6210 PAI 4G5 Box
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1. Deve sempre utilizar se equipamentos espec ficos para cada area de trabalho prepara o de amostras pr amplifica o amplifica o e p s amplifica o Todos os equipamentos utilizados na rea de p s PCR n o devem sais desta zona Utilize micropipetas luvas e batas espec ficas para cada rea Utilize preferencialmente luvas sem talco uma vez que o talco pode inibir a reac o de PCR Utilize pontas de filtro de forma a minimizar contamina es cruzadas Verifique periodicamente as micropipetas de forma a assegurar a varia o de pipetagem inferior a 5 Utilize micropipetas adaptadas a cada volume de pipetagem Verifique periodicamente os termocicladores de forma a assegurar a varia o de temperaturas inferiores a 1 Abra e feche os reagentes com cuidado Depois de utilizar armazene os restantes componentes do kit s temperaturas recomendadas devidamente fechados N o utilize o kit com a validade expirada Os componentes dos kits s o resistentes s temperaturas de armazenamento indicadas O armazenamento dos kits a temperaturas n o recomendadas podem levar rupturas no material e contamina o dos reagentes dos kits Os materiais pl sticos fornecidos neste kit s o resistentes gama de temperaturas de utiliza o e armazenamento recomendadas A sua utiliza o em gamas distintas de temperaturas pode causar rupturas impossibilitando a utiliza o normal do kit Verifiq2. de teste diagn sticos 15 20 geneBOX investiga o e desenvolvimento de teste diagn sticos garante que os primers presentes no kit de tipagem MTHFR Box apresentam as especificidades dadas nas folhas e tabelas de interpreta o de resultados do produto 1 Placa de Tipagem Armazenamento a 20 C os primers desidratados permanecem est veis durante 12 a 19 meses a partir da data de produ o ver validade do lote na embalagem Armazenamento a 4 C os primers desidratados permanecem est veis durante 12 meses a partir da data de produ o temperatura ambiente os primers desidratados permanecem est veis durante 3 a 4 semanas a partir da data de recep o Quando o selante removido os primers desidratados permanecem est veis durante 2 dias no m ximo desde que n o humede am 2 Mistura de Reac o Armazenamento a 20 C a mistura de reac o permanece est vel durante 18 meses a partir da data de produ o ver validade do lote na embalagem Armazenamento a 42C a mistura de reac o permanece est vel durante 15 dias a partir da data de recep o temperatura ambiente a mistura de reac o permanece est vel durante 3 dias a partir da data de recep o A mistura de reac o nunca deve ser deixada ou armazenada com a tampa aberta 3 DNA O DNA extra do por salting out ou por qualquer outro m todo deve ser armazenado a 4 C ou 20 C Ao optar pela congela o das amostras devem ser evi
3. Refer ncias 1 Gokalp D Tuzcu A Bahceci M Ayyildiz O Yurt M Celik Y Alpagat G Analysis of thrombophilic genetic mutations in patients with Sheehan s syndrome is thrombophilia responsible for the pathogenesis of Sheehan s syndrome Pituitary 2010 Nov 25 2 Ahmed W Malik M Saeed I Khan AA Sadeque A Kaleem U Ahmed N Ajmal M Azam M Qamar R Role of tissue plasminogen activator and plasminogen activator inhibitor polymorphism in myocardial infarction Mol Biol Rep 2010 Nov 17 3 Arslan S Manduz S Epozturk K Karahan O Akkurt I Association of deep venous thrombosis with prothrombotic gene polymorphism identified in lung cancer cases Mol Biol Rep 2010 Nov 16 4 Chang HR Yang SF Tsai JP Hsieh MC Wu SW Tsai HC Hung TW Huang JH Lian JD Plasminogen activator inhibitor 1 5G 5G genotype is a protecting factor preventing posttransplant diabetes mellitus Clin Chim Acta 2011 J an 30 412 3 4 322 6 5 Ashavaid TF Todur SP Kondkar AA Nair KG Shalia KK Dalal JJ Rajani R Ponde CK Platelet polymorphisms frequency distribution and association with coronary artery disease in an Indian population Platelets 2011 22 2 85 91 6 Katrancioglu N Manduz S Ozen F Yilmaz MB Karahan O Ozdemir O Berkan O Type plasminogen activator inhibitor 4G allele frequency is associated with chronic venous insufficiency Int Med Res 2010 J ul Aug 38 4 1513 8 7 Pieters M de Lange Z Hoekstra T Ellis SM Kruger A Trigly
4. Verifique a qualidade e concentra o do DNA Dissolva o DNA em 44H20 de forma a obter a concentra o exacta Repita a tipagem com um DNA de boa qualidade Contamina o com outros produtos de PCR ou outras amostras de DNA durante a prepara o do PCR Degrada o da amostra de DNA Limpe a zona de trabalho Trabalhe em zonas Pr e P s PCR separadas Utilize batas distintas para a zona Pr e P s PCR Mude de luvas frequentemente Repita a tipagem com um DNA de boa qualidade Reextraia a amostra de DNA de material fresco Repita a tipagem com um DNA de boa qualidade Amostra de DNA muito concentrada Verifique a qualidade e concentra o do DNA Dissolva o DNA em 44H20 de forma a obter a concentra o exacta Repita a tipagem com um DNA de boa qualidade Problemas com tamp o de electroforese Fora de prazo ou composi o errada Use um tamp o recomendado novo 11 20
5. a e os documentos t cnicos deste produto s o mantidos na geneBOX biocant centro de inova o em biotecnologia 3060 197 Cantanhede Portugal Sandra Balseiro Directora T cnica 16 20 Componentes do PAI 4G5 Box 1 0 Typing Kit e Tiras de tipagem de PAI 48 tipagens 24 tiras 48 amostras conservar de 15 a 302C e PCR Master Mix com Taq DNA Polimerase 4X 85 ul conservar de 15 a 30 C e Selantes das tiras 12 c psulas selantes e Manual de instru es 1 Manual de Instru es com pares de primers espec ficos desidratados Componentes da PCR Master Mix Nucle tidos concentra o final de cada dNTP 600 uM Tamp o da PCR concentra es finais s o 3 3x NH4 2 0 mM MgCl e 0 4 u ul Amplitaq DNA polimerase pH 8 3 Glicerol concentra o final 16 6 Vermelho de cresol concentra o final de 300ug ml 5 20 Protocolo de amplifica o por PCR Reagentes e Amostra de DNA 100 200 ng ul e PCR Master Mix e gua bi destilada est ril n o fornecida Extrac o de DNA Para a tipagem por SSP necess rio DNA extra puro Recomenda se que o isolamento de DNA seja efectuado utilizando kits de extrac o com marca o CE que garantam um r cio DO 260 280 maior do que 1 6 e uma concentra o entre 100ng 200 ng ul Alternativamente o DNA pode ser extra do utilizando sais de Brometo de Trimetilamonia DTAB CTAB ou por salting out dissolvendo o em Tamp o TE Devem ser ass
6. a regulamenta o aplic vel os res duos devem ser devidamente tratados e ou incinerados 14 Informa o sobre o transporte No transporte dos Kits devem estar a seguradas as temperaturas n o devendo ultrapassar os 25 C A dura o do transporte n o deve ser superior a 3 dias de modo a garantir que todos os componentes do Kit cheguem em perfeitas condi es aos seus destinat rios 15 Contactos teis N mero Nacional de Emerg ncia 112 Centro de Informa o Anti Venenos 808 250 143 16 Outras informa es As informa es a cima dispon veis s o baseados no n vel de conhecimento actual devendo ser utilizado apenas como guia A geneBOX R amp D Diagnostic Tests n o se responsabiliza por qualquer dano causado pela manipula o inapropriada ou pelo contacto com os referidos produtos Para mais esclarecimentos por favor contactem com o apoio t cnico para o 351 231 410 946 19 20 Folha de Dados de Seguran a 2 3 Material Safety Data Sheet MSDS 6 Protec o pessoal Protec o das m os use luvas apropriadas resistentes a qu micos Protec o dos olhos recomenda se o uso de culos de protec o qu mica 7 Manipula o e armazenamento Manipula o evite o contacto directo com a subst ncia Armazenamento armazene temperatura aconselhada proteja do contacto com a luz Danifica o da embalagem protectora rejeitar o constituinte contido na embalagem 8 Perigos Os componentes da
7. casos na presen a da banda espec fica Na aus ncia da banda controlo por favor repita a tipagem NOTA Se o PCR tiver bandas com tamanhos diferentes dos previstos n o as considere pois pode tratar se de bandas n o espec ficas ou artefactos 10 20 Guia de resolu o de problemas PROBLEMAS Bandas controlo e espec ficas fracas Os controlos internos falharam em diversos po os Falsos negativos de uma banda espec fica com o controlo interno normal Detec o de mais de dois alelos espec ficos Esfrega o de bandas POSSIVEIS CAUSAS Concentra o da amostra de DNA baixa SUGEST ES Verifique a qualidade e concentra o do DNA Reextraia a amostra de DNA ou tente n o adicionar gua mistura de reac o Repita a tipagem com um DNA de boa qualidade Presen a de inibidores da Taq polimerase nas amostras de DNA Presen a de inibidores da Taq polimerase nas amostras de DNA Repurifique a amostra de DNA Repita a tipagem com um DNA de boa qualidade Repurifique a amostra de DNA Repita a tipagem com um DNA de boa qualidade Produtos de amplifica o secos Degrada o da amostra de DNA Amostra de DNA muito concentrada Verifique a selagem das placas Repita a tipagem utilizando um adaptador de silicone para placas de 96 e ou adicione leo Mineral Reextraia a amostra de DNA de material fresco Repita a tipagem com um DNA de boa ualidade
8. ceride concentration and waist circumference influence alcohol related plasminogen activator inhibitor 1 activity increase in black South Africans Blood Coagul Fibrinolysis 2010 Dec 21 8 736 43 8 Bentley JP Asselbergs FW Coffey CS Hebert PR Moore JH Hillege HL van Gilst WH Cardiovascular risk associated with interactions among polymorphisms in genes from the renin angiotensin bradykinin and fibrinolytic systems PLoS One 2010 Sep 15 5 9 e12757 ene eve geneBox 000 DESENVOLVIMENTO E PRODU AO biocant centro de inova o em biotecnologia n cleo 4 lote 3 3060 197 cantanhede portugal tel 351 231 410 946 fax 351 231 410 947 e mail info genebox com www genebox com 20 20 C digo do Produto 0111 PAI 4G5 Box 2 0 Typing Kit Dispositivo para utiliza o in vitro Manual de I nstru es oqo e Ue geneBox 009 DESENVOLVIMENTO E PRODU O DE TESTES DE DIAGN STICO Versao1 0 Dezembro de 2010 1 20 6 0 U geneBox 000 DESENVOLVIMENTO E PRODU O DE TESTES DE DIAGN STICO biocant centro de inova o em biotecnologia n cleo 4 lote 3 3060 197 cantanhede portugal tel 351 231 410 946 fax 351 231 410 947 e mail info genebox com www genebox com 2 20 Folha de Dados de Seguran a 3 3 Material Safety Data Sheet MSDS 12 Informa o ecol gica N o existem dados dispon veis 13 Informa o sobre a elimina o de res duos Elimine o material de acordo com toda
9. de volume forem superiores a 20 n o devem ser validados os resultados obtidos De forma a prevenir esta situa o devem adicionar previamente leo mineral mistura de reac o ou utilizar um adaptador de silicone para placas de 96 Tamb m se deve ter em aten o a temperatura de aquecimento do aparelho Se a temperatura de aquecimento n o for suficiente v o se verificar problemas de condensa o 5 Termociclador Recomenda se utiliza o de qualquer Termociclador que apresente as seguintes caracter sticas heating rate superior a 2 5 C sec cooling rate superior a 1 5 C sec gama de temperatures 4 100 C uniformidade de temperaturas 0 5 C heated lid superior a 100 C 6 Validade Como especificado na embalagem Se os problemas persistirem por favor contactem com o apoio t cnico para o 351 231 410 946 13 20 Avisos e precau es A amplifica o por PCR permite nos obter milh es de c pias de DNA a partir de uma pequena quantidade de amostra Infelizmente isto tamb m verdade para o DNA contaminante que pode comprometer performance da nossa reac o Consequentemente pr ticas laboratoriais espec ficas podem evitar a presen a de amplifica es inespec ficas Em baixo encontram se descriminadas as recomenda es da Genebox Separe fisicamente as reas de pr PCR e de p s PCR O fluxo Laboratorial deve ser sempre unidireccional da rea pr PCR para a rea p s PCR
10. eguradas o mesmo n vel de DO e de concentra o N O UTILIZE SANGUE HEPARINIZADO COM ESTE M TODO Amplifica o por PCR 1 Agite brevemente os tubos de DNA e da mistura de reac o 2 Junte e 7 pl da PCR Master Mix e 15 pl de gua bi destilada est ril e e 24ylda amostra de DNA conc 100 200 ng ul num tubo de 0 7 ml ou 1 5 ml 3 Agite vigorosamente durante 15 segundos 4 Pipete 10 pl da mistura para cada poco da tira de tipagem 2 pares de primers 5 Repita os passos anteriores para cada uma das amostras DNA num total de 4 amostras por tira 6 Sele a tira de tipagem com a c psula e coloque num aparelho PCR de 96 po os 6 20 Aviso de garantia geneBOX investiga o e desenvolvimento de teste diagn sticos responsabiliza se perante os seus clientes pelos defeitos no material e componentes dos seus produtos aplicados em condi es normais Os produtos da empresa que apresentam esta garantia devem ser substitu dos sem encargos para o cliente Esta garantia aplica se s para produtos que sejam manipulados e armazenados de acordo com as especifica es e recomenda es de utiliza o As reclama es devem ser enviadas por escrito directamente para a geneBOX e devem ser acompanhadas por uma c pia da guia de transporte ou factura do produto Este produto n o pode ser reformulado reembalado ou revendido em nenhuma forma sem o expresso consentimento da geneBOX investiga o e desenvolvimento
11. esoxiribonucleico Oligonucle tido Vermelho de Cresol Mistura de reac o Desoxiribonucle tidos Nucle tidos Tamp o NH4 Cloreto de Magn sio MgCl2 Vermelho de Cresol Glicerol Taq DNA Polimerase Taq 3 Propriedades fisico quimicas Componente Aspecto Cor Odor Placa seco no fundo do poco vermelho nenhum Mistura de reac o l quido vermelho rosa nenhum 4 Informa o Toxicol gica Qu mico Toxicidade Glicerol LD50 oral 4090 mg kg ratinho LD50 oral 12600 mg kg rato LD50 oral 1480 mg kg humano 5 Estabilidade e reactividade Condi es a evitar Calor e humidade Incompatibilidades Bases e agentes oxidantes fortes 17 20 Declara o de Conformidade Nome do Produto PAI 4G 5 Box Numero do Produto GB 62 10 Utiliza o Tipagem gen tica do gene PAI Produ o geneBOX R amp D Diagnostic Tests biocant centro de inova o em biotecnologia n cleo 4 lote 3 3060 197 cantanhede portugal N s geneBOX investiga o e desenvolvimento de testes de diagn stico indubitavelmente declaramos que este produto ao qual se relaciona esta declara o de conformidade est em conformidade com os seguintes documentos normativos ISO 9001 2008 e ISO 13485 2004 Seguindo ainda as indica es da Directiva Europeia 98 79 CE sobre dispositivos m dicos de diagn stico in vitro conformidade de acordo com o Anexo IV transposto para as leis nacionais dos estados membros da Uni o Europeia Europeia A fich
12. hos e pele 11 Medidas a tomar no caso de derrame acidental Precau es pessoais evite o contacto directo com a subst ncia Limpeza limpe normalmente a rea afectada n o s o necess rios cuidados adicionais Protec o da pele use uma bata de laborat rio 18 20 Apresenta o nana amarrar enem nnns 4 Altera es e melhoramento do Produto ms 4 Controlo da Qualidade 4 Componentes do PAI 4G5 Box 1 0 Typing Kit 5 Protocolo de amplifica o por PCR 6 Reagentes sistemas n das raias eg 6 Extrac o de DNA 6 Amplifica o por PCR is 6 Par metros do programa de PCR 7 Protocolo de electroforese em gel de agarose 8 Prepara o do gel a 2 8 als ojnigo fo SOs ccctriny rhein eae DO RR 8 Esquema da tira PAI 4G5 Box 1 0 9 Identifica o da tira PAI 4G5 Box 1 0 9 Tabela de interpreta o dos Resultados sssr 10 Guia de resolu o de problemas ieerees 11 Avisos precau es arara raiar 12 Gua TECNICO asi svarisamaindan o piasaeiro assina RO 13 ASAT AVE het se esc O ents ana tcnade vad ececas ak esse dataset 14 Aviso de Garantia sa cczssccassatee cenevannenencyenntassavainensceveneesanvarnetens 15 Declara o de Conformidade CE 16 Folha de dados de seguran a a 17 Refer ncias sirene aerea area r area aterrar anna 20 3 20 Apresenta o Este kit cont m tiras com misturas de primers de
13. mistura de reac o podem ser perigosos se inalados ingeridos ou absorvidos pela pele Este material pode causar irrita o da pele dos olhos e do tracto respirat rio A ingest o de grandes quantidades desta mistura pode causar dores de est mago v mitos ou diarreia 9 Medidas de Primeiros Socorros No caso de contacto com os olhos deve lavar imediatamente os olhos com gua abundante por cerca de 15 minutos Deve consultar o seu m dico No caso de contacto com a pele deve lavar imediatamente a zona afectada com gua corrente e sab o Lave a roupa contaminada antes da sua utiliza o No caso de ingest o lave a boca com gua abundante Deve contactar o seu m dico se necess rio No caso de inala o mudar a v tima para um local arejado Se se encontrar inanimado aplique respira o artificial Se apresentar dificuldades respirat rias aplique oxig nio Deve consultar o seu m dico 10 Medidas a tomar em caso de inc ndio Meios de extin o gua di xido de carbono p qu mico seco ou espuma apropriada Meios de extin o n o aconselhados n o existem restri es conhecidas Perigos espec ficos de exposi o em caso de inc ndio podem emitir fumos t xicos de di xido e mon xido de carbono nitrog nio f sforo cloreto de hidrog nio e g s hidrog nio Equipamento especial de combate ao inc ndio quando s o libertadas grandes quantidades de subst ncia trabalhe apenas com protec o adequada para ol
14. sidratadas e PCR Master Mix para efectuar a tipagem gen tica do polimorfismo 4G5 do gene PAI Altera es e melhoramento do Produto Este produto pode ser melhorado de modo a aumentar o seu rendimento As altera es adi es ou modifica es de primers em rela o ao lote anterior est o detalhadas na tabela abaixo Tubo primers motivo N A Controlo de Qualidade Devido inexist ncia de linhas celulares controlo n o foram feitos testes normais de controlo da qualidade Contudo a Genebox testou as misturas de primers com v rios DNAs padr o obtendo amostras positivas e negativas para cada uma das muta es A Genebox garante a qualidade e a fiabilidade do seu kit PAI 4G5 Box 4 20 Folha de Dados de Seguran a 1 3 Material Safety Data Sheet MSDS geneBOX R amp D Diagnostic Tests PCR SSP Kits Produtos de tipagem SSP da geneBOX Esta folha de dados de seguran a aplic vel a todos os produtos de tipagem por PCR SSP da geneBOx 1 Produtos Qu micos e Identifica o da Companhia Data de realiza o Dezembro 2010 Grupo do produto Produtos de tipagem SSP da geneBOx Manufactura o geneBOX R amp D Diagnostic Tests biocant centro de inova o em biotecnologia n cleo 4 lote 3 3060 197 cantanhede portugal tel fax 351 231 410 946 351 231 410 947 e mail info genebox com 2 Composi o e Informa o sobre os reagentes Componente Qu mico Nome vulgar Placa Acido D
15. tadas ciclos repetidos de congela o descongela o de modo a impedir a degrada o da amostra As amostras de DNA armazenadas em dH 0 permanecem est veis durante pelo menos 4 semanas a 42C ou 2 anos a 202C As amostras de DNA armazenadas em tamp o TE permanecem est veis durante pelo menos 2 anos a 42C ou 5 anos a 202C 14 20 Par metros do programa PCR Desnatura o 96 2C 1 min 1 Desnatura o 96 2C 25 seg 21 Emparelhamento 65 C 45 seg Extens o 72 C 30 seg Extens o 72 C 10 min 1 7 No final da PCR guarde a placa a 2 8 C 8 Detecte os produtos do PCR com uma electroforese em gel de agarose a 2 Protocolo de electroforese em gel de agarose Prepara o do gel de agarose a 2 1 Dissolver 4 gramas de p agarose em 200 ml de tamp o TAE 1x Dissolver completamente a agarose aquecendo a no microondas Arrefe a o gel at aproximadamente 502C Adicione pelo menos 20 pl de brometo de etidio 10 mg ml ou 2 ul de Sybr Safe 10000x concentrado a agarose Agite at estar completamente incorporado Numa superf cie nivelada monte a placa do gel com 96 po os Verta uma camada de gel com cerca de 5mm Deixe o gel arrefecer Aten o este reagente um forte agente mutag nico leia atentamente a MSDS do produto Electroforese se w Ne Submirja o gel na tina de electroforese com tamp o TAE 1X Remova os pentes com cuidado do gel Adicione 10 pl do prod
16. ue a concentra o e qualidade de todas as amostras de DNA antes de utilizar este kit Instru es de gerais de seguran a no laborat rio N o coma beba ou fume dentro do laborat rio Utilize sempre luvas descart veis e mude as com frequ ncia Utilize batas limpas e proteja os olhos sempre que se justifique Lave as m os antes e depois de qualquer manipula o de amostras ou reagentes Lave a rea de trabalho antes e depois de qualquer manipula o N o pipete com a boca 12 20 Esquema da tira PAI 4G5 Box 1 0 Direc o de pipetagem Identifica o da tira PAI 4G5 Box 1 0 Posi o Gene Local olim rfico 9 20 bela de interpreta o de resultados A Cc E G PAI Ins del 4G5 4G 140 790 Ins del 4G5 5G 140 790 B D F H PAI A c E G PAI B D F H PAI Ins del 4G5 4G 140 790 Ins del 4G5 5G 140 790 A Cc E G PAI Ins del 4G5 4G 140 790 Ins del 4G5 5G 140 790 B D F H PAI Qs pares de primers controlo emparelham com sequ ncias n o polim rficas Os primers de controlo positivo interno amplificam segmentos do gene PIC1 originando fragmentos com 790 pares de bases Na presen a da banda espec fica a banda controlo pode ver diminu da a sua intensidade A reac o de PCR s valida na presen a da banda controlo ou nalguns
17. uto de PCR em cada po o Ligue a tina de electroforese corrente com uma voltagem m dia 115V Deixe a electroforese correr por cerca de 20 minutos ou at o corante estar a 2 3 da linha Ponha o gel no transiluminador Fotografe o gel e identifique o Use a Tabela de interpreta o de resultados para interpretar os resultados 8 20 Guia T cnico 1 Pureza e Concentra o do DNA Para obter bons resultados com o PAI 4G5 Box 1 0Typing Kit a pureza da amostra de DNA cr tica Ter uma amostra pura significa obter uma raz o 260nm 280nm de DO superior a 1 6 e uma por o de DNA superior a 9 4 kb A elevada degrada o do DNA ou uma raz o 260nm 280nm inferior a 1 5 requer uma nova extrac o de DNA Cada amostra de DNA deve ter aproximadamente 100 a 200 ng ul Concentra es elevadas de DNA provocam um decl nio consider vel na especificidade da PCR Recomenda se o uso de qualquer kit de extrac o de DNA que apresente marca o CE de modo a obter um DNA extra puro 2 Tag Polimerase O PAI 4G5 Box 1 0Typing Kit foi intensivamente testado utilizando a Taq da Reagente 5 Reagente 5 Lisboa Portugal 3 Mistura de reac o Para uma boa performance da tipagem com o PAI 4G5 Box 1 0Typing Ki obrigat ria a utiliza o da PCR Master Mix fornecida com o Kit t 4 Procedimentos de amplifica o No fim da PCR examine o grau de evapora o e de condensa o da mistura de reac o da PCR Se as perdas
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