeweils paarweise miteinander verglichen Dabei pr ft der Haupteffekt Verd nner Pvera ob hinsichtlich der untersuchten Parameter zwischen den mit den verschiedenen Verd nnern aufgearbeiteten Ejakulaten gemittelt ber alle Mittelwerte ein Niveauunterschied besteht und der Haupteffekt Zeit Pzeit ob insgesamt ein Zeiteinfluss nachgewiesen werden kann oder anders ausgedr ckt ob im Durchschnitt ber alle verd nnten Ejakulate die Mittelwerte der untersuchten Parameter konstant bleiben Dar ber hinaus pr ft die Wechselwirkung pw ob die Zeitverl ufe zwischen den mit den verschiedenen Verd nnern aufgearbeiteten Ejakulaten parallel bzw gleichsinnig sind Zur Beurteilung der Zusammenh nge zwischen den subjektiv bestimmten und den objektiv mittels CASA gemessenen Werten wurden Korrelationsanalysen durchgef hrt Hierbei wurden alle zeitgleichen Variablenpaare subjektiv gesch tzte Vorw rtsbewegli
238. eutschland Leja Products B V Luzernestraat 10 2153 GN Nieuw Vennep Niederlande MAGV GmbH Laborbedarf und Laborgerate Gie ener Str 48 35466 Rabenau Deutschland Memmert GmbH amp Co KG u ere Rittersbacher Str 38 91126 Schwabach Deutschland 258 Tel 49 0 6441 2004 0 Fax 49 0 6441 2004 44 E Mail info hund de Webseite www hund de Tel 06187 93900 Tel 07146 28386 Tel 541 465 8300 Fax 541 335 0504 Webseite probes invitrogen com Tel 49 0 6441 29 0 Fax 49 0 64 41 29 2590 Webseite www leica microsystems com Tel 31 0 252 621848 Fax 31 0 252 621806 Webseite www leja nl Tel 06407 90388 Fax 06407 8727 E Mail Kontakt MAGV GmbH de Webseite www magv gmbh de Tel 49 0 9122 925 0 Fax 49 0 9122 14585 E Mail sales memmert com Webseite www memmert com Anhang Gerhard Menzel Glasbearbeitungswerk GmbH amp Co KG Saarbruckener Str 248 38116 Braunschweig Deutschland Merck KGaA Frankfurter Str 250 64293 Darmstadt Deutschland Mettler Toledo GmbH Ockerweg 3 Postfach 110840 35353 GieRen Deutschland Miele amp Cie KG Carl Miele Str 29 33332 G tersloh Deutschland Postfach 33325 G tersloh Minit b GmbH Hauptstr 41 84184 Tiefenbach Deutschland Olympus Deutschland GmbH Wendenstr 14 18 20097 Hamburg Deutschland Osram GmbH Hellabrunner Str 1 81543 M nchen Deutschland 259 Tel
239. euztisches zur Ausstattung Fur das Viabilitatsmodul kamen des Weiteren eine Farbbildkamera ein Fluoreszenzmikroskop Standard Labormikroskop BX 41 mit Auflicht Fluoreszenz System Olympus Deutschland GmbH Hamburg mit Filtermodul f r Breitband Blauanregung 115 230 V 50 60 Hz und ein Quecksilber Hochdruckbrenner mit Quecksilberdampflampe Quecksilberdampf Kurzbogenlampe HBO 50 W AC L1 Osram GmbH M nchen zum Einsatz Die Messungen erfolgten in Leja Messkammern Leja Standard Count 4 Chamber Slide Leja Products B V Nieuw Vennep Niederlande welche aus einem Objekttrager mit jeweils vier Kammern A D mit einer standardisierten Tiefe von 20 um bestehen Nach Beschickung einer Messkammer siehe unten bewegte das SpermVision System das Pr parat zur Beurteilung unter dem Mikroskopobjektiv auf vordefinierte Positionen Motilit tsanalyse bzw es wurden mittels Joystick die entsprechenden Positionen eingestellt Viabilit tsanalyse Diese Positionen befanden sich auf der L ngsachse genau entlang der Mittellinie im Zentrum der Messkammer Ziel war es nicht in den verj ngten Kammerbereichen am hinteren und vorderen Kammerende sowie in den seitlichen Randbereichen zu messen Das Messsystem nahm pro Gesichtsfeld innerhalb von 0 5 Sekunden eine Serie von 30 Bildern auf und beurteilte in jedem Bild die Partikel die der voreingestellten Definition der Spermien Fl che von 20 bis 60 um entsprachen Pro Probe wurden jeweils mindeste
240. evity and intracellular Ca concentration of dog spermatozoa Theriogenology 59 8 1725 1739 Pe a F J NUfez Martinez l Moran J M 2006 Semen technologies in dog breeding An update Reprod Dom Anim 41 Suppl 2 21 29 Pe a Martinez A 2004 Canine fresh and cryopreserved semen evaluation Anim Reprod Sci 82 83 209 224 Pesch S Schuler G Wilhelm E Hoffmann B 2007 Samengewinnung konservierung und k nstliche Besamung beim Hund Tierarztl Prax 35 K 81 90 241 Literaturverzeichnis Pinto C R F Eilts B E Paccamonti D L 1998 The effect of reducing hindquarter elevation time after artificial insemination in bitches Theriogenology 50 2 301 305 Pinto C R F Paccamonti D L Eilts B E 1999 Fertility in bitches artificially inseminated with extended chilled semen Theriogenology 52 4 609 616 Pinto C R F Kozink D M 2008 Simplified hypoosmotic swelling testing HOST of fresh and frozen thawed canine spermatozoa Anim Reprod Sci 104 2 4 450 455 Ponglowhapan S Ess n Gustavsson B Linde Forsberg C 2004 Influence of glucose and fructose in the extender during long term storage of chilled canine semen Theriogenology 62 8 1498 1517 Pretzer S D Lillich R K Althouse G C 2006 Single transcervical insemination using frozen thawed semen in the Greyhound A case series study Theriogenology 65 6 1029 1036 Province C A
241. eweils zwei Verd nner bez glich der CASA Vorw rtsbeweglichkeit miteinander verglichen wurden ist dem Anhang zu entnehmen Tab A10 A14 Kap 9 8 4 3 1 4 Weitere mittels CASA bestimmte Motilit tsparameter Die Messergebnisse f r weitere durch CASA SpermVision System bestimmte Motilit tsparameter DAP DCL DSL VAP VCL VSL ALH BCF STR LIN WOB in den mit den verschiedenen Verd nnern aufgearbeiteten Ejakulaten bei Fl ssigkonservierung bei 4 C f r zehn Tage werden im Anhang tabellarisch dargestellt Tab A9 Kap 9 8 Ebenso l sst sich dort eine ausf hrliche Darstellung der Resultate der zweifaktoriellen Varianzanalysen mit Messwiederholungen bez glich der Faktoren Verd nner und Zeit in denen jeweils zwei Verd nner bez glich der genannten CASA Motilit tsparameter miteinander verglichen wurden finden Tab A10 A14 Kap 9 8 129 Ergebnisse Bei Betrachtung der Streckenparameter DAP DCL DSL konnten im Zeitverlauf in allen verdunnten Ejakulaten Abnahmen der Mittelwerte beobachtet werden Dabei waren die Differenzen zwischen Tag 0 und Tag 10 in den mit Up1 2 verd nnten Ejakulaten f r alle drei Parameter am gr ten gefolgt von den mit Up 1 verd nnten Ejakulaten Demgegen ber kam es in den mit CP und TE verd nnten Ejakulaten ber den Untersuchungszeitraum hinweg nur zu einer geringen Reduktion der Mittelwerte Insgesamt lagen die in den mit CP und TE verd nnten Proben gemessenen Werte deutlich
242. f r diese initialen Motilit tssteigerungen wurden jedoch keine Angaben gemacht Ein denkbarer Erkl rungsansatz ist dass es bedingt durch die Substratzufuhr ber den Verd nner zu einer Stoffwechselsteigerung der Spermien Sch fer et al 1997 und somit auch zu einer Steigerung der Motilitat kam Auch nach Weitze und Petrunkina 2007 reagieren S ugersamenzellen nach Verd nnung mit einer gesteigerten Aktivit t Dagegen spricht allerdings dass in den anderen Verd nnern eine solche Motilitatszunahme nicht zu beobachten war obwohl auch hier Energiesubstrate enthalten waren Obwohl Glycerol blicherweise nicht zur Fl ssigkonservierung von Hundesperma eingesetzt wird Province et al 1984 schien das im Verd nner Up 1 enthaltene Glycerol 3 in der vorliegenden Untersuchung keinen unmittelbaren nachteiligen Effekt auf die Motilit t CASA Gesamtmotilitat CASA Vorw rtsbeweglichkeit auszu ben Dies best tigt die Aussage von Province et al 1984 dass der Zusatz von 3 Glycerol keine Auswirkungen auf die Motilitat besitzt Im Gegenteil kam es im Verd nner Up 1 zu einer initialen Steigerung der CASA Gesamtmotilitat und der CASA Vorw rtsbeweglichkeit Betrachtet man allerdings die subjektiv gesch tzte Vorw rtsbeweglichkeit sowie die CASA Motilitatsparameter VAP VCL VSL und BCF so kam es im Verd nner Up 1 zu einer signifikanten Motilit tsreduktion gegen ber dem Nativsperma wodurch die von Province et al 1984 getroffene Aussag
243. farbstoffen SYBR 14 und PI besteht Beide Farbstoffe binden an die DNA der Zellen und reagieren auf eine Anregung mit sichtbarem Licht mit einer Wellenlange von 488 nm durch Fluoreszenzemission SYBR 14 ist membranpermeabel penetriert die Membranen von lebenden und toten Zellen und dient als Marker fur Zellen mit 88 Material und Methoden einer intakten Plasmamembran Wenn der Farbstoff an die DNA gebunden ist liegt das Maximum seiner Fluoreszenzemission bei 516nm die Fluoreszenz ist hellgr n Pl wurde f r die Gegenf rbung eingesetzt Es handelt sich hierbei um einen membranimpermeablen Farbstoff der nur defekte Zellmembranen von gesch digten oder toten Zellen durchdringen kann und in diesen Zellen dann so stark fluoresziert dass die hellgr ne Fluoreszenz von SYBR 14 nicht mehr sichtbar ist Sein Maximum der Fluoreszenzemission liegt in an die DNA gebundenem Zustand bei 617 nm es wird eine starke Rotfluoreszenz abgegeben Beide Farbstoffe f rben nur die Samenzellen an und keine anderen Zellreste Gr n fluoreszierende Spermien stellen somit intakte Spermien dar w hrend rot fluoreszierende Spermien gesch digt sind Garner und Johnson 1995 Produktinformation des Herstellers a F rbung der Proben F r die F rbung der Proben wurden im Vorfeld der Untersuchungen braune Eppendorf Reaktionsgef e Safe Lock Tubes 0 5 ml Eppendorf AG Hamburg mit je 2 5 ul der F rbel sung Herstellungsanleitung siehe Kap 9 5 3 3 gef llt
244. fluss besitzt konnten Koderle et al 2009 infolge der Zentrifugation eine Reduktion der Motilit t nach dem Auftauen und eine Erh hung des Prozentsatzes an morphologisch anormalen Spermien sowie des Grades der 36 Literatur Chromatindenaturierung der Spermien im Zeitverlauf nachweisen sodass zumindest vor der Kryokonservierung das Zentrifugieren nicht l nger per se empfohlen werden kann Die Zugabe des Verd nners zum Sperma sollte umgehend nach der Gewinnung Foote und Leonard 1964 tropfenweise unter leichtem Schwenken erfolgen Pesch et al 2007 wobei Verd nner und Sperma die gleiche Temperatur ca 35 C Andersen 1980 Nishiyama et al 1999 haben sollten Linde Forsberg 1991 1995 Die Verd nnungsrate Verh ltnis von Ejakulat zu Verd nner variiert von 1 1 bis 1 20 Foote 1964a Foote und Leonard 1964 Andersen 1980 Christiansen 1984a Linde Forsberg 1991 Nishiyama et al 1999 Pinto et al 1999 Iguer Ouada und Verstegen 2001b Pe a et al 2006 Pesch et al 2007 wobei blicherweise Verd nnungen zwischen 1 3 und 1 5 eingesetzt werden Gunzel 1986 Linde Forsberg 1991 1995 Pefa et al 2006 Andere Autoren empfehlen eine Verd nnung auf eine Dichte von 100 200 bzw 300 x 10 Samenzellen pro ml Tsutsui et al 2003b Ponglowhapan et al 2004 Shahiduzzaman und Linde Forsberg 2007 Lopes et al 2009a Nizanski et al 2009 Optimalerweise ist die Verd nnung von der initialen Spermienkonzentr
245. ft Morton und Bruce 1989 bzw der eine Erhaltung des genetischen Potenzials von gef hrdeten Rassen sichert Thomassen und Farstad 2009 den Z chtern von Diensthunden wie Sprengstoffsp r Drogensp r und Blindenbegleithunden etc erm glicht die Kryokonservierung von Sperma die Kastration der m nnlichen Tiere in einem fr hen Alter w hrend die Verf gbarkeit ihrer Gene erhalten bleibt bis ihre Leistung getestet wurde England und Millar 2008 M glichkeit zur Bergung genetischen Materials vor einer medizinischen Behandlung bei einem kranken m nnlichen Tier Thomassen und Farstad 2009 die Notwendigkeit R den in Zuchtzwingern zu halten wird reduziert wodurch Kosten gesenkt werden k nnen England und Millar 2008 Trotz der vielen Vorteile gibt es jedoch auch einige m gliche Nachteile der KB Dazu z hlen folgende Punkte Verursachen eines physischen oder psychischen Traumas w hrend der Durchf hrung der KB England und Millar 2008 Ausf hrung einer KB aus unangemessenen Gr nden z B wenn der Zuchtausschluss eines Tieres aufgrund einer erblichen Krankheit wie H ftgelenksdysplasie oder anatomischer Anomalit t des Reproduktionstraktes erfolgte England und Millar 2008 Literatur potenzielle Einschleppung von Erbkrankheiten oder Anomalien in die Population England und Millar 2008 m gliche berbeanspruchung einzelner R den in einem Zuchtprogramm oder innerhalb einer bestimmten Rasse Engl
246. fugationskraft verursacht werden zustande 205 Diskussion kommen Koderle et al 2009 konnten Rijsselaere et al 2002a bez glich der Pathomorphologie keine signifikanten Unterschiede zwischen verschiedenen Zentrifugationsgeschwindigkeiten finden In der vorliegenden Arbeit konnte eine nachteilige Beeinflussung der Morphologie der Samenzellen durch die Zentrifugation nicht nachgewiesen werden da der Anteil an morphologisch ver nderten Samenzellen in zentrifugierten Proben nicht signifikant h her war als in nicht zentrifugierten Proben W hrend in der vorliegenden Arbeit hinsichtlich der Pathomorphologie unmittelbar nach dem Verd nnen keine signifikanten Unterschiede zwischen den verschiedenen Verd nnern bestanden siehe Kap 5 3 2 4 war dies wohl aber bei Betrachtung des gesamten Zeitverlaufs der Fl ssigkonservierung der Fall Hier unterschieden sich die Verd nner CP und TE signifikant voneinander wobei im Verd nner TE bis einschlie lich Tag 3 ein h herer Anteil an morphologisch ver nderten Spermien beobachtet werden konnte als im Verd nner CP w hrend die Zeitverl ufe ber den restlichen Untersuchungszeitraum sehr hnlich waren Des Weiteren konnte zwischen den mit CP und den mit Up 1 2 aufgearbeiteten Ejakulaten ein signifikanter Unterschied der Zeitverl ufe ermittelt werden Dabei war zun chst in den mit Up 1 2 aufgearbeiteten Ejakulaten bis einschlie lich Tag 2 ein h herer Anteil an morphologisch ver ndert
247. g der Spermiendefekte erfolgt bei 1000 facher Vergr erung mit limmersion Soderberg 1986 Morphologische Ver nderungen der Samenzellen k nnen nach ihrem Ursprung in prim re sekund re und terti re Ver nderungen Christiansen 1984b Oettl und Soley 1988 Hoffmann 2003c in Haupt Major und Nebendefekte Minor 20 Literatur Oettl und Soley 1988 sowie nach ihrer Lokalisation in Kopf Mittelstuck und Schwanzveranderungen eingeteilt werden Morton und Bruce 1989 Primare Veranderungen entstehen wahrend der Spermatogenese im Keimepithel der Hoden Christiansen 1984b Hoffmann 2003c Die haufigste primare Veranderung stellen proximale Zytoplasmatropfen dar Morton und Bruce 1989 Als sekund re Ver nderungen welche nach dem Vorgang der Spermiation d h nach Abgabe der Spermien in das Lumen der Tubuli seminiferi contorti entstehen Hoffmann 2003c k nnen geknickte oder gekr mmte Schw nze abgel ste K pfe distale Zytoplasmatropfen und abgel ste Akrosome angesehen werden Johnston 1991 Hoffmann 2003c Terti re Ver nderungen entstehen nach Abgabe der Samenzellen aus dem m nnlichen Genitale und hneln weitestgehend den sekund ren Ver nderungen Hoffmann 2003c Hauptdefekte sind erwiesenerma en mit einer verminderten Fertilit t assoziiert w hrend Nebendefekte erst zu einer herabgesetzten Fertilitat f hren wenn sie in gro er Anzahl auftreten Oettl amp und Soley 1988 Es gibt verschie
248. g nach zw lf Tagen Fl ssigkonservierung in TRIS Fruktose Eigelb Verd nner betr gt der mittels Triple F rbetechnik bestimmte Anteil an Samenzellen mit Verlust des Akrosoms etwa 11 Tsutsui et al 2003b 208 Diskussion Auch in der vorliegenden Untersuchung kam es in den mit CP TE und Up1 verdunnten Ejakulaten im Zeitverlauf der Flussigkonservierung bei 4 C Uber zehn Tage zu signifikanten Zunahmen des mittels Spermac F rbung bestimmten Anteils an Samenzellen mit Kopfkappenver nderungen Pzei 0 0006 bis lt 0 0001 Ebenso konnten bei getrennter Betrachtung der einzelnen Kopfkappenver nderungen in den mit CP TE und Up 1 verd nnten Ejakulaten signifikante Zunahmen der Anteile an abgel sten Kopfkappen an schiefen Kopfkappen und an sonstigen Ver nderungen ermittelt werden Dies ist sinngem bereinstimmend mit den Ergebnissen anderer Autoren welche nach Fl ssigkonservierung f r eine Lagerungsdauer von 3 bis 23 Tagen in TRIS Glukose Eigelb Verd nnern bzw in Trockenmagermilch Glukose Verd nner mittels Spermac Nigrosin Eosin oder FITC PNA Fluoreszenzf rbung signifikante Abnahmen des Anteils an Samenzellen mit intakten Akrosomen nachweisen konnten England und Ponzio 1996 Shahiduzzaman und Linde Forsberg 2007 Michael et al 2009 2010 Allerdings war verglichen mit den Zunahmen des Anteils an Samenzellen mit akrosomalen Ver nderungen in den eigenen Untersuchungen das Ausma der Abnahmen des Anteils an Sam
249. gation der Nativejakulate mit folgendem Abpipettieren des Seminalplasma berstandes Versuchsteile und II und die einst ndige quilibrierung bei 4 C nach dem Zusatz von Verd nner 1 bzw vor dem Zusatz von Verd nner 2 nur Versuchsteil I Diese Unterschiede bez glich der Aufarbeitung m ssen bei der Interpretation der Versuchsergebnisse Ber cksichtigung finden da insbesondere die Auswirkungen von Seminalplasma auf den Konservierungserfolg und die Effekte der Zentrifugation auf die Samenzellen in der Literatur kontrovers diskutiert 174 Diskussion werden siehe Kap 2 4 1 1 Weiterhin ist zu beachten dass in Versuchsteil bedingt durch die einst ndige Aquilibrierung bei 4 C die Untersuchung der mit Up 1 2 aufgearbeiteten Aliquote nicht zeitgleich mit der Untersuchung der mit CP und der mit TE aufgearbeiteten Aliquote erfolgte Letztere wurden unmittelbar nach dem Verd nnen untersucht w hrend die mit Up 1 2 aufgearbeiteten Aliquote erst nach vorheriger Abk hlung auf 4 C und anschlie endem Wiedererw rmen auf 37 C untersucht wurden Durch die unterschiedliche Aufarbeitung mit den verschiedenen Verd nnern kam es auch zu Unterschieden in den Endverd nnungen der fl ssigkonservierten Ejakulate Die mit CP und die mit TE aufgearbeiteten Aliquote hatten aufgrund des gleichen Aufarbeitungsschemas ann hernd die gleichen Endkonzentrationen F r die mit dem Uppsala Equex 2 System Verd nner aufgearbeiteten Aliquote galt die
250. ge Fertilit t des Spermas sein Soderberg 1986 l d R weisen R den mit hoher Fertilitat gt 80 progressiv bewegliche Samenzellen auf Soderberg 1986 wobei mindestens 70 75 vorwartsbewegliche Samenzellen als Referenzwert angesehen werden Fielden 1971 Johnston 1991 Linde Forsberg 1991 Freshman 2002 Hoffmann 2003b Eine Verminderung der Spermienmotilitat ist eine haufige fruhzeitig eintretende nichtspezifische Veranderung die bei Hunden mit einer Infektion oder anderen Erkrankungen gefunden werden kann Johnston 1991 Motile Spermien sind jedoch nicht zwangsl ufig auch fertil da z B nach der Kryokonservierung und dem Auftauen akrosomale Sch digungen und Ver nderungen der Plasmamembran auftreten k nnen die zwar die Fertilit t aber nicht die Motilit t beeinflussen Eilts 2005a 19 Literatur b Lebend Tot Farbung Zur Differenzierung von lebenden und toten Samenzellen kann eine Nigrosin Eosin Farbung genutzt werden Nach Anfertigung des Ausstriches werden zur Beurteilung mindestens 200 Spermien ausgez hlt indem ungef rbte als lebend und gef rbte als tot gewertet werden Nachteilig an dieser Untersuchungsmethode ist dass die Interpretation von ungef rbt und gef rbt zwischen verschiedenen Untersuchern variieren kann Campbell et al 1956 Riesenbeck et al 2001 und Hoffmann 2003b empfehlen im Gegensatz zur vorgenannten Methode zur Beurteilung des Anteils an lebenden Samenzellen die Supravitalf rbung
251. gegeben und mit einem weiteren Objekttr ger ausgestrichen Dieser Ausstrich wurde ca f nf Minuten luftgetrocknet und dann in der Fixierl sung Fixans f r f nf bis zehn Minuten fixiert Danach erfolgte ein Waschen des Objekttr gers durch mehrfaches Eintauchen und Schwenken in einem Becherglas mit Leitungswasser bevor f r zwei Minuten mit F rbel sung A Reagenz A rot gef rbt wurde Anschlie end wurde der Objekttr ger zweimal wie oben beschrieben gewaschen und in F rbel sung B Reagenz B blassgr n berf hrt in der er f r eine Minute verblieb Nach nochmaligem Waschen wurde er dann f r eine Minute in F rbel sung C Reagenz C dunkelgr n gegeben und im Anschluss ein letztes Mal gewaschen Das Wasser zum Waschen der Objekttr ger wurde nach jedem Waschvorgang ausgetauscht und nach jedem Waschen wurde der Objekttr ger mit der schmalen unteren Seite auf saugf higes Zellstoffpapier gedr ckt um restliches Wasser zu entfernen Nach dem letzten Waschen wurde der gef rbte Ausstrich luftgetrocknet und im Anschluss wurden 200 Spermien bei 1000 facher Vergr erung mit limmersion und negativem Phasenkontrast beurteilt Die verschiedenen Spermienanteile stellten sich wie folgt dar Akrosom Kopfkappe gr n Kern rot aquatoriales Band blassgr n Mittelst ck und Schwanz gr n Bei Normospermie sollte der Anteil an akrosomgesch digten Spermien im Gesamtejakulat 5 nicht bersteigen und der Anteil pathologisch ver nderter Sa
252. gelb TRIS Verd nner bei 53 6 verglichen mit 30 4 im Eigelb Milch Verd nner und 14 1 im Eigelb Sahne Verd nner Zus tzlich wiesen die Samenzellen im Eigelb TRIS Verd nner die h chsten Spermiengeschwindigkeiten auf Hinsichtlich des Akrosomstatus beurteilt anhand Spermac Farbung und der Plasmamembranintegritat beurteilt anhand Fluoreszenzf rbung mit CFDA PI und HOS Test waren jedoch keine 67 Literatur Unterschiede zwischen den Verdunnern nachweisbar Zusammenfassend scheint der Eigelb TRIS Verd nner fur die Konservierung von caninem Sperma bei 4 C besser geeignet zu sein als die anderen getesteten Verd nner Rota et al 1995 Iguer Ouada und Verstegen 2001b verglichen in ihren Untersuchungen die drei kommerziellen Verd nner Green Verd nner Fresh phos Verd nner und Biladyl Verd nner jeweils ohne und mit 20 Eigelbzusatz sowie die vier nichtkommerziellen Verd nner TRIS Fruktose Verd nner TRIS Glukose Verd nner TRIS BES Verd nner und EDTA Verd nner alle mit 20 Eigelbzusatz hinsichtlich ihrer Eignung zur Fl ssigkonservierung von Hundesperma bei 4 C Die Untersuchungen wurden solange durchgef hrt bis keine Motilit t mehr nachweisbar war Unterschiede zwischen den kommerziellen Verd nnern ohne und mit Eigelbzusatz waren hinsichtlich Gesamtmotilitat und anderen Motilit tsparametern Vorw rtsbeweglichkeit VAP VSL VCL erst ab Tag 1 feststellbar wobei die eigelbhaltigen Verd nner berlegen wa
253. gen bedingt sein Die gew hlten Einstellungen wurden in der vorliegenden Arbeit sowohl f r die Messung der Nativejakulate als auch f r die Messung des fl ssigkonservierten Spermas verwendet Dadurch war ein direkter Vergleich der Messergebnisse vor 163 Diskussion und nach Fl ssigkonservierung m glich ohne dass eine Beeinflussung durch verschiedene Einstellungen auftreten konnte Tab 25 Vergleichende Darstellung der verwendeten technischen Einstellungen fur die Motilitatsanalyse mit den von Schafer Somi und Aurich 2007 genutzten Einstellungen Abkurzungen siehe Abkurzungsverzeichnis Parameter verwendete Einstellung Schafer Somi und Aurich 2007 Probenschichtdicke 20 um 20 um Pixel zu um Verh ltnis 168 zu 100 keine Angabe Spermienerkennung 20 60 um 35 um Z hlkriterien 4000 Spermien oder 7 Felder mit 100 Zellen 8 Felder pro Feld Punkte bei der 11 keine Angabe Spermienbewegung Gesamtmotilitat Die Gesamtmotilitat ergibt sich aus der Summe der lokal und der vorwarts beweglichen Spermien VCL gt 15 um s unbewegliche Spermien AOC lt 9 5 AOC lt 9 5 lokalbewegliche Spermien DSL lt 6 0 um keine Angabe vorw rtsbewegliche Spermien Jede Zelle die nicht als unbeweglich oder lokalbeweglich VCL gt 15 um s STR gt 0 9 schnell vorw rtsbewegliche eingestuft wurde Spermien hyperaktive Spermien VCL gt 118 um s VCL gt 118 um s
254. geron et al 2007 Wahrscheinlich interagieren Caseine die Hauptproteine der Milch mit den Seminalplasmaproteinen Bergeron und Manjunath 2006 Bergeron et al 2007 W hrend es sich bei der Bindung von LDL aus Eigelb an die Seminalplasmaproteine um eine Protein Lipoprotein Interaktion handelt fangen in der Milch die Caseinmicellen die Seminalplasmaproteine ab was eine Protein Protein Interaktion darstellt Bergeron et al 2007 Au erdem scheint auch Laktose in den Prozess der Spermienprotektion durch Milch involviert zu sein Sie scheint die Effektivit t des Verd nners zu verbessern ist alleine aber nicht ausreichend zum Schutz der Spermien Bergeron und Manjunath 2006 Wie Eigelb ist auch Milch ein Produkt tierischen Ursprungs das in seiner Zusammensetzung nicht konstant ist und das potentielle Risiko einer Spermakontamination in sich birgt Bergeron und Manjunath 2006 2 5 2 4 Kryoprotektiva Der Zusatz von Kryoprotektiva zu Spermaverd nnern reduziert Gefriersch den Concannon und Battista 1989 und verbessert so das berleben der Samenzellen nach dem Einfrierprozess England 1993 Die Tiefgefrierung von Hundespermien in Abwesenheit eines Kryoprotektivums resultiert in einer starken Reduktion der Anzahl an berlebenden motilen Spermien nach dem Auftauen Concannon und Battista 1989 Kryoprotektive Substanzen lassen sich in zwei Gruppen einteilen 1 zellpenetrierende Substanzen wie Glycerol Dimethylsulfoxid DMSO
255. gkeiten und normalen Wurfgr en f hren kann Linde Forsberg 1991 Subjektive Sch tzungen von Spermaparametern sind durch zahlreiche Faktoren beeinflusst unter denen die Erfahrung der Untersucher eine wichtige Rolle spielt Verstegen et al 2002 Diese Subjektivit t der Analyse bei der konventionellen mikroskopischen Untersuchung insbesondere bei der Bestimmung der Motilitat und der Pathomorphologie Amann 1989 macht den Vergleich von Ergebnissen aufgrund hoher Variabilit t zwischen verschiedenen Laboren und Untersuchern schwierig Iguer Ouada und Verstegen 2001a 2001c Zusammenfassend ist die begrenzte Aussagekraft der mittels konventioneller lichtmikroskopischer Untersuchungstechniken gewonnenen Ergebnisse durch deren Subjektivit t Variabilit t der geringen Anzahl an untersuchten Samenzellen und der niedrigen Korrelation mit dem Befruchtungspotenzial bedingt was die Notwendigkeit neuer erganzender in vitro Untersuchungstechniken wie Computer gest tzten Methoden zur Beurteilung von Motilitat und Morphologie sowie Durchflusszytometrie erl utert Pena Martinez 2004 Rijsselaere et al 2005 2 3 1 Konventionelle Spermauntersuchung blicherweise erfasste Ejakulatparameter sind Volumen Aussehen pH Wert Dichte SGZ Bewegungsaktivitat der Samenzellen sowie die Anteile eosingef rbter und morphologisch abweichender Samenzellen G nzel 1986 2 3 1 1 Makroskopische Untersuchung Einleitend erfolgt die makroskopische Un
256. h die Unterschiede zwischen den mit CP und den mit Up 1 verd nnten Proben p lt 0 01 sowie die zwischen den mit TE und den mit Up 1 verd nnten Proben p lt 0 01 als signifikant zu bewerten Tab A6 A8 Kap 9 8 Die folgende Tabelle Tab 14 gibt die durchschnittlichen mittels CASA bestimmten Werte des Motilit tsparameters ALH der Ejakulate vor und unmittelbar nach dem Verd nnen Tag 0 wieder Auch bei diesem Parameter fiel auf dass es in den verd nnten Ejakulaten im Vergleich mit dem Nativsperma stets zu einer Abnahme der Mittelwerte kam Hier konnte allerdings in den mit Up 1 verd nnten Proben die geringste Reduktion gesehen werden und aber wieder in den mit Up 1 2 verd nnten Proben die st rkste Tab 14 CASA Motilit tsparameter ALH n x SD Min Max im Nativsperma und in den verschiedenen Verd nnern an Tag 0 Verd nner n x SD um Min um Max um keiner Nativsperma 30 5 7 41 0 3 5 7 9 CP 30 5 2 0 8 3 6 6 8 TE 30 5 4 0 9 3 4 7 5 Up1 2 12 4 4 0 6 3 4 5 4 Up 1 18 5 5 0 8 3 8 6 7 In den einfaktoriellen Varianzanalysen und den paarweisen Vergleichen nach Student Newman Keuls bestanden bez glich des Parameters ALH signifikante Unterschiede zwischen dem Nativsperma und den mit CP p lt 0 05 sowie den mit Up 1 2 p lt 0 01 aufgearbeiteten Ejakulaten Auch zwischen den mit CP und den mit Up 1 2 verd nnten Proben sowie zwischen den mit TE und den mit Up1 2 verd nnten Pr
257. h sichtbar gemacht werden Der Spermienschwanz erscheint dabei aufgerollt Jeyendran et al 1992 Dieses Ph nomen wird als tail curling Jeyendran et al 1992 oder curled tail Riesenbeck et al 2001 bezeichnet Die Auspr gung der typischen Aufrollung des Schwanzes kann unterschiedlich sein siehe Abb 1 wird aber trotzdem einheitlich als curled tail benannt Riesenbeck et al 2001 Nur Samenzellen mit einer chemisch und physikalisch intakten Plasmamembran zeigen im hypoosmotischen Milieu tail curling Obwohl der HOS Test also in erster Linie nur die Integrit t der Schwanzmembran erfasst kann davon ausgegangen werden dass eine funktionell intakte Schwanzmembran einen guten Indikator daf r darstellt dass auch die Plasmamembran des Kopfes intakt ist Die biochemische Integrit t der Plasmamembran ist essentiell f r die normale Spermienfunktion Nicht nur die metabolischen Prozesse die w hrend der Spermienbewegung ablaufen sondern auch die Vorg nge die w hrend der Befruchtung stattfinden wie z B die Kapazitation die Akrosomreaktion AR und die Bindung der Spermien an die Eizelloberfl che sind auf die biochemische Integrit t der Plasmamembran angewiesen Jeyendran et al 1992 Als geeignet f r den HOS Test erwiesen sich 150 mosmol Natriumzitrat Fruktose L sung Jeyendran et al 1984 England und Plummer 1993 Riesenbeck et al 2001 60 mosmol Fruktose L sung Kumi Diaka 1993 sowie 100 mmol Sac
258. he differences to the other extenders tested were not significant for all the parameters Due to these results the extender CP seems to be superior to the other extenders tested and is therefore recommended for chilling of canine semen at 4 C However as in the present study it remained unclear to what extent the fertility of the chilled extended semen changes over time and what effects the extenders tested have on preservation of the fertilizing capacity of the sperm cells further studies are necessary to characterize the preservation of the fertilizing capacity in vivo and in vitro 226 Literaturverzeichnis 8 Literaturverzeichnis Alhaider A K Watson P F 2009 Cryopreservation of dog semen The effects of Equex STM paste on plasma membrane fluidity and the control of intracellular free calcium Anim Reprod Sci 110 1 2 147 161 Althouse G C Ko J C Hopkins S M Evans L E 1991 Effect of latex and vinyl examination gloves on canine spermatozoal motility J Am Vet Med Assoc 199 2 227 229 Amann R P 1989 Can the fertility potential of a seminal sample be predicted accurately J Androl 10 2 89 98 Amann R P Hammerstedt R H 1980 Validation of a system for computerized measurements of spermatozoal velocity and percentage of motile sperm Biol Reprod 23 3 647 656 Amann R P Hammerstedt R H 1993 In vitro evaluation of sperm quality An opinion J Androl 14 6 3
259. hen den mit TE und den mit Up 1 2 sowie mit Up 1 verd nnten Ejakulaten unterschieden sich f r alle drei Parameter signifikant pw 0 0007 bis lt 0 0001 Tab A10 A14 Kap 9 8 F r die Geschwindigkeitsparameter VAP VCL VSL galt hnliches wie f r die Streckenparameter Auch hier waren im Zeitverlauf in allen verd nnten Ejakulaten Abnahmen der durchschnittlichen Messwerte zu beobachten und die Differenzen zwischen Tag 0 und Tag 10 waren f r die Parameter VCL und VSL in den mit 130 Ergebnisse Up 1 2 verd nnten Ejakulaten am gr ten gefolgt von den mit Up 1 verd nnten Ejakulaten Lediglich f r den Parameter VAP war die Differenz zwischen Tag 0 und Tag 10 in den mit Up 1 verd nnten Ejakulaten am gr ten unterschied sich aber nur geringf gig von der in den mit Up 1 2 verd nnten Ejakulaten In den mit CP und TE verd nnten Ejakulaten waren die Differenzen und damit die Reduktion der Mittelwerte im Zeitverlauf wesentlich geringer Auch insgesamt lagen die in den mit CP und TE aufgearbeiteten Ejakulaten gemessenen Werte wieder deutlich ber denen in den mit Up 1 2 sowie nur mit Up 1 aufgearbeiteten Ejakulaten Dabei waren die Mittelwerte f r die Parameter VAP und VCL in den mit CP und TE aufgearbeiteten Ejakulaten sogar an Tag 10 noch h her als in die in den mit Up 1 2 aufgearbeiteten Ejakulaten an Tag 0 F r den Parameter VSL galt Letzteres nur in den mit CP aufgearbeiteten Ejakulaten Generell konnten in den mit C
260. hiduzzaman und Linde Forsberg 2007 Die akzeptablen Motilitatsergebnisse schwanken je nach Autor zwischen einer Dauer von vier und bis zu mehr als zehn Tagen Glukose scheint als Energiesubstrat besser geeignet zu sein als Fruktose da mit Glukose uber etwa 13 Iguer Ouada und Verstegen 2001b bzw 14 Tage Shahiduzzaman und Linde Forsberg 2007 akzeptable Motilitatswerte erzielt wurden im Vergleich zu etwa zehn Tagen mit Fruktose Iguer Ouada und Verstegen 2001b Inwieweit dies auf eine Praferenz von Hundespermien fur die Metabolisierung von Glukose anstelle von Fruktose hindeutet Iguer Ouada und Verstegen 2001b bleibt 73 Literatur unbeantwortet Lecithin scheint eine geeignete Alternative zu Eigelb zu sein da die Konservierungsergebnisse vergleichbar Beccaglia et al 2009a oder sogar uberlegen sind Kmenta et al 2011 74 Material und Methoden 3 Material und Methoden 3 1 Probanden Das f r die Untersuchungen genutzte Sperma wurde im Zeitraum von April bis Juni 2010 in der Klinik f r Geburtshilfe Gyn kologie und Andrologie der Gro und Kleintiere mit Tierarztlicher Ambulanz der Justus Liebig Universit t Gie en KGGA von 30 gesunden und zuchttauglichen R den 16 verschiedener Rassen im Alter von ein bis neun Jahren 3 4 2 2 Jahre gewonnen Die Rasseverteilung innerhalb des Probandenkollektivs sowie weitere Angaben zu den einzelnen Hunden sind in Tab 5 wiedergegeben Tab 5 Angaben zu den einz
261. hr lebende Samenzellen nachweisen lie en als in den Nativejakulaten konnte in hnlicher Weise auch bei Burgess et al 2001 gefunden werden Hier enthielten die verd nnten Proben nach Nigrosin Eosin F rbung ebenfalls immer einen leicht h heren Anteil an lebenden Spermien als die Nativejakulate Nach Ansicht der Autoren ist dies vermutlich auf eine durch Verd nnerbestandteile insbesondere Eigelb verursachte Agglutination der Spermien in den mit Nigrosin Eosin gef rbten Ausstrichen zur ckzuf hren da agglutinierte Spermien von der Beurteilung ausgeschlossen wurden weil die einzelnen Spermienk pfe schwierig zu erkennen waren Zudem neigen gerade unbewegliche und tote Samenzellen eher zu Agglutinationen Campbell et al 1956 was letztlich in einer Untersch tzung ihrer Anzahl resultierte Burgess et al 2001 Diese Theorie k nnte auch die in der vorliegenden Arbeit ermittelten Ergebnisse erkl ren Weiterhin l sst sie sich auch auf die tendenziellen Zunahmen der mittels CASA nach SYBR 14 Pl Farbung gemessenen Viabilitat in den Verd nnern CP TE und Up1 anwenden da das SpermVision System agglutinierte Spermien ebenfalls automatisch von der Beurteilung ausschlie t 5 3 2 4 Pathomorphologie Der Gesamtanteil an morphologisch ver nderten Samenzellen in den mit den verschiedenen Verd nnern aufgearbeiteten Ejakulaten zeigte unmittelbar nach dem Verd nnen in den Verd nnern CP und TE signifikante Unterschiede zum Nativsperma wobei
262. hreren H ndinnen aliquotiert werden soll verst rkt auf die korrekte Verd nnung der Ejakulate geachtet werden da die daraus resultierende Spermiendichte und somit auch die SGZ in den fl ssigkonservierten Ejakulaten von entscheidender Bedeutung f r die Kalkulation der ben tigten Besamungsdosis bei Verwendung zur KB ist 5 3 2 2 Motilit t Unmittelbar nach Zugabe der verschiedenen Verd nner zu den Nativejakulaten konnte bez glich der subjektiv gesch tzten Vorwartsbeweglichkeit in allen 180 Diskussion verd nnten Ejakulaten eine tendenzielle Motilit tsreduktion beobachtet werden welche jedoch nur bei den mit Up 1 aufgearbeiteten Ejakulaten als signifikant zu beurteilen war p lt 0 05 Zwischen den verschiedenen Verd nnern untereinander gab es keine signifikanten Unterschiede bez glich der subjektiv gesch tzten Vorw rtsbeweglichkeit Bei Betrachtung der CASA Gesamtmotilitat lie sich nur in den mit CP und Up 1 2 verd nnten Ejakulaten eine tendenzielle Abnahme beobachten w hrend der durchschnittliche Wert in den mit TE verd nnten Ejakulaten nahezu konstant blieb und in den mit Up1 verd nnten Ejakulaten im Vergleich mit dem Nativsperma sogar anstieg Bez glich der CASA Vorw rtsbeweglichkeit konnte in den mit CP TE und Up 1 2 verd nnten Ejakulaten eine Reduktion der Motilitat gesehen werden und in den mit Up 1 verd nnten Ejakulaten wiederum eine Zunahme Verglichen mit den Nativejakulaten erwies sich keine der genan
263. hung des Ejakulates besteht aus der Messung des pH Wertes Dieser wird mithilfe von Indikatorpapier bestimmt Freshman 2002 Alternativ kann auch ein pH Meter verwendet werden Bartlett 1962b Als physiologisch wird ein pH Wert im Gesamtejakulat zwischen 6 3 und 6 6 Seager und Platz 1977b bzw 6 7 Johnston 1991 angesehen In der ersten Fraktion liegt der mittlere pH Wert bei 6 4 in der zweiten bei 6 2 und in der dritten bei 6 5 Bartlett 1962b Bei Hunden mit bakterieller Infektion der Prostata k nnen abweichende Werte gefunden werden wobei der pH Wert i d R saurer wird Dies kann fur die Wahl des Antibiotikums von entscheidender Bedeutung sein da sich beispielsweise in saurem Seminalplasma eher basische Antibiotika besser anreichern Johnston 1991 Im Falle einer Infektion stellt der pH Wert also eine n tzliche Hilfe bei der Auswahl eines geeigneten antibakteriellen Wirkstoffes dar Freshman 2002 2 3 1 3 Mikroskopische Untersuchung An die makroskopische Untersuchung schlie t sich die mikroskopische Untersuchung des Spermas an Diese umfasst die Beurteilung der Motilit t der Samenzellen der Intaktheit der Plasmamembran und des qualitativen und quantitativen Vorkommens morphologisch ver nderter Samenzellen sowie die Bestimmung der Dichte und der SGZ Weiterhin wird auf sonstige mikroskopische Beimengungen geachtet Hoffmann 2003b 18 Literatur a Motilitat Die Beurteilung der Motilitat sollte sofort im Anschlus
264. i verschiedene Verd nner f r die Fl ssigkonservierung von caninem Sperma bei 4 C vergleichend untersucht Dabei handelte es sich um den kommerziellen Verd nner CaniPRO Chill 10 CP und zwei nichtkommerzielle Verd nner TRIS Fruktose Eigelb Verd nner TE und Uppsala Equex 2 System Beim zweiphasigen Uppsala Equex 2 System waren zwei Versuchsteile zu unterscheiden In Versuchsteil erfolgte die Verd nnung mit Verd nner 1 und Verd nner 2 des Uppsala Equex 2 Systems Up 1 2 in Versuchsteil II nur mit Verd nner 1 Up 1 Ziel der vorliegenden Untersuchungen war es den am besten geeigneten Verd nner f r die Fl ssigkonservierung von Hundesperma bei 4 C ber einen Lagerungszeitraum von zehn Tagen zu bestimmen Zudem sollte gepr ft werden wie lange eine akzeptable Spermaqualit t in den verd nnten Ejakulaten aufrechterhalten werden kann Dazu wurde von 30 R den jeweils ein Ejakulat fraktioniert gewonnen und die spermienreiche Fraktion mittels klassischer und moderner spermatologischer Untersuchungsmethoden CASA System SpermVision hinsichtlich Motilit t subjektiv gesch tzte Vorw rtsbeweglichkeit VW CASA Gesamtmotilitat GMcasa CASA Vorw rtsbeweglichkeit VWcasa Viabilitat Lebend Tot Anteil im Eosinausstrich Lebende CASA Viabilitat nach SYBR 14 Pl Farbung Viacasa Pathomorphologie Eosinausstrich Patho akrosomaler Veranderungen Spermac Farbung AV und funktioneller Integritat der Plasmamembran Anteil a
265. ie Konservierung des Spermas ist nur die 14 Literatur zweite Fraktion von Interesse Fielden 1971 Linde Forsberg 1991 1995 da das Seminalplasma einen nachteiligen Effekt auf die Uberlebensdauer sowie die Kaltetoleranz der Samenzellen besitzt Andersen 1980 Das gewonnene Sperma sollte vor abrupten Temperatur nderungen berm igem Sch tteln Wasser Desinfektions und Reinigungsmitteln gesch tzt werden Obwohl canines Sperma nicht so k lteempfindlich ist wie das Sperma anderer Haustierspezies wie beispielsweise das von Rind oder Pferd ist es jedoch sehr empfindlich gegen ber Hitze sodass bis zur Weiterverarbeitung eine Aufbewahrung zwischen K rper 37 C und Raumtemperatur 20 C empfohlen wird Kutzler 2005 2 3 Spermauntersuchung Ziel einer Spermauntersuchung ist die Voraussage der Befruchtungsf higkeit einer Spermaprobe Pe a Martinez 2004 weshalb sie integraler Bestandteil der Untersuchung auf Zuchttauglichkeit und auch im Rahmen der Herstellung von fl ssig oder kryokonserviertem Sperma Riesenbeck et al 2001 oder der KB Pena et al 2006 unerl sslich ist Zweck der Untersuchung von nativem Sperma ist es die normale Funktion von Hoden und Nebenhoden zu beurteilen wohingegen die Untersuchung von kryokonserviertem Sperma eher dahin gerichtet ist den Grad an Zellsch digungen der durch die Kryokonservierung verursacht wurde zu ermitteln Pena Martinez 2004 und somit zu bestimmen ob ein indivi
266. ie am h ufigsten verwendeten Medien milch oder eigelbbasierte Verd nner mit unterschiedlichen Variationen Pinto et al 1999 Der erste erfolgreich eingesetzte Verd nner war pasteurisierte und f r zehn Minuten auf 92 94 C erhitzte Milch Harrop 1954 1956 Heutzutage ist einer der gebr uchlichsten Verd nner ein TRIS gepufferter Eigelb Verd nner mit 20 Eigelb und entweder Glukose oder Fruktosezusatz G nzel 1986 Concannon und Battista 1989 Linde Forsberg 1995 Iguer Ouada und Verstegen 2001b Hermansson und Linde Forsberg 2006 G nzel Apel 2007 Pesch et al 2007 Ein weiterer g ngiger Verdunner besteht aus 80 homogenisierter pasteurisierter Sahne 12 Fett und 20 Eigelb Linde Forsberg 1991 Grunds tzlich k nnen kommerzielle und nichtkommerzielle d h selbst im Labor hergestellte Verd nner unterschieden werden Die quantitative Zusammensetzung kommerzieller Verdunner ist oftmals unbekannt da sie von den Herstellern nicht offengelegt wird Linde Forsberg 1995 Iguer Ouada und Verstegen 2001b Dies in Kombination mit dem Fehlen von objektiven wissenschaftlichen Studien hinsichtlich der resultierenden Tr chtigkeitsraten macht einen Vergleich mit den gut dokumentierten nichtkommerziellen Verd nnern schwierig oder gar unm glich Linde Forsberg 1995 Umgekehrt betrachtet ist die Verf gbarkeit von gebrauchsfertigen Verd nnern allerdings interessant da sie vergleichende Untersuchungen zwischen verschiedenen
267. ie durchschnittliche Vorw rtsbeweglichkeit betrug an Tag 2 60 4 28 0 und an Tag 3 sogar nur noch 47 9 30 0 verglichen mit durchschnittlich gt 75 an Tag 2 und gt 70 an Tag 3 in den mit den anderen Verd nnern aufgearbeiteten Ejakulaten Eine hnliche Abnahme der subjektiv gesch tzten Vorw rtsbeweglichkeit wie in den mit Up 1 2 verd nnten Ejakulaten konnte in den mit Up 1 verd nnten Ejakulaten ab Tag 5 bzw ab Tag 7 gesehen werden Hier betrug die subjektiv gesch tzte Vorw rtsbeweglichkeit an Tag 5 durchschnittlich 65 3 11 7 und an Tag 7 durchschnittlich 44 9 17 4 w hrend sie im Gegensatz dazu in den mit CP und TE verd nnten Ejakulaten an Tag 5 noch rund 70 und an Tag 7 noch etwa 60 65 betrug An Tag 10 war in den mit CP verd nnten Ejakulaten im Mittel noch eine gesch tzte Vorw rtsbeweglichkeit von 58 2 22 1 und in den mit TE verd nnten Ejakulaten von 49 3 23 9 vorhanden 123 Ergebnisse 100 0 90 0 80 0 v 70 0 N 60 0 is CP n 30 53 500 TE n 30 29 40 0 u Be ane Up 1 2 n 12 E 20 0 Up 1 n 18 10 0 0 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 410 Tage Abb 13 Ver nderungen der Mittelwerte SD des Prozentsatzes an vorw rtsbeweglichen Samenzellen subjektiv gesch tzte Vorw rts beweglichkeit unter dem Phasenkontrastmikroskop in den verschiedenen Verd nnern im Zeitverlauf der Fl ssigkonservierung bei 4 C ber zehn Tage CP Verdunner CaniPRO Chill 10 TE TRI
268. iebung des Lebend Tot Verh ltnisses zugunsten des Anteils an lebenden Samenzellen Keine der Ver nderungen war als signifikant zu bewerten 113 Ergebnisse KAN KAKA Se ER Z 2 ONativsperma n 30 GCP n 30 TE n 30 Up 1 2 n 12 Up 1 n 18 THK Se Soe 2525 225 AR THK Se ae 0 OR B85 Mere S325 oS xx XS es 2 amp TO SESS RER RRRRL EKK lt 3 SeS 2 SS THK Se Soe 2525 225 EEK Cc Oo as BD BO De wn 20 RR C oc 2o U om g c lt EX KEN RR RR RR Abb 10 Prozentualer Anteil lebender Samenzellen Eosinausstrich im Nativsperma und in den verschiedenen Verd nnern an Tag 0 dargestellt als r cktransformierter Mittelwert X modifizierter Mittelwert mit negativem und positivem Fehlerbalken modifizierter 1 s Bereich CP Verd nner CaniPRO Chill 10 TE TRIS Fruktose Eigelb Verd nner Up1 2 Uppsala Equex 2 System Verd nner 1 und Verd nner 2 Up1 Uppsala Equex 2 System nur Verd nner 1 n Probenanzahl Unmittelbar nach dem Verd nnen an Tag 0 konnte in der einfaktoriellen Varianzanalyse mit Messwiederholungen bez glich des Faktors Verd nner kein signifikanter Unterschied des durchschnittlichen prozentualen Anteils an lebenden Samenzellen im Eosinausstrich zwischen dem Nativsperma den mit CP TE sowie Up1 2 aufgearbeiteten Ejakulaten ermittelt werden n 12 p 0 14 Auch zwischen dem Nativsper
269. iges Halsbruch 4 Schwanzver nderungen schleifenf rmig aufgerollt um den Kopf gerollt abgeknickt sonstiges z B Doppelschwanz Auffransung des Mittelst ckes l d R sekundare tertiare Ver nderungen 1 lose K pfe 2 Krummlinge 3 sonstiges Plasmatropfen im Bereich von Hals Mittelst ck Endst ck 80 Material und Methoden d Dichtebestimmung Die Dichtebestimmung erfolge mithilfe einer Neubauer Zahlkammer H mozytometer Tiefe 0 100mm Fl che 0 0025mm Heinz Herenz Medizinalbedarf GmbH Hamburg Bei der Vorbereitung der Z hlkammer wurde darauf geachtet dass das Deckglas Gerhard Menzel Glasbearbeitungswerk GmbH amp Co KG Braunschweig so fest an die Z hlkammer angedr ckt wurde bis es an den Haftstellen auf den Seitenstegen der Z hlkammer zur Bildung von Newton schen Ringen kam Das Sperma wurde nach behutsamem Mischen in einer Erythrozytenmischpipette nach Thoma bis zur Marke 1 zweite Markierungslinie aufgezogen danach die Pipette von au en mit einem Wattetupfer abgewischt und anschlie end Leitungswasser bis zur Marke 101 dritte Markierungslinie nachgezogen wodurch eine 100 fache Verd nnung entstand Nach Schwenken der Pipette zur Durchmischung und Verwerfen der ersten Tropfen wurde mit der Pipette je ein Tropfen des Sperma Wasser Gemisches an den beiden R ndern des Deckglases aufgebracht von wo aus das Gemisch dann durch Kapillarkr fte eingesogen wurde Es wurden
270. ight line gradlinige Strecke in um VCL velocity curved line Geschwindigkeit Kurvenstrecke in wum s Geschwindigkeit ber die tats chlich zuruckgelegte Bahn VAP velocity average path Geschwindigkeit durchschnittliche Strecke in um s Geschwindigkeit ber die gemittelte Bahn VSL velocity straight line Geschwindigkeit gradlinige Strecke in um s Geschwindigkeit ber eine gerade Linie vom Anfang bis zum Ende ALH amplitude of lateral head displacement durchschnittliche seitliche Kopfauslenkung in um BCF beat cross frequency frequency of head displacement Frequenz der seitlichen oszillatorischen Bewegungen des Spermienkopfes um die mittlere Bahn in Hz AOC average orientation change of the head durchschnittlicher Richtungswechsel des Kopfes in b Sekund re Parameter LIN linearity VSL VCL Linearitat in Gradlinigkeit STR straightness VSL VAP Gradlinigkeit in Kraftige Gradlinigkeit WOB wobble VAP VCL Schwankung der kurvilinearen Strecke um die mittlere Strecke in Die Parameter Anteil lokalbeweglicher Spermien Anteil unbeweglicher Spermien und AOC wurden in der Datenbearbeitung dieser Arbeit nicht erfasst 3 3 4 4 Viabilitatsanalyse Die Viabilitatsanalyse basierte auf einer Fluoreszenzfarbung der Spermien Dafur wurde das LIVE DEAD Sperm Viability Kit Invitrogen Molecular Probes Eugene Oregon USA eingesetzt welches aus den Fluoreszenz
271. ikant Dabei war der Anteil an abgel sten Akrosomen in den mit CP verd nnten Proben ab Tag 2 stets niedriger als der in den mit TE verd nnten Proben und betrug an Tag 10 durchschnittlich 3 1 SF 2 73 gegen ber 5 4 SF 1 94 in den mit TE verd nnten Proben Bis einschlie lich Tag 3 war der Anteil an abgel sten Kopfkappen in den mit Up 1 verd nnten Proben niedriger als in den mit CP verd nnten Proben ab Tag 5 dann jedoch stets h her sodass an Tag 10 ein mittlerer Anteil von 3 7 SF 1 81 beobachtet werden konnte Der Anteil an abgel sten Akrosomen in den mit Up1 2 verd nnten Ejakulaten ver nderte sich im Zeitverlauf nur geringf gig und betrug an Tag 10 durchschnittlich 3 0 SF 3 55 F r den Anteil an schiefen Kopfkappen waren im Zeitverlauf in den mit CP TE und Up 1 aufgearbeiteten Ejakulaten ebenfalls signifikante Zunahmen zu beobachten Pzeit 0 012 bis lt 0 0001 Die mit CP verd nnten Ejakulate zeigten bez glich dieses Anteils einen signifikanten Niveauunterschied zu den mit Up 1 verd nnten Ejakulaten Pverg 0 043 wobei die durchschnittlichen Werte in den mit CP verd nnten Proben im Mittel h her waren als in den mit Up 1 verd nnten Proben auch wenn die Werte an Tag 10 sich nicht voneinander unterschieden CP 1 3 SF 2 78 Up 1 1 3 SF 2 14 Auch f r den Anteil an sonstigen Kopfkappenver nderungen konnten in den mit CP TE und Up 1 verd nnten Ejakulaten im Zeitverlauf signifikante Zunahmen ermi
272. ilitat nach dem Auftauen zu f rdern wohingegen der Zusatz von Monosacchariden insbesondere Fruktose und Xylose Motilitat Viabilitat und akrosomale Integritat nach dem Auftauen verbessert Yildiz et al 2000 Die Zuckerkomponenten werden vermutlich in Milchs ure umgewandelt was einen st rkeren Abfall des pH Wertes w hrend der Lagerung bedingt Foote 1964b Die eingesetzten Monosaccharidkonzentrationen in den gebr uchlichen Verd nnern f r die Fl ssigkonservierung von Hundesperma reichen von 5 bis 120 mM Foote 1964a Gill et al 1970 Province et al 1984 Rota et al 1995 Iguer Ouada und Verstegen 2001b Ponglowhapan et al 2004 Verstegen et al 2005 Ponglowhapan et al 2004 konnten eine berlegenheit h herer Konzentrationen 70 mM gegen ber niedrigen 10 mM feststellen Sie sehen einen TRIS Eigelb Verd nner mit einer Fruktosekonzentration von 70mM als am geeignetsten f r die Langzeitkonservierung von Fl ssigsperma an Abweichend davon sind Rigau et al 2001 der Ansicht dass der Einsatz hoher Zuckerkonzentrationen die Konservierung nicht beg nstigen kann da die Samenzellen einer Umgebung ausgesetzt werden welche ihre Energie gewinnenden Mechanismen s ttigt Deshalb k nnten niedrigere Zuckerkonzentrationen positivere Effekte aus ben weil sie zu einem physiologischeren Energiestatus der Hundespermien f hren Rigau et al 2001 2 5 2 2 Puffer Hundespermien sind in einem pH Bereich von 5 0 bis 10 0 be
273. ility analysis SpermVision of epididymal spermatozoa from domestic cat in 7th International Conference on Behaviour Physiology and Genetics of Wildlife Berlin 2009 Poster Internet URL http www izw berlin de en research fg4 index html news html rechts Eilts B E 2005a Theoretical aspects of canine cryopreserved semen evaluation Theriogenology 64 3 685 691 Eilts B E 2005b Theoretical aspects of canine semen cryopreservation Theriogenology 64 3 692 697 230 Literaturverzeichnis Ellington J Scarlett J Meyers Wallen V Mohammed H O Surman V 1993 Computer assisted sperm analysis of canine spermatozoa motility measurements Theriogenology 40 4 725 733 England G C W 1993 Cryopreservation of dog semen A review J Reprod Fertil 47 Suppl 243 255 England G C W 1999 Semen quality in dogs and the influence of a short interval second ejaculation Theriogenology 52 6 981 986 England G C W Allen W E 1992 Factors affecting the viability of canine spermatozoa Il Effects of seminal plasma and blood Theriogenology 37 2 373 381 England G C W Millar K M 2008 The ethics and role of Al with fresh and frozen semen in dogs Reprod Dom Anim 43 Suppl 2 165 171 England G C W Plummer J M 1993 Hypo osmotic swelling of dog spermatozoa J Reprod Fertil 47 Suppl 261 270 England G C W Ponzio P 1996 Comparison of the quality of f
274. in bei 5 C mit Stickstoffgas begast Zitrat Eigelb Natriumzitrat 2 9 ige Lsg Christiansen Verd nner 80 Eigelb 20 1984a Eigelb Zitrat Zitronens ure 1 16 g Tsutsui et al Glycin Glukose Glycin 0 75 g Glukose 1 0 g 2003b Verd nner Eigelb 20 ml Aqua bidest 80 ml Penicillin G Kalium 100000 IU Streptomycinsulfat 0 1 g Eigelb Zitrat Natriumzitratdihydrat 1 45 g 6 6 6 8 Foote 1964a Glycin Glukose Glycin 0 937 g Glukose 1 25 g 1964b Foote Verd nner Aqua bidest ad 100 ml Eigelb und Leonard 20 Penicillin 1000 IU ml 1964 Dihydrostreptomycin 1000 pg ml Eigelb Natriumzitratdihydrat 3 0 g Tsutsui et al Natriumzitratdihy Eigelb 20 ml Aqua bidest 80 ml 2003b drat Verd nner Penicillin G Kalium 100000 IU Streptomycinsulfat 0 1 g Cornell Zitronens uremonohydrat 0 07 g 6 75 0 02 308 5 Province et al University Natriumbikarbonat 0 17 g 1984 Zitrat Natriumzitratdihydrat 1 16 g Bikarbonat Kaliumchlorid 0 03 g Glycin Eigelb 0 75 g Glukose 0 24 g Eigelb Verd nner 20 ml Penicillin 500 IU ml Streptomycinsulfat 1 mg ml TRIS BES TRIS 0 43 g BES 1 499 6 81 310 Iguer Ouada Verd nner Laktose 3 4 g Glukose 0 59 g und Aqua dest 100 ml Eigelb 20 Verstegen Benzylpenicillin 100 mg 2001b Dihydrostreptomycinsulfat 100 mg EDTA EDTA 0 37 g Natriumbikarbonat 6 81 464 Iguer Ouada Verd nner 0 12 g Glukose 6 g Aqua dest und 100 ml Eigelb 20 Verstegen Benzylpenicillin 100 mg 2001b Dihydr
275. in den Nativejakulaten und in den mit den verschiedenen Verd nnern aufgearbeiteten Ejakulaten n Anzahl der getesteten zeitgleichen Variablenpaare r Korrelationskoeffizient nach Pearson p p Wert Parameter Verd nner n r p subjektiv gesch tzte keiner Nativsperma 30 0 499 0 005 Vorw rtsbeweglichkeit versus CP 210 0 717 lt 0 001 Anteil an morphologisch TE 210 0 643 lt 0 001 ver nderten Samenzellen nach Up 1 2 84 0 488 lt 0 001 logarithmischer Transformation Up 1 126 0 390 lt 0 001 CASA Vorwartsbeweglichkeit keiner Nativsperma 30 0 487 0 006 versus Anteil an morphologisch CP 210 0 708 lt 0 001 veranderten Samenzellen nach TE 210 0 672 lt 0 001 logarithmischer Transformation Up1 2 84 0 547 lt 0 001 Up 1 126 0 366 lt 0 001 Anteil lebender Samenzellen im keiner Nativsperma 30 0 430 0 018 Eosinausstrich nach Arcus CP 210 0 696 lt 0 001 Sinus Transformation versus TE 210 0 697 lt 0 001 Anteil an morphologisch Up 1 2 84 0 824 lt 0 001 veranderten Samenzellen nach Up 1 126 0 653 lt 0 001 logarithmischer Transformation CASA Viabilitat nach Arcus keiner Nativsperma 30 0 449 0 013 Sinus Transformation versus CP 210 0 653 lt 0 001 Anteil an morphologisch TE 210 0 582 lt 0 001 ver nderten Sa
276. in ml Die Verwendung eines Enhancers erwies sich bei allen getesteten Verd nnern als n tzlich durch dessen Zusatz konnte in allen Verd nnern die mittels CASA bestimmte Vorw rtsbeweglichkeit nach der Wiedererw rmung verbessert werden Im TRIS Eigelb Verd nner wurde die h chste Vorw rtsbeweglichkeit an Tag 8 mit dem TRIS Puffer als Enhancer erzielt w hrend sich bez glich der Vorw rtsbeweglichkeit im TRIS Lecithin im TRIS Lecithin Katalase und im TRIS Lecithin Katalase Tyrosin Verd nner keine Unterschiede zwischen den verschiedenen Enhancern zeigten Die Viabilit t an Tag 8 konnte im TRIS Lecithin und im TRIS Lecithin Katalase Tyrosin Verd nner durch den Zusatz von TRIS Puffer mit 0 2 mg Acetylcarnitin ml als Enhancer gesteigert werden Insgesamt wurden durch die Zugabe von TRIS Puffer unmittelbar vor der Untersuchung des fl ssigkonservierten Spermas sowohl die Motilitat als auch die 72 Literatur Viabilitat in allen Proben signifikant verbessert Der Zusatz von Acetylcarnitin zum Enhancer brachte keine weitere Verbesserung der Spermaqualitat Nach 3 t giger Fl ssigkonservierung bei 4 C war die mittels CASA bestimmte Vorw rtsbeweglichkeit im TRIS Lecithin Katalase Verd nner mit TRIS Puffer als Enhancer signifikant h her als in den anderen getesteten Verd nnern und auch nach 8 tagiger Lagerung konnten im TRIS Lecithin Katalase und im TRIS Lecithin Katalase Tyrosin Verdunner noch e
277. ine Vorw rtsbeweglichkeit gt 70 jeweils mit TRIS Puffer als Enhancer und eine Viabilit t gt 80 beobachtet werden wohingegen die Werte im TRIS Eigelb und im TRIS Lecithin Verd nner an Tag 8 bereits signifikant geringer waren Der Prozentsatz an morphologisch ver nderten Samenzellen war sowohl an Tag 0 als auch an Tag 8 im TRIS Eigelb Verd nner am h chsten Der TRIS Lecithin Katalase Verd nner war zudem aufgrund der signifikant h heren ZP Bindungsf higkeit der Samenzellen an den Tagen 0 und 3 insbesondere gegen ber dem TRIS Eigelb Verd nner berlegen Insgesamt konservierte der TRIS Lecithin Katalase Verd nner die Vorw rts beweglichkeit und die Viabilit t w hrend der Fl ssigkonservierung bei 4 C ber acht Tage besser als der TRIS Eigelb Verd nner allerdings nur wenn ein Enhancer verwendet wurde Daher kamen die Autoren zu dem Schluss dass der TRIS Lecithin Katalase Verd nner mit 0 8 Lecithin und 150 U ml Katalase besser zur Fl ssigkonservierung von caninem Sperma geeignet ist als der konventionelle TRIS Eigelb Verd nner Kmenta et al 2011 Zusammenfassend l sst sich bei Betrachtung aller genannten Studien feststellen dass die besten Konservierungsergebnisse f r canines Fl ssigsperma mit Zitrat und oder TRIS gepufferten eigelbhaltigen Verd nnern erzielt werden k nnen Foote und Leonard 1964 Province et al 1984 Rota et al 1995 Iguer Ouada und Verstegen 2001b Tsutsui et al 2003b Sha
278. ine signifikante positive Korrelation zwischen dem HOS Test Anteil an Spermien mit aufgerollter Gei el und der Spermienviabilit t Eosin Nigrosin F rbung ermitteln konnten Auch Jeyendran et al 1984 konnten f r humanes Sperma eine signifikante positive Korrelation zwischen dem HOS Test Prozentsatz an geschwollenen Spermienschw nzen und dem Anteil an lebenden Samenzellen im Eosinausstrich verifizieren Im Gegensatz dazu konnten England und Plummer 1993 keine Korrelation zwischen dem HOS Test und der Vitalf rbung finden und auch nach Kumi Diaka und Badtram 1994 besteht zwischen dem HOS Test und der Lebend Tot F rbung keine signifikante Korrelation Die bislang publizierten Zusammenh nge zwischen Pathomorphologie und HOS Test sind kontrovers W hrend England und Plummer 1993 keine Korrelation zwischen der Morphologie und dem HOS Test nachweisen konnten und auch nach Kumi Diaka 1993 der HOS Test weder mit dem Anteil an Mittelst ckver nderungen noch mit dem Anteil an Schwanzver nderungen signifikant korreliert ist konnte in den eigenen Untersuchungen sinngem bereinstimmend mit Jeyendran et al 1984 und Pinto und Kozink 2008 eine signifikante positive Korrelation zwischen dem Anteil an morphologisch 216 Diskussion veranderten Samenzellen und dem Anteil an Samenzellen mit nicht aufgerollter Gei el im HOS Test ermittelt werden r 0 446 p lt 0 001 5 4 Schlussbetrachtung und Fazit f r die Praxis Die
279. inearit t war in den mit Up 1 verd nnten Proben zu erkennen Tab 16 CASA Motilit tsparameter LIN VSL VCL n x SD Min Max im Nativsperma und in den verschiedenen Verd nnern an Tag 0 Verd nner n x SD Min Max keiner Nativsperma 30 56 6 11 6 27 0 76 0 CP 30 59 3 9 2 39 0 77 0 TE 30 56 2 49 4 37 0 69 0 Up1 2 12 55 0 8 5 42 0 68 0 Up 1 18 53 8 6 4 43 0 65 0 Den Parameter LIN betreffend konnte in den einfaktoriellen Varianzanalysen mit Messwiederholungen bez glich des Faktors Verd nner und den paarweisen Vergleichen nach Student Newman Keuls einzig zwischen den mit CP und den mit Up 1 verd nnten Ejakulaten ein signifikanter Unterschied nachgewiesen werden p lt 0 01 Tab A6 A8 Kap 9 8 Insgesamt lie en sich in der einfaktoriellen Varianzanalyse mit Messwiederholungen bez glich des Faktors Verd nner zum Vergleich der Verd nner CP TE und Up 1 2 mit dem Nativsperma n 12 unmittelbar nach dem Verd nnen an Tag 0 f r die CASA Motilitatsparameter DAP DCL VAP VCL VSL und ALH signifikante Unterschiede nachweisen Tab A6 Kap 9 8 In der einfaktoriellen Varianzanalyse zum Vergleich der Verd nner CP TE und Up 1 mit dem Nativsperma n 18 unmittelbar nach dem Verd nnen an Tag 0 konnten f r alle CASA Motilit tsparameter mit Ausnahme von ALH signifikante Unterschiede ermittelt werden Tab A7 Kap 9 8 und auch in der einfaktoriellen Varianzanalyse
280. ision System ermittelten Viabilitat nach SYBR 14 PI F rbung in den Nativejakulaten und in den mit den verschiedenen Verd nnern aufgearbeiteten Ejakulaten ons een 151 Korrelationen zwischen verschiedenen Untersuchungsparametern in den Nativejakulaten und in den mit den verschiedenen Verd nnern aufgearbeiteten Ejakulaten 222 22 u r2rs244424444440 00 RR Erna nan nn 153 Korrelationen zwischen verschiedenen Untersuchungsparametern in den Nativejakulaten und in allen verd nnten Ejakulaten zu allen Untersuchungszeitpunkten ee 155 Vergleichende Darstellung der verwendeten technischen Einstellungen fur die Motilitatsanalyse mit den von Schafer Somi und Aurich 2007 genutzten Einstellungen cccccccescsecsecccceneeeteeeeescecceecseeeeenseeeseses 164 Vergleichende Darstellung der sonstigen verwendeten technischen Einstellungen mit den von Sch fer Somi und Aurich 2007 genutzten Einstellingen 2 222222 ar era ER ea 166 Name Zusammensetzung pH Wert und Osmolarit t von milchbasierten Verd nnern f r die Fl ssigkonservierung von Hundesperma u 2 ana 261 Zusammensetzung pH Wert und Osmolarit t verschiedener TRIS gepufferter Eigelb Verd nner f r die Fl ssigkonservierung von H ndesp erma sariren a a a a 262 Name Zusammensetzung pH Wert und Osmolarit t sonstiger Verd nner f r die Fl ssigkonservierung von Hundesperma 264 288 Anhang Tab Tab T
281. iskussion Eigelbzusatz hergestellten Verd nner nicht sicher gew hrleistet werden was den Bestrebungen vorzugsweise definierte Medien zu verwenden um m glichst standardisiert zu arbeiten widerspricht In der vorliegenden Arbeit wurde versucht dieses Problem zu umgehen indem alle Verd nner im Vorhinein mit Eiern derselben Herkunft hergestellt und bis zur Verwendung portioniert bei 21 C gelagert wurden So konnte fur den Vergleich der getesteten Verd nner untereinander eine ann hernde Konsistenz bez glich der Zusammensetzung des Eigelbs sichergestellt werden Die Zuckerkomponente in den drei untersuchten Verd nnern war Fruktose Dabei enthielten der Verd nner TE und der Uppsala Equex 2 System Verd nner die gleiche Menge an Fruktose Im Verd nner CP war neben Fruktose auch Glukose enthalten Glukose und Fruktose sind die am h ufigsten genutzten Zucker in Verd nnern f r die Fl ssigkonservierung von caninem Sperma Ponglowhapan et al 2004 Glukose bedingt eine mehr oszillatorische Bewegung w hrend Fruktose ein schnelleres und mehr lineares Bewegungsmuster verursacht Allerdings ver ndert sich der Prozentsatz an motilen Spermien weder durch Fruktose noch durch Glukose Rigau et al 2001 Welcher Zucker Fruktose oder Glukose als Energiezusatz besser geeignet ist wird kontrovers diskutiert Iguer Ouada und Verstegen 2001b Ponglowhapan et al 2004 bereinstimmend mit Ponglowhapan et al 2004 welche einen TRIS Eigelb
282. it Messwiederholungen bez glich des Faktors Verd nner ein signifikanter Unterschied des durchschnittlichen Anteils an membrandefekten Samenzellen im HOS Test zwischen dem Nativsperma den mit CP TE sowie Up1 2 aufgearbeiteten Ejakulaten ermittelt werden n 12 p lt 0 0001 Der im Anschluss durchgef hrte Student Newman Keuls Test zeigte signifikante Unterschiede zwischen dem Nativsperma und den mit CP TE sowie Up 1 2 verd nnten Ejakulaten jeweils mit p lt 0 01 Beim Vergleich der mit den verschiedenen Verd nnern aufgearbeiteten Ejakulate untereinander lie en sich keine signifikanten Unterschiede erkennen Auch zwischen dem Nativsperma und den mit CP TE sowie Up 1 verd nnten Proben lie sich bez glich des Anteils an membrandefekten Samenzellen im HOS Test in der einfaktoriellen Varianzanalyse ein signifikanter Unterschied nachweisen n 18 p 0 027 Im anschlie enden paarweisen Vergleich nach Student Newman Keuls ergab sich allerdings lediglich ein signifikanter Unterschied zwischen dem Nativsperma und den mit Up1 aufgearbeiteten Ejakulaten p lt 0 05 Weiterhin konnte unmittelbar nach dem Verdunnen in der einfaktoriellen Varianzanalyse ein signifikanter Unterschied zwischen dem Nativsperma den mit CP und den mit TE verd nnten Ejakulaten festgestellt werden n 30 p 0 0002 121 Ergebnisse Der im Anschluss an die Varianzanalyse durchgefuhrte paarweise Vergleich nach Student Newman Keuls zeigte einen signifika
283. it den Ergebnissen anderer Autoren Beispielsweise konnten Kmenta et al 2011 nach acht Tagen Fl ssigkonservierung bei 4 C in einem TRIS Fruktose Eigelb Verd nner eine CASA Viabilit t nach SYBR 14 PI F rbung von 76 0 13 5 ermitteln w hrend die CASA Vorw rtsbeweglichkeit nur noch etwa 38 betrug Diese Beobachtungen machen deutlich dass unbewegliche Samenzellen nicht zwangsl ufig auch tot sind Dass eine Reaktivierung der Motilit t von offensichtlich unbeweglichen Spermien durch Zusatz von frischem Verd nner m glich ist konnte bereits von Verstegen et al 2005 gezeigt werden Inwieweit es im weiblichen Reproduktionstrakt zu einer Reaktivierung der Motilit t kommen kann ist jedoch unklar 5 3 3 3 Pathomorphologie Die Morphologie der Samenzellen welche teilweise durch die Motilitat ausgedr ckt wird und direkt mit den physiologischen Vorg ngen w hrend der Befruchtung in Zusammenhang steht ist folgerichtig auch mit dem Reproduktionsergebnis direkt korreliert Verstegen et al 2002 was die Bedeutung ihrer Beurteilung erkl rt Nach England und Ponzio 1996 ist die Morphologie der Samenzellen der Qualitatsparameter der sich bei Fl ssigkonservierung am schnellsten verschlechtert Dies konnte in der vorliegenden Arbeit nicht best tigt werden W hrend unmittelbar nach der Aufarbeitung mit den verschiedenen Verd nnern in allen verd nnten Ejakulaten eine tendenzielle bzw in den mit CP und TE verd nnten Ejakulaten soga
284. iv einfach flussigkonserviertes Sperma herzustellen Pena et al 2006 da keine besonderen Einrichtungen erforderlich sind Pesch et al 2007 zum anderen k nnen durch den verbreiteten Gebrauch der Serum Progesteronbestimmung mit flussigkonserviertem Sperma gute Tr chtigkeitsraten und optimale Wurfgr en erzielt werden Pena et al 2006 Au erdem hat die Entwicklung der Rassezucht eine steigende Nachfrage nach Spermaimport und export verursacht Pe a et al 2006 und gerade bei der Fl ssigkonservierung sind die Versandkosten one way gering Linde Forsberg 2001 Allerdings erfordert die Verwendung von 35 Literatur flussigkonserviertem Sperma neben der kurzfristigen Verf gbarkeit des Spenderr den einen schnellen Samentransport Pesch et al 2007 Das gr te Problem bei der Fl ssigkonservierung von Sperma stellt jedoch die begrenzte berlebensdauer der konservierten Samenzellen dar Ponglowhapan et al 2004 Shahiduzzaman und Linde Forsberg 2007 2 4 1 1 Herstellung von fl ssigkonserviertem Sperma Grundlage fur die Herstellung von fl ssigkonserviertem Sperma ist die zweite spermienreiche Fraktion des Ejakulates Brochart und Coulomb 1952 Seager und Fletcher 1972 Andersen 1980 Pena et al 2006 Ob Seminalplasma enthalten sein darf oder nicht wird aufgrund der zahlreichen positiven antioxidativ h here Osmotoleranz erh hte Membranstabilit t und negativen Eigenschaften reaktive Sauerstoffspezies re
285. jakulate zu allen Untersuchungsterminen einbezogen wurden 154 Ergebnisse Tab 24 Korrelationen zwischen verschiedenen Untersuchungsparametern in den Ejakulaten zu zeitgleichen Nativejakulaten und in allen verd nnten Untersuchungszeitpunkten n Anzahl der getesteten Variablenpaare r Korrelationskoeffizient nach Pearson p p Wert allen Parameter n r p subjektiv gesch tzte Vorw rtsbeweglichkeit versus Anteil an morphologisch ver nderten Samenzellen nach logarithmischer Transformation 660 0 501 lt 0 001 CASA Vorw rtsbeweglichkeit versus Anteil an morphologisch ver nderten Samenzellen nach logarithmischer Transformation 660 0 538 lt 0 001 Anteil lebender Samenzellen im Eosinausstrich nach Arcus Sinus Transformation versus Anteil an morphologisch ver nderten Samenzellen nach logarithmischer Transformation 660 0 672 lt 0 001 CASA Viabilitat nach Arcus Sinus Transformation versus Anteil an morphologisch ver nderten Samenzellen nach logarithmischer Transformation subjektiv gesch tzte Vorw rtsbeweglichkeit versus Anteil an Samenzellen mit nicht aufgerollter Gei el im HOS Test nach logarithmischer Transformation 660 120 0 535 0 525 lt 0 001 lt 0 001 CASA Gesamtmotilitat versus Anteil an Samenzellen mit nicht aufgerollter Gei el im HOS Test nach logarithmischer Transformation 120 0 523 lt
286. jektiven konventionellen Untersuchungsmethoden das CASA System SpermVision zum Einsatz Die mit beiden Methoden bestimmten Ergebnisse f r die Spermienkonzentration die Motilit t sowie die Viabilit t waren gr tenteils als 218 Diskussion annahernd gleichwertig anzusehen was sich auch in den ermittelten Korrelationen widerspiegelte Zusammenfassend l sst sich feststellen dass die KB beim Hund von zunehmender Bedeutung ist Daher sollten Praktiker die diese Dienstleistung anbieten wollen sowohl mit den Techniken zur Bestimmung des optimalen Besamungszeitpunktes und zur Samen bertragung als auch mit den Methoden der Spermakonservierung vertraut sein F r die Fl ssigkonservierung caniner Ejakulate kann auf Basis der vorliegenden Arbeit der kommerzielle Verd nner CP empfohlen werden Dieser zeichnet sich durch eine gute Erhaltung der Spermaqualit t ber mindestens zehn Tage eine schnelle Verf gbarkeit und eine einfache Handhabung aus wodurch er f r den Einsatz in der Praxis gut geeignet erscheint Weiterhin scheint unter Praxisbedingungen die Beurteilung nativer sowie fl ssigkonservierter Ejakulate mittels konventioneller Methoden ausreichend zu sein da eine gute bereinstimmung zu den objektiven Methoden besteht 5 5 Offene Fragestellungen Obwohl nach Verstegen et al 2005 fl ssigkonserviertes Sperma f r mindestens elf Tage fertil zu bleiben scheint sind weiterf hrende Studien notwendig um die Fertilit
287. kappenver nderungen bzw an abgel sten Akrosomen Werte in Klammern in der Spermac F rbung im Nativsperma und in den verschiedenen Verd nnern an Tag 0 n Xg SF Min Max Verd nner n xg SF Min Max keiner Nativsperma 30 2 7 2 63 0 0 13 5 22 1 4 2 67 0 0 5 0 CP 30 4 2 2 43 0 0 25 0 22 2 1 2 05 0 0 7 0 TE 30 39 2 67 0 0 24 5 22 1 8 2 28 0 0 8 0 Up1 2 12 6 6 2 18 1 5 24 0 4 2 7 1 55 1 9 4 0 Up 1 18 2 8 2 34 0 0 9 0 18 1 4 2 42 0 0 4 0 Unmittelbar nach dem Verd nnen an Tag O konnte in der einfaktoriellen Varianzanalyse mit Messwiederholungen bez glich des Faktors Verd nner kein signifikanter Unterschied des durchschnittlichen prozentualen Anteils an Kopfkappenver nderungen in der Spermac F rbung zwischen dem Nativsperma den mit CP TE sowie Up 1 2 aufgearbeiteten Ejakulaten ermittelt werden n 12 p 0 076 Auch bei gesonderter Betrachtung der einzelnen auftretenden Kopfkappenver nderungen abgel ste Kopfkappen schiefe Kopfkappen sonstige Ver nderungen konnten durch die einfaktoriellen Varianzanalysen keine signifikanten Unterschiede verifiziert werden Zwischen dem Nativsperma den mit CP TE und Up 1 verd nnten Ejakulaten war in der einfaktoriellen Varianzanalyse kein signifikanter Unterschied bez glich des mittleren Anteils an Kopfkappenver nderungen zu beobachten n
288. konservierung entfallen Concannon und Battista 1989 2 die Zervix stellt eine kleinere Barriere dar Concannon und Battista 1989 da fl ssigkonservierte Samenzellen eine ausreichend hohe Motilit t zur berwindung der Zervixbarriere aufweisen Pesch et al 2007 3 die Anzahl an zu inseminierenden Spermien ist i d R h her Concannon und Battista 1989 und 4 die Lebensdauer der Spermien im Reproduktionstrakt der H ndin ist l nger wodurch die Notwendigkeit einer pr zisen Bestimmung des Besamungszeitpunktes weniger kritisch ist als bei TG Sperma Concannon und Battista 1989 Pinto et al 1999 Gerade bei Kurzzeitlagerung ist fl ssigkonserviertes Sperma kryokonserviertem Sperma stets deutlich berlegen Die durchschnittliche Zeit die es dauert bis die Qualit t von fl ssigkonserviertem Sperma der von kryokonserviertem entspricht betr gt im Mittel circa 118 7 25 9 Stunden Sollte die angestrebte 44 Literatur Lagerungsdauer diese Zeitspanne von 4 9 Tagen berschreiten so ist eine Kryokonservierung des Spermas vorzuziehen England und Ponzio 1996 Auf die Vorteile der Flussigkonservierung hinsichtlich Herstellung und Versand wurde bereits zuvor hingewiesen Ponglowhapan et al 2004 Verstegen et al 2005 Pena et al 2006 Shahiduzzaman und Linde Forsberg 2007 Haufig sind auch die rechtlichen Bestimmungen fur Import und Export weniger kompliziert als die fur gefrorenes Sperma Ponglowhapan et al 2004 Nach
289. krosomalen Ver nderungen durch die Verd nnung mit Up 1 nahezu unver ndert blieb Der tendenziell st rkste Anstieg an akrosomalen Ver nderungen wurde im Verd nner Up 1 2 nachgewiesen auch wenn dieser sich als nicht signifikant erwies M glicherweise k nnte dies durch die bereits erfolgte K hlung auf 4 C bedingt sein wodurch die in der Literatur gefundenen Aussagen von Burgess et al 2001 und Oettl 1986 bez glich des Einflusses der K hlung auf die akrosomale Integrit t untermauert werden k nnten Dass die Zentrifugation keinen nachteiligen Effekt auf den Anteil an akrosomintakten Samenzellen hat G nzel 1986 konnte durch die vorliegenden 191 Diskussion Ergebnisse bestatigt werden da der Anteil an akrosomalen Veranderungen in den zentrifugierten Proben im Vergleich zum Nativsperma nicht signifikant anstieg und auch zwischen zentrifugierten und nicht zentrifugierten Ejakulaten kein signifikanter Unterschied nachgewiesen werden konnte Allerdings kann ebenso ein negativer Einfluss von Prostatasekret auf die akrosomale Integrit t nicht ausgeschlossen werden da gerade die nicht zentrifugierten und somit Prostatasekret enthaltenden Proben CP TE verglichen mit dem Nativsperma signifikante Zunahmen des Anteils an akrosomalen Ver nderungen zeigten 5 3 2 6 Funktionelle Integrit t der Plasmamembran Die Untersuchung der funktionellen Integrit t der Plasmamembran erfolgte mithilfe des HOS Tests Dabei kam es in allen
290. kt oxidativen Stress verursachen indem sie die enzymatische Abwehr der Samenzellen herabsetzen Michael et al 2010 Um den oxidativen Stress zu vermeiden und das berleben und die funktionale Integrit t der Samenzellen zu verbessern sollte die Verwendung von Antioxidantien im Verd nner in Erw gung gezogen werden Beccaglia et al 2009a Die Erg nzung des Verd nners mit bestimmten Antioxidantien kann verglichen mit einer Kontrollgruppe die 59 Literatur Spermaqualitatsparameter nach 24 und oder 72 Stunden Lagerung signifikant verbessern Michael et al 2009 Es wurde bereits eine Vielzahl an Substanzen bzw Substanzkombinationen hinsichtlich ihrer antioxidativen Wirkung bei der Flussigkonservierung von caninem Sperma getestet Darunter die Thiole Cystein N Acetylcystein und Glutathion Michael et al 2009 2010 die Vitamine Vitamin B16 Pyridoxin Michael et al 2009 Vitamin C Ascorbinsaure Ceylan und Serin 2007 Michael et al 2008 2009 und Vitamin E a Tocopherol Michael et al 2009 das Enzym Katalase Beccaglia et al 2009a Michael et al 2009 und die Aminosulfonsaure Taurin Michael et al 2009 Zusammenfassend zeigten von allen getesteten Antioxidantien Vitamin B16 und Vitamin E Zusatze zu Verd nnern fur die Fl ssigkonservierung hinsichtlich der Erhaltung der Spermaqualit t sowie der Hemmung von ROS die ausgepr gtesten positiven Effekte Michael et al 2009 2 5 2 6 2 Natriumdodecyl laur
291. lat vorhandener oder eingebrachter Keime nicht zu rechnen ist k nnte wahrscheinlich auf diesen Zusatz verzichtet werden Hoffmann 2003d Zudem k nnen Antibiotika m glicherweise die Verbreitung von Infektionen verhindern Linde Forsberg 2001 I d R werden den verschiedenen Verd nnern Penicillin und Streptomycin zugesetzt Foote 1964a Foote und Leonard 1964 Andersen 1980 Concannon und Battista 1989 Linde Forsberg 1995 Dieser Antibiotikazusatz ist f r die Spermien nicht sch dlich und hilft das Wachstum kontaminierender Organismen zu kontrollieren Foote und Leonard 1964 2 5 2 6 Sonstige Inhaltsstoffe 2 5 2 6 1 Antioxidantien Samenzellen besitzen in ihrer Plasmamembran einen relativ hohen Gehalt an mehrfach unges ttigten Fetts uren welche leicht oxidiert werden k nnen 58 Literatur wodurch die Samenzellen besonders empfindlich gegenuber oxidativem Stress sind Beccaglia et al 2009a Michael et al 2010 Hinzu kommt dass die Samenzellen nur einen begrenzten Gehalt an Antioxidantien besitzen Michael et al 2010 Im Ejakulat werden durch die Spermien selbst sowie durch enthaltene Leukozyten reaktive oxidative Substanzen ROS produziert Griveau et al 1995 welche in niedrigen Konzentrationen als Mediatoren der normalen Spermienfunktion agieren w hrend sie wenn sie im berma produziert werden hoch toxisch f r die Samenzellen sind Michael et al 2010 Wasserstoffperoxid H202 welches durch
292. lear All Fields New Field r a I Display overlay Current Previous User Sandra Level 3 Dsn B EO amp a Iarspermuision Resist Dolment Merosot El B A oe Abb 4 Monitorbild des Programms SpermVision nach der Motilit tsanalyse links ist das Mikroskopbild des zuletzt beurteilten Gesichtsfeldes zu erkennen rechts die gew hlten Einstellungen die numerischen Ergebnisse der Messung f r das aktuelle Feld und die durchschnittlichen numerischen Ergebnisse aller gemessenen Felder tame 1 of 30 gt i lol SpermVision berechnete die Samendichte und analysierte die Beweglichkeit der Samenzellen mithilfe einer gro en Anzahl von Motilitatsparametern Folgende Parameter wurden von SpermVision gemessen bzw errechnet Verstegen et al 2002 Rijsselaere et al 2003 Sch fer Somi und Aurich 2007 SpermVision Benutzerhandbuch 12049 0586 a Prim re Parameter Spermienkonzentration in 10 Spermien pro ml Anteil motiler Spermien in Gesamtmotilit t Summe lokalbeweglicher und vorw rtsbeweglicher Spermien Anteil vorw rtsbeweglicher Spermien in Progressive Motilit t Anteil lokalbeweglicher Spermien in Anteil unbeweglicher Spermien in 87 Material und Methoden DCL distance curved line Kurvenstrecke in um tats chlich zuruckgelegte Strecke DAP distance average path durchschnittliche Strecke in um Strecke in geglatteter Linie DSL distance stra
293. len da nach Kumi Diaka 1993 die Spermakonservierung die Reaktion der Samenzellen auf den HOS Test nachteilig beeinflusst W hrend der Lagerung in ICG Verd nner International Canine Genetics bei 5 C f r 72 Stunden konnte eine kontinuierliche signifikante Abnahme des Anteils an Samenzellen mit aufgerollter Gei el im HOS Test nachgewiesen werden was darauf hindeutet dass die Lagerung bei 5 C Sch den der Spermienmembran verursacht welche zur Folge haben dass die Samenzellen ihre F higkeit mit einer Aufrollung der Gei el auf die hypoosmotische L sung zu reagieren verlieren Kumi Diaka 1993 Tendenzen zur Unterst tzung dieser These konnten in der vorliegenden Arbeit bereits an Tag 0 gesehen werden da die mit Up 1 2 verd nnten Proben welche den st rksten Anstieg des Anteils an Samenzellen mit nicht aufgerollter Gei el zeigten zum Zeitpunkt der Untersuchung bereits f r eine Stunde bei 4 C gek hlt worden waren 5 3 3 Ergebnisse der Halteproben im Zeitverlauf Die Fl ssigkonservierung caniner Ejakulate f hrt nicht zur Verbesserung der Spermaqualit t sondern es wird lediglich ber einen zu definierenden Zeitraum die Ausgangsqualit t aufrechterhalten Kumi Diaka und Badtram 1994 Unumstritten ist dass die Spermaqualitat bei Fl ssigkonservierung bei 4 bzw 5 C 193 Diskussion im Zeitverlauf stetig abnimmt England und Ponzio 1996 Ponglowhapan et al 2004 Michael et al 2008 2009 wie es auch in der vo
294. lich am Korrelationskoeffizienten zeigte r 0 539 p 0 002 Die mittels CASA gemessenen Spermienkonzentrationen lagen in den Nativejakulaten stets weit unter den mittels Neubauer Z hlkammer bestimmten Werten Dies ist bereinstimmend mit der von Rijsselaere et al 2003 beschriebenen Untersch tzung der Spermienkonzentration durch CASA Systeme welche mit steigenden Spermienkonzentrationen zunimmt Eine Unterschatzung der Spermienkonzentration konnte in weit geringerer Auspr gung jedoch auch bei den verd nnten Ejakulaten festgestellt werden Dass die Unterschatzung der Spermienkonzentration durch CASA in der vorliegenden Arbeit mit steigenden Spermienkonzentrationen zunahm bzw dass die Abweichungen zwischen beiden Methoden mit steigenden Spermienkonzentrationen gr er wurden ist auch deutlich in der graphischen Darstellung des Zusammenhang zwischen den mittels Neubauer Z hlkammer bestimmten und den durch CASA ermittelten Dichten zu erkennen siehe Abb 20 Kap 4 4 1 2 Nach Kuster 2005 sind die bei der Konzentrationsbestimmung auftretenden Unterschiede zwischen CASA Systemen welche mit Z hlkammern von 20 um Tiefe arbeiten und H mozytometern durch den Segre Silberberg Effekt bedingt welcher w hrend des Poiseuille Flusses in d nnen und sich durch Kapillarkr fte f llenden Z hlkammern auftritt Durch diesen Effekt ist die Spermienkonzentration in den Messbereichen der 20 um Z hlkammern niedriger als die wahre Spermien konzent
295. liche mittels CASA bestimmte Gesamtmotilitat der Ejakulate vor und unmittelbar nach dem Verdunnen Tag 0 ist in Abb 8 dargestellt Im Gegensatz zur subjektiv gesch tzten Vorw rtsbeweglichkeit bei der es durch alle Verd nner zu einer Motilit tsabnahme unmittelbar nach dem Verd nnen kam konnte bei der CASA Gesamtmotilitat beim Vergleich der Messwerte der verd nnten Ejakulate mit denen des Nativspermas nur bei den mit CP und Up 1 2 verd nnten Ejakulaten eine Reduktion der Motilit t beobachtet werden Der Motilitatsabfall war in den mit Up 1 2 verd nnten Ejakulaten am st rksten ausgepr gt In den mit TE verd nnten Ejakulaten blieb die durchschnittliche CASA Gesamtmotilitat nahezu konstant und in den mit Up 1 verd nnten Proben konnte sogar eine Zunahme der mittleren CASA Gesamtmotilitat festgestellt werden Allerdings konnte f r keine der genannten Ver nderungen eine statistische Signifikanz belegt werden ONativsperma n 30 ECP n 30 EITE n 30 Up 1 2 n 12 Up 1 n 18 aR RR RR OX KKK N 3 z en X tate SE COTO RR SE S552 lt P DON 2525 See Se ER ee ee ee x RK aces fete ee ee ee x RK Ro ate OEK 29 RL N a ES iQ 5 E E p RR 3 lt op lt O r gt gt gt gt Abb 8 Prozentsatz an motilen Samenzellen mittels Computer assisted sperm analysis CASA SpermVision System gemessene Gesamtmoti
296. lin Glycerol Eigelb Die Osmolaritat betragt 865 mOsm Verdunner 2 TRIS Zitronensaure Fruktose Streptomycin Aqua dest Benzylpenicillin 254 3 025 g 1 79 1 25g 0 1g ad 77 ml 0 06 g in 0 3 ml Aqua dest 3 ml 20 ml der pH 6 72 3 025 g 1 79 1 259 0 1g ad 72 ml 0 06 g in 0 3 ml Aqua dest Anhang Glycerol 7 ml Equex 1ml Eigelb 20 ml Die Osmolarit t betr gt 1495 mOsm der pH 6 74 Auftaumedium TRIS 3 025g Zitronens ure 1 79 Fruktose 1 25g Streptomycin 0 1g Aqua dest ad 100 ml Benzylpenicillin 0 06 g in 0 3 ml Aqua dest Die Osmolaritat betragt 324 mOsm der pH 6 76 9 5 2 Zusammensetzung des Verdunners CaniPRO Chill 10 Manual CaniPRO Chill 10 Minit b Reinstwasser Natriumzitrat TRIS Glukose Fruktose Herstellereigene Bestandteile Gentamicin 9 5 3 Rezepte diverser Gebrauchsl sungen 9 5 3 1 9 5 3 2 Eosin F rbel sung Hoffmann 2003b 2g Eosin B 3g Natriumzitrat ad 100 ml Aqua dest Hypoosmotische L sung 150 mosmol Jeyendran et al 1984 Riesenbeck et al 2001 Hoffmann 2003b 0 735 g Natriumzitrat 1 351 g Fruktose ad 100 ml Aqua dest 255 Anhang 9 5 3 3 Farbelosung fur die Viabilitatsanalyse LIVE DEAD Sperm Viability Kit Invitrogen Molecular Probes Herstellungsanleitung nach Minitub Die Komponenten der Farbelosung sind lichtempfindlich Darauf sollte w hrend der Herstellung
297. litat x SD im Nativsperma und in den verschiedenen Verd nnern an Tag 0 CP Verd nner CaniPRO Chill 10 TE TRIS Fruktose Eigelb Verdunner Up1 2 Uppsala Equex 2 System Verd nner 1 und Verdunner 2 Up1 Uppsala Equex 2 System nur Verd nner 1 n Probenanzahl Unmittelbar nach dem Verdunnen konnte in der einfaktoriellen Varianzanalyse mit Messwiederholungen bez glich des Faktors Verd nner kein signifikanter Unterschied der durchschnittlichen CASA Gesamtmotilitat zwischen dem Nativsperma den mit CP TE sowie Up 1 2 aufgearbeiteten Ejakulaten ermittelt werden n 12 p 0 12 Auch zwischen dem Nativsperma den mit CP und den 104 Ergebnisse mit TE verdunnten Proben lie sich kein signifikanter Unterschied nachweisen n 30 p 0 41 Zwischen dem Nativsperma den mit CP TE und Up1 verd nnten Ejakulaten konnte jedoch ein signifikanter Unterschied der durchschnittlichen mittels CASA bestimmten Gesamtmotilit t verifiziert werden n 18 p 0 036 Der folgende paarweise Vergleich nach Student Newman Keuls ergab einen signifikanten Unterschied zwischen den mittleren CASA Gesamtmotilitaten in den mit CP und Up 1 aufgearbeiteten Ejakulaten p lt 0 05 wobei der Mittelwert in Up 1 75 5 11 8 h her lag als in CP 68 3 13 7 Zwischen den Nativejakulaten und den verschiedenen Verd nnern sowie zwischen den Verd nnern CP und TE bzw TE und Up1 lie en sich keine weiteren signifikanten Unterschiede feststellen
298. lkammer bestimmten und den durch CASA gemessenen Dichten 147 4 4 1 1 Korrelationen nach Verd nnern getrennt 147 4 4 1 2 Korrelation ohne Trennung nach Verd nnernn 148 4 4 2 Zusammenhang zwischen der subjektiv gesch tzten und der mittels CASA gemessenen Vorw rtsbeweglichkeit 149 4 4 2 1 Korrelationen nach Verd nnern getrennt 149 4 4 2 2 Korrelationen ohne Trennung nach Verd nnen 150 4 4 3 Zusammenhang zwischen dem im Eosinausstrich bestimmten Anteil an lebenden Spermien und der durch CASA ermittelten Viabilitat zes eier ee ee 150 4 4 3 1 Korrelationen nach Verd nnern getrennt 151 4 4 3 2 Korrelationen ohne Trennung nach Verd nnen 151 4 4 4 Zusammenh nge zwischen verschiedenen Spermaparametern 152 4 4 4 1 Korrelationen nach Verd nnern getrennt 152 4 4 4 2 Korrelationen ohne Trennung nach Verd nnen 154 9 Biskussi n en cerssneriiennsinenesiennersaee 156 5 1 Diskussion der Fragestellung He 156 5 2 Diskussion der Methodik eek ee rn 158 5 2 1 Auswahl der Probanden rare ee 158 5 2 2 Spermagewinnung assnse reed 160 5 2 3 Verwendete spermatologische Untersuchungsmethoden 161 Inhaltsverzeichnis 5 2 3 1 Klassische Spermatologie cccceeeeeeeeeeeeteeeee
299. llen unbeeinflusst bleiben England 1999 Nach Fielden 1971 Christiansen 1984b und G nzel 1986 sind die drei wichtigsten Methoden zur Spermagewinnung beim Hund die digitale Manipulation manuelle Penismassage siehe unten die k nstliche Vagina Macpherson und Penner 1967 Fielden 1971 Christiansen 1984b Johnston 1991 Yamashiro et al 2007 und die Elektroejakulation Macpherson und Penner 1967 Seager und Platz 1977b Christiansen 1984b Ohl et al 1994 Pesch et al 2007 Thomassen und Farstad 2009 Eine weitere Alternative ist die Nutzung pharmakologischer Methoden Kutzler 2005 Dar ber hinaus besteht die M glichkeit Samenzellen direkt aus dem Epididymis zu gewinnen was sowohl intra vitam nach Kastration als auch post mortem erfolgen kann Thomassen und Farstad 2009 Die manuelle Stimulation ist die gebr uchlichste Methode der Spermagewinnung beim Hund Kutzler 2005 Es werden ausschlie lich vorgew rmte graduierte Glas oder vorzugsweise Plastikgef e mit einer weiten ffnung und einem verj ngten Ende ben tigt Seager und Fletcher 1972 G nzel 1986 Linde Forsberg 1991 Freshman 2002 Vor der Absamung sollte zur Entfernung von Pr putialkatarrh die Pr putial ffnung mit Zellstoff trocken gereinigt werden Hoffmann 2003a Die Spermagewinnung sollte mit behandschuhten H nden durchgef hrt werden Seager und Fletcher 1972 Linde Forsberg 1991 wobei anstatt von Latex aufgrund des nachteilig
300. logien und Berechnungsformeln und auch verschiedene Softwareparameter Einstellungen f r die Spermienerkennung verwenden was einen direkten Vergleich der numerischen Werte schwierig bzw unm glich macht Amann und Katz 2004 Hoogewijs et al 2011 Gerade diese technischen Einstellungen sind aber wichtig um die Bewegungsbahnen der einzelnen Spermien zu identifizieren und zu rekonstruieren Rijsselaere et al 2003 und sie beeinflussen daher die Datenausgabe in kritischer Weise Ellington et al 1993 Smith und England 2001 Amann und Katz 2004 Ohne R cksicht auf die technischen Einstellungen das verwendete System die betreffende Spezies und die Spermabehandlung k nnen CASA Systeme irref hrende oder fehlerhafte Daten liefern Ellington et al 1993 Smith und England 2001 Verstegen et al 2002 Rijsselaere et al 2003 Parallel zur Entwicklung der CASA Systeme wurden spezielle Messkammern mit einer fixen Tiefe von 20 um entwickelt die es erm glichten alle Zellen ausreichend scharf darzustellen um deren Digitalisierung zu erreichen Amann und Katz 2004 Die Qualit t der Z hlkammern beeinflusst die Ergebnisse deutlich Hoogewijs et al 2011 und ist daher ebenso wie bei der manuellen Spermabeurteilung eine der Fehlerquellen bei CASA Systemen Verstegen et al 2002 Zudem hat auch die Beschickungstechnik der Kammern einen gro en Einfluss auf die Motilit tsparameter und die ermittelten Konzentrationen Hoogewijs et al 201
301. lt 6 lt O X 2 ox ace Ss OO aces S ee s k EA 28 25 KS X Ly Abb 11 Prozentsatz an lebenden Samenzellen mittels Computer assisted sperm analysis CASA SpermVision System gemessene Viabilit t nach SYBR 14 Pl F rbung im Nativsperma und in den verschiedenen Verd nnern an Tag 0 dargestellt als r cktransformierter Mittelwert Xr modifizierter Mittelwert mit negativem und positivem Fehlerbalken modifizierter 1 s Bereich CP Verdunner CaniPRO Chill 10 TE TRIS Fruktose Eigelb Verd nner Up1 2 Uppsala Equex 2 System Verd nner 1 und Verd nner 2 Up 1 Uppsala Equex 2 System nur Verd nner 1 n Probenanzahl Unmittelbar nach dem Verd nnen konnte in der einfaktoriellen Varianzanalyse mit Messwiederholungen bez glich des Faktors Verd nner kein signifikanter Unterschied der im Durchschnitt mittels CASA bestimmten Viabilit t zwischen dem Nativsperma den mit CP TE sowie Up 1 2 aufgearbeiteten Ejakulaten ermittelt werden n 12 p 0 6 Auch zwischen dem Nativsperma den mit CP und den mit TE verd nnten Ejakulaten konnte bei Betrachtung der CASA Viabilit t kein signifikanter Unterschied nachgewiesen werden n 30 p 0 5 Zwischen dem Nativsperma den mit CP TE und Up 1 verd nnten Ejakulaten lie sich hingegen ein signifikanter Unterschied der durchschnittlichen mittels CASA bestimmten Viabilit t nachweisen n 18 p 0 021 Im anschlie enden Student Newma
302. lten waren k nnten auch diese urs chlich zum besseren Erhalt der Motilit t beigetragen haben 201 Diskussion Einen weiteren Unterschied zwischen den VerdUnnern CP und TE der eventuell als urs chlich f r die bessere Konservierung der Motilitat in den mit CP verdunnten Ejakulaten in Betracht zu ziehen ist stellt der Antibiotikazusatz Gentamicin im Verd nner CP dar Aurich und Spergser 2007 konnten zum einen zeigen dass bestimmte Bakterien gemessen an _ Maotilitat Spermiengeschwindigkeit und Membranintegritat schadliche Effekte auf die Qualit t von fl ssigkonserviertem Hengstsperma aus ben k nnen Diese Effekte wurden durch den Zusatz von Gentamicin nicht reduziert Zum anderen wurde jedoch auch durch Gentamicin die Spermienfunktion in fl ssigkonserviertem Sperma negativ beeinflusst Aurich und Spergser 2007 Untersuchungen ob diese Beobachtungen auch f r canines Sperma zutreffend sind konnten in der Literatur nicht gefunden werden Trotzdem k nnen sowohl negative bakterielle Effekte als auch negative Effekte durch den Antibiotikazusatz auf fl ssigkonserviertes Hundesperma nicht ausgeschlossen werden Es ist denkbar dass es in der vorliegenden Arbeit in den verd nnten Ejakulaten ohne Antibiotikazusatz TE Up1 Up1 2 zu einer Vermehrung von eventuell enthaltenen Bakterien kam welche zur Verminderung der Spermaqualit t im Zeitverlauf der Fl ssigkonservierung beigetragen hat und dass eben diese Vermehrung in den mit
303. lung des Verh ltnisses lebender zu toter Samenzellen und des qualitativen und quantitativen Vorkommens morphologisch ver nderter Samenzellen mittels Eosinausstrich die Bestimmung der Dichte mit der Neubauer Z hlkammer sowie den Nachweis von Agglutinationen oder etwaiger sonstiger mikroskopischer Beimengungen z B Fremdzellen im Ejakulat Hoffmann 2003b Sie wurde mit einem Phasenkontrastmikroskop Objektive 10x 0 25 20x 0 35 40x 0 65 100x 1 25 Oel mit auf 37 C beheizbarem Objekttr gertisch hund H 500 Helmut Hund GmbH Wetzlar durchgef hrt Die Auswertung der Eosinausstriche erfolgte zum Teil an einem Phasenkontrastmikroskop Objektive E2 PLAN 4x 0 10 E2 PLAN PH 10x 0 25 E2 PLAN PH 40x 0 65 ohne beheizbaren Objekttragertisch Leica CM E Leica Microsystems GmbH Wetzlar Zum Ausz hlen der verschiedenen Parameter wurde ein elektronisches Z hlger t Assistent Counter 345 15 Typ AC 15 PC Karl Hecht GmbH amp Co KG Sondheim verwendet 78 Material und Methoden a Vorwartsbeweglichkeit Die Sch tzung der Vorwartsbeweglichkeit der Samenzellen erfolge am Deckglaspr parat bei 400 facher Vergr erung mit positivem Phasenkontrast Zur Herstellung des Deckglaspr parates wurde nach mehrmaligem Schwenken des Tulpenglases mithilfe einer Eppendorf Pipette Eppendorf AG Hamburg ein 10 ul gro er Tropfen Sperma auf einen vorgew rmten Objekttr ger 37 C gegeben und dieser dann mit einem Deckglas 18x 18mm abgedeck
304. lution et la conservation du sperme de Chien Bull Acad Vet Fr 1952 Fevrier 59 62 Burgess C M Bredl J C S Plummer J M England G C W 2001 Vital and ultrastructural changes in dog spermatozoa during cryopreservation J Reprod Fertil 57 Suppl 357 363 Cain J L 2001 An overview of canine reproduction services Getting started Vet Clin North Am Small Anim Pract 31 2 209 218 Campbell R C Dott H M Glover T D 1956 Nigrosin eosin as a stain for differentiating live and dead spermatozoa J Agric Sci 48 1 8 Ceylan A Serin 2007 Influence of ascorbic acid addition to the extender on dog sperm motility viability and acrosomal integrity during cooled storage Revue M d Vet 158 7 384 387 Christiansen J 1984a Reproduction in the Dog Chapter 6 Artificial breeding and embryo transfer in Christiansen J Reproduction in the Dog and Cat Verlag Bailliere Tindall London Philadelphia 115 123 Christiansen J 1984b Reproduction in the Dog Chapter 4 Andrology of the normal male in Christiansen J Reproduction in the Dog and Cat Verlag Bailliere Tindall London Philadelphia 80 109 Concannon P W Battista M 1989 Canine semen freezing and artificial insemination in Kirk R W Hrsg Current veterinary therapy X Small animal practice Verlag Saunders Philadelphia London 1247 1258 Correa J R Zavos P M 1994 The hypoosmotic swelling
305. m Anim 45 2 201 207 Mickelsen W D Memon M A Anderson P B Freeman D A 1993 The relationship of semen quality to pregnancy rate and litter size following artificial insemination in the bitch Theriogenology 39 2 553 560 Mogas T Rigau T Piedrafita J Bonet S Rodriguez Gil J E 1998 Effect of column filtration upon the quality parameters of fresh dog semen Theriogenology 50 8 1171 1189 Morton D B Bruce S G 1989 Semen evaluation cryopreservation and factors relevant to the use of frozen semen in dogs J Reprod Fertil 39 Suppl 311 316 Nishiyama T Kinugasa T Kimura T Watanabe G Taya K Tsumagari S Takeishi M 1999 Determination of optimal time for mating by artificial insemination with chilled semen using luteinizing hormone surge as an indicator in beagles J Am Anim Hosp Assoc 35 4 348 352 Ni a ski W 2006 Intravaginal insemination of bitches with fresh and frozen thawed semen with addition of prostatic fluid Use of an infusion pipette and the Osiris catheter Theriogenology 66 2 470 483 Ni a ski W 2009 Artificial insemination in dogs Use of chilled vs cryopreserved semen Reprod Dom Anim 44 Suppl 3 63 Abstract 239 Literaturverzeichnis Nizanski W Klimowicz M 2005 Zastosowanie barwienia flourescencyjnego SYBR 14 jodek propydyny i cytometrii przep ywowej w ocenie jako ci nasienia ps w poddanego konserwacji w st
306. ma den mit CP TE und Up 1 verd nnten Ejakulaten n 18 p 0 19 und zwischen dem Nativsperma den mit CP und den mit TE verd nnten Proben n 30 p 0 64 lie sich bei Betrachtung des prozentualen Anteils an lebenden Spermien im Eosinausstrich kein signifikanter Unterschied nachweisen 4 2 3 2 Mittels CASA gemessene Viabilit t Die durchschnittliche mittels CASA bestimmte Viabilit t nach SYBR 14 PI F rbung der Nativejakulate und der mit den verschiedenen Verd nnern aufgearbeiteten Ejakulate unmittelbar nach dem Verdunnen Tag 0 ist in Abb 11 dargestellt Nach Aufarbeitung des Nativspermas mit den verschiedenen Verd nnern konnte nur in den mit Up 1 2 verd nnten Ejakulaten eine Verringerung der CASA Viabilit t im Vergleich mit den Nativejakulaten gesehen werden Bei den mit CP TE und Up 1 aufgearbeiteten Ejakulaten lie sich im Vergleich mit der durchschnittlichen CASA 114 Ergebnisse Viabilitat der Nativejakulate hingegen sogar eine leichte Zunahme der Mittelwerte unmittelbar nach Verd nnung feststellen Die beobachteten Ver nderungen waren jedoch nicht signifikant Re lt a Sl WV RR 2 RS SES X ONativsperma n 30 GCP n 30 ATE n 30 Up 1 2 n 12 BUp 1 n 18 2 2 RK Ro Se ee S 82 TK aces ee ee amp amp x pore 2585 tater ox pete gt i gt TKO RRRI SER SES x s ae t 4 2 Ree gt jececegece
307. ma nicht so erfolgreich wie die von verd nntem was auf die sch dlichen Eigenschaften des Prostatasekretes oder anderer Komponenten des Seminalplasmas zur ckzuf hren ist Concannon und Battista 1989 Da bei der Spermakonservierung auch bei optimaler Methodik ein gewisser Vitalitatsverlust der Samenzellen unvermeidbar ist m ssen an das Ausgangsmaterial besonders hohe Anforderungen gestellt werden Daher sollten f r die Fl ssig und Kryokonservierung ausschlie lich Ejakulate verwendet werden die den Anforderungen in Tab 2 gen gen Pesch et al 2007 Tab 2 Qualit tskriterien f r R denejakulate Pesch et al 2007 Kriterium Referenzwert vorw rtsbewegliche Spermien 275 morphologisch veranderte Spermien lt 20 pH Wert 6 2 7 2 Gesamtspermienzahl x 10 gt 0 3 1 0 Volumen spermienreiche Fraktion ml 0 5 2 0 abh ngig von der K rpergr e z B Dackel 2 0 3 Dobermann gt 1 0 34 Literatur 2 4 1 Flussigkonservierung Ziel dieser Art der Spermakonservierung ist es die Befruchtungsfahigkeit der Spermien ber einen m glichst langen Zeitraum zu erhalten Hoffmann 2003d indem die Keimzellen bei niedrigen Temperaturen aufbewahrt werden ohne dass der Gefrierpunkt erreicht wird Iguer Ouada und Verstegen 2001b Lopes et al 2008 da dies intrazellul re Sch digungen verursachen w rde welche die Viabilit t und die Befruchtungsf higkeit der Samenzellen beeinflussen k nn
308. ma sollte im Dunkeln gelagert werden Nishiyama et al 1999 Pena et al 2006 Um eine zu schnelle Abk hlung zu vermeiden wird das R hrchen in einem mit Wasser von Raumtemperatur gef llten Glas platziert und mit diesem zusammen f r eine halbe bis vier Stunden Andersen 1980 Linde Forsberg 1991 Pena et al 2006 in den K hlschrank gestellt bevor es versandfertig gemacht wird Pe a et al 2006 Das Wasser im Becherglas verhindert einen K lteschock w hrend des K hlungsprozesses Rijsselaere et al 2002a und vermindert Temperaturvariationen w hrend des Aufbewahrungszeitraumes Linde Forsberg und Forsberg 1993 Eine weitere M glichkeit zur Herunterk hlung des Samens auf 5 C besteht darin das verd nnte Sperma f r zwei Stunden in eine Styroporbox im K hlschrank zu verbringen Pesch et al 2007 Um die Temperatur auf 4 C abzusenken kann auch ein programmiertes Niedrig Temperatur Bad UH JF Chino Ltd Japan eingesetzt werden welches das Sperma innerhalb einer Periode von einer Stunde auf die gew nschte Temperatur abk hlt Tsutsui et al 2003b Unabh ngig von der Methode ist das Ziel des langsamen Abk hlens eine Reduktion der Effekte des K lteschocks Ponglowhapan et al 2004 Hermansson und Linde Forsberg 2006 Shahiduzzaman und Linde Forsberg 2007 Nizanski et al 2009 am geringsten werden Gesamtmotilitat und Vorw rtsbeweglichkeit bei K hlraten von 0 3 bis 1 C pro Minute beeinflusst Bouchard et al 19
309. meist um einen leicht erh hten Anteil an Samenzellen mit Kopfkappenver nderungen in der Spermac F rbung handelte Nr 1 2 6 7 9 und 11 Bei Hund Nr 7 war zus tzlich ein erh hter Anteil an morphologisch ver nderten Samenzellen und bei Hund Nr 24 eine verminderte SGZ im Ejakulat zu beobachten Die genannten Abweichungen von den physiologischen Referenzbereichen waren jedoch f r die vorliegenden Untersuchungen nicht weiter relevant da die Proben vor und nach der Fl ssigkonservierung individuelle Ber cksichtigung fanden 5 3 1 2 CASA F r die mittels CASA bestimmten Motilit tsparameter sowie f r die mittels CASA nach SYBR 14 PI F rbung bestimmte Viabilitat lie en sich in der Literatur keine Referenzbereiche f r R densperma finden Daher konnten die vorliegenden 176 Diskussion Ergebnisse nur mit denen anderer Ver ffentlichungen verglichen werden Hierbei muss jedoch beachtet werden dass es z T Unterschiede bez glich der genutzten CASA Systeme und der eingesetzten Verd nnungen bzw Verd nnermedien gibt In der Literatur konnten nur wenige Arbeiten gefunden werden in denen die CASA Messungen ohne vorherige Verd nnung der Nativejakulate erfolgten so wie es in der vorliegenden Arbeit gr tenteils der Fall war Auf die Problematik hinsichtlich der Verd nnung der Nativejakulate f r die Beurteilung mittels CASA bei den vorliegenden Untersuchungen wurde bereits in Kap 5 2 3 2 hingewiesen Verglichen mit den von S
310. menzellen nach Up 1 2 84 0 532 lt 0 001 logarithmischer Transformation Up 1 126 0 567 lt 0 001 subjektiv gesch tzte Vorwarts keiner Nativsperma 30 0 518 0 003 beweglichkeit versus Anteil an CP 30 0 380 0 038 Samenzellen mit nicht TE 30 0 509 0 004 aufgerollter Gei el im HOS Test Up 1 2 12 0 847 lt 0 001 nach logarithmischer Up 1 18 0 560 0 016 Transformation CASA Gesamtmotilitat versus keiner Nativsperma 30 0 464 0 010 Anteil an Samenzellen mit nicht CP 30 0 401 0 028 aufgerollter Gei el im HOS Test TE 30 0 521 0 003 nach logarithmischer Up1 2 12 0 881 lt 0 001 Transformation Up 1 18 0 674 0 002 CASA Vorw rtsbeweglichkeit keiner Nativsperma 30 0 508 0 004 versus Anteil an Samenzellen mit CP 30 0 400 0 029 nicht aufgerollter Gei el im HOS TE 30 0 513 0 004 Test nach logarithmischer Up 1 2 12 0 875 lt 0 001 Transformation Up 1 18 0 668 0 002 153 Ergebnisse Anteil lebender Samenzellen im keiner Nativsperma 30 0 385 0 036 Eosinausstrich nach Arcus CP 30 0 613 lt 0 001 Sinus Transformation versus TE 30 0 582 lt 0 001 Anteil an Samenzellen mit nicht Up 1 2 12 0 786 0 002 aufgerollter Gei el im HOS Test Up 1 18 0 513 0 030 nach logarithmischer Transformation CASA Viabilitat nach Arcus keiner
311. menzellen sollte maximal 20 betragen Riesenbeck et al 2001 Es wurden nur die Kopfkappenver nderungen beachtet und diese in abgel ste Kopfkappen schiefe Kopfkappen und sonstige Ver nderungen z B geschwollene Kopfkappen differenziert 3 3 3 HOS Test Zur Beurteilung des Funktionszustandes der Plasmamembran wurde der HOS Test eingesetzt Hierbei zeigen intakte Spermien unter hypoosmotischen 82 Material und Methoden Bedingungen infolge von Wasseraufnahme eine Anschwellung die sich in einem charakteristischen Aufrollen des Schwanzes u ert curled tail w hrend membrandefekte Spermien dieses Ph nomen nicht erkennen lassen not curled Riesenbeck et al 2001 Die hypoosmotische L sung wurde im Vorherein nach Rezept siehe Kap 9 5 3 2 hergestellt und in Portionen von 100 ul in Eppendorf Reaktionsgef en 1 5 ml Eppendorf AG Hamburg im Gefrierfach bei 21 C gelagert Vor Gebrauch wurde sie aufgetaut und auf 37 C angew rmt F r die Untersuchung wurden in die 100 ul hypoosmotische L sung mithilfe einer Eppendorf Pipette Eppendorf AG Hamburg 10 ul Sperma eingebracht Das Gemisch wurde kurz geschwenkt und f r 30 Minuten bei 37 C inkubiert Riesenbeck et al 2001 Im Anschluss wurde aus 10 ul dieses Gemisches ein Deckglaspr parat hergestell welches nach f nfmin tiger Absenkungszeit ausgez hlt wurde indem 200 Spermien bei 400 facher Vergr erung und positivem Phasenkontrast beurteilt wurden u
312. meter Gesamtmotilitat VCL und BCF hoch 31 Literatur korreliert mit der Penetrationsrate humaner Oozyten Fetterolf und Rogers 1990 Bei Untersuchungen an bovinem Sperma konnten bei kollektiver Korrelation verschiedener Parameter mit der Fertilitat definiert als Non Return Rate von 59 Tagen signifikante Zusammenhange ermittelt werden Die engste Korrelation bestand dabei fur die Parameterkombination ALH BCF LIN VAP und VSL Diese Zusammenhange lassen den Schluss zu dass die potentielle Fertilitat eines Bullen auf Basis der Bewegungsqualitat der Spermien abgeschatzt werden kann Farrell et al 1998 2 3 3 3 Viabilitatsanalyse Die Integritat der Plasmamembran ist essentiell fur die Befruchtungsfahigkeit von Spermien In letzter Zeit wurden verschiedene Fluoreszenzf rbungen fur die Untersuchung der Spermienmembranintegrit t bei Hunden genutzt und validiert Rijsselaere et al 2005 Carboxyfluoresceindiacetat CFDA in Kombination mit Propidiumiodid PI Rota et al 1995 Pe a et al 1998b Hermansson und Linde Forsberg 2006 SYBR 14 in Kombination mit PI Rijsselaere et al 2002a Yu und Leibo 2002 Nizanski 2006 Schafer Somi und Aurich 2007 Carboxy Seminaphthorhodfluor Carboxy SNARF in Kombination mit PI Pe a et al 1999 Calcein AM in Kombination mit Ethidiumhomodimer Calcein AM EthD 1 Sirivaidyapong et al 2000 Hoechst 33258 Hewitt et al 2001 Aufgrund des weitverbreiteten Einsatzes
313. mt werden welche Spermaparameter fur die Vorhersage der in vivo Fertilitat am nutzlichsten sind Fur bovines Sperma konnten beispielsweise zwischen den kombinierten Prozentsatzen von Motilitat und Geschwindigkeit und der Fertilitat hohe Korrelationen ermittelt werden Farrell et al 1998 Fur canines Sperma ist jedoch noch immer unklar welche der CASA Motilitatsparameter von klinischem Wert fur die Vorrausage der Fertilitat einer gegebenen Spermaprobe sind Verstegen et al 2002 Zudem erschienen in der vorliegenden Arbeit auch die CASA Einstellungen an sich teilweise als verbesserungswurdig was ebenfalls weiterf hrender Untersuchungen bedarf 220 Zusammenfassung 6 Zusammenfassung Evaluierung verschiedener Verd nner zur Fl ssigkonservierung von caninem Sperma Die k nstliche Besamung gewinnt in der Hundezucht immer mehr an Bedeutung Dabei k nnen durch die Verwendung von fl ssigkonserviertem Sperma selbst bei vaginaler Deponierung des Samens i d R deutlich bessere Tr chtigkeitsraten und h here Wurfgr en erzielt werden als mit kryokonserviertem Sperma ein optimales Besamungsmanagement vorausgesetzt Zudem ist die Fl ssigkonservierung von Sperma hinsichtlich Herstellung und Versand einfacher und kosteng nstiger als die Kryokonservierung Limitierend beim Einsatz von flussigkonserviertem Sperma ist jedoch die begrenzte berlebensdauer der Samenzellen In der vorliegenden Arbeit wurden mittels Splitsample Verfahren dre
314. n Keuls Test konnte diese Signifikanz jedoch nicht best tigt werden Hier zeigte keines der vergleichend getesteten Paare einen signifikanten Unterschied 115 Ergebnisse 4 2 4 Einfluss der Verdunner auf den Anteil an morphologisch ver nderten Samenzellen an Tag 0 Der durchschnittliche Anteil an morphologisch ver nderten Samenzellen im Eosinausstrich in der spermienreichen Fraktion vor und unmittelbar nach dem Verd nnen Tag 0 mit den verschiedenen Verdunnern ist in Tab 17 dargestellt Durch die Verd nnung des Nativspermas mit den verschiedenen Verd nnern kam es zu keiner Zunahme des im Mittel bestimmten Anteils an morphologisch ver nderten Samenzellen Im Gegenteil war der im Nativsperma ausgez hlte mittlere Anteil h her als in den verd nnten Ejakulaten Tab 17 Prozentualer Anteil an morphologisch ver nderten Samenzellen Eosinausstrich n Xg SF Min Max im Nativsperma und in den verschiedenen Verd nnern an Tag 0 Verd nner n Xg SF Min Max keiner Nativsperma 30 10 3 1 66 4 0 37 0 CP 30 7 4 2 21 0 5 30 5 TE 30 8 2 1 93 2 5 35 0 Up1 2 12 7 9 2 08 3 0 26 0 Up 1 18 9 3 1 72 6 0 30 0 Unmittelbar nach dem Verd nnen Tag 0 konnte in der einfaktoriellen Varianzanalyse mit Messwiederholungen bez glich des Faktors Verd nner ein signifikanter Unterschied hinsichtlich des Anteils an morphologisch ver nderten Samenzellen im Eosinausstrich zwische
315. n und Maximum Max in der Form x x SD x SD Min Max dargestellt Bei positiven quantitativen Merkmalen mit rechtsschiefer Verteilung bei denen die Originaldaten logarithmisch transformiert wurden Gesamtanteil morphologisch ver nderter Samenzellen Kopf Hals Schwanzver nderungen lose K pfe und Plasmatropfen im Eosinausstrich Gesamtanteil an Kopfkappenver nderungen und abgel ste Kopfkappen in der Spermac F rbung Anteil an nicht aufgerollten Gei eln im HOS Test erfolgte die einfache Datenbeschreibung durch Angabe von geometrischem Mittelwert xg Streufaktor SF Minimum Min und Maximum Max in der Form x SF Min Max Bei graphischen Abbildungen wurden diese in Form von Intervallen xy x SF Xg SF dargestellt x SF Zur Beurteilung der morphologischen Ver nderungen wurden folgende Gruppen zusammengefasst Kopf Hals Schwanzver nderungen lose K pfe und Plasmatropfen Aus der Summe aller Ver nderungen wurde der Gesamtprozentsatz morphologisch ver nderter Samenzellen ermittelt Zur statistischen Pr fung des Verdunnereinflusses der drei bzw vier verschiedenen Verd nner auf die untersuchten Spermaparameter im Vergleich mit Nativsperma an Tag 0 auf Signifikanz wurden einfaktorielle Varianzanalysen mit Messwiederholungen bez glich des Faktors Verd nner durchgef hrt Bei signifikanten Ergebnissen wurden die Werte im Anschluss an die Varianzanalyse paarweise mit dem Student Newman K
316. n 2 C und 8 C k nnen die den Verd nner enthaltenden Flaschen ber ein Jahr lang gelagert werden Vor Gebrauch muss lediglich die entsprechende Menge an Eigelb zugesetzt werden was die Handhabung dieses Verd nners leicht macht da keine Herstellung nach Rezept mit Abwiegen einzelner Komponenten n tig ist Im Gegensatz zum vorgenannten Verd nner handelte es sich beim Verd nner TE und beim Uppsala Equex 2 System Verd nner um nichtkommerzielle Verd nner 170 Diskussion welche im eigenen Labor selbst hergestellt wurden Hierzu m ssen die ben tigten Ger te und Chemikalien vorhanden sein was einen Hinderungsgrund f r den Einsatz in der tierarztlichen Praxis darstellen k nnte Zudem ist der arbeitstechnische Aufwand im Vergleich zu kommerziellen Verd nnern wesentlich h her und zeitintensiver Allerdings ist die eigene Herstellung bei h ufiger Nachfrage g nstiger als der kommerzielle Erwerb vorausgesetzt die n tigen Ger te stehen zur Verf gung und m ssen nicht extra gekauft werden 5 2 4 1 Inhaltsstoffe Zwischen den drei untersuchten Verd nnern existierten bez glich der Inhaltsstoffe neben einigen Gemeinsamkeiten auch wesentliche Unterschiede welche bei der Interpretation der Versuchsergebnisse ber cksichtigt werden m ssen Da es sich bei dem Verd nner CP um einen kommerziellen Verd nner handelte war seine genaue Zusammensetzung nicht bekannt Es lagen lediglich die Herstellerangaben vor Demnach enthielt
317. n vitro bietet der Zona pellucida ZP Bindungstest welcher die F higkeit der Spermien an eine homologe Eizelle zu binden misst Strom Holst et al 2000 Mittels dieses Tests konnte festgestellt werden dass die Fl ssigkonservierung bei 4 C f r vier Tage die ZP Bindungsf higkeit der Samenzellen tendenziell reduziert wenngleich die mittlere Anzahl der an die ZP gebundenen Spermien nach einem Tag Lagerungsdauer sich nicht signifikant von der nach vier Tagen unterscheidet Dennoch sprechen die Ergebnisse f r einen negativen Effekt der l ngeren Fl ssigkonservierung auf die ZP Bindungsf higkeit von caninen Spermien Str m Holst et al 2000 bzw deuten darauf hin dass mit steigender Lagerungsdauer die ZP Bindungsf higkeit der fl ssigkonservierten Samenzellen abnimmt Ponglowhapan et al 2004 Auch Hermansson et al 2006 best tigen dies indem sie zeigen konnten dass nach einer Stunde Inkubation die ZP Bindungsf higkeit von f r einen Tag gelagerten Spermien besser ist als die von f r zwei Tage gelagerten Bei einer vergleichenden Untersuchung der Penetration der ZP von in vitro gereiften Oozyten durch frische und fl ssigkonservierte Spermien zeigen frische Spermien eine h here mittlere Penetrationsrate Allerdings kann w hrend der ersten Stunde der Ko Inkubation von Spermien und Eizellen bei gek hlten Spermien ein h herer Prozentsatz an Penetration gesehen werden als bei frischen Spermien De los Reyes et al 2009 Dies deut
318. n Ejakulaten unterschieden sich f r alle drei Parameter signifikant pw 0 0007 bis lt 0 0001 Tab A10 A14 Kap 9 8 131 Ergebnisse Bez glich des Motilit tsparameters ALH konnten im Zeitverlauf in den mit CP TE und Up 1 2 verd nnten Ejakulaten nur geringf gige Ver nderungen beobachtet werden Einzig in den mit Up1 verd nnten Ejakulaten kam es ber den Untersuchungszeitraum zu einer deutlichen Abnahme der Mittelwerte Insgesamt waren die in den mit CP und TE aufgearbeiteten Ejakulaten gemessenen Werte einander sehr hnlich und lagen w hrend des gesamten Zeitverlaufs ber denen in den mit Up1 2 aufgearbeiteten Ejakulaten Die Mittelwerte in den mit Up 1 aufgearbeiteten Ejakulaten entsprachen zu Beginn des Untersuchungszeitraumes bis einschlie lich Tag 5 ann hernd den Werten in den mit CP und TE aufgearbeiteten Ejakulaten und lagen somit bis dahin auch ber denen in den mit Up 1 2 aufgearbeiteten Ejakulaten Zwischen Tag 7 und Tag 10 kam es dann jedoch zu einer deutlichen Abnahme der Mittelwerte in den mit Up 1 aufgearbeiteten Ejakulaten sodass die Werte an Tag 10 eher denen in den mit Up 1 2 aufgearbeiteten Ejakulaten entsprachen als denen in den mit CP und TE aufgearbeiteten Ejakulaten Obwohl die beobachteten Ver nderungen des Parameters ALH z T nur geringf gig erschienen konnten im Zeitverlauf der Fl ssigkonservierung in allen verd nnten Ejakulaten signifikante Abnahmen bez glich dieses Parameters nachgewiesen
319. n Exodus www exodusbreed Universal Canine Breeders ers com Semen Extender Corporation York PA USA Triladyl Canine TRIS gepufferter Minit b G nzel Apel 45 ml Verd nner vor GmbH 2007 Tiefgefrierverd nner Gebrauch m ssen Tiefenbach www minitube de 10 ml Eigelb Germany zugegeben werden 9 8 Ergebnistabellen Tab A5 CASA Motilit tsparameter DAP DCL DSL VAP VCL VSL ALH BCF STR LIN und WOB n x SD Min Max im Nativsperma und in den verschiedenen Verd nnern an Tag 0 Verd nner Parameter x SD Min Max keiner DAP um 41 6 8 7 23 7 53 9 Nativsperma DCL um 61 9 11 6 42 6 85 1 n 30 DSL um 35 1 9 1 14 9 50 0 VAP um s 97 4 20 4 55 2 123 7 VCL um s 144 9 27 5 97 9 199 9 VSL um s 82 5 21 3 33 9 112 9 ALH um 5 7 1 0 3 5 7 9 BCF Hz 26 2 3 4 20 5 34 5 STR VSL VAP 83 4 8 1 61 0 92 0 LIN VSL VCL 56 6 11 6 27 0 76 0 WOB VAP VCL 67 0 8 4 45 0 82 0 CP DAP um 38 8 6 8 232 48 9 n 30 DCL um 54 4 6 9 39 6 65 6 DSL um 32 4 6 8 16 8 44 6 VAP m s 90 9 16 0 54 1 113 0 VCL um s 127 0 16 5 90 2 153 7 VSL um s 76 2 15 7 39 2 101 7 ALH um 5 2 0 8 3 6 6 8 BCF Hz 24 0 2 7 19 7 30 6 STR VSL VAP 82 9 5 3 72 0 94 0 LIN VSL VCL 59 3 9 2 39 0 77 0 WOB VAP VCL 70 9 7 3 54 0 82 0 TE DAP um 37 3 6 5 22 6 51 0 n 30 DCL um 54 0 7 7 36 9 70 3
320. n Nativejakulaten und in allen verd nnten Ejakulaten zu allen Untersuchungszeitpunkten 2 s 42442424444040HeRern Hann 152 9 10 Tabellenverzeichnis Tab Tab Tab Tab Tab Tab Tab 1 Vergleichende Darstellung der Konzeptionsraten und der durchschnittlichen Wurfgr en bei nat rlicher Paarung k nstlicher Besamung KB mit Frischsperma KB mit fl ssigkonserviertem Sperma und KB mit Tiefgefriersperma TG Sperma 242424444442 20 11 Qualit tskriterien f r R denejakulate Pesch et al 2007 34 Tr chtigkeitsergebnisse f r verschiedene Verdunner zur Fl ssig konservierung von Hundesperma von 1990 bis 1993 Linde Forsberg Motilitat akrosomale Integrit t und Plasmamembranintegritat im Nativsperma und in mit UE 2 1 Teilverd nner 1 des Uppsala Equex 2 Verd nners f r ein oder zwei Tage bei 4 C fl ssigkonserviertem Sperma Hermansson et al 2006 ssr244 4444044440 71 Angaben zu den einzelnen Hunden n 30 2244444nneennn nenn 75 Einteilung der morphologischen Ver nderungen nach Hoffmann 20036 modiizierlasss tose era 80 Messergebnisse der einzelnen durch CASA SpermVision System bestimmten Motilitatsparameter in den Nativejakulaten n 30 101 286 Anhang Tab 8 Tab 9 Tab Tab Tab Tab Tab Tab Tab Tab Tab Tab 10 11 12 13 14
321. n Punkte stellen die einzelnen Positionen des Spermiums zu den verschiedenen Zeitpunkten w hrend der Analyseperiode dar DSL geradliniige Strecke VSL lineare Geschwindigkeit DAP Durchschnittsstrecke VAP mittlere Geschwindigkeit DCL kurvilineare tats chlich zur ckgelegte Strecke VCL kurvilineare Geschwindigkeit ALH durchschnittliche seitliche Kopfauslenkung BCF beat cross frequency AOC durchschnittlicher Richtungswechsel des Kopfes nach Eder et al 2009 modifiziert Der Prozentsatz vorw rtsbeweglicher Samenzellen der sich in der Geschwindigkeit VAP und der Geradlinigkeit STR der Motilit t widerspiegelt ist einer der wichtigsten Parameter Iguer Ouada und Verstegen 2001a Die Amplitude ALH und die Frequenz BCF der Kopfauslenkung der Spermien sind ebenso von Bedeutung insbesondere fur die Penetration der Zona pellucida Iguer Ouada und Verstegen 2001a Verstegen et al 2002 Der Parameter ALH ist dabei so definiert dass ein steigender Wert fur ALH in einer steigenden kurvilinearen Geschwindigkeit VCL resultiert Wijchman et al 2001 An humanem Sperma konnte festgestellt werden dass die Parameter VCL und ALH f r ein bestimmtes Ejakulat charakteristisch sind und dessen Identifizierung erm glichen Wijchman et al 2001 Insgesamt besteht bei humanen Ejakulaten eine positive Korrelation zwischen einer hohen Gesamtmotilitat und hohen Spermiengeschwindigkeiten Wijchman et al 2001 Ebenso sind die Para
322. n an Tag 0 ersehen 115 Prozentsatz an Samenzellen mit nicht aufgerolltem Schwanz not curled im HOS Test im Nativsperma und in den verschiedenen Verd nnern an Tag O siesena adnan aiea et 121 284 Anhang Abb Abb Abb Abb Abb Abb Abb 15 17 Ver nderungen der Mittelwerte SD des Prozentsatzes an vorw rtsbeweglichen Samenzellen subjektiv gesch tzte Vorw rtsbeweglichkeit unter dem Phasenkontrastmikroskop in den verschiedenen Verd nnern im Zeitverlauf der Fl ssigkonservierung bei APC UDR ZEN Tage Ann ei nee E raria tena 124 Veranderungen der Mittelwerte SD des Prozentsatzes an motilen Samenzellen mittels Computer assisted sperm analysis CASA SpermVision System gemessene Gesamtmotilitat in den verschiedenen Verd nnern im Zeitverlauf der Fl ssigkonservierung bei APC UDGE ZEN Tage nn ae ee ikea 126 Ver nderungen der Mittelwerte SD des Prozentsatzes an vorw rtsbeweglichen Samenzellen mittels Computer assisted sperm analysis CASA SpermVision System gemessene Vorw rts beweglichkeit in den verschiedenen Verd nnern im Zeitverlauf der Fl ssigkonservierung bei 4 C ber zehn Tage nsn nenn 128 Ver nderungen des prozentualen Anteils lebender Samenzellen Eosinausstrich in den verschiedenen Verd nnern im Zeitverlauf der Fl ssigkonservierung bei 4 C ber zehn Tage 2222n nenn 137 Ver nderungen des Prozentsatzes an lebenden Samenzellen mittels Computer a
323. n dem Nativsperma den mit CP TE sowie Up 1 2 aufgearbeiteten Ejakulaten ermittelt werden n 12 p 0 041 Beim anschlie enden paarweisen Vergleich mit dem Student Newman Keuls Test stellte sich dieser als signifikanter Unterschied zwischen dem Nativsperma und den mit CP verd nnten Proben heraus p lt 0 05 Dabei lag der in den mit CP verd nnten Proben bestimmte durchschnittliche Anteil an morphologisch ver nderten Samenzellen unter dem Anteil der im Nativsperma bestimmt wurde Tab 17 signifikanten Differenzen Die anderen paarweisen Vergleiche lieferten keine weiteren Getrennt nach den einzelnen auftretenden morphologischen Ver nderungen lie en sich in der einfaktoriellen Varianzanalyse zwischen dem Nativsperma den mit CP TE sowie Up 1 2 aufgearbeiteten Ejakulaten signifikante Unterschiede f r den Anteil an Schwanzver nderungen n 12 p 0 047 f r den Anteil an 116 Ergebnisse Knickschwanzen n 12 p 0 0047 und f r den Prozentsatz an Plasmatropfen n 12 p 0 011 feststellen Hierbei unterschieden sich im Student Newman Keuls Test bez glich der Schwanzveranderungen die mit CP verd nnten Ejakulate signifikant vom Nativsperma p lt 0 05 Bez glich der Knickschwanze unterschieden sich ebenfalls die mit CP verd nnten Ejakulate signifikant vom Nativsperma p lt 0 05 und bez glich der Plasmatropfen unterschieden sich die mit allen drei Verd nnern aufgearbeiteten Ejakulate signifikant vom Nativsperma CP mit p l
324. n erreicht werden k nnen als mit kryokonserviertem Sperma Daher ist in der klinischen Praxis die Nachfrage nach fl ssigkonserviertem Hundesperma steigend zudem im Vergleich mit tiefgefrorenem Sperma auch die Herstellung und der Versand von fl ssigkonserviertem Sperma einfacher und kosteng nstiger sind Problematisch bei der Fl ssigkonservierung ist allerdings die begrenzte berlebensdauer der Samenzellen welche eine gutes Zeitmanagement hinsichtlich Samengewinnung und Besamungszeitpunkt erfordert Ungekl rt ist dabei wie lange die Befruchtungsf higkeit der fl ssigkonservierten Spermien konkret aufrechterhalten werden kann In bisherigen Untersuchungen zur Konservierung von caninem Sperma wurden haupts chlich Verd nner f r die Kryokonservierung getestet In den weniger zahlreichen Arbeiten die sich mit Verd nnern f r die Fl ssigkonservierung besch ftigen wurde die Spermaqualit t zum Teil nur ber einen Zeitraum von wenigen Tagen untersucht da generell davon ausgegangen wurde dass die Fertilitat des Spermas nur f r eine relativ kurze Zeitspanne aufrechterhalten werden kann Es wurden jedoch auch Studien durchgef hrt die l ngere Untersuchungszeitr ume aufwiesen und somit darauf hindeuten dass die Befruchtungsf higkeit der Samenzellen ber eine l ngere Zeitspanne konserviert werden kann Des Weiteren wurden Versuche unternommen die Lebensspanne der Spermien durch den Zusatz verschiedener Antioxidantien oder anderer Stoffe
325. n k nnen 5 2 Diskussion der Methodik 5 2 1 Auswahl der Probanden Das f r die Untersuchungen genutzte Sperma wurde von einem heterogenen Probandenkollektiv aus 30 R den gewonnen um eine f r den klinischen Alltag repr sentative Stichprobe und zudem unabh ngige Proben zu erhalten Die M glichkeit individueller Effekte wurde dabei zugunsten der Unabh ngigkeit der Proben in Kauf genommen Von der ausschlie lichen Nutzung der klinikseigenen R den wurde abgesehen da Ergebnisse erzielt werden sollten die auf die Situation in der klinischen Praxis bertragen werden k nnen Die R den unterschieden sich hinsichtlich der Rassen des Alters und der bisherigen Zuchtnutzung Alle Faktoren zusammen sollten gew hrleisten dass das Probandenkollektiv die Situation im klinischen Alltag widerspiegelt Des Weiteren wurden die insgesamt 16 verschiedenen Rassen gew hlt um eine Rassediversit t sicherzustellen und damit einen wie von England 1999 158 Diskussion beschriebenen Einfluss der Rasse auf die Spermaqualit t auszuschlie en Die Bevorzugung von R den mittlerer bis gro er Hunderassen geschah vor dem Hintergrund dass die Untersuchungen mittels Splitsample Verfahren durchgef hrt wurden weshalb m glichst volumenreiche Ejakulate ben tigt wurden und Volumen und SGZ der spermienreichen Fraktion von der K rpergr e des R den abh ngig sind G nzel 1986 Dabei ist die SGZ positiv korreliert mit der K rpergr e des Hundes
326. n membrandefekten Samenzellen im HOS Test HOS beurteilt Im Anschluss wurden die Ejakulate in drei Aliquote geteilt und es 221 Zusammenfassung erfolgte die Aufarbeitung mit den verschiedenen Verd nnern Unmittelbar nach der Herstellung Tag 0 wurden in den verd nnten Ejakulaten die gleichen Beurteilungsparameter untersucht wie in den Nativejakulaten Nach 1 2 3 5 7 und 10 Tagen Lagerung bei 4 C wurden 100 ul Aliquote der verd nnten Ejakulate f r f nf Minuten im Wasserbad auf 37 C angew rmt und anschlie end hinsichtlich VW GMcasa VWcasa Lebende Viacasa Patho und AV beurteilt Die in den Nativejakulaten untersuchten Spermaparameter variierten zwischen den verschiedenen R den Die durchschnittlich ermittelten Werte waren VW 80 8 9 5 GMcasa 70 9 18 1 VWeasa 65 0 19 9 Lebende 87 4 80 6 92 9 Viacasa 82 7 71 0 91 9 Patho 10 3 SF 1 66 AV 2 7 SF 2 63 und HOS 3 1 SF 2 34 Durch die Verd nnung mit den verschiedenen Verd nnern wurden die untersuchten Parameter mit Ausnahme von HOS CP 5 0 SF 2 23 TE 4 7 SF 2 12 Up1 2 80 SF 2 16 Up1 4 3 SF 1 69 nicht wesentlich beeinflusst Tag 0 Insgesamt nahm die Spermaqualitat ber den Untersuchungszeitraum von zehn Tagen jedoch in allen verd nnten Ejakulaten kontinuierlich ab Die Fl ssigkonservierung bewirkte in allen verd nnten Ejakulaten eine signifikante Reduktion der Motilit t VW GMcasa VWeasa eine signifikante Verlangsamung d
327. nach Verd nnung signifikant an was darauf hindeutet dass Zuckerzus ze in Verd nnern die Spermiengeschwindigkeit anregen Ponglowhapan et al 2004 Canines Sperma ist durch eine sehr niedrige Fruktosekonzentration charakterisiert trotzdem k nnen Hundespermien zugesetzte Fruktose unter anaeroben Bedingungen in gleichem Ausma nutzen wie Spermien von Spezies die ein fruktosereiches Ejakulat produzieren Bartlett 1962b Generell k nnen als Zuckerkomponenten Fruktose Galaktose Glukose Xylose Monosaccharide Laktose Trehalose Maltose Sukrose Disaccharide oder Raffinose Trisaccharid eingesetzt werden Yildiz et al 2000 Die am h ufigsten genutzten Zucker in Verd nnern f r die Fl ssigkonservierung von caninem Sperma sind Glukose und Fruktose welche von frisch ejakulierten Hundespermien in separaten Stoffwechselwegen metabolisiert werden Ponglowhapan et al 2004 Letzteres bedingt dass sich die Effekte von Glukose und Fruktose auf den Energiestatus der Zellen voneinander unterscheiden wodurch gleichzeitig die Motilit tsmuster verschieden sind Fruktose f hrt zu einem schnelleren und mehr linearen Bewegungsmuster w hrend Glukose eine mehr oszillatorische Bewegung verursacht Allerdings wird weder durch Fruktose noch durch Glukose der Prozentsatz an motilen Spermien ver ndert Rigau et al 2001 Welcher Zucker Fruktose oder Glukose als Energiezusatz besser geeignet ist wird kontrovers diskutiert Iguer Ouada und Ve
328. nd II Darauf folgte eine quilibrierung f r die Dauer einer Stunde bei 4 C im K hlschrank in einer Styroporbox Nach dieser quilibrierungsperiode wurde die gleiche Menge an Uppsala Equex 2 System Verd nner 2 auf 4 C gek hlt hinzugegeben Versuchsteil 1 wodurch eine Endverd nnung im Verh ltnis 1 4 entstand F r die Verd nner CP und TE galt dass bei einer Dichte des Nativspermas von bis zu 100 000 Spermien ul das Aliquot 1 2 verd nnt wurde n 1 bei einer Dichte von 100 000 bis 650 000 Spermien ul 1 3 n 22 bei einer Dichte von 650 000 bis 1 000 000 Spermien ul 1 4 n 3 und bei einer Dichte gr er als 1 000 000 Spermien ul 1 5 n 5 Angestrebt wurde dabei immer eine Endkonzentration im verd nnten Sperma von etwa 100 000 Spermien pro Mikroliter Die entsprechende Menge an Verd nner wurde immer in einem gleichm igen Strahl an der Innenseite des Zentrifugenr hrchens ablaufen gelassen wobei das Zentrifugenr hrchen langsam gedreht und geschwenkt wurde um eine gleichm ige Durchmischung von Sperma und Verd nner zu erhalten Nach der Verd nnung wurden alle Proben f r den weiteren Verlauf der Untersuchungen identisch behandelt Die verd nnten Spermaproben wurden nach mehrmaligem Schwenken aus den Zentrifugenr hrchen aus Glas in Plastikrohrchen aus Zellkultur geeignetem Kunststoff mit Schraubverschluss BD Falcon Konisches R hrchen 15 ml BD Franklin Lakes USA berf hrt in denen die Lagerung im K hlschrank
329. nd Linde Forsberg 2007 verglichen den kommerziellen CLONE Chilled Semen Verd nner mit einem nichtkommerziellen TRIS Eigelb Glukose Verd nner ber einen Untersuchungszeitraum von 23 Tagen Die genaue Zusammensetzung des CLONE Chilled Semen Verd nners ist unbekannt Prinzip im CLONE Chilled Semen Verd nner ist dass die Samenzellen immotil werden und dies ber die Dauer der Lagerung bei 5 C bleiben Erst nach Zusatz des Aktivators aus dem CLONE Chilled Semen Kit und Wiedererw rmung bei 37 C f r 8 10 Minuten kommt es dann zu einer Reaktivierung der Motilitat wobei deren genaue Mechanismen unbekannt sind Allerdings erlangen in CLONE Chilled Semen Verd nner konservierte Samenzellen wenn auch langsamer ihre Motilit t auch ohne den Zusatz des Aktivators zur ck wenn sie Raumtemperatur oder 37 C ausgesetzt werden Im Gegensatz dazu behalten mit TRIS Eigelb Glukose Verd nner konservierte Spermien ihre Motilit t w hrend der Lagerung bei 5 C bei Alle untersuchten Parameter Gesamtmotilitat Integrit t der Plasmamembran und des Akrosoms wurden im Zeitverlauf im TRIS Eigelb Glukose Verd nner besser konserviert als im CLONE Chilled Semen Verd nner was die Hypothese widerlegt dass die durch den CLONE Chilled Semen Verd nner induzierte Immotilitat einen positiven Einfluss auf die Langlebigkeit der Spermien hat Bei Lagerung bei 5 C im TRIS Eigelb Glukose Verd nner scheint Hundesperma guter 71 Literatur Qualit t fur bi
330. nd der Anteil an Samenzellen mit nicht aufgerollter Gei el not curled angegeben wurde 3 3 4 Computer assisted sperm analysis CASA Die Samenbeurteilung mittels CASA erfolgte mit dem Messsystem SpermVision Minit b GmbH Tiefenbach Parallel zur Sch tzung der Spermienbeweglichkeit am Lichtmikroskop wurde eine computergest tzte Motilit tsanalyse mit SpermVision durchgef hrt Des Weiteren erfolgte eine Viabilitatsanalyse 3 3 4 1 Aufbau und Funktionsweise des SpermVision Systems Das genutzte SpermVision System bestand aus einem Mikroskop Standard Labormikroskop BX 41 Olympus Deutschland GmbH Hamburg mit negativem Phasenkontrast Negativ Hoch Kontrast Objektiv UPlanFINH 20x 0 50 Ph 1 Olympus Deutschland GmbH Hamburg und beheizbarem motorisierten Mikroskop Kreuztisch ScanStage welches ber eine Hochgeschwindigkeits Schwarz Wei Digitalkamera mit hoher Aufl sung 60 Frames Sekunde mit TV Adapter mit einem Rechner verbunden war Auf dem Rechner Pentium 4D Dual Core Computer mit 3 0 GHz Prozessor und Betriebssystem Microsoft Windows XP Professional Vista comp Grafikkarte 19 TFT Monitor war das SpermVision Softwarepaket Version 3 5 6 2 Juli 2009 installiert Weiterhin geh rten eine Heizplatte HT 200 Minitub GmbH Tiefenbach die in das Steuerger t f r den Mikroskopheiztisch integriert war sowie ein Joystick zur 83 Material und Methoden manuellen Steuerung des Mikroskop Kr
331. nd enth lt entweder Ticarcillin oder Gentamicin Magermilch Verd nner Kenney Typ Lane Manufacturing Inc Denver CO Pinto et al 1999 Die Rezepte einiger Verd nner auf Milchbasis sowie falls bekannt deren pH Werte und Osmolaritaten sind in Tab A1 Kap 9 7 1 wiedergegeben Bullenspermien k nnen ihre Motilitat in gekochter Magermilch sowie in gekochter homogenisierter Vollmilch w hrend der Lagerung bei 4 C f r zehn Tage erhalten was sich nicht signifikant von der Lebensdauer in Eigelb Zitrat Verd nnern unterscheidet Thacker und Almquist 1953 Die Ergebnisse beim R den sind dagegen kontrovers W hrend Milchverd nner erhitzte Magermilch bzw erhitzte homogenisierte Vollmilch bei Foote und Leonard 1964 und Foote 1964b gegen ber den Eigelb Zitrat Glycin Verd nnern mit 20 Eigelb deutlich unterlegen waren war bei Bouchard et al 1990 der milchhaltige Verd nner NFDMS G Verd nner dem Eigelb Zitrat Verd nner mit 3 5 Eigelb Fresh Plus Extender Edwards Agri Sales Inc Baraboo WI hinsichtlich der Konservierung der Gesamtmotilitat und der Vorw rtsbeweglichkeit ber den Beobachtungs zeitraum von f nf Tagen deutlich berlegen Allerdings war der Anteil an Spermienagglutinationen im NFDMS G Verd nner gr er Bouchard et al 1990 2 5 3 2 TRIS gepufferte Eigelb Verd nner Da einer der derzeit gebr uchlichsten Verd nner ein TRIS Eigelb Verd nner mit 20 Eigelb und entweder Glukose oder Fruktosezusatz
332. nden Samenzellen kein signifikanter Unterschied zwischen den mit den verschiedenen Verd nnern aufgearbeiteten Ejakulaten festgestellt werden konnte siehe Kap 4 2 3 1 zeigten sich im weiteren Zeitverlauf dagegen deutliche Niveauunterschiede zwischen den verd nnten Ejakulaten ber den gesamten Untersuchungszeitraum hinweg lag der Anteil lebender Samenzellen in den mit Up1 aufgearbeiteten Proben ber dem in mit den anderen Verd nnern aufgearbeiteten Proben und betrug an Tag 10 noch durchschnittlich 84 6 In den mit CP und TE verd nnten Ejakulaten konnte ein ann hernd identischer Verlauf des Anteils lebender Samenzellen ber die Zeit hinweg beobachtet werden Hier lag der Anteil an Tag 10 im Mittel noch bei 80 0 CP bzw 79 6 TE Der Anteil an lebenden Samenzellen in den mit Up 1 2 verd nnten Ejakulaten lag ab 136 Ergebnisse Tag 1 zu jedem Untersuchungszeitpunkt unter dem Anteil in den mit den anderen Verd nnern aufgearbeiteten Ejakulaten und betrug an Tag 10 durchschnittlich nur noch 71 5 _ oo o gt 2 o o D ro e CP n 30 TE n 30 Up 1 2 n 12 lt Up 1 n 18 Anteil lebender Samenzellen Eosinausstrich in N O O Abb 16 Ver nderungen des prozentualen Anteils lebender Samenzellen Eosinausstrich in den verschiedenen Verd nnern im Zeitverlauf der Fl ssigkonservierung bei 4 C ber zehn Tage dargestellt als r cktransformierter Mittelwert x mo
333. ne mikrobiologischen Untersuchungen der Ejakulate durchgef hrt sodass keine Aussagen dar ber gemacht werden k nnen ob und wie stark sich eventuell in den Ejakulaten vorhandene Keime w hrend des Untersuchungszeitraumes vermehrt haben Dieser Unterschied bez glich des Antibiotikazusatzes muss bei der Interpretation der Versuchsergebnisse Beachtung finden Ein weiterer wesentlicher Unterschied zwischen den drei untersuchten Verd nnern bestand im Zusatz von Equex STM Paste Equex welche nur im Verd nner 2 des Uppsala Equex 2 System Verd nners enthalten war Der Zusatz von Equex zu einem konventionellen TRIS Gefrierverd nner verbessert die Viabilit t und die Langlebigkeit der Spermien nach dem Auftauen Rota et al 1997 f hrt zu einer h heren Gesamt und Vorw rtsbeweglichkeit nach dem Auftauen Rota et al 1999a Alhaider und Watson 2009 und besitzt eine positive Auswirkung auf die 173 Diskussion ZP Bindungsf higkeit von kryokonservierten Spermien Str m Holst et al 2000 2001 Im Gegensatz dazu konnten Nizanski et al 2009 zeigen dass durch den Zusatz von Equex zu einem TRIS Eigelb Verd nner zur Fl ssigkonservierung von caninem Sperma bei 5 C die Lebensdauer der Spermien verk rzt wird Sie sehen den Zusatz von Equex zu Verd nnern f r die Fl ssigkonservierung als ungeeignet an da der Prozentsatz an motilen Samenzellen nur f r drei Tage zufriedenstellende Werte zeigt w hrend bei Proben ohne Equex Zusatz ber
334. ners zur Fl ssigkonservierung gibt es nur wenige Publikationen Hermansson und Linde Forsberg 2006 Hermansson et al 2006 157 Diskussion Bisher lasst sich in der Literatur keine Untersuchung finden welche die drei genannten Verdunner miteinander vergleicht Ziel der vorliegenden Arbeit war es daher die drei Verd nner hinsichtlich ihrer Eignung zur Fl ssigkonservierung von caninem Sperma bei 4 C vergleichend zu berpr fen und so den am besten geeigneten Verd nner f r die Fl ssigkonservierung von Hundesperma im klinischen Alltag auszuw hlen um diese Informationsl cke zu f llen Die verschiedenen Spermaparameter welche als Beurteilungsgrundlage dienten wurden z T sowohl mit den Methoden der klassischen Spermatologie als auch mittels CASA System SpermVision der Minitub GmbH Tiefenbach untersucht In der Literatur werden hohe Korrelationen zwischen der subjektiv gesch tzten Motilit t und der mittels CASA bestimmten Motilitat G nzel Apel et al 1993 Rijsselaere et al 2002b 2003 Sch fer Somi und Aurich 2007 sowie zwischen der subjektiv bestimmten Konzentration und der mittels CASA gemessenen Spermienkonzentration G nzel Apel et al 1993 Rijsselaere et al 2003 beschrieben Deshalb bestand ein weiteres Ziel der vorliegenden Arbeit darin zu berpr fen ob sich mit beiden Untersuchungsmethoden gleichwertige Ergebnisse erzielen lassen und somit die in der Literatur gefundenen Aussagen best tigt werde
335. ngen in den Bereich von ca 17 bis 4 C eintritt Hoffmann 2003d Als prim re Ursache hierf r werden Fluiditatsveranderungen in der Plasmamembran verantwortlich gemacht Hoffmann 2003d welche durch eine Veranderung der Lipidzusammensetzung des Membranbilayers entstehen Hammerstedt et al 1990 Weitze und Petrunkina 2007 Eine Temperaturerniedrigung fordert die Verschiebung von einer Fl ssigphase zu einem Gelzustand Hammerstedt et al 1990 Hoffmann 2003d Weitze und Petrunkina 2007 durch Verminderung der Lateralbewegung von Membranphospholipiden Weitze und Petrunkina 2007 bzw durch Zusammenlagerung von nicht bilayer Lipiden Hammerstedt et al 1990 Die Membranen verlieren ihre selektive Permeabilitat was in einer Freisetzung vieler zellularer Komponenten Lipide Proteine lonen resultiert und zusatzlich den Einstrom von Natrium und Calciumionen in das Zellinnere erm glicht In Folge nimmt die metabolische Aktivit t ab und weitere sekund re Ver nderungen entstehen Watson und Morris 1987 Die Viabilitat von Zellen nach einer Temperaturver nderung ist von der Schnelligkeit der Temperaturerniedrigung der finalen Temperatur und der Zeitdauer der Inkubation bei reduzierter Temperatur vor der Wiedererw rmung abh ngig mit zunehmender Inkubationszeit steigt der Verlust an Viabilit t Watson und Morris 1987 Der K lteschock ist je nach Spezies verschieden ausgepr gt Weitze 2001 Hoffmann 2003d Hundespermien reagie
336. ninem Sperma bei 4 C geeignet ist und zum anderen wie lange eine akzeptable Spermaqualit t in den fl ssigkonservierten Ejakulaten aufrechterhalten werden kann Als Beurteilungsparameter wurden dazu verschiedene Spermaparameter welche ber einen Zeitraum von zehn Tagen f r drei Tage im 24 Stunden Rhythmus und anschlie end im 48 bzw 72 Stunden Rhythmus vergleichend untersucht wurden herangezogen Hierbei kamen sowohl die Methoden der klassischen Spermatologie als auch die Computer gest tzte Spermienanalyse System SpermVision der Minitub GmbH Tiefenbach zur Anwendung Daher bestand ein weiteres Ziel der vorliegenden Arbeit darin zu berpr fen ob mit beiden Untersuchungsmethoden gleichwertige Ergebnisse erzielt werden k nnen Literatur 2 Literatur 2 1 Bedeutung der k nstlichen Besamung f r die Hundezucht Die kunstliche Besamung KB oder artifizielle Insemination Al stellt die Einfuhrung von Sperma in den weiblichen Reproduktionstrakt ohne das Stattfinden eines naturlichen Deckaktes dar England und Millar 2008 Sie kann intravaginal intrauterin oder intratubal mit frischem flussigkonserviertem oder tiefgefrorenem Sperma durchgefuhrt werden Pinto et al 1999 Farstad 2000 England und Millar 2008 Thomassen und Farstad 2009 Der erste wissenschaftliche Bericht ber eine erfolgreiche KB beim Saugetier stammt aus Italien aus dem Jahr 1780 und beschreibt die Al einer Barbet H ndin durch Abb Spallanzani die
337. nkubation des zuvor gek hlten Spermas bei 39 C f hrt nur zu einem leichten Anstieg der akrosomalen Ver nderungen Burgess et al 2001 was gegen einen verz gerten Effekt der K hlung auf die akrosomale Integrit t spricht Nach Sirivaidyapong et al 2001 wird die akrosomale Integrit t weder durch die Verd nnung mit einem TRIS Eigelb Verd nner noch durch die K hlung auf 4 C beeinflusst und auch Prostatasekret hat keine negativen Effekte auf das Akrosom Dies steht im Gegensatz zu den Aussagen von Oettl 1986 nach denen akrosomale Sch den w hrend der Verd nnung und der K hlung auftreten So kommt es bereits durch die Verd nnung mit einem TRIS Zitrat Eigelb Verd nner zu einer Reduktion des Anteils an Samenzellen mit normalem Akrosom um ca 11 und durch die K hlung auf 5 C nochmals zu einer Verminderung um etwa 17 Daraus kann geschlussfolgert werden dass ein signifikanter Anteil der akrosomalen Sch den in gleichem Ma e durch die Verd nnung und die K hlung verursacht wird und nicht erst durch das Einfrieren Oettle 1986 Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit best tigen zum einen die Aussage dass es bereits durch die Verd nnung zu einer Zunahme des Anteils an akrosomalen Ver nderungen kommt Oettle 1986 wobei allerdings eine statistische Signifikanz nur f r die Verd nner CP und TE nachgewiesen werden konnte Auf der anderen Seite kann auch die Aussage von Burgess et al 2001 best tigt werden da der Anteil an a
338. nners sein da bekannt ist dass Glycerol einen depressiven Effekt auf die Motilit t von fl ssigkonservierten Samenzellen aus bt G nzel Apel et al 1993 Nach Rijsselaere et al 2004b induziert eine viertagige Flussigkonservierung bei 4 C keine signifikante Reduktion der Gesamtmotilitat oder der Vorwarts beweglichkeit und auch nach Verstegen et al 2005 unterscheiden sich die Gesamtmotilitat und die Vorw rtsbeweglichkeit in mit TRIS Glukose Eigelb Verd nner fl ssigkonservierten Ejakulaten w hrend der ersten zehn 195 Diskussion Gesamtmotilitat bzw funf Tage Vorwartsbeweglichkeit der Lagerung nicht signifikant von den initialen Motilitatswerten Im Gegensatz dazu kam es in der eigenen Arbeit in allen verd nnten Ejakulaten w hrend der Fl ssigkonservierung bei 4 C ber zehn Tage zu einer signifikanten Reduktion der Motilitat p lt 0 0001 was sowohl mit den Methoden der klassischen Spermatologie als auch mittels CASA verifiziert werden konnte Auch f r die mittels CASA bestimmten Streckenparameter DAP DCL und DSL f r die Geschwindigkeitsparameter VAP VCL und VSL sowie f r den Parameter ALH lie en sich im Zeitverlauf in allen verd nnten Ejakulaten signifikante Abnahmen nachweisen Bez glich des Parameters BCF konnten in allen verd nnten Ejakulaten tendenzielle Abnahmen beobachtet werden welche jedoch nur in den mit Up 1 2 und Up 1 verd nnten Ejakulaten als signifikant zu beurteilen waren Die Parameter L
339. nnte in den mit CP verd nnten Ejakulaten kein signifikanter Unterschied ermittelt werden Auch die mit TE verd nnten Ejakulate zeigten bez glich des Parameters STR einen signifikanten Niveauunterschied zu den mit Up1 verd nnten Ejakulaten Pvera 0 042 w hrend sich die Zeitverl ufe allerdings nicht signifikant voneinander unterschieden Hier waren in den mit TE verd nnten Proben zu jedem Untersuchungszeitpunkt h here Werte nachweisbar als in den mit Up 1 verd nnten Proben Zu den mit Up 1 2 verd nnten Ejakulaten konnte in den mit TE verd nnten Ejakulaten kein signifikanter Unterschied verifiziert werden Tab A10 A14 Kap 9 8 Fur den Parameter LIN konnten im Zeitverlauf in den mit CP TE und Up 1 aufgearbeiteten Ejakulaten tendenzielle Abnahmen der durchschnittlichen Werte festgestellt werden wahrend es in den mit Up 1 2 aufgearbeiteten Ejakulaten im Mittel zu einer tendenziellen Zunahme kam Die gr te Differenz zwischen Tag 0 und Tag 10 konnte in den mit CP verd nnten Proben beobachtet werden wobei die Werte bis einschlie lich Tag 7 in den mit CP verd nnten Proben jedoch trotzdem h her lagen als in den mit TE Up 1 2 und Up 1 verd nnten Proben Die Mittelwerte in den mit TE aufgearbeiteten Ejakulaten lagen zu fast jedem Untersuchungstermin uber denen in den mit Up1 2 und Up 1 aufgearbeiteten Ejakulaten Jedoch zeigte sich an Tag 10 der h chste durchschnittliche Wert f r LIN in den mit Up 1 2 aufgearbeiteten Ejakulaten
340. nnung nach Verdunnern Der Zusammenhang zwischen der subjektiv gesch tzten und der mittels CASA bestimmten Vorw rtsbeweglichkeit wird durch die nachfolgenden Punktwolke Abb 21 dargestellt Regressionsgerade y 0 90903x 17 431 Phasenkontrastmikroskop in x C S D Q N E E O gt 2 N N 10 c oO N D CASA Vorw rtsbeweglichkeit in Abb 21 Korrelation zwischen der gesch tzten Vorw rtsbeweglichkeit unter dem Phasenkontrastmikroskop und der mittels Computer assisted sperm analysis CASA SpermVision System gemessenen Vorw rts beweglichkeit in den Nativejakulaten und in allen verd nnten Ejakulaten zu allen Untersuchungszeitpunkten n zeitgleiche Variablenpaare 660 Die Korrelationsanalyse ergab einen Korrelationskoeffizienten von r 0 885 bei einer Signifikanz von p lt 0 001 Somit konnte ein statistisch signifikanter Zusammenhang zwischen der subjektiv gesch tzten Vorw rtsbeweglichkeit und der mittels CASA gemessenen Vorw rtsbeweglichkeit nachgewiesen werden wobei die subjektiv gesch tzten Mittelwerte durchschnittlich jedoch 12 5 11 5 ber den mittels CASA bestimmten Werten lagen 4 4 3 Zusammenhang zwischen dem im Eosinausstrich bestimmten Anteil an lebenden Spermien und der durch CASA ermittelten Viabilit t Der Anteil lebender Spermien wurde in den einzelnen verd nnten Ejakulaten zu jedem Untersuchungstermin durch Ausz hlung von 200 Spermien im Eosinaus
341. ns 4000 Spermien beurteilt Die gew hlten Einstellungen zur Spermienerkennung und zu den Z hlkriterien sind dem Anhang Kap 9 2 zu entnehmen Durch Vergleich der 30 Bilder einer Serie wurden die von den Spermien zur ckgelegen Wegstrecken erkannt und hieraus die Motilit tsparameter berechnet Die Spermienkonzentration wurde vom System anhand der erkannten Spermien w hrend der Motilit tsanalyse des beurteilten Messvolumens und der eventuellen Verd nnung bestimmt Das Ergebnis der Messung stellte einen Mittelwert aller Motilit ts und Konzentrationsdaten der einzelnen Gesichtsfelder dar Die Analyseergebnisse wurden auf dem Bildschirm sowohl graphisch als auch in Zahlenwerten dargestellt Gleichzeitig erfolgte eine Speicherung der Ergebnisse in den Datenbanken des SpermVision Systems 84 Material und Methoden 3 3 4 2 Probenvorbereitung und Bef llung der Messkammer Vor Beginn der Messung wurden alle Daten des Samenspenders in das SpermVision System eingegeben und das Analysefenster ge ffnet Mittels Dropdown Liste wurden Tierart und Verd nnung ausgew hlt Zur Bef llung der Messkammern wurde eine Pipette Pipet Lite mit LTS Rainin Instrument LLC Oakland USA mit einem eingestellten Volumen von 2 5 ul verwendet Die Pipettenspitzen bioclean Precision Pipette Tips Rainin Instrument LLC Oakland USA wurden ebenso wie die Messkammern selbst vor Gebrauch auf der Heizplatte auf 37 C angewarmt Das Gef mit dem Sp
342. nten Ver nderungen als signifikant Jedoch lie en sich hinsichtlich der CASA Gesamtmotilitat und der CASA Vorw rtsbeweglichkeit signifikante Unterschiede zwischen den Verd nnern CP und Up 1 ermitteln jeweils mit p lt 0 05 wobei in Up 1 durchschnittlich h here Motilitatswerte ermittelt werden konnten Im Gegensatz zur CASA Gesamtmotilitat und zur CASA Vorw rtsbeweglichkeit konnten unmittelbar nach Zugabe der verschiedenen Verd nner zu den Nativejakulaten einheitlich in allen verd nnten Ejakulaten signifikante Abnahmen der durchschnittlichen Werte f r die Geschwindigkeitsparameter VAP VCL und VSL nachgewiesen werden jeweils mit p lt 0 05 bzw p lt 0 01 Dabei waren die Reduktionen fur alle genannten Parameter in den mit CP verdunnten Ejakulaten am geringsten und in den mit Up1 2 verd nnten Ejakulaten am st rksten ausgepr gt Die mit CP aufgearbeiteten Ejakulate unterschieden sich bez glich der Geschwindigkeitsparameter an Tag O nicht signifikant von den mit TE aufgearbeiteten Ejakulaten Hingegen waren die in den mit CP und TE verd nnten Proben ermittelten Werte fur VAP signifikant h her als die in den mit Up 1 2 und Up 1 verd nnten Proben f r VCL signifikant h her als in den mit Up1 2 verd nnten Proben und f r VSL signifikant h her als in den mit Up 1 verd nnten Proben jeweils mit p lt 0 01 Auch bei Betrachtung des Parameters ALH konnte in allen verd nnten Ejakulaten unmittelbar nach dem Verd nnen eine tendenzielle
343. nten Unterschied zwischen dem Nativsperma und den mit CP verd nnten Proben sowie zwischen dem Nativsperma und den mit TE verd nnen Proben auf jeweils mit p lt 0 01 Zusammenfassend konnte mit dem HOS Test nachgewiesen werden dass der Anteil an Samenzellen mit einer defekten Plasmamembran in allen verd nnten Ejakulaten signifikant h her ist verglichen mit den Nativejakulaten Beim Vergleich der mit den verschiedenen Verd nnern aufgearbeiteten Ejakulate untereinander konnten keine signifikanten Unterschiede ermittelt werden 4 3 Ergebnisse der Halteproben im Zeitverlauf In diesem Kapitel erfolgt die Darstellung der Untersuchungsergebnisse nach Fl ssigkonservierung ber einen Zeitraum von zehn Tagen Mit Ausnahme des HOS Testes wurden an den Tagen 1 2 3 5 7 und 10 die gleichen Spermaparameter untersucht wie an Tag 0 und wie bei der Untersuchung der Nativejakulate Somit konnten die Einfl sse der verschiedenen Verd nner auf die einzelnen Parameter ber den gesamten Untersuchungszeitraum verfolgt werden 4 3 1 Einfluss der Verd nner auf die Motilit t im Zeitverlauf Die Motilit t der mit den verschiedenen Verd nnern aufgearbeiteten Ejakulate verminderte sich w hrend der Fl ssigkonservierung bei 4 C ber zehn Tage was sowohl mit den Methoden der klassischen Spermatologie als auch mittels CASA verifiziert werden konnte Bei Betrachtung der subjektiv gesch tzten Vorw rtsbeweglichkeit der CASA Gesamtmotilitat und der CAS
344. nur etwa 20 um was die untere Grenze des spezifizierten Fl chenbereichs zur Spermienerkennung bei der Motilit tsanalyse darstellte Obgleich die Einstellungen zur Spermienerkennung gemessen anhand der in der Literatur gefundenen Angaben zur Spermiengr e realistisch erscheinen konnte in einigen F llen dennoch eine schlechte Spermienerkennung w hrend der Motilit tsanalyse beobachtet werden Bei den vom Hersteller empfohlenen und daher auch in der vorliegenden Arbeit verwendeten Analyseeinstellungen f r die Viabilit tsanalyse siehe Kap 9 2 betrug der spezifizierte Fl chenbereich zur Spermienerkennung f r die gr ne Fl che 20 bis 600 um maximale Fl che der einzelnen Zelle 150 um und f r die rote Fl che 10 bis 800 um maximale Fl che der einzelnen Zelle 200 um Es ist ersichtlich dass die Untergrenzen gleich bzw niedriger waren verglichen mit den Einstellungen f r die Motilit tsanalyse w hrend die Obergrenzen deutlich h her lagen Der Grund f r diese unterschiedlichen Einstellungen ist unbekannt Bei den vorliegenden Untersuchungen fiel allerdings auf dass die Spermienerkennung bei der Viabilitatsmessung im Vergleich zur Motilit tsmessung z T als schlechter zu beurteilen war Ob und inwieweit dies jedoch auf die unterschiedlichen Einstellungen hinsichtlich der Spermienerkennung zur ckzuf hren war blieb ungekl rt Insgesamt wurde aber deutlich dass die CASA Einstellungen eventuell verbesserungsw rdig sind um di
345. nziell war bereinstimmend mit Rijsselaere et al 2003 eher eine Untersch tzung der Spermienkonzentration im Vergleich mit den durch die Neubauer Z hlkammer bestimmten Werten festzustellen Diese war insbesondere bei den Nativejakulaten stark ausgepr gt siehe Kap 4 1 3 und Kap 4 1 6 konnte in geringerem Ma e jedoch auch bei den verd nnten Ejakulaten beobachtet werden siehe Kap 4 2 1 Die gr eren Abweichungen bei den Nativejakulaten unterst tzen die Aussage von Rijsselaere et al 2003 dass die Unterschatzung der Spermienkonzentration mit steigenden Spermien konzentrationen zunimmt Auf die statistisch ermittelten Zusammenh nge zwischen beiden Methoden der Konzentrationsbestimmung wird in Kap 5 3 4 1 n her eingegangen 5 2 3 2 2 Motilit tsanalyse Grunds tzlich fiel bei der Motilitatsanalyse durch das SpermVision System auf dass es bei subjektiv als gut bewerteten Ejakulaten bei Messung durch SpermVision zu einer Untersch tzung der Motilit t kam und bei subjektiv als eher schlecht beurteilten Ejakulaten zu einer bersch tzung der Motilit t Dies war sowohl bei der Motilitatsanalyse der Nativejakulate als auch bei der Motilit tsanalyse der fl ssigkonservierten Ejakulate zu beobachten Aufgrund dessen scheint eine kritische Beurteilung der gemessenen Motilitatswerte erforderlich Ebenso kann jedoch auch an der Aussagekraft der subjektiven Motilit tssch tzung gezweifelt werden zudem in der Literatur f r die s
346. oben p lt 0 01 und zwischen den mit TE und den mit Up1 2 aufgearbeiteten Ejakulaten p lt 0 01 siehe Tab A6 Kap 9 8 Auch zwischen dem Nativsperma den mit CP TE und Up 1 verd nnten Ejakulaten konnte unmittelbar nach dem Verd nnen in der einfaktoriellen Varianzanalyse ein signifikanter Unterschied fur VAP nachgewiesen werden n 18 p lt 0 0001 Der folgende paarweise Vergleich nach Student Newman Keuls ergab signifikante Unterschiede zwischen dem Nativsperma und den mit den Verd nnern CP TE und Up 1 verd nnten Ejakulaten jeweils mit p lt 0 01 Ebenso unterschieden sich bei Betrachtung des Parameters VAP die Verd nner CP und Up 1 p lt 0 01 und die Verd nner TE und Up1 p lt 0 01 signifikant voneinander Zwischen den Verd nnern CP und TE konnte mit dem Student Newman Keuls Test kein signifikanter Unterschied ermittelt werden siehe Tab A7 Kap 9 8 Weiterhin lie sich unmittelbar nach dem Verd nnen mittels der einfaktoriellen Varianzanalyse ein signifikanter Unterschied f r VAP zwischen dem Nativsperma den mit CP und den mit TE verd nnten Proben nachweisen n 30 p 0 0001 Der im Anschluss durchgef hrte paarweise Vergleich nach Student Newman Keuls zeigte signifikante Unterschiede zwischen dem Nativsperma und den mit CP verd nnten Proben p lt 0 01 und zwischen dem Nativsperma und den mit TE verd nnten Proben p lt 0 01 auf Die mit CP und TE aufgearbeiteten Ejakulate unterschieden sich bez glich des Parameters
347. oben konnten signifikante Unterschiede ermittelt werden jeweils mit p lt 0 01 Die mit den Verd nnern CP und TE aufgearbeiteten Ejakulate zeigten keine signifikanten Unterschiede Tab A6 A8 Kap 9 8 110 Ergebnisse Die durchschnittlichen mittels CASA bestimmten Werte des Motilit tsparameters BCF der Nativejakulate und der mit den verschiedenen Verd nnern aufgearbeiteten Ejakulate unmittelbar nach dem Verd nnen Tag 0 werden in Tab 15 wiedergegeben Verglichen mit dem Nativsperma konnte unmittelbar nach Zugabe der Verd nner in allen verd nnten Ejakulaten eine Abnahme der Mittelwerte beobachtet werden Dabei war die Abnahme im Gegensatz zu allen anderen Motilitatsparametern in den mit Up1 2 verdunnten Ejakulaten am geringsten ausgepr gt und in den mit TE verd nnen Proben am st rksten Tab 15 CASA Motilitatsparameter BCF n x SD Min Max im Nativsperma und in den verschiedenen Verd nnern an Tag 0 Verd nner n x SD Hz Min Hz Max Hz keiner Nativsperma 30 26 2 3 4 20 5 34 5 CP 30 24 0 2 7 19 7 30 6 TE 30 23 1 2 4 19 7 29 7 Up1 2 12 24 9 3 1 21 2 31 2 Up 1 18 23 6 2 7 19 5 29 1 In den einfaktoriellen Varianzanalysen und den paarweisen Vergleichen nach Student Newman Keuls konnten f r BCF signifikante Unterschiede zwischen dem Nativsperma und den mit CP TE sowie Up 1 aufgearbeiteten Ejakulaten ermittelt werden jeweils mit p lt 0 01 Die mit den verschiedenen Ver
348. ogisch ver nderten Samenzellen war jedoch im Eigelb TRIS Fruktose Zitrat Verd nner geringf gig h her als in den anderen Verd nnern Besamungsversuche mit einer Besamungsdosis von 4x 10 Samenzellen haben gezeigt dass mit Eigelb TRIS Fruktose Zitrat Verd nner konserviertes canines Sperma vier Tage lang fur intravaginale Besamungen genutzt werden kann Konzeptionsrate nach viert giger Lagerung 83 3 mittlere Wurfgr e 3 2 1 3 Tsutsui et al 2003b Hermansson und Linde Forsberg 2006 untersuchten mit Uppsala Equex 2 Verd nner UE 2 1 und UE 2 2 und mit TRIS Eigelb Fruktose Verd nner EYT 1 und EYT 2 konserviertes canines Sperma ber einen Zeitraum von zwei Tagen Das Ziel dieser Studie bestand darin herauszufinden ob fl ssigkonserviertes Sperma nach ein bis zwei Tagen Lagerungsdauer bei 4 C noch erfolgreich kryokonserviert werden kann Aufgrund der verwendeten Verd nner erscheint eine Darstellung der Ergebnisse vor dem Einfrieren jedoch trotzdem interessant da die 69 Literatur Verd nner denen der eigenen Untersuchungen entsprechen Dabei besteht der einzige Unterschied zwischen den beiden Verd nnern im Glycerolgehalt der Uppsala Equex 2 Verd nner enth lt Glycerol UE 2 1 mit 3 Glycerol UE 2 2 mit 7 Glycerol der TRIS Eigelb Fruktose Verd nner nicht bzw erst im zweiten Teilverd nner EYT 1 mit 0 Glycerol EYT 2 mit 10 Glycerol Die Autoren kommen zu dem Schluss dass fl ssigkonservierte
349. olumina zu einem Verlust von Spermien aufgrund des R ckflusses aus Uterus oder Vagina f hren Linde Forsberg 2001 Entsprechend der Gr e der H ndin sollte jedoch ein Volumen von 2 4 ml auch nicht unterschritten werden Pena et al 2006 2 1 4 Erfolgsraten Der Erfolg der KB bei der H ndin ist von zahlreichen Faktoren abh ngig So haben der Zeitpunkt der Besamung die Qualit t des inseminierten Spermas der 9 Literatur Ort der Samendeponierung die Anzahl der Besamungen die Fertilitat von H ndin und R de sowie die verwendete Besamungsdosis einen Einfluss auf die erzielten Konzeptionsraten Wilson 1993 England und Millar 2008 Insbesondere bei Verwendung von TG Sperma ist die Wahl des korrekten Besamungszeitpunktes von entscheidender Bedeutung was wahrscheinlich auf die reduzierte berlebensdauer von kryokonservierten Spermien zur ckzuf hren ist Farstad und Andersen Berg 1989 Bei Raumtemperatur konnte f r aufgetaute Spermien eine berlebensdauer von sechs bis sieben Stunden ermittelt werden allerdings ist in vivo von einer l ngeren Lebensspanne auszugehen Seager und Fletcher 1973 Frische Spermien haben im Uterus der H ndin hingegen eine Lebensdauer von mindestens vier bis sechs Tagen Doak et al 1967 Die intrauterine KB f hrt zu deutlich besseren Konzeptionsraten als die intravaginale Insemination Fontbonne und Badinand 1993 Linde Forsberg et al 1999 Unabh ngig von der Inseminationstechnik verbe
350. on Prostatasekret Spermienkonzentration 4 Unterschiedliche Methoden zur Motilit tsbeurteilung subjektiv oder objektiv Ponglowhapan et al 2004 Zudem ist bei einigen Publikationen nicht deutlich erkennbar ob eine Anw rmung der fl ssigkonservierten Ejakulate vor der Motilit tsbeurteilung wie sie von Linde Forsberg 1991 empfohlen wird und wie sie auch in der vorliegenden Arbeit erfolgte durchgef hrt wurde In den eigenen Untersuchungen war das Ausma der Motilitatsreduktion gemittelt ber die subjektiv gesch tzte Vorwartsbeweglichkeit die CASA Gesamtmotilitat und die CASA Vorwartsbeweglichkeit je nach Verd nner unterschiedlich ausgepr gt An Tag 3 konnte in den mit CP verd nnten Ejakulaten eine Abnahme auf durchschnittlich 96 in den mit TE verd nnten Ejakulaten auf durchschnittlich 94 in den mit Up 1 2 verd nnten Ejakulaten auf rund 60 und in den mit Up 1 verd nnten Ejakulaten auf durchschnittlich 93 der Ausgangsmotilitat nachgewiesen werden An Tag 10 betrug die Motilitat in den mit CP verd nnten Ejakulaten noch rund 77 in den mit TE verd nnten Ejakulaten noch durchschnittlich 68 in den mit Up 1 2 verd nnten Ejakulaten noch etwa 8 und in den mit Up1 verd nnten Ejakulaten noch durchschnittlich 24 des Initialwertes Insgesamt war somit die Konservierung der Motilit t an Tag 3 in den Verd nnern CP TE und Up 1 als gut zu bewerten Lediglich im Verd nner Up 1 2 197 Diskussion kam es verglich
351. on als geeignet an w hrend hingegen bei 50 Mio Spermien die Konzeptionsraten signifikant niedriger sind 20 versus 80 Bei Verwendung von TG Sperma zur intrauterinen Besamung empfehlen Andersen 1975 Farstad und Andersen Berg 1989 und Rota et al 1999a eine Gesamtzahl von 150 200x10 Spermien pro Besamungsdosis um eine Konzeption und normale Wurfgr en zu erzielen den optimalen Zeitpunkt f r die Besamung vorausgesetzt Rijsselaere et al 2002a inseminieren bei Nutzung von frischem gek hltem Samen ein Minimum von 150x10 motilen Spermien und empfehlen bei Verwendung von gefrorenem Sperma sogar eine Gesamtzahl von 300 x 10 Spermien Generell wird empfohlen mindestens 150 200 Mio motile und morphologisch normale Samenzellen pro Insemination zu verwenden Linde Forsberg 2001 Pena et al 2006 eine zweimalige KB erscheint sinnvoll Linde Forsberg 2001 Eine unterdurchschnittliche Spermaqualit t sollte durch eine Erh hung der Spermienanzahl pro Besamungsdosis kompensiert werden Linde Forsberg 2001 Das finale Inseminationsvolumen sollte abh ngig von der jeweiligen Rasse und Gr e der H ndin bei intrauterinen Besamungen eine Menge von 1 3 ml Linde Forsberg 2005 bzw 2 ml Cain 2001 Pesch et al 2007 und bei intravaginalen Besamungen eine Menge von 3 5 ml Soderberg 1986 Linde Forsberg 2005 nicht berschreiten da das Uteruslumen bei der H ndin klein ist Linde Forsberg 1991 1995 2005 und gr ere V
352. ontrollieren Weitze und Petrunkina 2007 Auch die Verwendung von TRIS er ffnete neue M glichkeiten Weitze 2001 Nachteilig an TRIS ist jedoch dass es bei einem pH Wert von 7 0 nur eine relativ geringe Pufferkapazit t besitzt England 1993 Weitze 2001 w hrend TES und HEPES bei 20 C einen pK Wert von 7 15 7 55 aufweisen Weitze 2001 Die Puffersubstanzen m ssen vor der Verwendung mit Alkali oder S ure auf den entsprechenden pH Wert titriert werden TRIS HCI TRIS Zitronens ure oder TES TRIS sind oder waren wichtige Kombinationen Weitze 2001 Des Weiteren haben auch Proteine frischer oder gefriergetrockneter Magermilch eine zufriedenstellende Pufferkapazit t Ihr Gebrauch beschr nkt sich allerdings auf die Tierarten Schaf Ziege und Pferd Weitze 2001 2 5 2 3 Membranprotektiva Die Spermienplasmamembran reagiert auf Temperaturschwankungen durch nderungen ihres physikalischen Status Innerhalb eines Temperaturbereiches von ca 17 bis 36 C k nnen Temperaturschwankungen im Hinblick auf die Intaktheit der Plasmamembran aufgefangen werden Bei weiter abfallenden Temperaturen treten Plasmamembransch den auf welche sich in K hl und Gefriersch den unterteilen lassen Hoffmann 2003d Die K hlsch den ergeben sich aus dem sog K lteschock Watson und Morris 1987 Weitze 2001 Hoffmann 2003d bzw K hlschock Weitze und Petrunkina 51 Literatur 2007 einem Phanomen welches bei Temperaturabsenku
353. op 1954 Verd nner Vollmilch erhitzt auf 92 94 C 1956 f r 10 Minuten und abgek hlt Bartlett Penicillin 1000 IU ml 1962a Foote Dihydrostreptomycin 1964b Foote 1000 pg ml Antibiotikazusatz und Leonard nur bei Foote und Leonard 1964 1964 und Foote 1964b Sahne Verd nner sterilisierte Sahne mit 9 Fett Foote und Leonard 1964 Eigelb Milch pasteurisierte Milch 0 1 6 56 0 04 297 3 35 Rota et al Verd nner Fett Eigelb 20 1995 Benzylpenicillin 1 mg ml Dihydrostreptomycinsulfat 1 mg ml Eigelb Sahne ultrahocherhitzte Sahne 12 6 404 0 02 308 4 3 Rota et al Verd nner Fett Eigelb 20 1995 Benzylpenicillin 1 mg ml Dihydrostreptomycinsulfat 1 mg ml Sahne Eigelb homogenisierte pasteurisierte Linde Verd nner Sahne 12 Fett 80 Forsberg Eigelb 20 1991 Benzylpenicillin 1000 IU ml Dihydrostreptomycin 1 mg ml Kenney Verd nner Trockenmagermilch 24 g 6 6 340 Bouchard et al 1990 England und Ponzio 1996 Sch fer et al 1997 9 7 2 TRIS gepufferte Eigelb Verd nner 261 COC 86002 Ie jo e lbea9ag 1007 juu Bw BsaqsJo4 epulq yeyjnsuloAwojydejsoupAuiq ju 001 G66L Ie JO ejoy E BZFL OZE 70 0F89 9 wy Bu unojuedjkzusg 0Z pe Bgzi By 6 Gzo e jw 6r1 OOL 6661 yeyinsuloAwojdesjsospAyiq u 001 le ye ewe lysin 1w NI 00 unolued kzusg 0Z pe BSL 62 Boe 6 1 0 JeyinsumsAwoIdans NI 000001 lu 0
354. opische Untersuchung cccceeeeeeeeeeeeenneeeeeeeeeeeeeeee 99 4 1 2 Chemisch physikalische Untersuchung 444444ss4444 HH 99 4 1 3 Mikroskopische Untersuchung s4444444444nnnnn ernennen nennen 99 4 1 4 Spermac F rbung See ee 100 BT HOSSTET a neue 100 4 1 6 Computer assisted sperm analysis CASA uuussersserseennnnnn 100 4 1 6 1 Motilitatsanalyse 00 0000000nnennennnnnnnnnnnnnnnn nenn 100 4 1 6 2 Viabilit tsanalyser u ae 101 4 2 Ergebnisse der weiterverarbeiteten Ejakulate unmittelbar nach dem Verdunneran Tag Van er ee 101 4 2 1 Dichten der verd nnten Ejakulate 442444444n nennen 102 4 2 1 1 Neubauer Z hlkammer 4 0444m 102 42 12 CASA se en RELITENE 102 4 2 2 Einfluss der Verdunner auf die Motilit t an Tag 0 102 4 2 2 1 Subjektiv gesch tzte Vorw rtsbeweglichkeit 103 4 2 2 2 Mittels CASA gemessene Gesamtmbotilit t 104 4 2 2 3 Mittels CASA gemessene Vorw rtsbeweglichkeit 105 4 2 2 4 Weitere mittels CASA bestimmte Motilit tsparameter 106 4 2 3 Einfluss der Verd nner auf die Viabilitat an Tag O 118 4 2 3 1 Anteil lebender Samenzellen im Eosinausstrich 113 4 2 3 2 Mittels CASA gemessene Viabilit t r 114 4 2 4 Einfluss der Verd nner auf den Anteil an morphologi
355. ostreptomycinsulfat 100 mg TRIS Lecithin TRIS 3 025 g Zitronensaure Beccaglia et Verdunner 1 7 g Fruktose 1 25 g Aqua dest al 2009a ad 100 ml Sojabohnen Lecithin 0 04 Benzylpenicillin 1 mg ml Dihydrostreptomycinsulfat 1mg ml TRIS Lecithin TRIS 3 025 g Zitronensaure TRIS TRIS Kmenta et al Verd nner 1 7 g Fruktose 1 25 g Aqua Puffer Puffer 2011 bidest ad 100 ml Lecithin 0 8 6 7 324 Gentamicin 0 2 g Lecithin Lecithin 6 6 337 264 Anhang 9 7 4 Kommerzielle Verd nner Tab A4 Name Zusammensetzung pH Wert und Osmolarit t einiger kommerzieller Verd nner f r die Fl ssigkonservierung von Hundesperma Verd nner Zusammensetzung Hersteller pH Wert Osmolaritat Quellen soweit bekannt mOsmol l Biladyl Minit b 6 77 418 Iguer Ouada und Tiefgefrierverd nner GmbH 6 66 mit 408 mit Verstegen 2001b f r Bullen Tiefenbach 20 20 Eigelb www minitube de Schafbock und Germany Eigelb zusatz Ziegenbocksamen zusatz CaniPRO Chill 5 Reinstwasser Minit b www minitube de 20 ml Natriumzitrat TRIS GmbH Glukose Fruktose Tiefenbach herstellereigene Germany Bestandteile Gentamicin CaniPRO Chill 10 Reinstwasser Minit b www minitube de 20 ml Natriumzitrat TRIS GmbH Glukose Fruktose Tiefenbach herstellereigene Germany Bestandteile Gentamicin erfordert den Zusatz von 4 ml frischem Eigelb CaninePro Minit b Pe a et al 2006 Gm
356. perma 30 0 539 0 002 CP 30 0 880 lt 0 001 TE 30 0 861 lt 0 001 Up1 2 12 0 798 0 002 Up 1 18 0 943 lt 0 001 Sowohl in den Nativejakulaten als auch in den mit den verschiedenen Verd nnern aufgearbeiteten Ejakulaten konnten statistisch signifikante Zusammenh nge zwischen den mittels Neubauer Z hlkammer bestimmten und den durch CASA gemessenen Dichten ermittelt werden 4 4 1 2 Korrelation ohne Trennung nach Verdunnern Der Zusammenhang zwischen den mittels Neubauer Z hlkammer bestimmten und den durch CASA ermittelten Dichten wird durch die nachfolgende Punktwolke Abb 20 veranschaulicht Regressionsgerade y 0 40013x 0 15647 c 2 w E 2 a fe N 5 lt O e D 2 a lt x N lt O 0 5 1 mittels Neubauer Zahlkammer bestimmte Dichte nach Wurzeltransformation Abb 20 Korrelation zwischen den mittels Neubauer Zahlkammer bestimmten und den durch Computer assisted sperm analysis CASA SpermVision System gemessenen Dichten in den Nativejakulaten und in allen verd nnten Ejakulaten n zeitgleiche Variablenpaare 120 148 Ergebnisse Die Korrelationsanalyse ergab einen Korrelationskoeffizienten von r 0 708 bei einer Signifikanz von p lt 0 001 Die Korrelation zwischen den mit den verschiedenen Methoden bestimmten Werten war somit als statistisch signifikant zu beurteilen Im Durchschnitt waren die mittels Neubauer Z hlkammer bestimmten Dichten j
357. perma bei 39 C verursachte keine signifikanten Ver nderungen der Anzahl an lebenden Spermien was bedeutet dass die Zugabe des Verd nners ebenso keinen verz gerten Effekt auf die Viabilit t bewirkt Lediglich die Inkubation nach K hlung resultierte in einer signifikanten Abnahme des Prozentsatzes an lebenden Spermien wodurch von einem verz gerten Effekt der K hlung auf die Viabilit t ausgegangen werden kann Burgess et al 2001 Auch nach Sirivaidyapong et al 2001 beeinflussen die Zugabe von TRIS Eigelb Verd nner und die K hlung auf 4 C die Viabilit t der Samenzellen nicht Nach Koderle et al 2009 verursachte die Zugabe von Up1 2 keinen signifikanten Abfall der Viabilit t der Samenzellen vor dem Einfrieren Auch dies konnte in der vorliegenden Arbeit best tigt werden Zum einen scheint Prostatasekret die Viabilit t von fl ssigkonserviertem Sperma zwar nicht zu beeinflussen Sirivaidyapong et al 2001 zum anderen bt jedoch auch die Zentrifugation keinen negativen Einfluss auf die Viabilit t der Samenzellen aus Koderle et al 2009 Dadurch dass in der vorliegenden Arbeit keine signifikanten Unterschiede zwischen den zentrifugierten und den nicht 186 Diskussion zentrifugierten fl ssigkonservierten Ejakulaten nachgewiesen werden konnten k nnen f r die Ergebnisse an Tag 0 auch diese Aussagen bekr ftigt werden Das Ph nomen dass sich in den mit Up1 verd nnten Ejakulaten im Eosinausstrich tendenziell me
358. pteffekte Wechselwirkung p Wert p Wert Verdunner Zeit Verdunner x Zeit geschatzte Vorwartsbeweglichkeit lt 0 0001 lt 0 0001 lt 0 0001 CASA Gesamtmotilitat 0 0003 lt 0 0001 lt 0 0001 CASA Vorw rtsbeweglichkeit 0 0045 lt 0 0001 lt 0 0001 DAP lt 0 0001 lt 0 0001 lt 0 0001 DCL lt 0 0001 lt 0 0001 lt 0 0001 DSL 0 0004 lt 0 0001 0 0007 VAP lt 0 0001 lt 0 0001 lt 0 0001 VCL lt 0 0001 lt 0 0001 lt 0 0001 VSL 0 0002 lt 0 0001 0 0007 ALH 0 028 lt 0 0001 0 0006 BCF 0 64 0 022 0 078 STR 0 042 0 063 0 13 LIN 0 016 0 0044 0 32 WOB 0 0078 lt 0 0001 0 53 Lebende Eosinausstrich 0 033 lt 0 0001 0 91 CASA Viabilit t 0 54 lt 0 0001 0 13 Pathomorphologie gesamt 0 63 0 0003 0 57 Kopfver nderungen 0 75 0 55 0 95 Halsver nderungen 0 061 0 15 0 48 Schwanzver nderungen 0 46 0 0064 0 43 aufgerollte Schw nze 0 11 0 076 0 75 Knickschw nze 0 13 0 0015 0 82 schleifenf rmige Schw nze 0 045 0 0003 0 55 lose K pfe 0 96 0 0004 0 90 Plasmatropfen 0 48 0 0059 0 22 Kopfkappenver nderungen gesamt 0 10 lt 0 0001 0 57 abgel ste Kopfkappen 0 08 lt 0 0001 0 40 schiefe Kopfkappen 0 55 0 012 0 16 sonstige Ver nderungen 0 087 lt 0 0001 0 14 283 Anhang 9 9 Abb Abb Abbildungsverzeichnis 1 Abb 3 Abb Abb Abb Abb Abb Abb Abb Abb Abb P Schematische Darstellung der Schwanzver nderungen von Rud
359. r die gemittelte Bahn um sec velocity curved line velocity curvilinear engl f r kurvilineare Geschwindigkeit Geschwindigkeit ber die tats chlich zur ckgelegte Bahn um sec Volumenprozent velocity straight line engl f r lineare Geschwindigkeit Geschwindigkeit ber eine gerade Linie vom Anfang zum Ende um sec VAP VCL wobble engl f r Schwankung der kurvilinearen Strecke um die mittlere Strecke arithmetischer Mittelwert geometrischer Mittelwert modifizierter Mittelwert r cktransformierter Mittelwert Zona pellucida Einleitung und Fragestellung 1 Einleitung und Fragestellung Nachdem die kunstliche Besamung bei vielen Nutztierarten bereits seit langer Zeit ein wichtiges Zuchtinstrument darstellt gewinnt sie auch in der Hundezucht immer mehr an Bedeutung Bei Verwendung von Sperma guter Qualitat und einem optimalen Besamungsregime k nnen mit der k nstlichen Besamung Trachtigkeitsergebnisse und Wurfgr en erzielt werden die denen eines nat rlichen Deckaktes entsprechen Dabei haben insbesondere die Wahl des geeigneten Besamungszeitpunktes sowie die korrekte Deponierung des Spermas im weiblichen Genitale einen entscheidenden Einfluss auf den Erfolg dieser Reproduktionstechnik Neben Frischsperma kommen bei der k nstlichen Besamung fl ssigkonserviertes Sperma sowie Tiefgefriersperma zum Einsatz wobei mit fl ssigkonserviertem Sperma deutlich bessere Konzeptionsraten und h here Wurfgr e
360. r eine signifikante Verringerung des Gesamtanteils an morphologisch ver nderten Spermien im Vergleich mit dem Nativsperma zu beobachten war siehe Kap 5 3 24 kam es ber den gesamten Untersuchungszeitraum gesehen dennoch in fast allen verd nnten Ejakulaten zu einer signifikanten Zunahme des Gesamtanteils an morphologisch ver nderten 204 Diskussion Samenzellen im Eosinausstrich pzeit 0 0007 bis lt 0 0001 Dies entspricht den Ergebnissen von Tsutsui et al 2003b und Kmenta et al 2011 die mittels Rose Bengal F rbung bzw nach Fixation in Hancock L sung ber eine Lagerungsdauer von zw lf bzw acht Tagen in mit TRIS Fruktose Eigelb Verd nnern fl ssigkonservierten Ejakulaten einen hnlichen Anstieg des Anteils an morphologisch ver nderten Samenzellen nachweisen konnten und ist sinngem bereinstimmend mit den Resultaten weiterer Autoren welche nach Fl ssigkonservierung f r eine Lagerungsdauer von drei bis zehn Tagen in TRIS Glukose Eigelb Verd nnern bzw in Trockenmagermilch Glukose Verd nner mittels Nigrosin Eosin F rbung signifikante Reduktionen des Anteils an Samenzellen mit normaler Morphologie nachweisen konnten England und Ponzio 1996 Rijsselaere et al 2004b Michael et al 2009 2010 Nach Burgess et al 2001 verursacht zwar die Zugabe eines glycerolhaltigen TRIS Fruktose Eigelb Verd nners keine transmissionselektronenmikroskopisch erkennbaren ultrastrukturellen Ver nderungen der Samenzellen
361. ration der Proben Dagegen scheint dieser Effekt in H mozytometern die 212 Diskussion mit 100 um wesentlich tiefer sind als die meisten Einweg Zahlkammern keine Rolle zu spielen Folglich bleibt die H mozytometrie der Golden Standard f r die Bestimmung der Spermienkonzentration Kuster 2005 5 3 4 2 Motilit t In der vorliegenden Arbeit konnte eine signifikante Korrelation der subjektiv gesch tzten Vorwartsbeweglichkeit mit der mittels CASA gemessenen Vorw rtsbeweglichkeit nachgewiesen werden r 0 885 p lt 0 001 wobei die subjektiv gesch tzten Mittelwerte durchschnittlich 12 5 11 5 Uber den mittels CASA bestimmten Werten lagen Bei getrennter Betrachtung der Nativejakulate und der mit den verschiedenen Verd nnern aufgearbeiteten Ejakulate fiel auf dass in den verd nnten Ejakulaten engere Korrelationen beobachtet werden konnten als in den Nativejakulaten siehe Kap 4 4 2 1 was jedoch durch die im Vergleich zum Nativsperma h here Anzahl an getesteten Variablenpaaren bei den verd nnten Proben oder durch die Verd nnung auf ann hernd optimale Konzentrationen f r die CASA Messungen 50 100 x 10 Spermien pro ml bedingt sein k nnte Die ermittelten Korrelationen sind bereinstimmend mit den Aussagen in der Literatur G nzel Apel et al 1993 Rijsselaere et al 2003 Sch fer Somi et al 2006 Sch fer Somi und Aurich 2007 Fraglich ist jedoch ob niedrige Motilit tsraten h here Abweichungen zwischen der durch CA
362. raum signifikant h here Messwerte f r die CASA Viabilit t als die mit Up 1 2 verdunnten Ejakulate Auf Basis dieser Ergebnisse war bez glich der Erhaltung der Viabilit t in den fl ssigkonservierten Ejakulaten der Verd nner Up1 als bester unter den getesteten Verd nnern zu beurteilen Jedoch konnten auch mit den Verd nnern CP und TE gute Ergebnisse erzielt werden Lediglich der Verd nner Up1 2 lieferte Ergebnisse die im Vergleich zu denen der anderen Verd nner als nicht zufriedenstellend anzusehen waren worin ebenfalls die erfolgte nderung des Versuchsplans Ersatz von Up1 2 durch Up 1 begr ndet lag Ein negativer Einfluss der Zentrifugation auf die Viabilit t der Samenzellen konnte in diesem Zusammenhang ausgeschlossen werden In bereinstimmung mit den vorherigen 203 Diskussion Aussagen erwies sich der Zusatz von Glycerol 5 und Equex im Verd nner Up 1 2 erneut als nachteilig Dies best tigt die Aussage von Foote und Leonard 1964 nach denen die Uberlebensrate der Spermien in Verd nnern die Glycerol enthalten etwas geringer ist und die von Nizanski et al 2009 dass der Zusatz von Equex die Lebensdauer der Spermien bei Inkubation bei 5 C verkurzt Grundsatzlich war zu beobachten dass die Viabilitat der Samenzellen uber den gesamten Zeitverlauf deutlich h her war als deren Motilitat Insbesondere gegen Ende des Untersuchungszeitraumes wurde die Diskrepanz immer gr er Dies ist jedoch bereinstimmend m
363. rbeit waren nicht zentrifugierte Ejakulate den Proben nach Zentrifugation berlegen Letztlich blieb jedoch unbeantwortet ob und inwieweit das Glycerol die Zentrifugation oder andere unbekannte Faktoren f r den beobachteten Motilitatsabfall verantwortlich waren Allerdings konnte durch die berlegenheit der nicht zentrifugierten Ejakulate best tigt werden dass Prostatasekret beimengungen die Motilit t von fl ssigkonserviertem Sperma nicht negativ beeinflussen Sirivaidyapong et al 2001 W hrend an Tag 0 der Verd nner Up 1 bez glich der CASA Gesamtmotilitat und der CASA Vorw rtsbeweglichkeit dem Verd nner CP noch signifikant berlegen war und die Verd nner CP und TE lediglich bez glich der CASA Motilit tsparameter signifikant bessere Werte lieferten siehe Kap 5 3 2 2 so nderte sich dies im weiteren Zeitverlauf deutlich Insgesamt wurde die Motilit t ber den gesamten Untersuchungszeitraum in den mit CP verd nnten Ejakulaten am besten konserviert was im Vergleich mit den mit Up1 2 verd nnten Ejakulaten f r die subjektiv gesch tzte Vorw rtsbeweglichkeit die CASA Gesamtmotilitat die CASA Vorwartsbeweglichkeit und verschiedene CASA Motilitatsparameter DAP DCL DSL VAP VCL VSL ALH BCF im Vergleich mit den mit Up1 verd nnten Ejakulaten f r die subjektiv gesch tzte Vorwartsbeweglichkeit die CASA Gesamtmotilitat die CASA Vorw rts beweglichkeit und verschiedene CASA Motilitatsparameter DAP DCL DSL VAP
364. rd nner Ber cksichtigung finden M glicherweise ist ein Zusammenhang zwischen dem in Up1 2 enthaltenen Glycerol oder dem Equex und dem st rkeren Anstieg in den entsprechenden Proben vorhanden Gegen Glycerol als verantwortliche Substanz spricht allerdings die Tatsache dass in Up1 auch Glycerol enthalten ist und in den mit Up 1 192 Diskussion verdunnten Proben der geringste Anstieg zu beobachten war Jedoch ist in Up 1 die Glycerolkonzentration wesentlich geringer Die vorliegenden Ergebnisse widersprechen den von Kumi Diaka und Badtram 1994 gemachten Beobachtungen dass die Verd nnung mit TRIS Dextrose Eigelb Verd nner und die anschlie ende Fl ssigkonservierung bei 5 C f r 24 Stunden die physikalischen und funktionellen Eigenschaften caniner Spermien nicht signifikant beeinflussen Bereits ohne K hlung kam es bei den vorliegenden Untersuchungen schon zu signifikanten Zunahmen des Anteils an Samenzellen mit nicht intakten Membranen M glicherweise waren jedoch auch methodische Unterschiede f r diese kontr ren Ergebnisse verantwortlich Zum einen setzten Kumi Diaka und Badtram 1994 einen anderen Verd nner ein und zum anderen besa auch die verwendete hypoosmotische L sung eine andere Osmolarit t und die f r den Test eingesetzte Spermamenge sowie die Inkubationszeit unterschieden sich Interessant w re gewesen den HOS Test zu ausgew hlten Zeitpunkten w hrend des Zeitraums der Fl ssigkonservierung bei 4 C zu wiederho
365. rden jeweils mit p lt 0 01 Zwischen den brigen Verd nnerpaaren zeigten sich keine signifikanten Unterschiede Tab A6 A8 Kap 9 8 Tab 13 zeigt die durch CASA bestimmten Mittelwerte des Motilitatsparameters VSL der aufgearbeiteten Ejakulate unmittelbar nach dem Verd nnen Tag 0 Verglichen Nativejakulate und der mit den verschiedenen Verd nnern mit den Nativejakulaten kam es durch die Zugabe der Verd nner in allen verd nnten Ejakulaten zu einer Reduktion der durchschnittlich gemessenen VSL In den mit CP verd nnten Proben war die Abnahme am geringsten und in den mit Up 1 2 verd nnten Proben am st rksten Tab 13 CASA Motilitatsparameter VSL n x SD Min Max im Nativsperma und in den verschiedenen Verd nnern an Tag 0 Verd nner n x SD um s Min um s Max um s keiner Nativsperma 30 82 5 21 3 33 9 112 9 CP 30 76 2 15 7 39 2 101 7 TE 30 71 8 14 8 40 3 105 5 Up1 2 12 60 7 13 1 40 9 82 5 Up 1 18 66 3 9 4 45 8 79 7 109 Ergebnisse In den einfaktoriellen Varianzanalysen und den paarweisen Vergleichen nach Student Newman Keuls konnten fur VSL signifikante Unterschiede zwischen dem Nativsperma und den mit den verschiedenen Verd nnern aufgearbeiteten Ejakulaten nachgewiesen werden jeweils mit p lt 0 05 bzw p lt 0 01 Die verd nnten Ejakulate untereinander unterschieden sich bez glich des CASA Motilitatsparameters VSL nur teilweise So waren lediglic
366. re Gesamtmotilitat von 52 verglichen mit 47 in mit Cornell University Verd nner konserviertem Sperma Daher empfehlen Province et al 1984 den Caprogen Verd nner f r die Fl ssigkonservierung von Hundesperma bei 5 C Bouchard et al 1990 verglichen einen NFDMS G Non Fat Dried Milk Solid Glucose Verd nner Kenney Verd nner mit einem Eigelb Zitrat Verd nner Fresh Plus Verd nner ber einen Untersuchungszeitraum von f nf Tagen Der NFDMS G Verd nner war zur Konservierung der Spermambotilit tsparameter gemessen als Gesamtmotilit t und Vorw rtsbeweglichkeit dem Eigelb Zitrat Verd nner w hrend des gesamten Beobachtungszeitraumes deutlich berlegen W hrend im NFDMS G Verd nner eine Gesamtmotilit t von ca 50 ber einen Zeitraum von 72 Stunden aufrechterhalten werden konnte betrug diese Zeitspanne im Eigelb Zitrat Verd nner lediglich 12 Stunden Jedoch konnten im NFDMS G Verd nner insbesondere nach einer Lagerungsdauer von mehr als 72 Stunden h ufiger Agglutinationen beobachtet werden als im Eigelb Zitrat Verdunner Bouchard et al 1990 Von Rota et al 1995 wurden drei verschiedene Verdunner Eigelb TRIS Eigelb Milch und Eigelb Sahne Verd nner f r die Fl ssigkonservierung von caninem Sperma bei 4 C ber einen Zeitraum von vier Tagen vergleichend untersucht Der Eigelb TRIS Verd nner war den anderen Verd nnern bez glich der Erhaltung der Motilit t berlegen An Tag 4 lag die Motilitat im Ei
367. ren Von letzteren war der Biladyl Verd nner berlegen ab Tag 5 war die Gesamtmotilitat signifikant h her und nach 8 3 0 2 Tagen waren 50 der Spermien durch gute Motilitatsparameter charakterisiert insgesamt konnte die Motilit t f r 10 Tage erhalten werden W hrend der TRIS BES und der EDTA Verd nner einen unmittelbaren depressiven Effekt auf die verschiedenen Motilit tsparameter hatten waren der TRIS Fruktose und der TRIS Glukose Verd nner gut geeignet die Motilitatsparameter zu konservieren Der TRIS Glukose Verd nner war ab Tag 4 Vorwartsbeweglichkeit bzw Tag 8 Gesamtmotilitat dem TRIS Fruktose Verd nner signifikant berlegen Dieser Unterschied ist vermutlich auf das Energiesubstrat Glukose anstelle von Fruktose zur ckzuf hren wobei Glukose einen positiveren Effekt auf die Erhaltung der Motilit t aus bt als Fruktose Im TRIS Fruktose Verd nner zeigten nach einer Lagerungsdauer von 9 7 0 6 Tagen noch 50 der Spermien gute Motilit tsparameter w hrend dies im TRIS Glukose Verdunner nach 13 1 1 1 Tagen der Fall war Insgesamt konnte die Motilit t im TRIS Glukose Verd nner f r 16 Tage erhalten werden Zusammenfassend war unter den kommerziellen Verd nnern der Biladyl Verd nner der beste der getesteten Verd nner und unter den im Labor hergestellten Verd nnern der TRIS Glukose Verd nner Durch die Verl ngerung der Konservierung der Spermaqualitat auf etwa 13 Tage im Vergleich zu circa 8 5 68 Literatur
368. ren relativ unempfindlich w hrend beispielsweise Schweinespermien sehr empfindlich sind Hoffmann 2003d Wichtige Effekte des K lteschocks sind Verminderung der Motilit t Weitze und Petrunkina 2007 Freisetzung von Enzymen Watson und Morris 1987 Weitze und Petrunkina 2007 lonentransporte ber die Membran Watson und Morris 1987 Weitze und Petrunkina 2007 und Verlust von Membranlipiden Weitze und Petrunkina 2007 Die Membranpermeabilitat wird erh ht sodass Phasenver nderungen und der damit verbundene Einstrom von freien Ca lonen aus der Umgebung in die Zelle calciumabh ngige Vorg nge ausl sen die zu kapazitations hnlichen Ph nomenen f hren k hlabh ngige Kapazitierung Weitze 2001 die Zellmembran fusiogener und somit instabiler machen Weitze und Petrunkina 2007 und damit die berlebensf higkeit der Samenzellen im Hinblick auf ihre Befruchtungsf higkeit begrenzen Weitze 2001 Ein gro er Anteil der Spermien zeigt nach einem K lteschock gesch digte akrosomale Membranen Watson und Morris 1987 52 Literatur Unreife Spermien aus den oberen oder mittleren Regionen des Epididymis sind weitaus weniger empfindlich gegen ber Kalteschockschaden was auf die sich ndernde Lipidzusammensetzung der Membranen w hrend der Spermienreifung zur ckzuf hren sein k nnte Watson und Morris 1987 2 5 2 3 1 Eigelb Um die durch das Ph nomen des K lteschocks induzierten Sch den an der Pl
369. rliegenden Arbeit beobachtet wurde Parallel zur Qualit tsreduktion der fl ssigkonservierten Ejakulate kommt es zu einem Anstieg des Anteils an ROS was vermuten l sst dass dies in kausalem Zusammenhang zur Verminderung der caninen Spermaqualit t steht Michael et al 2009 Bei gesonderter Betrachtung der fl ssigkonservierten Proben des R den Nr 20 dessen Ejakulat eine geringe Blutbeimengung aufwies war im Vergleich zu den brigen Proben keine Tendenz f r eine zus tzliche nachteilige Beeinflussung der Spermaqualit t durch Blut zu erkennen Dies bekr ftigt die bei Rijsselaere et al 2004b gefundene Aussage dass Blutbeimengungen lt 10 Vol keine negativen Effekte auf die funktionellen Charakteristika von bei 4 C fl ssigkonservierten caninen Spermien aus ben W hrend Rijsselaere et al 2004b dies f r eine Lagerungsdauer von vier Tagen nachweisen konnten waren in der vorliegenden Arbeit auch ber zehn Tage keine Tendenzen f r negative Effekte durch die Blutbeimengung festzustellen Es ist davon auszugehen dass Blut im Ejakulat die Befruchtungsf higkeit caniner Spermien nicht beeinflusst Linde Forsberg 1995 5 3 3 1 Motilit t Obwohl die Motilit t nur eine von vielen wichtigen Eigenschaften eines fertilen Spermiums darstellt ist sie der am h ufigsten genutzte Indikator f r eine normale Spermienfunktion Pe a Martinez 2004 und auch einer der wichtigsten Parameter f r die Beurteilung der Spermaqualit t Rigau et
370. rostatasekret zwar die Qualit t von kryokonserviertem Sperma negativ beeinflusst nicht jedoch die Motilit t von fl ssigkonserviertem Sperma Der im Verd nner Up 1 unmittelbar nach dem Verd nnen erkennbare Anstieg der Motilit t war nicht zu erwarten und konnte nur mittels CASA Gesamtmotilitat und Vorw rtsbeweglichkeit nicht aber durch die subjektive Sch tzung nachgewiesen werden Dies k nnte m glicherweise dadurch bedingt sein dass die CASA Messungen genauer waren da CASA Systeme selbst feine Ver nderungen in der Spermienbewegung erkennen k nnen Ellington et al 1993 Amann und Katz 2004 welche f r den menschlichen Untersucher nicht sichtbar sind Dagegen 184 Diskussion spricht allerdings dass bez glich der CASA Motilit tsparameter VAP VCL VSL ALH und BCF in den mit Up 1 verd nnten Ejakulaten keine Zunahmen beobachtet werden konnten Zudem waren solch initiale Zunahmen der Vorw rtsbeweglichkeit auch bei G nzel 1986 und Tsutsui et al 2003b zu finden welche ohne CASA arbeiteten Weiterhin konnte auch bei Sch fer Somi und Aurich 2007 verglichen mit der gesch tzten Motilitat der Nativejakulate eine signifikante Zunahme der CASA Gesamtmotilitat durch Zugabe von TRIS Fruktose Puffer gesehen werden Ebenso lie sich bei Nizanski et al 2009 eine initiale Zunahme fast aller durch CASA bestimmten Motilit tsparameter unmittelbar nach dem Verd nnen mit einem TRIS Glukose Eigelb Verd nner finden Zur Ursache
371. rotektiven Effekte kann Glycerol Ver nderungen in der Lipidpackungsstruktur der Spermienmembran induzieren Infolgedessen k nnen sich Stabilit t und Wasserpermeabilitat der Zelle ndern was zu einer reduzierten Lebensdauer der Spermien f hren kann Silva et al 2006 Daher stellt die optimale Konzentration von Glycerol die Balance zwischen seinen toxischen und seinen sch tzenden Effekten dar England 1993 Beim Hund variieren die genutzten Glycerolkonzentrationen in Abh ngigkeit von der Zusammensetzung des Verd nners und dem verwendeten Puffer zwischen 1 und 16 Vol Concannon und Battista 1989 England 1993 Farstad 1996 Futino et al 2010 Rohloff et al 1978 konnten optimale Konzentrationen von 4 bis 8 ermitteln Rota et al 1999a 2006 verwenden eine Endkonzentration von 5 Glycerol im Verdunner Silva et al 2006 6 und Tsutsui et al 2000 7 Nach Pe a et al 2006 tolerieren Hundespermien dagegen nur eine Glycerol konzentration von 4 5 Province et al 1984 konnten zeigen dass ein Zusatz von 6 Glycerol zum Verdunner die Motilitat von fl ssigkonservierten Hundespermien herabsetzt w hrend ein Zusatz von 3 keine Auswirkungen auf die Motilit t besitzt G nzel Apel et al 1993 konnten ebenfalls eine abnehmende Tendenz der durchschnittlichen Bewegungsgeschwindigkeit der Spermien nach dem Zusatz von Glycerol beobachten und auch nach Foote und Leonard 1964 ist die berlebensrate der Spermien in Verd nnern
372. rozen thawed and cooled rewarmed dog semen Theriogenology 46 1 165 171 Eulenberger K Schafer Somi S Aurich C 2009 Effect of different concentrations of ascorbic acid on motility membrane integrity and chromatin status of frozen thawed canine spermatozoa within six hours of storage at 37 C Reprod Dom Anim 44 Suppl 2 354 358 Farrell P B Presicce G A Brockett C C Foote R H 1998 Quantification of bull sperm characteristics measured by computer assisted sperm analysis CASA and the relationship to fertility Theriogenology 49 4 871 879 Farstad W 1984 Bitch fertility after natural mating and after artificial insemination with fresh or frozen semen J Small Anim Pract 25 9 561 565 231 Literaturverzeichnis Farstad W 1996 Semen cryopreservation in dogs and foxes Anim Reprod Sci 42 1 4 251 260 Farstad W 2000 Assisted reproductive technology in canid species Theriogenology 53 1 175 186 Farstad W 2009 Cryopreservation of canine semen new challenges Reprod Dom Anim 44 Suppl 2 336 341 Farstad W Andersen Berg K 1989 Factors influencing the success rate of artificial insemination with frozen semen in the dog J Reprod Fertil 39 Suppl 289 292 Fetterolf P M Rogers B J 1990 Prediction of human sperm penetrating ability using computerized motion parameters Mol Reprod Dev 27 4 326 331 Abstract Fielden E D 1971 Artifi
373. rphologisch ver nderten Samenzellen in den verd nnten Ejakulaten durch die Milieuverbesserung aufgrund der Verd nnerzugabe verursacht wurde Hierf r kommt insbesondere eine Abnahme der Gei elver nderungen in Frage Bei getrennter Betrachtung der einzelnen auftretenden morphologischen Ver nderungen waren die Anteile der entsprechenden Ver nderungen in den verd nnten Ejakulaten an Tag 0 mit Ausnahme des Anteils an schleifenformigen Schw nzen in den mit CP TE und Up 1 verd nnten Ejakulaten ebenfalls stets geringer als in den Nativejakulaten was bereinstimmend mit den Beobachtungen f r den Gesamtanteil an morphologisch ver nderten Samenzellen war siehe oben Die in den mit CP TE und Up1 2 aufgearbeiteten Ejakulaten ermittelte signifikante Verringerung des Anteils an Samenzellen mit Plasmatropfen im Vergleich mit dem Nativsperma fiel jedoch in hnlicher Weise bereits w hrend der Untersuchungen aller verd nnten Ejakulate auf W hrend bei der Motilit tsbeurteilung unter dem Phasenkontrastmikroskop in den entsprechenden Nativejakulaten noch viele Spermien mit Plasmatropfen zu erkennen waren lie en sich sp ter im Eosinausstrich des Nativspermas sowie im Eosinausstrich des verd nnten Spermas wesentlich weniger Samenzellen mit Plasmatropfen nachweisen Dies k nnte darauf hindeuten dass es durch das Ausstreichen und oder die F rbung der Spermien m glicherweise zu einer Abl sung der Plasmatropfen kommen kann und somit der Ant
374. rrad n P G 1998a Effects of sodiumdodecylsulphate on post thaw dog semen quality during in vitro incubation at 39 C and 22 C Reprod Dom Anim 33 6 393 398 240 Literaturverzeichnis Pena A I Quintela L A Herrad n P G 1998b Viability assessment of dog spermatozoa using flow cytometry Theriogenology 50 8 1211 1220 Pe a A Johannisson A Linde Forsberg C 1999 Post thaw evaluation of dog spermatozoa using new triple fluorescent staining and flow cytometry Theriogenology 52 6 965 980 Pena A Linde Forsberg C 2000 Effects of Equex one or two step dilution and two freezing and thawing rates on post thaw survival of dog spermatozoa Theriogenology 54 6 859 875 Pena A I Johannisson A Linde Forsberg C 2001 Validation of flow cytometry for assessment of viability and acrosomal integrity of dog spermatozoa and for evaluation of different methods of cryopreservation J Reprod Fertil 57 Suppl 371 376 Pena A l L pez Lugilde L Barrio M Becerra J J Quintela L A Herrad n P G 2003a Studies on the intracellular Ca concentration of thawed dog spermatozoa Influence of Equex from different sources two thawing diluents and post thaw incubation in capacitating conditions Reprod Dom Anim 38 1 27 35 Pena A I Lugilde L L Barrio M Herradon P G Quintela L A 2003b Effects of Equex from different sources on post thaw survival long
375. rschiedener kommerzieller Verd nner zur Fl ssigkonservierung von Hundesperma Zu einigen der genannten Verd nner Biladyl CLONE Chilled Semen Kit Fresh phos Verd nner Fresh Plus Verd nner Green Verd nner Kenney Verd nner gibt es wissenschaftliche Untersuchungen bez glich ihrer Eignung zur Fl ssigkonservierung caniner Spermien siehe Kap 2 5 3 5 zu den anderen nicht Des Weiteren ist anzumerken dass es sich bei manchen der Verd nner eigentlich um Tiefgefrierverd nner teilweise auch urspr nglich f r andere Spezies entwickelt handelt welche von den jeweiligen Autoren jedoch trotzdem zur Fl ssigkonservierung von Hundesperma eingesetzt wurden 2 5 3 5 Vergleichende Untersuchungen In diesem Kapitel erfolgt eine Darstellung von Studien in denen verschiedene Verd nner f r die Fl ssigkonservierung von caninem Sperma ber variierende Untersuchungszeitr ume miteinander verglichen wurden Bartlett 1962a verglich einen Eigelb Phosphat Verd nner pH 6 75 einen Eigelb Zitrat Verd nner pH 7 0 und einen Sterilmilch Verd nner ber einen Untersuchungszeitraum von 32 Stunden Bei diesem Vergleich konnte beobachtet werden dass wenn die Samenzellen im Eigelb Phosphat Verd nner bereits vollst ndig immotil geworden sind 65 Literatur Samenzellen derselben Spermaprobe im Eigelb Zitrat sowie im Sterilmilch Verd nner noch ihre initiale Motilit t aufweisen Im Eigelb Zitrat Verd nner erhielten vier von siebzehn
376. rstegen 2001b Ponglowhapan et al 2004 Allerdings ist der Glukoseverbrauch stets h her als der Fruktoseverbrauch wenn beide Zucker in gleichen Mengen vorhanden sind Ponglowhapan et al 2004 was darauf hindeutet dass Hundespermien vorzugsweise Glukose nutzen Iguer Ouada und Verstegen 2001b Ponglowhapan et al 2004 Eine m gliche Erkl rung f r die Pr ferenz von Glukose k nnte die h here Kapazit t an Glukosetransportsystemen sein Ponglowhapan et al 2004 Untersuchungen beim Mann ergaben sogar dass humane Spermien Glukose im Seminalplasma selbst dann bevorzugt verwenden wenn die Fruktosekonzentration 50 fach h her ist Martikainen et al 1980 In einer vergleichenden Untersuchung verschiedener Zuckerzus tze 70 mM zu einem TRIS Zitrat Verd nner mit 8 Glycerol und 20 Eigelb hinsichtlich ihres Einflusses auf Motilit t Viabilit t und akrosomale Integrit t w hrend Verd nnung 49 Literatur quilibrierung und Kryokonservierung konnten Yildiz et al 2000 feststellen dass die verwendete Zuckerart die genannten Parameter wahrend der Aquilibrierung und der Kryokonservierung signifikant beeinflusst So reduziert der Zusatz von Galaktose Laktose Trehalose Maltose und Sukrose bei aquilibrierten Proben signifikant den Prozentsatz geschadigter Akrosome Disaccharidzusatz mit Ausnahme von Laktose vermindert den Anteil an toten Spermien nach dem Auftauen und oder den Prozentsatz geschadigter Akrosome ohne die Mot
377. rte schlechtere Resultate als die Zitrat Glycin Verd nner mit 20 Eigelbzusatz 5 Gesamtmotilitat an Tag 8 versus durchschnittlich 30 und auch der Sahne Verd nner war dem Zitrat Glycin Glukose Verd nner mit 20 Eigelbzusatz deutlich unterlegen 6 Gesamtmotilitat an Tag 8 versus 56 Nach 13 t giger Lagerung bei 5 C konnten in mit Zitrat Glycin Glukose Verd nner mit 20 Eigelbzusatz konservierten Ejakulaten noch 40 motile Samenzellen beobachtet werden Foote und Leonard 1964 Province et al 1984 untersuchten vergleichend sechs verschiedene Verd nner f r die Fl ssigkonservierung von Hundesperma bei 5 C solange bis in zwei aufeinanderfolgenden Untersuchungen im Abstand von 24 Stunden keine Motilit t mehr nachweisbar war Dabei handelte es sich um einen Eigelb TRIS einen 66 Literatur Eigelb Bikarbonat den Beltsville F 3 den Cornell University den Caprogen und einen Magermilch Verdunner Es konnte gezeigt werden dass der Beltsville F 3 und der Eigelb Bikarbonat Verdunner welche ursprunglich fur die Konservierung von Ebersperma entwickelt wurden toxisch f r Hundespermien waren Der Caprogen Verd nner war hingegen zu fast jedem Untersuchungszeitpunkt allen anderen Verd nnern berlegen obwohl die Gesamtmotilitat im Cornell University Verd nner fur die ersten 72 Stunden gleich gut konserviert wurde Im Caprogen Verd nner konserviertes Sperma hatte ber den Lagerungszeitraum von 240 Stunden eine mittle
378. rwendet da die Blutbeimengung als gering einzustufen war und des Weiteren gepr ft werden sollte ob die in der Literatur gefundenen Aussagen bez glich Blutbeimengungen bei Fl ssigkonservierung best tigt werden k nnen Nach Seager und Fletcher 1972 kann Blut ein Medium f r bakterielles Wachstum bieten und so die Spermaqualit t nachteilig beeinflussen Diese nachteiligen Effekte treten allerdings erst nach l ngerer Inkubationsdauer auf England und Allen 1992 Rijsselaere et al 2004b konnten keine negativen Effekte von Blutbeimengungen Zusatz von lt 10 Vol ven sem Vollblut auf die funktionellen Merkmale von f r vier Tage fl ssigkonserviertem Sperma nachweisen wohl aber 159 Diskussion eine signifikante Qualitatsreduktion nach Kryokonservierung und Auftauen bei Blutbeimengungen 2 2 Vol ven sem Vollblut Als Ursache hierf r ist die nach Kryokonservierung im Vergleich zur Flussigkonservierung wesentlich starkere Hamolyse anzusehen und insbesondere das freigesetzte Hamoglobin Rijsselaere et al 2004b Bei Hund Nr 24 fiel wahrend der speziellen andrologischen Untersuchung eine derb knotige Konsistenz des rechten Hodens auf bei welcher es sich um einen Hodentumor handelte Die bei der Spermauntersuchung erfassten Parameter lagen mit Ausnahme der SGZ des Ejakulates im Normbereich Die verminderte Gesamtzahl der Spermien im Ejakulat Oligozoospermie stand vermutlich in Zusammenhang mit dem am Hoden erhobenen Befund
379. s sind in der folgenden Tabelle Tab 7 aufgef hrt 100 Ergebnisse Tab 7 Messergebnisse der einzelnen durch CASA SpermVision System bestimmten Motilit tsparameter in den Nativejakulaten n 30 dargestellt durch Angabe von arithmetischem Mittelwert X Standardabweichung SD Minimum Min und Maximum Max Parameter x SD Min Max DAP um 41 6 8 7 23 7 53 9 DCL um 61 9 11 6 42 6 85 1 DSL um 35 1 9 1 14 9 50 0 VAP um s 97 4 20 4 55 2 123 7 VCL um s 144 9 27 5 97 9 199 9 VSL um s 82 5 21 3 33 9 112 9 ALH um 8 7 1 0 3 5 7 9 BCF Hz 26 2 3 4 20 5 34 5 STR VSL VAP 83 4 8 1 61 0 92 0 LIN VSL VCL 56 6 11 6 27 0 76 0 WOB VAP VCL 67 0 8 4 45 0 82 0 4 1 6 2 Viabilitatsanalyse Die nach SYBR 14 Pl F rbung gemessene Viabilitat der Spermien in den Nativejakulaten betrug nach Anwendung der Arcus Sinus Transformation im Durchschnitt 82 7 71 0 91 9 Min 57 4 Max 97 1 4 2 Ergebnisse der weiterverarbeiteten Ejakulate unmittelbar nach dem Verd nnen an Tag 0 Voraussetzung f r die Weiterverarbeitung der spermienreichen Fraktion war eine gesch tzte Vorw rtsbeweglichkeit von mindestens 50 siehe Kap 3 4 die von allen 30 Probanden erf llt wurde Nach vollst ndiger Aufarbeitung des Spermas mit den verschiedenen Verd nnern erfolgte vor der endg ltigen K hlung eine Untersuchung der verd nnten Ejakulate
380. s an die Spermagewinnung erfolgen Johnston 1991 Freshman 2002 Fl ssig bzw kryokonserviertes Sperma sollte vor der Untersuchung immer mindestens auf Raumtemperatur besser jedoch auf 37 C angewarmt werden Linde Forsberg 1991 Unterschieden werden Massenbewegung deren Nachweis von der Spermiendichte und der Motilitat der einzelnen Samenzellen abh ngig ist Soderberg 1986 sowie Einzelmotilit t bei deren Beurteilung es sich um eine subjektive Sch tzung des Prozentsatzes an motilen Samenzellen handelt Freshman 2002 Obwohl die Motilitat nur eines der Merkmale eines fertilen Spermiums ist Pe a Martinez 2004 stellt sie einen wichtigen sowie einfach und schnell zu ermittelnden Parameter bei der Beurteilung der caninen Spermaqualit t dar Johnston 1991 Linde Forsberg 1991 und ist nach wie vor der am h ufigsten genutzte Indikator f r eine normale Spermienfunktion Pe a Martinez 2004 Motilit t ist ein Ausdruck der strukturellen und funktionellen Intaktheit der Samenzellen Daher ist der Prozentsatz vorw rtsbeweglicher Samenzellen blicherweise positiv korreliert mit dem Anteil an Samenzellen mit normaler Plasmamembranintegrit t und normaler Morphologie Ellington et al 1993 Kumi Diaka 1993 In einer anormalen Bewegung spiegeln sich oft die strukturellen Defekte wieder die bei der morphologischen Beurteilung gefunden werden Eine schnelle Abnahme der Motilit t nach der Spermagewinnung kann ein Anzeichen f r gerin
381. s in den mit den anderen Verd nnern aufgearbeiteten Proben Schlie lich konnte an Tag 10 in den mit Up1 2 aufgearbeiteten Ejakulaten der geringste Anteil an morphologisch ver nderten Samenzellen beobachtet werden 9 8 w hrend dieser in den mit den anderen Verdunnern aufgearbeiteten Ejakulaten 10 7 CP TE bzw 10 6 Up 1 betrug 140 Ergebnisse e CP n 30 TE n 30 Up 1 2 n 12 Up 1 n 18 Ke O 2 D 2 O lt Q p O E 0 g c lt x ver nderter Samenzellen Eosinausstrich in Abb 18 Ver nderungen des prozentualen an Anteils morphologisch ver nderten Samenzellen Eosinausstrich in den verschiedenen Verd nnern im Zeitverlauf der Fl ssigkonservierung bei 4 C ber zehn Tage dargestellt als geometrischer Mittelwert und Streufaktor xg SF CP Verd nner CaniPRO Chill 10 TE TRIS Fruktose Eigelb Verd nner Up 1 2 Uppsala Equex 2 System Verd nner 1 und Verd nner 2 Up 1 Uppsala Equex 2 System nur Verd nner 1 n Probenanzahl Im Zeitverlauf der Fl ssigkonservierung kam es in fast allen verd nnten Ejakulaten zu einem signifikanten Anstieg des Anteils an morphologisch ver nderten Samenzellen im Eosinausstrich Pzeit 0 0007 bis lt 0 0001 Die mit CP verd nnten Ejakulate zeigten ber den Untersuchungszeitraum bez glich des Anteils an morphologisch ver nderten Samenzellen einen signifikanten Niveauunterschied zu den mit TE verdunnten Ejakulaten Pvera
382. s nur in Versuchsteil I Endverd nnung 1 4 wobei auch hier mittels Neubauer Z hlkammer teilweise h here Spermienkonzentrationen bestimmt werden konnten als in den mit CP und in den mit TE verd nnten Aliquoten was vermutlich durch die Zentrifugation der Nativejakulate vor der Aufarbeitung bedingt war In Versuchsteil II Endverd nnung 1 2 hatten die mit dem Uppsala Equex 2 System Verd nner aufgearbeiteten Aliquote sowohl bei Bestimmung mit der Neubauer Z hlkammer als auch bei Messung mittels CASA deutlich h here Endkonzentrationen als die mit CP und die mit TE aufgearbeiteten Aliquote Dies war durch die nderung im Versuchsaufbau bedingt W hrend in Versuchsteil Verd nner 1 und Verd nner 2 des Uppsala Equex 2 Systems zum Einsatz kamen Up 1 2 wurde in Versuchsteil II nur Verd nner 1 verwendet Up 1 Grund fur diese Modifikation im Versuchsaufbau waren die schlechten Konservierungsergebnisse bei Verd nnung der Ejakulate mit dem kompletten Uppsala Equex 2 System siehe Kap 4 3 Um nicht zu stark vom Uppsala Verfahren abzuweichen wurden die entsprechenden Aliquote in Versuchsteil II jedoch trotzdem nur im Verh ltnis 1 2 verd nnt Dies geschah auch im Hinblick darauf dass in der Praxis nur mit Verd nner 1 des Uppsala Equex 2 Systems aufgearbeitete Ejakulate nach der Fl ssigkonservierung noch mit Verd nner 2 versetzt und anschlie end kryokonserviert werden k nnten So k nnten beispielsweise in der Praxis Ejakulate gewonnen un
383. s zu 14 Tage konserviert werden zu k nnen Shahiduzzaman und Linde Forsberg 2007 Beccaglia et al 2009a untersuchten vergleichend einen TRIS Eigelb und einen TRIS Lecithin Verd nner f r die Fl ssigkonservierung von caninem Sperma ber einen Zeitraum von vier Tagen Die Ergebnisse der Studie zeigen dass Lecithin als eine geeignete Alternative zu Eigelb bei der Fl ssigkonservierung von caninem Sperma angesehen werden kann Der TRIS Eigelb und der TRIS Lecithin Verd nner lieferten hnliche Werte hinsichtlich der gemessenen Motilitatsraten der Anzahl an nicht kapazitierten Spermien und der Anzahl an Samenzellen die an die ZP der Eizelle binden sodass der TRIS Lecithin Verd nner f r die Konservierung des Spermas ber vier Tage eingesetzt werden kann Beccaglia et al 2009a Kmenta et al 2011 verglichen einen TRIS Eigelb einen TRIS Lecithin einen TRIS Lecithin Katalase und einen TRIS Lecithin Katalase Tyrosin Verd nner ber einen Untersuchungszeitraum von acht Tagen Neben dem Vergleich der vier genannten Verd nner wurden in dieser Studie die Auswirkungen verschiedener Enhancer Zus tze welche dem fl ssig konservierten Sperma nach der Wiedererw rmung unmittelbar vor der Beurteilung im Verh ltnis 1 1 zugegeben wurden untersucht Bei den Enhancern handelte es sich um TRIS Puffer TRIS Puffer mit 0 02 mg Acetylcarnitin ml TRIS Puffer mit 0 1 mg Acetylcarnitin ml und TRIS Puffer mit 0 2 mg Acetylcarnit
384. sand des fl ssigkonservierten Spermas und f r die anschlie ende Lagerung am Bestimmungsort bis zur Verwendung zur KB Auch eine zweimalige KB im Abstand von 24 bzw 48 Stunden sollte in diesem Zeitraum m glich sein Das Hauptziel der vorliegenden Arbeit bestand darin den am besten geeigneten Verd nner f r die Fl ssigkonservierung von caninem Sperma bei 4 C ber eine Lagerungsdauer von zehn Tagen zu bestimmen Bez glich der Erhaltung der Motilit t erwies sich der Verd nner CP den brigen Verd nnern eindeutig als signifikant berlegen Der Verd nner TE zeigte wiederum eine signifikante berlegenheit gegen ber den Verd nnern Up 1 2 und 217 Diskussion Up 1 Im Verd nner Up 1 2 wurde eine gute Motilitat lediglich ber 24 Stunden erhalten im Verdunner Up 1 dagegen bis einschlie lich Tag 5 Hinsichtlich der Konservierung der Viabilitat war der Verdunner Up 1 den anderen Verd nnern signifikant berlegen Die Verd nner CP und TE zeigten wiederum eine tendenziell Anteil an lebenden Samenzellen im Eosinausstrich bzw eine signifikant CASA Viabilitat bessere Konservierung der Viabilitat als der Verd nner Up1 2 Bez glich der Pathomorphologie erschien der Verd nner Up1 2 den brigen Verd nnern tendenziell berlegen Eine statistische Signifikanz lie sich jedoch nur im Vergleich zum Verd nner CP ermitteln Der Verdunner CP war hinsichtlich der Pathomorphologie wiederum dem Verd nner TE signifikant berlegen
385. sch ver nderten Samenzellen an Tag uneeeeesesnsssnnnnnnnnnnnnnnn nn 116 4 2 5 Einfluss der Verd nner auf den Anteil an akrosomalen Ver nderungen bzw auf den Anteil an abgel sten Akrosomen an 4 2 6 Einfluss der Verd nner auf den Anteil an membrandefekten Samenzellen im HOS Test an Tag O 22224sannnenennnnnn nenne 120 4 3 Ergebnisse der Halteproben im Zeitverlauf uuur es nennen 122 4 3 1 Einfluss der Verd nner auf die Motilit t im Zeitverlauf 122 Inhaltsverzeichnis 4 3 1 1 Subjektiv gesch tzte Vorw rtsbeweglichkeit 123 4 3 1 2 Mittels CASA gemessene Gesamtmotilit t 125 4 3 1 3 Mittels CASA gemessene Vorw rtsbeweglichkeit 127 4 3 1 4 Weitere mittels CASA bestimmte Motilitatsparameter 129 4 3 2 Einfluss der Verd nner auf die Viabilit t im Zeitverlauf 136 4 3 2 1 Anteil lebender Samenzellen im Eosinausstrich 136 4 3 2 2 Mittels CASA gemessene Viabilit t 138 4 3 3 Einfluss der Verd nner auf den Anteil an morphologisch ver nderten Samenzellen im Zeitverlauf nn 140 4 3 4 Einfluss der Verdunner auf den Anteil an akrosomalen Ver nderungen im Zeitverlauf eeesssssnsnnnnnnnnnnnnnsnnnnnnnnnnnnnnn 144 4 4 Korrelationen der untersuchten Parameter nn 147 4 4 1 Zusammenhang zwischen den mittels Neubauer Z h
386. sch ver nderten Spermien im Zeitverlauf nachgewiesen wurden Es ist denkbar dass es bedingt durch die h here Viskosit t der glycerolhaltigen Verd nner zu einer vermehrten Agglutination der Spermien im Eosinausstrich wie sie von Burgess et al 2001 beschrieben wurde kam Bei getrennter Betrachtung der einzelnen morphologischen Ver nderungen fiel auf dass es im Zeitverlauf in fast allen verd nnten Ejakulaten zu einem signifikanten Anstieg des Anteils an Schwanzveranderungen kam Dies ist z T bereinstimmend mit Tsutsui et al 2003b welche mittels Rose Bengal F rbung nachweisen konnten dass in verd nntem Sperma vor allem die Ver nderungen an Mittelstuck und Schwanz der Samenzellen ansteigen W hrend an Tag O 207 Diskussion bereits in den mit CP TE und Up1 verd nnten Ejakulaten eine signifikante Zunahme des Anteils an Samenzellen mit schleifenformigen Schwanzen im Vergleich zum Nativsperma zu erkennen war siehe Kap 5 3 2 4 so konnte im Zeitverlauf dann in allen verdunnten Ejakulaten eine signifikanten Zunahme des Anteils an schleifenformigen Schw nzen beobachtet werden Die Anteile an aufgerollten Schw nzen und an Knickschw nzen zeigten demgegen ber nur teilweise einen signifikanten Anstieg Diese Beobachtungen k nnten darauf hindeuten dass es durch die Fl ssigkonservierung bevorzugt Zu Schwanzver nderungen in Form von schleifenf rmigen Schw nzen kommt 5 3 3 4 Akrosomale Ver nderungen Die Integri
387. schiede zu den mit TE und Up1 2 aufgearbeiteten Ejakulaten ermittelt werden Hingegen lie sich zwischen den mit CP und den mit Up 1 aufgearbeiteten Ejakulaten ein signifikanter Niveauunterschied nachweisen Pvera 0 021 auch wenn die Zeitverl ufe keinen signifikanten Unterschied zeigten Dabei konnten in den mit CP verd nnten Proben bis einschlie lich Tag 3 h here durchschnittliche Anteile an Samenzellen mit Kopfkappenver nderungen beobachtet werden als in den mit Up 1 verd nnten Proben Ab Tag 5 waren dann die durchschnittlichen Anteile in den mit CP verd nnten Proben stets niedriger als in den mit Up 1 verd nnten Proben Zwischen den mit TE und Up 1 2 sowie zwischen den mit TE und Up 1 aufgearbeiteten Ejakulaten konnten bez glich des Anteils an Kopfkappenver nderungen keine signifikanten Unterschiede ermittelt werden Bei gesonderter Betrachtung der einzelnen auftretenden Kopfkappen ver nderungen abgel ste Kopfkappen schiefe Kopfkappen sonstige 145 Ergebnisse Ver nderungen konnten f r den Anteil an abgel sten Kopfkappen Uber den Untersuchungszeitraum in den mit CP TE und Up1 verd nnten Ejakulaten signifikante Zunahmen nachgewiesen werden pzeit 0 0018 bis lt 0 0001 Zudem unterschieden sich die Zeitverl ufe zwischen den mit CP und den mit TE verd nnten Ejakulaten pw 0 0068 sowie zwischen den mit CP und den mit Up 1 verd nnten Ejakulaten pw 0 038 bez glich des Anteils an abgel sten Kopfkappen signif
388. schieden sich jedoch nicht signifikant Dabei war der durchschnittliche Anteil an schleifenf rmigen Schwanzen im Zeitverlauf in den mit CP verd nnten Proben geringer als in den mit TE verd nnten Proben aber h her als in den mit Up 1 2 verd nnten Proben Auch in den mit TE verd nnten Proben war der mittlere Prozentsatz an schleifenf rmigen Schw nzen im Zeitverlauf h her als in den mit Up 1 2 verd nnten Proben und lag ebenso ber dem in den mit Up 1 verd nnten Proben Bei Betrachtung des Anteils an losen K pfen konnten in den mit TE und Up 1 aufgearbeiteten Ejakulaten signifikante Abnahmen im Zeitverlauf nachgewiesen werden pzeit 0 0004 Zwischen den mit den verschiedenen Verd nnern aufgearbeiteten Ejakulaten untereinander bestanden bez glich des Anteils an losen K pfen keine signifikanten Unterschiede Der Prozentsatz an Plasmatropfen zeigte ber den Untersuchungszeitraum in den mit Up 1 verd nnten Ejakulaten eine signifikante Zunahme pzeit 0 013 Zudem bestand ein signifikanter Niveauunterschied zwischen den mit CP und den mit Up 1 verd nnten Ejakulaten Pvera 0 032 wobei die Zeitverl ufe sich allerdings nicht signifikant unterschieden Dabei war der durchschnittliche Prozentsatz an Plasmatropfen in den mit CP verd nnten Proben niedriger als in den mit Up 1 verd nnten Proben Eine ausf hrliche Darstellung der Ergebnisse der zweifaktoriellen Varianzanalysen mit Messwiederholungen bez glich der Faktoren Verd nn
389. schwindigkeit gemessen Uber die tatsachlich zuruckgelegte Punkt zu Punkt Bahn der Samenzelle in um s darstellt Verstegen et al 2002 Rijsselaere et al 2003 die mittlere Geschwindigkeit VAP velocity average pathway welche der mittleren Geschwindigkeit ber die geglattete Bahn in um s entspricht Verstegen et al 2002 Rijsselaere et al 2003 die lineare Geschwindigkeit VSL velocity straight line welche die durchschnittliche Geschwindigkeit gemessen ber eine gerade Linie vom Anfang zum Ende der Bahn in um s repr sentiert Verstegen et al 2002 Rijsselaere et al 2003 die kurvilineare Strecke DCL distance curved line welche die tats chliche Distanz ist die das Spermium w hrend der Analyseperiode zur ckgelegt hat in um Sch fer Somi und Aurich 2007 die Durchschnittsstrecke DAP distance average path welches die gemessene Distanz ist wenn eine gegl ttete Linie als Referenz genutzt wird in um Sch fer Somi und Aurich 2007 die geradlinige Strecke DSL distance straight line welche die Distanz von dem Punkt an dem sich die Samenzelle zu Beginn der Analyse befand zu der Lokalisation der Zelle im letzten Bild der Analyse in einer geraden Linie darstellt in um Sch fer Somi und Aurich 2007 29 Literatur die durchschnittliche seitliche Kopfauslenkung ALH amplitude of lateral head displacement welche die mittlere Weite der Kopfoszillation der Spermien wahrend des Schwimmens angibt in um Ver
390. sprophylaxe kann zuvor noch eine geeignete keimhemmende Salbe z B Akridinsalbe auf die Penisschleimhaut aufgetragen werden Pesch et al 2007 Kutzler 2005 empfiehlt das Auftragen eines nichtspermiziden wasserl slichen Gleitgels auf die Penisschleimhaut insbesondere im Bereich hinter dem Bulbus glandis um einer Inversion des Pr putiums vorzubeugen Die manuelle Stimulation induziert sowohl die Paarungsreflexe als auch einen geordneten Ejakulationsablauf G nzel 1986 Die einzelnen Fraktionen k nnen hierbei durch Auswechseln der Samenauffanggl ser bei makroskopisch sichtbarer Konsistenz und Farb nderung des Sekrets einfach und pr zise getrennt werden Christiansen 1984b G nzel 1986 Das Ejakulat des Hundes besteht aus drei Fraktionen Erste spermienarme Fraktion zweite spermienreiche Fraktion und dritte Fraktion Prostatasekret Seager und Platz 1977b Christiansen 1984b Kutzler 2005 Die erste Fraktion ist w ssrig stammt von der Prostata und hat i d R ein Volumen von 1 5 ml Ihre Abgabe dauert etwa 0 5 bis 1 Minute Die zweite Fraktion ist milchig wei misst 1 3 ml enth lt den Hauptanteil an Spermien und wird innerhalb von 1 bis 2 Minuten abgegeben Die dritte Fraktion kommt von der Prostata und stellt den Hauptanteil des Ejakulates dar Ihr Volumen kann bei gro en Rassen bis zu 30 40 ml betragen Dieses wird innerhalb von 5 Minuten bis zu 1 Stunde abgegeben Linde Forsberg 1991 1995 F r die KB und d
391. ssenschaftlicher Praxis niedergelegt sind eingehalten Daniela Klaus ee ae VVB LAUFERSWEILER VERLAG VVB LAUFERSWEILER VERLAG TIER III TT IE 111011 TT STAUFENBERGRING 15 ISBN 978 3 8359 5924 8 D 35396 GIESSEN Tel 0641 5599888 Fax 5599890 redaktion doktorverlag de 9117838351959 248 www doktorverlag de Cover photo front biglama cover photo back Kitty Fotolia com
392. ssert sich die Konzeptionsrate mit steigender Anzahl an Besamungen G nzel 1986 Linde Forsberg und Forsberg 1989 1993 Thomassen et al 2001 sodass G nzel 1986 eine zweimalige Besamung im Abstand von 48 Stunden bei Verwendung von Frischsperma bzw im Abstand von 24 Stunden bei fl ssig oder kryokonserviertem Sperma empfiehlt Bei zweimaliger Insemination am optimalen Besamungszeitpunkt unterscheiden sich die Konzeptionsraten nicht signifikant 79 3 versus 76 8 allerdings ist die Wurfgr e bei zweimaliger Besamung h her Thomassen et al 2006 Die Erfolgsquoten der KB beim Einsatz von frischem oder fl ssigkonserviertem Sperma k nnen denen eines nat rlichen Deckaktes entsprechen Pinto et al 1999 was auch aus der nachfolgenden tabellarischen bersicht der Konzeptionsraten ersichtlich wird Tab 1 Zudem ist erkennbar dass mit fl ssigkonserviertem Sperma auch bei vaginaler Deponierung des Samens die Tr chtigkeitsraten akzeptabel bleiben Rota et al 1995 Wichtig ist bei der Interpretation der Daten zu beachten dass es zwischen den einzelnen Studien signifikante Unterschiede bez glich der eingesetzten Samen bertragungstechnik der verwendeten Besamungsdosis sowie der H ufigkeit der Inseminationen gibt Silva et al 1996 England und Millar 2008 und in vielen Arbeiten nur eine geringe Anzahl an H ndinnen verwendet wurde England und Millar 2008 10 Literatur Tab 1 Vergleichende Darstellung der Konz
393. ssisted sperm analysis CASA SpermVision System gemessene Viabilitat nach SYBR 14 Pl Farbung in den verschiedenen Verdunnern im Zeitverlauf der Flussigkonservierung bei 4 C uber zehn Ver nderungen des prozentualen Anteils an morphologisch ver nderten Samenzellen Eosinausstrich in den verschiedenen Verd nnern im Zeitverlauf der Fl ssigkonservierung bei 4 C ber zehn Ver nderungen des prozentualen Anteils an Samenzellen mit Kopfkappenver nderungen Spermac F rbung in den verschiedenen Verd nnern im Zeitverlauf der Fl ssigkonservierung bei 4 C ber zehn 285 Anhang Abb 20 Abb 21 Abb 22 Korrelation zwischen den mittels Neubauer Zahlkammer bestimmten und den durch Computer assisted sperm analysis CASA SpermVision System gemessenen Dichten in den Nativejakulaten und in allen verd nnten Ejakulaten u ssnn nennen 148 Korrelation zwischen der gesch tzten Vorw rtsbeweglichkeit unter dem Phasenkontrastmikroskop und der mittels Computer assisted sperm analysis CASA SpermVision System gemessenen Vorw rts beweglichkeit in den Nativejakulaten und in allen verd nnten Ejakulaten zu allen Untersuchungszeitpunkten uuuusr224424nnnnnnnennnnenn nenne 150 Korrelation zwischen dem im Eosinausstrich bestimmten Anteil lebender Spermien und der durch Computer assisted sperm analysis CASA SpermVision System ermittelten Viabilitat nach SYBR 14 PI F rbung in de
394. stegen 2001b Die Beurteilung des akrosomalen Status der Samenzellen erfolgte in der vorliegenden Arbeit nach Spermac F rbung Diese erwies sich nach Oettle 1986 als vorteilhaft um Ver nderungen am Akrosom zu erfassen welche w hrend des Verarbeitungsprozesses bei der Konservierung von caninem Sperma auftreten k nnen Tendenziell war in den mit CP TE und Up 1 2 verd nnten Ejakulaten eine Zunahme des Anteils an Kopfkappenver nderungen sowie des Anteils an abgel sten Akrosomen zu erkennen w hrend in den mit Up1 verd nnten Ejakulaten beide Anteile nahezu konstant blieben Signifikante Unterschiede der einzelnen Verd nner zum Nativsperma lie en sich nur f r die Verd nner CP und TE bez glich des Anteils an Kopfkappenver nderungen nachweisen jeweils mit p lt 0 05 Zwischen den verschiedenen Verd nnern untereinander konnten keine signifikanten Unterschiede ermittelt werden 190 Diskussion Tendenzielle Zunahmen des Anteils an akrosomalen Veranderungen durch die Verd nnerzugabe konnten auch von Rota et al 1995 nachgewiesen werden Nach Burgess et al 2001 verursacht die Zugabe eines glycerolhaltigen TRIS Fruktose Eigelb Verd nners jedoch keine signifikanten unmittelbaren oder verz gerten ultrastrukturellen Ver nderungen der Samenzellen wohingegen die anschlie ende K hlung in einem unmittelbaren Anstieg der Anzahl an transmissionselektronenmikroskopisch erkennbaren akrosomalen Ver nderungen resultiert Weitere I
395. stegen et al 2002 Rijsselaere et al 2003 die beat cross frequency BCF welches die Frequenz in Hertz Hz ist mit der die K pfe der Samenzellen die gemittelte Bahn der Spermien kreuzen Verstegen et al 2002 Rijsselaere et al 2003 der durchschnittliche Richtungswechsel des Kopfes AOC average orientation change welches die durchschnittliche Gradzahl ist die der Spermienkopf sich wahrend der Analyse von links nach rechts bewegt hat AOC lt 9 5 zeigt an dass Spermien passiv bewegt werden oder immotil sind Schafer Somi und Aurich 2007 die Geradlinigkeit STR straightness welche der durchschnittliche Wert des Verhaltnisses VSL VAP in Prozent ist diese Geradlinigkeit schatzt die Nahe des zuruckgelegten Weges der Samenzelle zu einer geraden Linie mit dem Hintergrund dass 100 die optimale Geradlinigkeit darstellen Verstegen et al 2002 Rijsselaere et al 2003 die Linearit t LIN linearity welche der durchschnittliche Wert des Verh ltnisses VSL VCL in Prozent ist die Linearit t beschreibt die N he der Bewegungsbahn zu einer geraden Linie Verstegen et al 2002 Rijsselaere et al 2003 Die Parameter DCL VCL DAP VAP DSL VSL ALH BCF und AOC sind nachfolgend zum besseren Verst ndnis schematisch dargestellt Abb 2 30 Literatur Abb 2 Schematische Abbildung der verschiedenen durch Computer assisted sperm analysis Systeme gemessenen Motilit tsparameter die fortlaufend nummerierte
396. stellung bei Motilitatsanalyse Volumen pro Messkammer Analysetemperatur Framerate Bildfrequenz Volumen von SYBR 14 PI pro Tube Inkubationszeit 9 3 Verbrauchsmaterialien STR gt 0 9 und LIN gt 0 5 Darstellungsfarbe hellgr n STR 0 9 und LIN lt 0 5 Darstellungsfarbe hellblau DAP Radius23 und LIN lt 0 5 Darstellungsfarbe wei 20 um 108 zu 100 gr ne Fl che 20 bis 600 um rote Fl che 10 bis 800 um gr n 150 um rot 200 um 4000 Spermien oder 30 Felder hellblau gelb 15 80 bis 110 2 5 ul 37 C 60 Frames s 2 5 ul 10 Minuten Leja Standard Count 4 Chamber Slide 20 um Leja Products B V Pipettenspitzen 10 ul farblos Pipettenspitzen 200 ul gelb Pipettenspitzen 1000 ul blau bioclean Precision Pipette Tips 252 Sarstedt AG amp Co Sarstedt AG amp Co Sarstedt AG amp Co Rainin Instrument LLC Anhang Objekttrager 76x26x1 mm Kanten geschnitten ohne Mattrand Interessengemeinschaft der Laborfachhandler GmbH amp Co KG Deckglaser 18x18 mm Karl Hecht GmbH amp Co KG pH Indikatorpapier pH 5 4 7 0 Spezialindikator Merck KGaA Parafilm Pechiney Plastic Packaging Safe Lock Tubes a 0 5 ml braun Eppendorf AG Eppendorf Reaktionsgef e a 1 5 ml Eppendorf AG BRAUN Injekt 5 ml Einwegspritzen B Braun Melsungen AG BD Falcon Konisches R hrchen 15 ml BD 9 4 Chemikalien Citronens ure Monohydrat krist Reinst M
397. strich bestimmt Daneben wurde nach SYBR 14 PI F rbung die Viabilitat durch CASA ermittelt 150 Ergebnisse 4 4 3 1 Korrelationen nach Verd nnern getrennt Tab 22 gibt die Resultate der Korrelationsanalysen zur Untersuchung des Zusammenhanges zwischen dem im Eosinausstrich bestimmten Anteil lebender Spermien und der durch CASA ermittelten Viabilit t nach SYBR 14 PI F rbung wieder Tab 22 Korrelationen zwischen dem im Eosinausstrich bestimmten Anteil lebender Spermien und der mittels CASA SpermVision System ermittelten Viabilitat nach SYBR 14 Pl Farbung in den Nativejakulaten und in den mit den verschiedenen Verd nnern aufgearbeiteten Ejakulaten n Anzahl der getesteten zeitgleichen Variablenpaare r Korrelationskoeffizient nach Pearson p p Wert Verdunner n r p keiner Nativsperma 30 0 476 0 008 CP 210 0 778 lt 0 001 TE 210 0 740 lt 0 001 Up1 2 84 0 778 lt 0 001 Up 1 126 0 612 lt 0 001 In den Nativejakulaten und in den mit den verschiedenen Verd nnern aufgearbeiteten Ejakulaten konnten statistisch signifikante Zusammenh nge zwischen dem im Eosinausstrich bestimmten Anteil lebender Spermien und der durch CASA ermittelten Viabilit t nach SYBR 14 Pl F rbung nachgewiesen werden 4 4 3 2 Korrelation ohne Trennung nach Verdunnern Der Zusammenhang zwischen dem im Eosinausstrich bestimmten Anteil lebender Spermien und der durch CASA ermittelten Viabilit t nach SYBR 14
398. t Ein Spermium galt als vorw rtsbeweglich wenn es mindestens zwei Drittel des Gesichtsfeldes mehr oder weniger linear durchquerte Hoffmann 2003b Es wurden mehrere Gesichtsfelder im Zentrum des Spermatropfens beurteilt und anschlie end der prozentuale Anteil vorw rtsbeweglicher Samenzellen an der Gesamtheit der Samenzellen gesch tzt F r alle weiteren Untersuchungen fand nur die zweite spermienreiche Fraktion Verwendung w hrend die erste sowie die dritte Fraktion verworfen wurden Ausnahmen bildeten die Hunde Nr 5 und Nr 10 bei denen aufgrund ungenauer Fraktionierung und zwecks Volumenvergr erung die erste und die zweite Fraktion gepoolt und dann zusammen weiterverarbeitet wurden b Lebend Tot F rbung Die Lebend Tot F rbung Supravitalf rbung zur Ermittlung des Verh ltnisses lebender zu toter Samenzellen erfolgte mittels Eosinausstrich Dazu wurde mithilfe einer Eppendorf Pipette Eppendorf AG Hamburg ein 10 ul gro er Tropfen Sperma auf einen auf 37 C vorgew rmten Objekttr ger gegeben dann ein doppelt so gro er Tropfen der Eosin F rbel sung Rezept siehe Kap 9 5 3 1 daneben gegeben durch mehrmaliges vorsichtiges Hin und her Schwenken f r 20 Sekunden miteinander vermischt und dann auf einem weiteren ebenfalls angew rmten Objekttr ger in einem Zug ausgestrichen Der Ausstrich wurde anschlie end luftgetrocknet Bei toten Spermien ist die Plasmamembran permeabel f r den Farbstoff Eosin Im Eosinausstrich rotg
399. t rksten Abnahmen der durchschnittlichen Motilit tswerte in den mit Up 1 2 verd nnten Ejakulaten beobachtet werden jedoch waren die Abnahmen nicht signifikant was den Beobachtungen von Koderle et al 2009 entspricht Im Gegensatz dazu kam es jedoch in den mit Up 1 verd nnten Ejakulaten zu einer signifikanten Reduktion der subjektiv gesch tzten Vorwartsbeweglichkeit im Vergleich mit dem Nativsperma Die in allen verd nnten Ejakulaten unmittelbar nach dem Verd nnen beobachteten signifikanten Abnahmen der Mittelwerte f r die Geschwindigkeitsparameter VAP VCL und VSL sowie f r den Parameter ALH waren ebenfalls in den mit Up1 2 verd nnten Ejakulaten am st rksten ausgepr gt Zudem konnten in den mit Up 1 2 verd nnten Proben signifikant niedrigere Werte f r VAP VCL und ALH gemessen werden als in den mit CP und TE verd nnten Proben Eine m gliche Erkl rung f r die tendenziell st rkeren Motilit tsabnahmen im Verd nner Up 1 2 im Vergleich zu den anderen Verd nnern ist dass die mit Up 1 2 verd nnten Proben vor der Beurteilung der Motilitat im Rahmen der quilibrierungsphase bereits auf 4 C abgek hlt worden waren was zu K hlsch den verursacht durch den sog K lteschock Hoffmann 2003d gef hrt haben k nnte welche sich zum Zeitpunkt der Untersuchung bereits in einer Motilit tsreduktion widerspiegelten Dies ist bereinstimmend mit Weitze und Petrunkina 2007 welche die Verminderung der Motilitat als einen wich
400. t t des Akrosoms ist wesentlich f r den Befruchtungsvorgang Iguer Ouada und Verstegen 2001b In fl ssigkonserviertem Sperma erreicht der Prozentsatz an akrosomreagierten Spermien in caninem Kapazitationsmedium sein Maximum fr her als in nativem Sperma weshalb es wahrscheinlich ist dass die Spermalagerung bei 5 C die AR initiiert bzw triggert was jedoch nicht auf eine Beeintr chtigung der Befruchtungsf higkeit der Samenzellen hinausl uft Kumi Diaka und Badtram 1994 Demgegen ber kann nach Iguer Ouada und Verstegen 2001b eine Aktivierung der AR w hrend der Fl ssigkonservierung zu einer schnellen Verminderung der Fertilitat des Spermas f hren Eigelb als Verd nnerbestandteil scheint die Samenzellen gegen eine spontane AR zu sch tzen wobei der Mechanismus durch den Eigelb das Akrosom stabilisiert unklar ist M glicherweise handelt es sich um einen direkten protektiven Effekt auf die akrosomale Membran Iguer Ouada und Verstegen 2001b Aufgrund des fehlenden Zusammenhangs zwischen Motilitat und akrosomaler Integrit t in verd nnten Ejakulaten Oettl 1986 sollte letztere zur Beurteilung der Qualit t von fl ssigkonserviertem Sperma stets gesondert untersucht werden W hrend der Anteil an Samenzellen mit abgel stem Akrosom in unverd nntem Sperma bei einer Lagerung bei 4 C rapide ansteigt und nach vier Tagen einen durchschnittlichen Wert von 17 8 erreicht kommt es in verd nntem Sperma nur zu einem allm hlichen Anstie
401. t 0 05 TE mit p lt 0 05 Up1 2 mit p lt 0 01 jedoch nicht untereinander F r alle genannten morphologischen Ver nderungen waren die Prozents tze in den verd nnten Ejakulaten geringer als im Nativsperma Zwischen dem Nativsperma den mit CP TE und Up1 verd nnten Ejakulaten konnte mittels einfaktorieller Varianzanalyse kein signifikanter Unterschied des prozentualen Anteils an morphologisch ver nderten Spermien nachgewiesen werden n 18 p 0 18 Bei Betrachtung der einzelnen auftretenden morphologischen Veranderungen konnten in der einfaktoriellen Varianzanalyse jedoch signifikante Unterschiede zwischen dem Nativsperma den mit CP TE und Up 1 aufgearbeiteten Ejakulaten bez glich des Anteils an Knickschwanzen n 18 p 0 0001 und des Anteils an schleifenf rmigen Schw nzen n 18 p 0 012 ermittelt werden Diese erwiesen sich im Student Newman Keuls Test als signifikante Unterschiede zwischen dem Nativsperma und den mit CP den mit TE sowie den mit Up 1 verd nnten Proben f r den Anteil an Knickschw nzen jeweils mit p lt 0 01 und als signifikante Unterschiede zwischen dem Nativsperma und den mit CP den mit TE sowie den mit Up1 verd nnten Proben f r den Anteil an schleifenf rmigen Schw nzen jeweils mit p lt 0 05 Dabei war der Prozentsatz an Knickschwanzen in den verd nnten Ejakulaten stets geringer als im Nativsperma der Anteil an schleifenf rmigen Schw nzen jedoch stets h her Bei keiner der genannten pathologischen V
402. t TE verd nnten Ejakulaten jedoch zu den mit Up1 2 und Up1 verd nnten Ejakulaten jeweils mit Pverd lt 0 0001 Der Zeitverlauf der mit CP verd nnten Ejakulate unterschied sich signifikant von den Zeitverl ufen der mit TE Up1 2 und Up1 verd nnten Ejakulate jeweils mit pw lt 0 0001 Bis einschlie lich Tag 2 lie en sich in den mit Up 1 verd nnten Proben h here Werte ermitteln als in den brigen Proben Weiterhin lag die durchschnittliche CASA Gesamtmotilit t in den mit TE verd nnten Proben bis einschlie lich Tag 3 ber der in den mit CP und Up 1 2 verd nnten Proben Ab Tag 3 konnten dann in den mit CP verd nnten Proben stets h here Werte bestimmt werden als in den mit TE Up1 2 und Up1 verd nnten Proben Die mit TE aufgearbeiteten Ejakulate wiesen bez glich der CASA Gesamtmotilitat ebenso einen signifikanten Niveauunterschied zu den mit Up 1 2 Pvera lt 0 0001 und Up 1 Pvera 0 0003 aufgearbeiteten Ejakulaten auf und auch der Zeitverlauf der mit TE aufgearbeiteten Ejakulate unterschied sich signifikant von den Zeitverl ufen der mit Up1 2 und Up1 aufgearbeiteten Ejakulate jeweils mit pw lt 0 0001 Ab Tag 3 waren die Mittelwerte in den mit TE verd nnten Proben stets h her als die in den mit Up 1 2 und Up 1 verd nnten Proben Eine ausf hrliche Darstellung der Resultate der zweifaktoriellen Varianzanalysen mit Messwiederholungen bez glich der Faktoren Verd nner und Zeit in denen jeweils zwei Verdunner bez
403. t wird Dies steht im Gegensatz zu den Beobachtungen von Iguer Ouada und Verstegen 2001b welche beim Vergleich von TRIS Fruktose Eigelb und TRIS Glukose Eigelb Verd nner signifikant bessere Motilitatsergebnisse f r den TRIS Glukose Eigelb Verd nner feststellen konnten Die Autoren vermuten dass die bessere Erhaltung der Motilit t im TRIS Glukose Eigelb Verd nner durch das Energiesubstrat Glukose anstelle von Fruktose bedingt war da dies den einzigen Unterschied zwischen den Verd nnern darstellte Die Ergebnisse deuten m glicherweise auf eine Pr ferenz von Hundespermien Glukose anstelle von Fruktose zu metabolisieren hin lguer Ouada und Verstegen 2001b Letzteres konnte auch von Ponglowhapan et al 2004 beobachtet werden Ein denkbarer Erkl rungsansatz f r die Glukosepr ferenz ist die h here Kapazit t des Glukosetransportsystems Ponglowhapan et al 2004 Im Gegensatz zu Iguer Ouada und Verstegen 2001b ermittelten Ponglowhapan et al 2004 dennoch in fruktosehaltigen TRIS Eigelb Verd nnern h here Gesamtmotilitatswerte als in glukosehaltigen oder in Fruktose und Glukose enthaltenden TRIS Eigelb Verd nnern Da in der vorliegenden Arbeit der Glukose und Fruktose enthaltende Verd nner CP signifikant bessere Ergebnisse lieferte als der fruktosehaltige Verd nner TE k nnen die Beobachtungen von Ponglowhapan et al 2004 nicht best tigt werden Da im Verd nner CP jedoch auch herstellereigene unbekannte Bestandteile entha
404. t zum paarweisen Vergleich der Mittelwerte QUTCHGSIUNEL EL A 272 CASA Motilitatsparameter DAP DCL DSL VAP VCL VSL ALH BCF STR LIN und WOB n x SD Min Max in den verschiedenen Verd nnern im Zeitvellauf ansssinia na 273 Resultate der zweifaktoriellen Varianzanalysen mit Messwiederholungen bez glich der Faktoren Verd nner und Zeit zum Vergleich der Verd nner CP und TE im Zeitverlauf Tag 0 10 der Fl ssigkonservierung bei 4 C f r 10 Tage n 30 279 289 Anhang Tab A11 Tab A12 Tab A13 Tab A14 Resultate der zweifaktoriellen Varianzanalysen mit Messwiederholungen bez glich der Faktoren Verd nner und Zeit zum Vergleich der Verd nner CP und Up 1 2 im Zeitverlauf Tag 0 10 der Fl ssigkonservierung bei 4 C f r 10 Tage n 12 280 Resultate der zweifaktoriellen Varianzanalysen mit Messwiederholungen bez glich der Faktoren Verd nner und Zeit zum Vergleich der Verd nner CP und Up 1 im Zeitverlauf Tag 0 10 der Fl ssigkonservierung bei 4 C f r 10 Tage n 18 281 Resultate der zweifaktoriellen Varianzanalysen mit Messwiederholungen bez glich der Faktoren Verd nner und Zeit zum Vergleich der Verd nner TE und Up 1 2 im Zeitverlauf Tag 0 10 der Fl ssigkonservierung bei 4 C f r 10 Tage n 12 282 Resultate der zweifaktoriellen Varianzanalysen mit Messwiederholungen bez glich der Faktoren Verd
405. tabolismus abh ngig ist Jeyendran et al 1984 Kumi Diaka 1993 Obwohl England und Plummer 1993 keine Korrelation zwischen dem HOS Test und der Motilitat verifizieren konnten gelang 215 Diskussion der Nachweis signifikanter positiver Korrelationen zwischen dem HOS Test und der Spermienmotilitat subjektiv gesch tzte Gesamtmotilitat und subjektiv gesch tzte Vorw rtsbeweglichkeit bzw CASA Gesamtmotilit t und CASA Vorw rtsbeweglichkeit zahlreichen Autoren in nativem Kumi Diaka 1993 Kumi Diaka und Badtram 1994 Rodriguez Gil et al 1994 Pinto und Kozink 2008 in 24 Std bei 4 C gelagertem unverd nntem Rodriguez Gil et al 1994 in verd nntem Kumi Diaka und Badtram 1994 und in aufgetautem TG Sperma Rota et al 2006 Pinto und Kozink 2008 Auch der Anteil an lebenden Samenzellen im Eosinausstrich r 0 522 p lt 0 001 und die CASA Viabilit t r 0 724 p lt 0 001 waren negativ korreliert mit dem Anteil an Samenzellen mit nicht aufgerollter Gei el im HOS Test Dies best tigt sinngem die Ergebnisse von Rodriguez Gil et al 1994 welche f r natives Sperma sowie f r 24 Stunden bei 4 C gelagertes unverd nntes Sperma signifikante positive Korrelationen zwischen dem HOS Test Prozentsatz an geschwollenen Spermienschw nzen und der Viabilit t F rbung mit Trypanblau und Giemsa nachweisen konnten und ebenso die Ergebnisse von Pinto und Kozink 2008 welche f r natives sowie f r aufgetautes Sperma e
406. tat in den mit Up 1 flussigkonservierten Ejakulaten entspricht den Beobachtungen von Hermansson et al 2006 Als Ursache fur den anschlie enden Motilitatsabfall kommen sowohl wie bereits zuvor diskutiert das im Verd nner enthaltene Glycerol 3 als auch die Zentrifugation der Proben in Frage Allerdings bt der Zusatz von 3 Glycerol zum Verdunner nach Province et al 1984 keinen Einfluss auf die Motilit t aus Die Aussagen zum Einfluss der Zentrifugation reichen von keine ung nstige Auswirkung G nzel 1986 bzw keine Beeinflussung Rijsselaere et al 2002a bis motilit tsreduzierend Sch fer Somi et al 2006 W hrend Koderle et al 2009 bei verd nnten Ejakulaten vor dem Einfrieren keine signifikanten Unterschiede bez glich der Motilit t zwischen zentrifugierten und 199 Diskussion nicht zentrifugierten Proben finden konnten wiesen sie jedoch nach dem Auftauen eine signifikant st rkere Motilitatsreduktion infolge der Zentrifugation nach Aufgrund dessen lassen sich auch bei der Fl ssigkonservierung verz gerte Effekte der Zentrifugation auf die Motilit t nicht ausschlie en Ursachen f r den nachteiligen Einfluss der Zentrifugation auf die Spermaqualit t nach dem Auftauen k nnten die mit der Zentrifugation einhergehende Entfernung von protektiven Seminalplasmaproteinen aus den Ejakulaten oder mechanische Sch digungen durch die Zentrifugationskraft an sich sein Koderle et al 2009 In dieser A
407. teilig bei fl ssigkonserviertem Sperma ist neben der begrenzten Lebensdauer der konservierten Samenzellen England und Ponzio 1996 Shahiduzzaman und Linde Forsberg 2007 Nizanski 2009 vor allem der organisatorische Aufwand Linde Forsberg 1991 So m ssen kurzfristig der Rudenbesitzer der die Spermagewinnung durchf hrende Tierarzt der H ndinnenbesitzer und der die KB ausf hrende Tierarzt verf gbar sein Linde Forsberg 1991 Ein entscheidender Vorteil der Kryo gegen ber der Fl ssigkonservierung ist darin zu sehen dass durch das Tiefgefrieren von Sperma die M glichkeit der Konservierung und Lagerung wertvoller Gene m nnlicher Tiere in Form von Samenbanken f r nahezu unendliche Zeit besteht Linde Forsberg 1991 Pena et al 2006 England und Millar 2008 Nachteilig an der Kryokonservierung ist der erh hte materielle und personelle Aufwand der die Durchf hrung der Kryokonservierung auf eine limitierte Anzahl an Tier rzten begrenzt Linde Forsberg 1991 Die Tatsache dass kryokonservierter Samen in fl ssigem Stickstoff als Gefahrengut transportiert werden muss kann durch Nutzung eines sogenannten Dry Shippers dessen Containerw nde den Stickstoff absorbieren und so ein Austreten unm glich machen umgangen werden Linde Forsberg 1991 Ein weiterer Nachteil ist dass die Besamungstechnik die bei gefrorenem Samen angewendet wird wesentlich schwieriger ist als die die bei frischem Samen genutzt wird Linde Forsberg 199
408. teng nstiger Linde Forsberg 1991 2001 Pe a et al 2006 Die Literaturrecherche hat gezeigt dass bereits viele verschiedene Verd nner f r die Fl ssigkonservierung von caninem Sperma getestet wurden Concannon und Battista 1989 Linde Forsberg 1991 Pena et al 2006 Dabei sind die am h ufigsten verwendeten Medien milch oder eigelbbasierte Verd nner mit unterschiedlichen Variationen Pinto et al 1999 In vergleichenden Studien wurden verschiedene nichtkommerzielle selbst im Labor hergestellte und z T 156 Diskussion auch kommerzielle Verd nner hinsichtlich ihrer Eignung f r die Fl ssigkonservierung von Hundesperma untersucht Bartlett 1962a Foote und Leonard 1964 Province et al 1984 Bouchard et al 1990 Rota et al 1995 Iguer Ouada und Verstegen 2001b Tsutsui et al 2003b Hermansson und Linde Forsberg 2006 Shahiduzzaman und Linde Forsberg 2007 Beccaglia et al 2009a Kmenta et al 2011 In vielen der genannten Publikationen fanden TRIS gepufferte Eigelb Verd nner Verwendung was auf die Bedeutung dieser Verd nner hinweist Tats chlich ist einer der derzeit gebr uchlichsten Verd nner ein TRIS gepufferter Eigelb Verd nner mit 20 Eigelb und entweder Glukose oder Fruktosezusatz Iguer Ouada und Verstegen 2001b Hermansson und Linde Forsberg 2006 G nzel Apel 2007 Pesch et al 2007 Neuere Arbeiten besch ftigen sich hingegen mit TRIS Lecithin Verd nnern Beccaglia et al 20098 Km
409. ter Milliarden Anzahl Non Fat Dried Milk Solid Glucose Verd nner Nummer nicht signifikant Hyperoxidanionen einfach negativ geladene radikalische Sauerstoffionen p value von probability engl fur Wahrscheinlichkeit p Wert Signifikanzwert p Wert f r Haupteffekt Verd nner p Wert f r Haupteffekt Zeit p Wert f r Wechselwirkung phosphate buffered saline engl f r phosphatgepufferte Salzl sung negativer dekadischer Logarithmus der Wasserstoffionen Konzentration Abkurzungsverzeichnis PI pK ROS SD SDS SF SGZ STR Tab TALP TES TG Sperma TRIS TE Up 1 Up1 2 VAP VCL Vol VSL WOB xI XI XI Propidiumiodid negativer dekadischer Logarithmus der S urekonstante Korrelationskoeffizient nach Pearson reactive oxygen species engl f r reaktive oxidative Substanzen bzw reaktive Sauerstoffspezies standard deviation engl f r Standardabweichung sodiumdodecyl lauryl sulfate engl fur Natriumdodecyl lauryl sulfat Streufaktor Spermiengesamizahl VSL VAP straightness engl fur Geradlinigkeit Tabelle Tyrode s Albumin Lactat Pyruvat N Tris hydroxymethyl methyl 2 aminoethansulfonsaure Tiefgefriersperma Tris hydroxymethyl aminomethan TRIS Fruktose Eigelb Verd nner Uppsala Equex 2 System nur Verd nner 1 Uppsala Equex 2 System Verd nner 1 und Verd nner 2 velocity average path way engl f r mittlere Geschwindigkeit Geschwindigkeit be
410. teraturverzeichnis Iguer Ouada M Verstegen J P 2001b Long term preservation of chilled canine semen Effect of commercial and laboratory prepared extenders Theriogenology 55 2 671 684 Iguer Ouada M Verstegen J P 2001c Validation of the sperm quality analyzer SQA for dog sperm analysis Theriogenology 55 5 1143 1158 Jeyendran R S Van der Ven H H Perez Pelaez M Crabo B G Zaneveld L J D 1984 Development of an assay to assess the functional integrity of the human sperm membrane and its relationship to other semen characteristics J Reprod Fertil 70 1 219 228 Jeyendran R S Van der Ven H H Zaneveld L J D 1992 The hypoosmotic swelling test An update Arch Androl 29 2 105 116 Johnston S D 1991 Performing a complete canine semen evaluation in a small animal hospital Vet Clin North Am Small Anim Pract 21 3 545 551 Kibble R M 1969 Artificial insemination in dogs Austr Vet J 45 4 194 199 Kmenta l Strohmayer C M ller Schl sser F Schafer Somi S 2011 Effects of a lecithin and catalase containing semen extender and a second dilution with different enhancing buffers on the quality of cold stored canine spermatozoa Theriogenology 75 6 1095 1103 Koderle M Aurich C Sch fer Somi S 2009 The influence of cryopreservation and seminal plasma on the chromatin structure of dog spermatozoa Theriogenology 72 9 1215 1220 Kumi
411. teren signifikanten Unterschiede feststellen 4 2 2 4 Weitere mittels CASA bestimmte Motilit tsparameter Im Folgenden werden weitere durch CASA SpermVision System bestimmte Motilit tsparameter Abk rzungen siehe Abk rzungsverzeichnis der 106 Ergebnisse Nativejakulate und der mit den verschiedenen Verdunnern aufgearbeiteten Ejakulate unmittelbar nach dem Verd nnen Tag 0 dargestellt Da das SpermVision System eine Vielzahl an Motilit tsparametern misst bzw errechnet sollen hier nur die Messergebnisse f r einige ausgew hlte Parameter VAP VCL VSL ALH BCF LIN wiedergegeben werden Eine ausf hrliche Darstellung der Messergebnisse f r alle CASA Motilitatsparameter DAP DCL DSL VAP VCL VSL ALH BCF STR LIN WOB der Nativejakulate und der mit den verschiedenen Verd nnern aufgearbeiteten Ejakulate unmittelbar nach dem Verd nnen Tag 0 findet sich im Anhang Tab A5 Kap 9 8 Bei den Streckenparametern DAP DCL DSL war im Vergleich mit dem Nativsperma in allen verd nnten Ejakulaten unmittelbar nach Zugabe der Verd nner eine Abnahme der durchschnittlich bestimmten Messwerte zu beobachten Dabei zeigten sich in mit CP verd nnten Proben f r alle drei Streckenparameter die geringsten und in mit Up 1 2 verd nnten Proben f r alle drei Parameter die st rksten Abnahmen F r die Geschwindigkeitsparameter VAP VCL VSL konnten die gleichen Beobachtungen gemacht werden Die nachstehenden Tabellen Tab
412. terschied zu den mit TE Pved 0 011 Up1 2 Pvera lt 0 0001 und Up1 Pverd 0 0001 aufgearbeiteten Ejakulaten und auch der Zeitverlauf der mit CP aufgearbeiteten Ejakulate unterschied sich signifikant von den Zeitverl ufen der mit TE Up1 2 und Up 1 aufgearbeiteten Ejakulate jeweils mit pw lt 0 0001 In den mit TE verd nnten Ejakulaten konnte wiederum ein signifikanter Niveauunterschied zu den mit Up 1 2 Pvera lt 0 0001 und Up 1 Pvera 0 0045 verd nnten Ejakulaten nachgewiesen werden Weiterhin zeigte der Zeitverlauf der mit TE verd nnten Ejakulate einen signifikanten Unterschied zu den Zeitverl ufen der mit Up1 2 und Up 1 verd nnten Ejakulate jeweils mit pw lt 0 0001 Insgesamt war die durchschnittliche CASA Vorw rtsbeweglichkeit in den mit CP und TE aufgearbeiteten Ejakulaten stets signifikant h her als in den mit Up1 2 aufgearbeiteten Ejakulaten Im Vergleich mit den mit Up1 aufgearbeiteten Ejakulaten lie en sich f r die durchschnittliche CASA Vorw rtsbeweglichkeit in den mit CP und TE aufgearbeiteten Ejakulaten anfangs niedrigere ab Tag 3 jedoch h here Werte nachweisen Die mit CP aufgearbeiteten Ejakulate zeigten ber den Zeitverlauf im Mittel signifikant h here Werte f r die CASA Vorw rtsbeweglichkeit als die mit TE aufgearbeiteten Ejakulate Eine ausf hrliche Darstellung der Ergebnisse der zweifaktoriellen Varianzanalysen mit Messwiederholungen bez glich der Faktoren Verd nner und Zeit in denen j
413. tersuchung Hierbei werden Volumen Farbe Konsistenz Geruch und etwaige Beimengungen beurteilt Hoffmann 2003b 16 Literatur a Volumen Volumen und SGZ der spermienreichen Fraktion sind von der K rpergr e des R den abh ngig G nzel 1986 Das Volumen des Gesamtejakulates variiert beim Hund von 0 5 bis 30 ml und ist abh ngig von der Menge an aufgefangenem Prostatasekret Soderberg 1986 Das Volumen ist bei dieser Spezies nicht mit der Spermaqualit t Johnston 1991 Root Kustritz 2007 oder der Fertilit t Soderberg 1986 korreliert Die Messung des Volumens ist Bestandteil der Berechnung der SGZ im Ejakulat welche ihrerseits einen Indikator der Spermaqualit t darstellt Root Kustritz 2007 b Farbe Physiologischerweise ist Hundesperma wei Seager und Platz 1977b Soderberg 1986 Johnston 1991 Sperma mit gelber F rbung deutet i d R auf eine Verunreinigung mit Urin hin Seager und Platz 1977b Soderberg 1986 welcher toxisch f r die Spermien ist Soderberg 1986 Auch Kontamination mit Eiter kann eine gelbliche Farbe verursachen Freshman 2002 Eine gr ne F rbung kann durch Kontamination mit Eiter Seager und Platz 1977b oder entz ndlichem Exsudat Johnston 1991 zustande kommen Sperma mit roter F rbung deutet im Allgemeinen auf frische Blutbeimengungen hin Seager und Platz 1977b Freshman 2002 w hrend braune F rbung h molysiertes Blut anzeigt Freshman 2002 Die h ufigsten Gr nde f
414. tigen Effekt des Kalteschocks ansehen und mit Oettl 1986 nach dem durch die K hlung relativ mehr Sch den an den Samenzellen auftreten als durch die Verd nnung Weiterhin kommt auch das im Verd nner Up 1 2 enthaltene Glycerol 5 als Ursache f r den st rkeren Motilitatsabfall in Frage da bekannt ist dass Glycerol einen depressiven Effekt auf die Motilit t von fl ssigkonservierten Samenzellen aus bt G nzel Apel et al 1993 und es daher blicherweise nicht zur Fl ssigkonservierung von Hundesperma verwendet wird Province et al 1984 Ein weiterer Inhaltstoff der den Verd nner Up 1 2 von den anderen Verd nnern unterschied war das Equex In der Literatur konnten jedoch keine Berichte ber einen m glichen durch Equex verursachten unmittelbaren Motilitatsabfall von flussigkonserviertem Sperma gefunden werden Im Gegensatz zum hier beobachteten Motilit tsabfall der mit Up1 2 verd nnten Ejakulate unmittelbar 183 Diskussion nach dem Verdunnen konnten Nizanski et al 2009 sogar eine initiale Aktivierung der Motilitat durch den Zusatz von Equex zum Verdunner beobachten was in der vorliegenden Arbeit folglich nicht bestatigt werden konnte Ein unmittelbarer nachteiliger Effekt der Zentrifugation auf die Motilitat konnte ausgeschlossen werden da sowohl die mit Up 1 2 als auch die nur mit Up 1 verdunnten Ejakulate vor der Aufarbeitung zentrifugiert wurden und somit auch die Motilitatswerte der mit Up 1 verd nnten
415. tion lag nach Anwendung der Wurzeltransformation bei 496 6 Mio Spermien ml 230 6 863 5 Mio ml Min 60 0 Mio ml Max 1450 0 Mio ml Eine Agglutination der Spermien konnte in einem Ejakulat 3 3 nachgewiesen werden Mikroskopische Beimengungen wurden bei 13 3 der Ejakulate n 4 gefunden Dabei handelte es sich in einer Probe 3 3 um Zellen der Spermatogenese und in drei Proben 10 0 um Prostasomen n 1 n 1 n 1 4 1 4 Spermac Farbung Der Anteil an Samenzellen mit Kopfkappenver nderungen betrug 2 7 SF 2 63 Min 0 0 Max 13 5 Hierbei konnte bei 1 4 SF 2 67 Min 0 0 Max 5 0 n 22 der Samenzellen ein Verlust des Akrosoms abgel ste Kopfkappe nachgewiesen werden 4 1 5 HOS Test Der HOS Test zeigte bei 3 1 SF 2 34 Min 0 5 Max 16 5 der Spermien eine nicht aufgerollte Gei el not curled 4 1 6 Computer assisted sperm analysis CASA Die durchschnittliche Dichte der spermienreichen Fraktion lag nach Anwendung der Wurzeltransformation bei 171 9 Mio Spermien ml 60 4 340 4 Mio ml Min 10 9 Mio ml Max 615 4 Mio ml 4 1 6 1 Motilit tsanalyse Mittels CASA wurden eine durchschnittliche Gesamtmotilitat von 70 9 18 1 Min 30 7 Max 95 6 und eine durchschnittliche Vorw rtsbeweglichkeit von 65 0 19 9 Min 22 1 Max 89 5 ermittelt Die Messergebnisse weiterer durch CASA bestimmter Motilit tsparameter Abk rzungen siehe Abk rzungs verzeichni
416. tsanalyse 256 9 6 Herstellerangabeniz uses eigenen el 256 9 7 WVerdunner zur Fl ssigkonservierung von caninem Sperma 261 9 7 1 Milchverd nner uan asene mens 261 9 7 2 TRIS gepufferte Eigelb Verd nner uruu 224444444nnnnn nennen nenn 261 9 7 3 Sonstige Verd unnerasen ee ee 264 9 7 4 Kommerzielle Verd nner u000nnnnnnnnennnnnnn nennen 265 9 8 Ergebnistabellen c cccunuche enue en 267 9 9 AbBildungsverzeichnis zen ee 284 9 10 Tabellenverzeichnls ste nen 286 10 Danksagung ar ee see 291 Abkurzungsverzeichnis Abkurzungsverzeichnis Abb Al ALH AOC Aqua dest Aqua bidest AR BCF BES C Ca Carboxy SNARF CASA CFDA CP DAP DCL DMSO DNA DSL EDTA et al Equex EthD 1 FITC PNA FITC PSA Abbildung Artifizielle Insemination amplitude of lateral head displacement engl f r durchschnittliche seitliche Kopfauslenkung der Samenzellen um average orientation change of the head engl f r durchschnittlicher Richtungswechsel des Spermienkopfes Grad Aqua destillata lat f r destilliertes Wasser Aqua bidestillata lat f r bidestilliertes Wasser Akrosomreaktion beat cross frequency engl f r Anzahl der seitlichen oszillatorischen Bewegungen des Spermienkopfes um die mittlere Bahn Hz N N bis 2 hydroxyethyl 2 aminoethansulfons ure Grad Celsius zweifach positiv geladene Calciumionen Carboxy
417. ttels CASA bestimmten Spermienkonzentrationen k nnen auch durch Verd nnerpartikel mit Spermien hnlicher Form und Gr e verursacht werden wenn die Verd nnermedien vor der Zugabe zum Sperma nicht gefiltert wurden G nzel Apel et al 1993 Nach Sch fer Somi und Aurich 2007 korrelieren jedoch die Ergebnisse f r die Konzentrationsbestimmung mit SpermCue Thoma Z hlkammer und SpermVision signifikant miteinander und auch Rijsselaere et al 2003 konnten hohe positive Korrelationen zwischen den mittels CASA HTR Ceros 12 1 und den mittels B rker Z hlkammer bestimmten Spermienkonzentrationen ermitteln Bei letzteren 28 Literatur lie sich im Allgemeinen allerdings eine Unterschatzung der Konzentration durch CASA beobachten welche mit steigenden Spermienkonzentrationen gr er wurde 2 3 3 2 Motilitatsanalyse Allgemein verwendete CASA Parameter zur Beschreibung der Spermienmotilitat sind die Gesamtmotilitat ausgedr ckt als Prozentsatz der Spermien mit VCL velocity curvilinear gt 15 um s Rigau et al 2001 der Prozentsatz an vorwartsbeweglichen Spermien welche durch eine VAP velocity average pathway gt 50 um s und eine STR straightness gt 70 definiert sind Rijsselaere et al 2003 bzw der Prozentsatz an progressiven schnellen Spermien welche durch eine minimale STR von 90 definiert sind Pe a et al 2003a die kurvilineare Geschwindigkeit VCL velocity curvilinear welche die mittlere Ge
418. ttelt werden jeweils mit Pzeit lt 0 0001 In den mit CP verd nnten Ejakulaten konnte bez glich des Anteils an sonstigen Kopfkappenver nderungen ein signifikanter Niveauunterschied zu den mit TE Pvera 0 031 sowie zu den mit Up 1 Pvera 0 0025 verd nnten Ejakulaten nachgewiesen werden und auch die Zeitverl ufe der mit CP und der mit Up 1 verd nnten Ejakulate unterschieden sich signifikant pw 0 03 Dabei war den Anteil an sonstigen akrosomalen Ver nderungen in den mit CP aufgearbeiteten Proben im Zeitverlauf durchschnittlich h her als in den mit TE aufgearbeiteten Proben und niedriger als in den mit Up 1 aufgearbeiteten Proben In den mit CP verd nnten Ejakulaten 146 Ergebnisse konnte an Tag 10 ein durchschnittlicher Anteil von 1 3 SF 5 03 in den mit TE verd nnten Ejakulaten von 1 1 SF 4 19 und in den mit Up1 verdunnten Ejakulaten von 2 2 SF 3 08 bestimmt werden In den mit Up 1 2 verdunnten Ejakulaten veranderte sich der Anteil an sonstigen Kopfkappenveranderungen uber den Untersuchungszeitraum kaum und betrug an Tag 10 im Durchschnitt 0 2 SF 1 0 Eine ausfuhrliche Darstellung der Resultate der zweifaktoriellen Varianzanalysen mit Messwiederholungen bez glich der Faktoren Verd nner und Zeit in denen jeweils zwei Verdunner bez glich des Anteils an Samenzellen mit Kopfkappenver nderungen bzw bez glich der einzelnen Kopfkappenver nderungen miteinander verglichen wurden ist dem Anh
419. ture 1984a Verd nner Kenney Verd nner Trockenmagermilch Fa Hamilton 6 6 340 Bouchard et al bzw 24 g Glukose 49 g Thorn 1990 England NFDMS G Non Fat Natriumbikarbonat Research und Ponzio 1996 Dried Milk Solid 13 g Aqua bidest Beverly MA Sch fer et al Glucose Verd nner ad 1000 ml USA 1997 Magermilch mit Ticarcillin oder Lane Manu Pinto et al 1999 Verd nner Kenney Gentamicin facturing Inc Typ f r Pferde Denver CO USA Magermilch Trockenmagermilch G nzel Apel et al Verd nner 2 4 g Glukose 1993 G nzel 4 9 g Natrium Apel 2007 hydrogencarbonat 8 4 ige Lsg 1 6 ml Aqua bidest ad 100 ml Kenney Skim Milk Jeffers Inc www jefferspet co Canine Semen Dothan AL m Extender Kit without USA antibiotics Canine Kenney Hamilton www equitainer co Extender Research m 10 ml 100 ml Inc South Hamilton MA USA Canine Semen Veterinary www veterinaryco Extender with Concepts ncepts com Gentamicin Kenney Magermilch verd nner Canine Semen Veterinary www veterinaryco Extender without Concepts ncepts com Antibiotics Kenney Magermilch verd nner Next Generation Dr Exodus www exodusbreed Kenney Canine Breeders ers com Semen Extender Corporation York PA USA 266 Anhang Next Generation enthalt Eigelb Exodus www exodusbreed Velocity Canine Breeders ers com Semen Extender Corporation York PA USA Next Generatio
420. u mare ren 77 3 3 1 Klassische Spermatologie 444enennnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn nennen 78 3 3 1 1 Makroskopische Untersuchung 444444ssss rs 78 3 3 1 2 Chemisch physikalische Untersuchung 222 78 3 3 1 3 Mikroskopische Untersuchung 24444444HHnsnnr ernennen 78 3 32 Spermac F arbung Jire epig tee eepe aneor nem 82 3233 THOS TCS sans een 82 3 3 4 Computer assisted sperm analysis CASA uusseserssssesennnnnnn 83 3 3 4 1 Aufbau und Funktionsweise des SpermVision Systems 83 3 3 4 2 Probenvorbereitung und Bef llung der Messkammer 85 3 3 4 3 Motilit tsanalyse cccccccceccceccceecceecceccceeceeeceeeceeeeeeeeeeees 86 3 3 4 4 Miabiliialsanalyse ensunesee es 88 3 4 Weiterverarbeitung des Spermas Aufbereitung mit den verschiedenen Verd nnern 90 3 4 1 Herstellung der Verd nner 2 2 sm0m2 4444444040404 90 3 4 2 Aliquotierung und Verd nnung des Spermas 91 3 5 Untersuchung des verd nnten Spermas uueneneneneeeee nenn 93 Inhaltsverzeichnis 3 6 Untersuchung der Halteproben 22 cccccecsecceeceeeeeeeneeensedeneeeteeeeeeeeeeenens 94 3 7 Statistische Methoden s 4 8 20a eee 96 ETGEBNISSE innere ath eh oe als ts acts E E 99 4 1 Untersuchungsergebnisse der Nativejakulate cceeeeeeeeeeeeeeeeeeeeees 99 4 1 1 Makrosk
421. ubjektive mikroskopische Untersuchung ber hohe Variationen bei der Beurteilung der 168 Diskussion Motilitatsparameter derselben Ejakulate durch verschiedene Untersucher berichtet wird Dunphy et al 1989 Eine Uberschatzung der Motilitat durch CASA bei subjektiv als schlecht beurteilten Ejakulaten konnte in ahnlicher Weise auch von Amann und Hammerstedt 1980 beobachtet werden Bei Proben die nur tote Bullenspermien enthielten wurden durch CASA trotzdem 31 bewegliche Spermien ermittelt Daher sind die Autoren der Ansicht dass CASA Untersuchungen nur f r Ejakulate die einen hohen Prozentsatz an motilen Spermien aufweisen gt 50 genaue und verl ssliche Ergebnisse liefern welche auch mit den Ergebnissen subjektiver Sch tzungen gut bereinstimmen Bei Ejakulaten die nur wenige bewegliche Spermien enthalten lt 25 sind CASA Untersuchungen jedoch ungenau Amann und Hammerstedt 1980 Insgesamt betrachtet war die bereinstimmung der durch das SpermVision System ermittelten Motilitatswerte mit den subjektiv gesch tzten Werten trotz einiger Ausnahmen jedoch als zufriedenstellend zu beurteilen wobei die durch SpermVision gemessenen Werte im Durchschnitt unter den subjektiv bestimmten Werten lagen siehe Kap 4 4 2 2 Auf die statistisch ermittelten Zusammenh nge zwischen beiden Methoden wird in Kap 5 3 4 2 n her eingegangen 5 2 3 2 3 Viabilit tsanalyse Das CASA System SpermVision ist im Vergleich
422. uls Test zum paarweisen Vergleich der Mittelwerte durchgef hrt die Ergebnisse werden getrennt nach den jeweils getesteten Paaren angegeben n s nicht signifikant p lt 0 01 signifikant mit p lt 0 01 p lt 0 05 signifikant mit p lt 0 05 Parameter Haupteffekt p Student Newman Keuls Test Wert Verd nner DAP 0 0017 0 1 n s 0 2 n s 0 3 p lt 0 01 1 2 n s 1 3 p lt 0 05 2 3 p lt 0 05 268 Anhang DCL 0 0001 0 1 p lt 0 05 0 2 p lt 0 05 0 3 p lt 0 01 1 2 n s 1 3 p lt 0 05 2 3 p lt 0 05 DSL 0 1 VAP VCL 0 0004 lt 0 0001 0 1 n s 0 2 n s 0 3 p lt 0 01 1 2 n s 1 3 p lt 0 01 2 3 p lt 0 01 0 1 p lt 0 05 0 2 p lt 0 05 0 3 p lt 0 01 1 2 n s 1 3 p lt 0 01 2 3 p lt 0 01 VSL 0 04 0 1 n s 0 2 n s 0 3 p lt 0 05 1 2 n s 1 3 n s 2 3 n s ALH 0 0001 0 1 n s 0 2 n s 0 3 p lt 0 01 1 2 n s 1 3 p lt 0 01 2 3 p lt 0 01 BCF 0 065 STR 0 27 LIN 0 68 WOB 0 74 269 Anhang Tab A7 Resultate der einfaktoriellen Varianzanalyse mit Messwiederholungen bez glich des Faktors Verd nner zum Vergleich der Verdunner CP 1 TE 2 und Up1 4 mit dem Nativsperma 0 unmittelbar nach dem Verd nnen Tag 0 n 18 bei signifikantem Resultat wurde anschlie end ein Student Newman Keuls Test zum paarweisen Vergleich der Mittelwerte durchgef hrt die Ergebnisse werden getrennt nach d
423. und auch wahrend der Lagerung Rucksicht genommen werden 2 5 ul der F rbel sung bestehen aus 1 2 ul Androhep Verdunner 0 05 ul SYBR 14 1 25 ul Pl Fur die Herstellung werden 0 12 ml Androhep Verd nner mit 5 ul SYBR 14 und 0 125ml PI gemischt Das daraus entstehende Volumen von 0 25ml wird anschlie end auf 100 braune Eppendorf Reaktionsgef e Safe Lock Tubes 0 5 ml Eppendorf AG Hamburg aufgeteilt sodass sich in jedem Gef 2 5 ul der F rbel sung befinden Bis zum Gebrauch sollte die F rbel sung bei 20 C aufbewahrt werden 9 6 Herstellerangaben Bauknecht Hausger te GmbH Tel 0711 81071 0 Industriestr 48 Fax 0711 81071 3333 70565 Stuttgart Deutschland E Mail bauknecht de bauknecht com Webseite www bauknecht de BD Becton Dickinson and Company Becton Dickinson GmbH One Becton Drive Tullastr 8 12 Franklin Lakes NJ 07417 USA 69126 Heidelberg Deutschland Tel 49 0 6221 305 0 Fax 49 0 6221 305 216 Webseite www bd com Tierarztpraxis Dr K amp C Blendinger Tel 06122 535868 0 Robert Bosch Str 12 Fax 06122 535868 45 65719 Hofheim Wallau Deutschland E Mail info blendivet de Webseite www blendivet de 256 Anhang B Braun Melsungen AG Postfach 1120 Carl Braun Str 1 34209 Melsungen Deutschland 34212 Melsungen Deutschland Tel 05661 71 0 Fax 05661 71 4567 Webseite www bbraun de Eppendorf AG Tel 49 0 40 53801 0 Barkhausenweg 1 Fax 4
424. und der daraus resultierenden Gr e der Hoden Olar et al 1983 G nzel 1986 Johnston 1991 Freshman 2002 Bez glich des Alters wurde darauf geachtet keine R den die j nger als ein Jahr waren zur Spermagewinnung heranzuziehen da aufgrund von Untersuchungen an Beagle R den erst ab circa diesem Zeitpunkt von einem vollst ndigen Erreichen der Geschlechtsreife auszugehen ist Christiansen 1984b Etwa die H lfte der R den 16 von 30 wurde vorher bereits zur Zucht eingesetzt Jedoch wurde der Zuchterfolg nicht weiter erfragt da dies f r die Untersuchungen nicht relevant erschien Die R den sollten bewusst nicht nach ihrer Spermaqualitat ausgew hlt werden was zu einer individuellen Variation der Spermaparameter f hrte wie es auch im klinischen Alltag der Fall ist Da die vorliegende Arbeit prim r die Haltbarkeit des fl ssigkonservierten Spermas betrachtete war es zu vertreten auch Sperma zu verwenden das den Mindestanforderungen nicht entsprach Allerdings wurde darauf geachtet dass die letzte Zuchtnutzung nat rlicher Deckakt oder manuelle Spermagewinnung l nger als mindestens zwei Tage zur cklag da bei einer h heren Absamungsfrequenz durch eine Ersch pfung der epididymalen Spermareserven die SGZ im Ejakulat vermindert sein kann Boucher et al 1958 England 1999 Die spermienreiche Fraktion eines R den Nr 20 wies eine Beimengung in Form von Blut auf Das betreffende Ejakulat wurde trotzdem f r die Versuche ve
425. ung der Wurzeltransformation dargestellt durch Angabe von modifiziertem Mittelwert x modifiziertem 1 s Bereich 1 s Bereich Minimum Min und Maximum Max Verd nner n Xr 1 s Bereich Min Max x10 ml x 10 ml x 10 ml x 10 ml CP 30 71 8 37 6 117 0 19 8 177 6 TE 30 77 7 40 5 126 7 24 8 205 4 Up1 2 12 66 8 40 9 99 1 25 5 115 3 Up 1 18 127 9 80 0 187 1 53 6 227 9 4 2 2 Einfluss der Verd nner auf die Motilit t an Tag 0 Nach Zugabe der verschiedenen Verdunner zu den Nativejakulaten konnte eine tendenzielle Abnahme fast aller untersuchten Motilit tsparameter beobachtet werden 102 Ergebnisse 4 2 2 1 Subjektiv gesch tzte Vorwartsbeweglichkeit Die durchschnittiiche subjektiv gesch tzte Vorwartsbeweglichkeit der Nativejakulate und der mit den verschiedenen Verd nnern aufgearbeiteten Ejakulate unmittelbar nach dem Verd nnen Tag 0 ist in Tab 10 dargestellt Durch alle Verd nner kam es verglichen mit dem Nativsperma zu einer leichten Reduktion der im Mittel gesch tzten Motilitatswerte Die geringsten Motilit tsabnahmen unmittelbar nach dem Verd nnen waren in den mit CP und TE aufgearbeiteten Ejakulaten zu beobachten die st rksten in den mit Up1 2 aufgearbeiteten Ejakulaten wenn auch der Unterschied sich als nicht signifikant erwies Tab 10 Subjektiv gesch tzte Vorw rtsbeweglichkeit n x SD Min Max im Nativsperma und in den verschiedenen
426. urch die Lagerung in fl ssigem Stickstoff bei einer Temperatur von 196 C wird der Stoffwechsel der Samenzellen stillgelegt wodurch diese in den Zustand der Anabiose eintreten Hoffmann 2003d und nahezu unbegrenzt lagerbar werden England und Millar 2008 Dadurch erm glicht die Kryokonservierung den internationalen Handel mit Sperma und es k nnen 42 Literatur Samenbanken von Ruden herausragenden genetischen Wertes errichtet werden Pena et al 2006 Fur die Kryokonservierung ist die Qualit t des Ausgangsmaterials noch entscheidender als bei der Fl ssigkonservierung Es sollten nur Ejakulate verwendet werden die in allen Parametern den geforderten Anspr chen siehe Tab 2 gen gen Pesch et al 2007 Das Sperma mancher R den l sst sich besser tiefgefrieren als das anderer R den Seager und Fletcher 1973 Eilts 2005b Farstad 2009 was auf genetische Unterschiede bez glich der Zusammensetzung der zellul ren Membranen zur ckzuf hren sein k nnte welche in einer unterschiedlichen Wasserpermeabilitat der Zellmembranen resultieren Eilts 2005b Individuelle Unterschiede hinsichtlich der Gefriertauglichkeit sind auch von anderen Haustierspezies und vom Menschen bekannt Seager und Fletcher 1973 Da Hundesperma physiologischerweise weniger konzentriert ist als z B Wiederk uersperma wird es vor der Weiterverarbeitung h ufig zentrifugiert und das gewonnene Pellet nach Verwerfung des berstandes in Abh ngigkeit
427. uster 2005 bestimmt werden wobei das H mozytometer die gebr uchlichste Methode ist 22 Literatur Seager und Platz 1977b und als Golden Standard angesehen werden kann Hansen et al 2006 Root Kustritz 2007 Da die Spermienkonzentration bzw die Dichte im Wesentlichen von der Quantitat des ejakulierten Prostatasekrets abh ngt ist die SGZ der entscheidende Parameter zur Beurteilung der Spermaqualit t Soderberg 1986 Johnston 1991 Die SGZ ist positiv korreliert mit der K rpergr e des Hundes und der daraus resultierenden Gr e der Hoden Olar et al 1983 G nzel 1986 Johnston 1991 Freshman 2002 Auch die Frequenz der Ejakulationen beeinflusst die SGZ pro Ejakulat Boucher et al 1958 Olar et al 1983 England 1999 Freshman 2002 Die SGZ kann durch mangelhafte Stimulation keine H ndin anwesend Stress Schmerzen oder andere Umweltfaktoren vermindert sein Pena Martinez 2004 Als Referenzbereich gilt eine SGZ im Ejakulat von 300 Mio bis 2 Mrd Johnston 1991 Ein R de durchschnittlicher Gr e sollte mindestens 250 300 Mio Samenzellen pro Ejakulat aufweisen Freshman 2002 Root Kustritz 2007 e Mikroskopische Beimengungen W hrend der mikroskopischen Untersuchung wird auf das Vorhandensein von Fremdbeimengungen geachtet Es k nnen wei e und rote Blutzellen epitheliale Zellen von der inneren Auskleidung des Reproduktionstraktes und im Zusammenhang mit Infektionen zellul rer Debris gefunden
428. ventioneller Z hlkammer bestimmten Spermienkonzentrationen signifikant mit den mittels Cellsoft Computer Videomicrography System gemessenen Konzentrationen korreliert Ebenso konnten Rijsselaere et al 2003 eine signifikante Korrelation zwischen der konventionellen Konzentrationsbestimmung mittels B rker Z hlkammer und der Konzentrationsmessung durch den HTR Ceros 12 1 ermitteln wobei die 211 Diskussion Unterschatzung durch den HTR Ceros 12 1 durchschnittlich 14 8 betrug Auch Schafer Somi et al 2006 konnten in nativem Sperma eine signifikante Korrelation zwischen der Konzentrationsbestimmung mittels Thoma Z hlkammer und der mittels SpermVision nachweisen Auch in der vorliegenden Arbeit konnte eine signifikante Korrelation zwischen den mittels Neubauer Z hlkammer bestimmten und den durch CASA SpermVision System gemessenen Dichten ermittelt werden r 0 708 p lt 0 001 wobei die mittels Neubauer Z hlkammer bestimmten Mittelwerte fast immer ber den durch CASA gemessenen Mittelwerten lagen Lediglich f r die mit Up 1 verd nnten Ejakulate konnte mittels CASA eine leicht h here durchschnittliche Dichte ermittelt werden als mittels Neubauer Z hlkammer Im Gegensatz zu den verd nnten Ejakulaten war die Abweichung zwischen den mit beiden Methoden bestimmten Mittelwerten bei den Nativejakulaten st rker ausgepr gt was sich auch bei den Korrelationsanalysen nach Nativsperma und nach den einzelnen Verd nnern getrennt deut
429. weglich mit einem pH Optimum zwischen 7 0 und 8 5 innerhalb dessen sie maximale Motilitat zeigen Wales und White 1958 Die metabolische Aktivit t der Samenzellen resultiert in einer Anh ufung von Wasserstoffionen Gibt es keine Mechanismen f r die Entfernung dieser lonen so sinkt der pH Wert des Verdunners was eine Reduktion der Langlebigkeit der Spermien und ihrer Fertilitat zur Folge hat Um 50 Literatur dies zu vermeiden kommen Puffersysteme zum Einsatz England 1993 Dabei k nnen Puffer entweder in geringer Konzentration zur Aufrechterhaltung eines bestimmten pH Wertes oder als Hauptkomponente des Verd nners Zitrat TRIS verwendet werden um Tonizit t und Pufferkapazit t zu gew hrleisten Weitze 2001 Die meisten Verd nner puffern in einem pH Wert Bereich von 6 9 bis 7 1 England 1993 Beispielsweise werden Bikarbonat und Zitrat welche dem Verd nner in Form von Natriumbikarbonat und oder Natriumzitrat zugesetzt werden als Puffer verwendet Weitze und Petrunkina 2007 Beim Vergleich von Zitrat Phosphat und Glycin Puffer stellte sich der Zitrat Puffer Natriumzitrat als berlegen dar wobei Konzentrationen von 1 16 oder 1 45 Natriumzitrat besser geeignet waren als niedrigere Konzentrationen Foote und Leonard 1964 Neuere Verd nner basieren auf organischen Zwitterionen Puffern England 1993 Weitze 2001 Weitze und Petrunkina 2007 wie TES und HEPES die Schwermetalle binden und den pH Wert k
430. weils mit p lt 0 01 Dabei war die Anteile an Knickschw nzen und Plasmatropfen in den mit CP und TE verd nnten Ejakulaten niedriger als im Nativsperma Die Verd nner untereinander zeigten keinen signifikanten Unterschied 4 2 5 Einfluss der Verd nner auf den Anteil an akrosomalen Ver nderungen bzw auf den Anteil an abgel sten Akrosomen an Tag 0 Der durchschnittliche Anteil an akrosomalen Ver nderungen Kopfkappen ver nderungen der Samenzellen bzw an abgel sten Akrosomen in der Spermac F rbung in den Nativejakulaten und in den mit den verschiedenen Verd nnern aufgearbeiteten Ejakulaten unmittelbar nach dem Verd nnen Tag 0 ist in Tab 18 dargestellt Tendenziell war in mit CP TE und Up 1 2 verd nnten Ejakulaten eine Zunahme des Anteils an Kopfkappenver nderungen der Samenzellen nach der Verd nnung zu erkennen w hrend in mit Up 1 verd nnten Proben der Anteil an Kopfkappenver nderungen nahezu konstant blieb Ebenso verhielt es sich f r den Anteil an abgel sten Akrosomen Auch hier konnte in den mit CP TE und Up 1 2 aufgearbeiteten Ejakulaten eine tendenzielle Zunahme festgestellt werden w hrend in mit Up 1 verd nnten Ejakulaten der Anteil an abgel sten Akrosomen konstant blieb F r beide Untersuchungsparameter wurden die st rksten Zunahmen in den mit Up1 2 aufgearbeiteten Ejakulaten beobachtet die geringsten in den mit Up 1 bzw in den mit TE verd nnten Proben 118 Ergebnisse Tab 18 Prozentsatz an Kopf
431. weyndeb sjy JeUSPSIYOSJOA Jellelowso pun La Hd Bunzissuswwesnz Zy Gel Bueyuy 9 6 ooz umAwoydans v66 wenpeg NI 000004 pun eyeiq 1winy uouedunen OZ Bat 69 5 Borz 2002 je 18 yosad E66 u 001 je 9 jedv jezung pe 9861 SZUNd 6 o umAwordays 0Z Isap q 2 gel 22 70 6 gzo e GlZ l 7002 Ie 6 1 0 yeyinsuloAwojyde ys u 001 esopyn 4 yo uedeymoj uod Zee 90 9 510 SE 02 pe d By 6 gzo e WOOL qLo0oz uebe si9 yeyjnsuloAwojde jsoupAuiq pun epenoc senb v9e 789 Bw QOL umolued Azueg 0Z u 001 Bgzi By 6 szo e 9002 Blaqsio4 epurq 6 1 9 umAwoIdays pun uossueulsH Sze 81 9 6 90 0 u OZ lu 08 pe TA 62 6 gzo e 162 z9 q126 3 qya vce 19 u 001 LLOZ and J ynd pe je jo euowy SIHL SIHL 6 z o upiwejuag 0Z as p1q TA 62 6 szo e Bueyuy Anhang 9 7 3 Sonstige Verd nner Tab A3 Name Zusammensetzung pH Wert und Osmolarit t sonstiger Verd nner f r die Fl ssigkonservierung von Hundesperma Verd nner Zusammensetzung in g 100 ml pH Wert Osmolarit t Quellen mOsmol l Caprogen Natriumzitratdihydrat 1 56 9 6 97 0 02 326 0 02 Province et al Verd nner Glycin 0 78 g Glukose 0 23 g 1984 N Kaprons ure 2 5 ige Lsg 1 0 ml Katalase 45 mg 100 ml Lsg 1 0 ml Eigelb 20 ml Penicillin 500 IU ml Strepto mycinsulfat 1 mg ml unmittelbar vor dem Gebrauch fur 15 20 M
432. wohl aber die nachfolgende K hlung Letztere hat m glicherweise sowohl sofortige als auch verz gerte Effekte auf die Ultrastruktur der Spermien Die sofortigen Effekte k nnen die Spermien entweder t ten oder sie durch Sch digung des Akrosoms befruchtungsunf hig machen wohingegen die verz gerten Effekte durch Modifikation der Plasmamembranstruktur die Langlebigkeit der Spermien reduzieren k nnen Burgess et al 2001 Demgegen ber wird nach Rijsselaere et al 2002a die Pr valenz von morphologischen Ver nderungen in der Nigrosin Eosin F rbung in mit TRIS Fruktose Eigelb Verd nner aufgearbeiteten Proben durch eine dreit gige Lagerung bei 4 C nicht beeinflusst Bez glich des Einflusses der Zentrifugation auf die Pathomorphologie der Samenzellen lassen sich in der Literatur kontroverse Aussagen finden Nach Koderle et al 2009 ist in vor dem Einfrieren zentrifugierten Proben der Prozentsatz an morphologisch ver nderten Spermien bestimmt nach Fixation in Hancock L sung nach dem Auftauen signifikant h her als in nicht zentrifugierten Proben und auch nach WHO 2010 kann es durch die Zentrifugation zu einer Beeinflussung der Spermienmorphologie kommen Daher muss auch bei der Fl ssigkonservierung eine Beeinflussung der Pathomorphologie durch die Zentrifugation in Betracht gezogen werden W hrend nicht ausgeschlossen werden kann dass die nachteiligen Effekte der Zentrifugation durch mechanische Sch digungen welche durch die Zentri
433. yl sulfat sodiumdodecyl lauryl sulfate SDS SDS ist ein wasserl sliches anionisches Detergens und Benetzungsmittel das genutzt wird um Proteine aufzuschlieRen Rota et al 1997 Es ist die aktive Komponente der Equex STM Paste Nova Chemical Sales Scituate Inc MA USA Rota et al 1997 1999a Pena und Linde Forsberg 2000 Strom Holst et al 2000 Pena et al 2003b Hermansson und Linde Forsberg 2006 Alhaider und Watson 2009 Bencharif et al 2010 einem kommerziell erhaltlichen Zusatzstoff zur Anwendung in Spermaverd nnern Rota et al 1999a Weitere Verdunnerzusatze die SDS enthalten sind Equex Pasta Minitub Tiefenbach Germany Pena et al 2003b Nizanski et al 2009 Orvus ES Paste Nova Chemical Sales Scituate Inc MA USA Tsutsui et al 2000 Hori et al 2006 und Orvus ES Paste Proctor and Gamble Cincinnati OH USA Pe a et al 2003b wobei der genaue Gehalt an SDS meist unbekannt ist Pe a et al 2003b Hori et al 2006 SDS ist auch als Einzelkomponente auf dem Markt erhaltlich SDS Schwarz Mann Biotech Division of ICN Biomedicals Inc Cleveland OH USA Pena et al 1998a Hori et al 2006 SDS wird dem Verd nner zugesetzt um den membranprotektiven Effekt des Eigelbs zu maximieren Pena et al 2003b 2006 Dabei Ubt es seinen positiven Einfluss durch die Ver nderung von Eigelbbestandteilen aus Pursel et al 1978 Nizanski et al 2009 Wahrscheinlich werden die aktiven Molekule
434. zeichnet Die AR findet nur an der Oberfl che der ZP statt So erlangen die Spermien die F higkeit diese Barriere zu durchdringen W hrend der AR werden inaktive Enzymformen wie Proakrosin zur aktiven Form umgewandelt Daher ist der Anteil an Spermien denen Proakrosin bzw Akrosin fehlt und oder das Ausma der Proakrosinaktivierung ein akkurater Indikator f r die AR Eine pr mature AR kann die Befruchtungsrate vermindern Cortes et al 2006 Durch Zentrifugation und Verd nnung mit einem TRIS Eigelb Verd nner werden weder der durchschnittliche Gehalt an Proakrosin noch die durchschnittliche Akrosinaktivit t ver ndert K hlung des verd nnten Spermas f hrt hingegen zu einer signifikanten Reduktion des Gehaltes an Proakrosin jedoch ohne signifikante Verminderung der Akrosinaktivit t Deshalb wird vermutet dass die K hlung die Autoaktivierung eines Teils des Proakrosins induziert das so gebildete Akrosin aber im Akrosom verbleibt Froman et al 1984 Nach Sirivaidyapong et al 2000 hat auch die Zusammensetzung des Verd nnungsmediums und insbesondere dessen Ca Konzentration einen deutlichen Einfluss auf die AR caniner Spermien hohe Ca Konzentrationen f rdern die AR w hrend niedrige sie verz gern Das in vielen Verd nnern enthaltene Eigelb verhindert einen signifikanten Anstieg kapazitierter Samenzellen w hrend der Fl ssigkonservierung Witte et al 2009 und sch tzt die Spermien somit gegen spontane AR Iguer Ouada und Ver
435. zu anderen CASA Systemen in der Lage zus tzlich zu den Motilitatsparametern die Zellmembranintegrit t objektiv zu beurteilen Sch fer Somi und Aurich 2007 Diese Viabilit tsanalyse basiert auf einer Fluoreszenzf rbung der Spermien mit SYBR 14 Pl Abweichend von Sch fer Somi und Aurich 2007 die 3 0 ul des SYBR 14 Pl Gemisches mit 100 ul Sperma inkubieren wurden in der vorliegenden Arbeit 2 5 ul SYBR 14 PI mit 10 ul Sperma inkubiert Die Inkubationszeit von zehn Minuten war jedoch bereinstimmend mit der von Sch fer Somi und Aurich 2007 siehe Tab 26 Weitere die Viabilit tsanalyse betreffende Einstellungen k nnen nicht miteinander verglichen werden da hierzu von Sch fer Somi und Aurich 2007 keine Angaben gemacht werden Fluoreszenzgef rbte Spermien k nnen auf ihre funktionellen und morphologischen Aspekte hin untersucht werden ohne dass es zu einer Interferenz mit extrazellul ren Medien kommt was insbesondere bei konserviertem Sperma von 169 Diskussion Bedeutung ist Pena Martinez 2004 SYBR 14 PI f rbt selektiv nur die Samenzellen an wodurch eine Differenzierung von anderen im Medium enthaltenen Partikeln m glich wird Pe a et al 2006 Aus diesem Grund stellten in der vorliegenden Arbeit die Eigelbpartikel in den fl ssigkonservierten Ejakulaten kein Problem f r die Spermienerkennung dar Allerdings kam es subjektiv betrachtet bei einigen Messungen durch eine schlechte Spermienerkennung zu einer Unt
436. zur weiteren Bearbeitung nach Microsoft Excel exportiert werden konnten 3 4 Weiterverarbeitung des Spermas Aufbereitung mit den verschiedenen Verd nnern Es wurden nur Ejakulate weiterverarbeitet die eine subjektiv gesch tzte Vorw rtsbeweglichkeit von mindestens 50 aufwiesen 3 4 1 Herstellung der Verd nner Es kamen zwei nichtkommerzielle Verd nner TRIS Fruktose Eigelb Verd nner und Uppsala Equex 2 System sowie ein kommerzieller Verd nner CaniPRO Chill 10 Minitub GmbH Tiefenbach zum Einsatz Alle Verd nner waren eigelbhaltig Die zur Herstellung verwendeten Ger te und Chemikalien sind dem Anhang Kap 9 zu entnehmen a Der TRIS Fruktose Eigelb Verd nner TE wurde gem Rezept siehe Kap 9 5 1 1 hergestellt und portioniert in 5ml Spritzen B Braun Melsungen AG Melsungen verschlossen mit Parafilm Pechiney Plastic Packaging Menasha USA im Gefrierfach bei 21 C gelagert Allerdings wurde abweichend vom Rezept auf den Zusatz antibiotischer Wirkstoffe verzichtet Vor Gebrauch wurde die entsprechende Menge Verdunner aufgetaut und auf der Heizplatte auf 37 C angewarmt b Beim Uppsala Equex 2 System handelte es sich um ein Verd nnersystem aus zwei Bestandteilen zweiphasig Verdunner 1 und 2 Beide Verd nner wurden nach Rezept siehe Kap 9 5 1 2 hergestellt und portioniert in 5ml Spritzen B Braun Melsungen AG Melsungen verschlossen mit Parafilm Pechiney Plastic Packaging Menasha USA im

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