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MANUEL D`UTILISATION

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1. Copie d cran 57 Onglets Images Manuel d Utilisation Microscope Confocal Zeiss LSM 710 Pr cis 01 2014 Les ic nes Images A gauche de chaque image vous trouverez une s rie d ic nes qui vous permettra d explorer de diff rentes fa ons votre image Ic nes Version 1 01 14 Condition de pr sence Sur toutes les images Sur les images multi canaux Sur les images multi param triques par exemple Z satck Sur les images Z stack Sur les images Z stack Sur toutes les images Sur les images Z stack Sur toutes les images Sur les images multi canaux Sur toutes les images Sur les images multi canaux Service Commun de Microscopie Fonction Superposition de tous les canaux merge Affiche s par ment tous les canaux merge Affiche s par ment toutes les images qui composent l exp rience Affiche la vue orthogonale de l image Coupe en X Y et Z Permet d afficher un plan de section du Z stack Affiche la distribution des intensit s dans un pseudo mode 3D Reconstruction 3D des Z stacks Affiche l histogramme distribution de l intensit des pixels de l image ou d une r gion d int r t Outil d exploration de la colocalisation Permet de r aliser des profils d intensit Outil de s paration spectrale post acquisition 63 En bas de la zone image voir Copie d cran 56 Logiciel LSM Zen 2 p 62 Fen
2. Version 1 01 14 Service Commun de Microscopie 68 Manuel d Utilisation Microscope Confocal Zeiss LSM 710 Pr cis 01 2014 Changer de lame au cours de la session Si vous souhaitez changer de lame au cours de la session suivez la proc dure suivante ka m 8 9 10 11 12 13 14 Si vous tes sur un objectif sec V rifiez qu aucune acquisition confocale n est en cours absence de barre de progression dans la zone d activit Passez sur l onglet Locate voir Copie d cran 1 Fen tre 1 en mode Locate p 3 V rifiez que l ic ne Online est activ e voir Installation de l chantillon p 17 Etape 1 Appuyez sur la touche Load Position sur la droite du statif pour descendre la platine voir Initiation pilotage manipulation du microscope p 12 Descendez au maximum la platine en appuyant et maintenant appuy jusqu l arr t la touche Load position sur la droite du statif voir Initiation pilotage manipulation du microscope p 12 Retirez d licatement votre lame du porte objet faites glisser doucement la lame vers vous Mettez en place votre nouvelle lame sur le porte objet voir Installation de l chantillon p 17 Etape 10 Allumez la lumi re transmise voir Initiation pilotage manipulation du microscope p 12 Centrez votre chantillon dans le spot de lumi re gr ce au joystick x y Appuyez sur la touche Focus Position sur la droite du
3. 01 14 Service Commun de Microscopie 76 Manuel d Utilisation Microscope Confocal Zeiss LSM 710 Pr cis 01 2014 Proc dures en cas d incident EN CAS D URGENCE TECHNIQUE OU D INCIDENT SUR UN EQUIPEMENT RAPROCCHEZ VOUS IMMEDIATEMENT DU RESPONSABLE DE LA PLATE FORME EN CAS D ABSENCE DU RESPONSABLE DE LA PLATE FORME SUIVEZ LES PROCEDURES CI DESSOUS Proc dure Urgence Technique En cas d absence du Responsable de la Plate Forme ATTENTION Cette proc dure concerne uniquement les probl mes relatifs aux locaux du SCM Ne concerne pas les incidents relatifs aux microscopes En cas de probl me dans une pi ce Si vous constatez une anomalie dans une pi ce du SCM fuite d eau coupure d lectricit contactez imm diatement l atelier Service Technique du site et d crivez le probl me En cas de besoin insistez sur le caract re urgent d une intervention si par exemple de l eau menace de tomber sur un microscope A contacter en priorit Responsable Atelier Jos LUIT T l 01 42 86 20 19 Port 06 63 13 35 99 Si pas de r ponse vous pouvez essayer de contacter Accueil Service Technique T l 01 42 86 20 16 Version 1 01 14 Service Commun de Microscopie 77 Manuel d Utilisation Microscope Confocal Zeiss LSM 710 Pr cis 01 2014 Si vous entendez ou voyez de l eau couler du plafond Si l eau menace de tomber sur un microscope 1 Coupez imm diatemen
4. Dans notre exemple nous choisissons 7 Copie d cran 27 Zone Speed Panneau Acquisition Mode Voir Copie d cran 25 Le panneau Acquisition Mode p 38 Version 1 01 14 Service Commun de Microscopie 40 Manuel d Utilisation Microscope Confocal Zeiss LSM 710 Pr cis 01 2014 Le bas de la zone F Speed indique le temps pass par pixel Pixel Dwell et le temps pass pour un scan complet Scan time incluant toutes les tracks voir Copie d cran 27 Zone Speed Panneau Acquisition Mode Cadre bleu 8 Danslazone G d finissez le nombre d it rations pour la m thode s lectionn e en zone l Par d faut vous pouvez r gler ce param tre sur 2 ou 4 OO Plus pr cis ment Si la m thode choisie en I est Mean a plus vous mettez d it rations en G plus vous am liorez le rapport signal bruit mais plus vous allongez le temps d acquisition Dans notre exemple nous choisissons 2 9 Dans la zone H choisissez le mode Line ou Frame CO Plus pr cis ment Si nombre d it rations en G est 4 et que la m thode choisie en l est Mean Line Le scanner fera 4 fois l acquisition de la 1 ligne puis fera la moyenne sur ces 4 lignes Le scanner passe ensuite la 2 ligne fait 4 fois l acquisition de la 2 ligne puis fera la moyenne sur ces 4 lignes Frame Le scanner fait une UU fois toute l image puis une 2 fois une 3
5. Si votre probl matique ne n cessite pas de r cup rer toutes l information en x y vous pouvez adapter la r solution en zone D Vous pourrez ainsi gagner du temps lors de l acquisition La valeur de r solution par d faut est 1024 x 1024 Entrez cette valeur manuellement puis appuyez sur Enter apr s chaque saisie ou s lectionnez des r solutions raccourcies en cliquant sur l ic ne suivante KZ x i Se voir zone D La valeur 1024 x 1024 est un bon compromis entre le temps d acquisition et la quantit d information recueillie Dans notre exemple nous choisissons 1024 x 1024 A Attention Souvenez vous que toutes les valeurs de r solution en dessous de la r solution optimale ne vous permettent pas de r cup rer toute l information donn e par l objectif D finissez une valeur de r solution inf rieure la r solution optimale uniquement si votre probl matique vous le permet 6 Dans la zone E mettez le Line Step sur 1 7 Dans la zone F Speed r glez la vitesse entre 6 et 7 OO Plus pr cis ment Cette zone permet de d finir la vitesse du scanner Plus la valeur est faible plus le scanner est lent Plus la vitesse est lente plus l image sera de qualit les vitesses lentes permettent d am liorer le rapport signal bruit Mais attention plus la vitesse est lente plus le temps d acquisition s allonge Il faut donc comme pour les autres param tres trouver le bon compromis
6. Si vous reprenez le microscope apr s un autre utilisateur qui aurait fait une mise au point trop haute et que vous appuyez sur Focus Position vous casserez votre lame Assurez vous que la position de focus corresponde bien vos besoins avant d appuyer sur Focus Position la premi re fois lorsqu une lame est charg e Voir Installation de l chantillon p 17 Etape 12 L gt Touche Load Position voir Photo s 9 p 14 G En appuyant sur cette touche vous descendez rapidement la platine en position basse Une fois cette position atteinte vous pouvez r appuyer et maintenir la touche Load position pour descendre au maximum la platine L cran de contr le indiquera alors Lower limit is reached Au dessus des vis macro microm triques gauche et droite vous trouverez une s rie de 5 touches de raccourcis Au dessus de la vis de gauche les touches permettent La touche centrale plate permet d ouvrir ou fermer le shutter de la lampe fluo voir Photo s 9 p 14 A Les 2 touches ergonomiques vers l arri re du statif permettent de faire tourner les cubes dans un sens ou dans l autre voir Photo s 9 p 14 B et C Au dessus de la vis de droite les touches permettent La touche centrale plate permet d allumer et d teindre la lampe halog ne voir Photo s 9 p 14 E Une molette sur la droite du statif vous permet d ajuster l intensit de la lampe halog ne voir Photo s 9 p 14 D Le
7. MES 458 561 Plate NoneLSM Visible light Invisible light S Stage Focus S Stage Focus T PMT T PMT gt de Stage Focus T PMT gt Copie d cran 17 Configuration des tracks pour l exemple La track 1 permettra de visualiser le DAPI la track 2 l Alexa 488 et la track 3 le TRITC A quoi servent les diff rents l ments du trajet optique S lection de la ou des raie s lasers visibles pour exciter l chantillon J S lection de la raie laser invisible pour exciter l chantillon K S lection du miroir dichro que principal MBS Main Beam Splitter pour la voie visible doit permettre de r fl chir la ou les longueur s d ondes s lectionn e s l ic ne l L S lection du miroir dichro que principal MBS Main Beam Splitter pour la voie invisible doit permettre de r fl chir la ou les longueur s d ondes s lectionn et s l ic ne J Les valeurs indiqu es sur les miroirs dichro ques principaux MBS Main Beam Splitter repr sentent les longueurs d ondes r fl chies par ce miroir Le miroir dichro que principal ne r fl chit donc QUE les longueurs d ondes indiqu es par les valeurs Toutes les autres longueurs d ondes passent travers le miroir MES 458 561 Ex le ne r fl chit QUE 458 nm et 561 nm Voir Copie d cran 16 Panneau Light Path p 30 Manuel d Utilisation Microscope Confocal Zeiss LSM 710 Pr cis 01 2014
8. Service Commun de Microscopie Microscope Confocal Zeiss LSM 710 Version 1 Pr cis Janvier 2014 MANUEL D UTILISATION Pr cis SERVICE COMMUN DE MICROSCOPIE MANUEL D UTILISATION Microscope Confocal Zeiss LSM 710 Version 1 Pr cis Janvier 2014 Sommaire PR SENTATION DUMICROSCOPE gege 1 PRESENTATION DU SOFTWARE tee 3 DESCRIPTION DES FENETRES ERNEIEREN AE EEN 4 GESTION DE L ESPACE DE RAA a a ee 5 BETA NDEN ae Ge a aa ea da a a a na a oc debout 5 DEMARRAGE DU MICROSCOPE E 6 OGESLON DES DONNEES E A D danse eee nee name en den nee nee eee Den nee De rene ee cases 9 PENDANT LA WE 9 ENAN DESEG ION oispa n E en E A E EEE E 9 ERGEALEIIEINGOEK ENEE Ee 11 DEMARRAGE DUCOGICIEL een 11 INITIATION PILOTAGE MANIPULATION DU MICROSCORE ttost tretet etet oett oett e En eee EPSE EPSE EEPE EEEPE Enee Eneee ennenen nene 12 Ce que vous pouvez faire dans le logiciel osennnossennesseenessreressreressreressrrresssrressseresssrressserressrreessrrresserressrrresseeresssrressererss 12 Ce que vous pouvez faire sur l cran de contr le essnnnesssenessrenessreressrrressrrresserrrsssrressserressrreesserressereessrreessereesserresserersss 13 Ce que vous pouvez faire sur le microscope is iiesssiineessessenesseesenesseeccnnseeceneseeeeeenseese 14 INSTALLATION DE L ECHANTILLON WE 17 REALISATION DETA MISE AU POIN EE 22 Pour faire la mise au point en fluorescence 22 Pour faire la mise au point en lumi re blanch
9. Version 1 01 14 Service Commun de Microscopie 12 Manuel d U ltsation Microscope Confocal Zeiss LSM 710 Pr cis 01 2014 Ce que vous pouvez faire sur l cran de contr le Pour acc der aux fonctions de pilotage sur l cran de contr le voir Photo s 1 Vue d ensemble du microscope confocal Zeiss LSM 710 p 1 Ic ne D appuyez tout d abord sur l ic ne Microscope D voir Photo s 6 Ecran de contr le Onglet Home ci dessous Vous pourrez alors Ouvrir Fermer le shutter de la lampe fluo Cliquez sur on ou off dans la zone RL Reflected light Zone A Allumer Eteindre la lampe halog ne Cliquez sur on ou off dans la zone TL Transmitted light Zone B Choisir votre objectif 10x sec 20x sec 63x eau 63x huile Cliquez sur l ic ne puis cliquez sur l objectif voulu Choisir votre cube de fluorescence Bleu Vert ou Rouge Cliquez sur l ic ne D puis choisissez le cube voulu Photo s 6 Ecran de contr le Onglet Home Photo s 7 Ecran de contr le Onglet Microscope Ajuster la mise au point de fa on macro ou microm trique gr ce aux 2 vis sur la droite de l cran de contr le Voir Photo s 8 Ecran de contr le Vis de focus ci dessous Photo s 8 Ecran de contr le Vis de focus Voir Photo s 7 Ecran de contr le Onglet Microscope Version 1 01 14 Service Commun de Microscopie 13 Manuel d Utilisation M
10. Copie d cran 47 Copie d cran 48 Copie d cran 49 Copie d cran 50 Copie d cran 51 Copie d cran 52 Copie d cran 53 Copie d cran 54 Copie d cran 55 Copie d cran 56 Copie d cran 57 Copie d cran 58 Copie d cran 59 Copie d cran 60 Copie d cran 61 Copie d cran 62 Photos Manuel d Utilisation Microscope Confocal Zeiss LSM 710 Pr cis 01 2014 Valeurs de Gain Master apr s ajustement sisi scnerssssssenessssssnns 51 Ajustement Dietal OMS e 52 Barre d ic nes Zone Experiment Manager 53 Jensen e E 54 Bane d OSSI eue 55 Experiment Manace SAR a a 55 lte 10 PAS Tel PR TR E E T 56 BEER EE ee 57 Barre de pr gression ZE CR a ne 57 Fen tre 3 Image non sauvegard e eege EE 58 Fen tre 3 Images sauvegarde es iii snnnsssscnensscenesesceensessennnssse 58 FE N A a E 59 D Gue D a E S 59 Cr ation nouveau dossier 60 Enregistrement d EE 60 M ECEE E r an E 61 Loze MZN a 62 One REES ra E A E 62 Oul complement aires ee 64 onele DIEN OR E a de ee 64 RTE DIDI RER RE ET 65 omelet 5 2 SR RE RE 66 COPEC CODE de a 66 Copie d cran 63 Planning ee SAT ee 72 Photo s 1 Vue d ensemble du microscope confocal Zeiss LSM 710 ns 1 Photo s 2 Etape de d marrage du MICTOSCOD ii e 6 POI OS IS ReO e e de a ee ee 7 Photos 4 Demarrage SO a ce 8 PROD SE REMONTER r nee a eee lee ee ee 8 Photo s 6 Ecran de contr le Onglet Home 13 Phot
11. Digital Offset Vous avez 3 solutions pour ajuster le Digital Offset Utilisez les fl ches haute et basse droite de la valeur num rique de l offset ajustement pr cis Cliquez et maintenez le curseur puis faites le glisser gauche augmentation de l offset ou droite diminution de l offset Cliquez sur la barre de glissement puis tournez la molette de la souris dans un sens ou dans l autre Par d faut l offset est autour de 0 Cette valeur donne la plupart du temps des r sultats satisfaisants Vous pouvez ajuster cette valeur si vous le souhaitez mais veuillez toujours ne pas mettre trop d offset au risque de perdre votre signal d int r t 17 Stoppez le live en cliqua nt sur l ic ne Stop voir Copie d cran 2 Fen tre 1 en mode Acquisition Colonne a Zone Experiment Manager Voir Copie d cran 29 Panneau Channels p 43 Version 1 01 14 Service Commun de Microscopie 52 Manuel d Utilisation Microscope Confocal Zeiss LSM 710 Pr cis 01 2014 Les ic nes de la barre suivante changent de forme en fonction de leur tat AF OH Et el Ei Find Focus Set Exp Continuous snap Copie d cran 42 Barre d ic nes Zone Experiment Manager voir Copie d cran 2 Fen tre 1 en mode Acquisition p 3 colonne a Les ic nes se transforment en elles sont actives Cliquez simplement sur cette ic ne Stop pour arr ter le
12. M Indique le cube de fluorescence en place Il faut donc s assurer ici que cette ic ne soit sur None LSM pour laisser passer librement le laser LA D D D D D A D LA O Permet de d tecter le signal en transmission si l ic ne est activ e D D D LA D D G Permet de visualiser et d ajuster la bande passante de d tection du signal La bande passante doit 3 Laisser passer dans la mesure du possible le pic d mission du fluorochrome 4 Bloquer la longueur d onde d excitation 5 Bloquer l mission provenant ventuellement d autres fluorochromes pr sents dans l chantillon Pour ajuster la largeur de la bande cliquez et maintenez sur une extr mit de la bande puis fais glisser avec la souris Si nous analysons maintenant la configuration cr e par le Smart Setup pour notre exemple nous remarquerons que le logiciel a mis en place des miroirs dichro ques diff rents Zone K et L pour chacune des tracks voir tableau ci dessous Gu 1488 1514 1561 1633 1458 1488 1514 1561 1633 11458 11488 1514 1561 1633 Plate Rien MBS 488 561 633 MBS 458 561 o MBS 405 Plate Rien Plate Rien t gt ce miroir permet bien de L gt ce miroir permet bien de i gt Ce miroir permet bien de Conclusion r fl chir la raie 405 nm r fl chir la raie 488 nm r fl chir la raie 561 nm s lectionn e enJ s lectionn e en l s lectionn e en l La configuration cr e par le Smart Setup fonctionne bi
13. Si vous tes sur un objectif immersion sssssesssssresssrrresssrressrrressrrressrrrrsssrrressreressreressrrressreressreressreressrtressreressseressnereessene 69 RAPPEL DES PARAMETRES D ACQUISITION D UNE IMAGE sense scennnesscennnesscennn nee ccennn nee ccennn nes ccennn ess eennn es ceennn ee ceenne es ceenenssseeneesesse 70 FINDE SESSION WT 71 ETAPESINITIALES TER 71 PROCEDURE DE FIN N 1 SANS ARRET DE L EQUIPEMENT uses esessssenenescsnnecenenso semence eenene semence semence cenene cena eecenenecceneneceneneecenenecesnenesenese 73 PROCEDURE DE FIN N 2 ARRET DE L QUIPEMENT sus eue csnsesenessocenenescenneceneneeceneneccenene semence cena ec te tutt sete ceneneceeneneceneneecenenececeenecesuse 74 PROCEDURES EN CAS D INCIDENT ee EE 77 PROCEDURES URGENCE TECHNIQUE EN CAS D ABSENCE DU RESPONSABLE DE LA PLATE FOoRME id es ennssssnnsssssnnns 77 ncaside probleme dans ee Ee 77 Si vous entendez ou voyez de l eau couler du plafond sisi 78 PROCEDURE EN CAS D INCIDENT EQUIPEMENT eege eelere 79 Encas d absence du Responsablede la Plate Forme serso RER Aa EE Eed 79 Si vous ne trouvez personne pour r soudre le probl me 79 TABLE DES ILLUSTRATIONS oria EA AAAA AA a ESTS 81 COPIES D CRAN E E Pa ed E a de A da 81 Manuel d Utilisation Microscope Confocal Zeiss LSM 710 Pr cis 01 2014 Pr sentation du microscope Te z Ce S 3 Een Photo s 1 Vue d ensemble du microsc
14. Version 1 01 14 Service Commun de Microscopie 28 Manuel d Utilisation Microscope Confocal Zeiss LSM 710 Pr cis 01 2014 Inconv nient de cette solution Dans certaines conditions des fuites spectrales peuvent tre observ es AN Attention N utilisez pas la solution Best Compromise de fa on syst matique Des fuites spectrales peuvent tre observ es avec cette solution Analysez bien vos fluorochromes pour v rifier que cette solution est adapt e vos besoins En cas de doute rapporchez vous du personnel de la Plate Forme Pour notre exemple nous choisirons la solution Best Signal pour obtenir le meilleur signal et limiter au l e Best signal maximum le risque de fuite spectrale Nous cliquons donc sur la solution 5 Une fois le type de configuration s lectionn cliquez sur pour valider votre choix Le logiciel cr e alors la configuration que nous allons ajuster dans la suite de la proc dure Dans notre exemple le logiciel va donc cr er une configuration avec 3 tracks 1 track pour chaque fluorochrome conform ment la solution Best Signal Fin de la fen tre Smart Setup Il faut maintenant ajuster la configuration Pour cela rendez vous dans le panneau Light Path voir Copie d cran 2 Fen tre 1 en mode Acquisition p 3 Colonne a Zone Setup Manager al La proc dure continue sur la page suivante Version 1 01 14 Service Com
15. e 1 seule track pour l acquisition de tous les fluorochromes mode simultan al L excitation de tous les fluorochromes se fera en m me temps La d tection du signal de fluorescence se fera en m me temps pour tous les fluorochromes Avantage de cette solution Solution la plus rapide Inconv nient de cette solution Risque important de fuites spectrales N utilisez cette solution que si vos fluorochromes sont bien s par s spectralement D Best Signal Cette proposition cr e 1 track pour chaque fluorochrome mode s quentiel Si vous imagez 3 fluorochromes cette solution cr e une configuration avec 3 tracks Chaque fluorochrome est excit puis observ individuellement Avantage de cette solution Cette solution vous permettra de b n ficier de tr s bonne s paration spectrale R duction au maximum du risque de fuites spectrales Inconv nient de cette solution Acquisition longue Ch Best compromise Cette proposition regroupe dans les m mes tracks les fluorochromes loign s spectralement les uns des autres Le best compromise s efforce de limiter les fuites spectrales cr e des tracks suppl mentaires si les fluorochromes sont trop proches spectralement tout en minimisant le temps d acquisition regroupe dans des tracks identiques les fluorochromes loign es spectralement Avantage de cette solution Meilleur compromis entre le temps d acquisition et la qualit du signal recueilli
16. et recherchez la position en z la plus satur e Tout en haut de l chantillon Position en z la plus satur e Tout en bas de l chantillon gt Copie d cran 37 Recherche du Z le plus intense A Attention Tournez tr s d licatement la vis microm trique dans un sens ou dans l autre Laissez le temps au microscope et au logiciel de rafraichir l image 15 Apr s avoir trouv en z la position la plus satur e ajustez la valeur de Gain Master pour chacun des canaux Le but est d exploiter au mieux la dynamique du d tecteur Il faut donc avoir uniquement quelques pixels rouges dans chaque canal Pour toutes les tracks pr sentes dans la zone A du panneau Channels s lectionnez les tracks une une puis L Dans la zone F du panneau Channels diminuez ou augmenter la valeur du Gain Master de fa on obtenir uniquement quelques pixels rouges pour chaque channel Copie d cran 38 R glage Gain Master Voir Copie d cran 29 Panneau Channels p 43 Version 1 01 14 Service Commun de Microscopie 50 Vous avez 3 solutions pour ajuster le Gain Master Utilisez les fl ches haute et basse droite de la valeur num rique du gain ajustement pr cis Cliquez et maintenez le curseur puis faites le glisser gauche diminution du gain ou droite augmentation du gain Cliquez sur la barre de glissement puis tournez la molette de la souris dans un sens ou d
17. glage du Gain Master G R glage du Digital Offset H R glage du Digital Gain La zone A permet de s lectionner une track pour ajuster ses param tres La zone B permet d ajuster les param tres de la track s lectionn e en A Pour chacune des tracks il y aura 4 l ments r gler en zone B Le pourcentage de transmission du laser La taille du pinhole La valeur du Gain Master La valeur du Digital Offset R glage du panneau Channels Les valeurs donn es dans la suite de la proc dure se rapportent l chantillon Suivez la m thode d crite ci apr s et adaptez les r glages selon vos besoins La proc dure 1 Ouvrez le panneau Channels s il n est pas ouvert puis cochez l option Show All si elle n est pas activ e Voir Copie d cran 29 Panneau Channels p 43 Version 1 01 14 Service Commun de Microscopie 43 Manuel d Utilisation Microscope Confocal Zeiss LSM 710 Pr cis 01 2014 Pour s lectionnez une track cliquez simplement sur la track de votre choix dans la zone A La zone B se met alors jour et vous montre les param tres concernant la track s lectionn e Tracks Channels OL hb DAPI Track 2 A4BS Track 3 TRIT y n Select All Unselect All Copie d cran 30 S lection Track Panneau Channels e e Pour toutes les tracks pr sentes dans la zone A s lectionnez les tracks une une puis gt 2 Dans la zone
18. 1 Zone 1 p 3 permet d interagir avec le microscope de le configurer en mode pifluorescence ainsi qu en mode confocal et de traiter les images L onglet Locate vous permet de manipuler le microscope en mode pifluorescence L l onglet Acquisition vous permet de manipuler et configurer le microscope en mode confocal Cet onglet est subdivis en 3 colonnes a b et C Voir Copie d cran 2 Fen tre 1 en mode Acquisition p 3 La colonne de gauche comprend une zone Experiment Manager et une zone Experiment Setup Cette colonne permet de d finir les param tres d exp rience et configurer le trajet optique en mode confocal La colonne centrale da Zone Acquisition Parameter al permet de param trer le scanner et les channels La colonne de droite C Zone Multidimensional Acquisition permet de configurer les exp riences multiparam triques D onglet Processing vous permet de traiter vos images ex Projection La fen tre centrale 2 Copie d cran 4 Logiciel LSM Zen 1 Zone 2 p 3 affiche les images acquises ou en cours d acquisition La fen tre de droite 3 Copie d cran 4 Logiciel LSM Zen 1 Zone 3 p 3 vous permet de g rer la sauvegarde des images La lecture et l utilisation de ce logiciel se fait donc de gauche droite de mani re chronologique 1 Configuration du microscope en mode pifluorescence et mode confocal 2 Visu
19. 2 S lectionnez vos fluorochromes gr ce au menu d roulant voir Copie d cran 9 Fen tre SpectraViewer p 24 Ic ne A Utilisez Add pour ajouter des fluorochromes voir Copie d cran 9 Fen tre SpectraViewer p 24 Ic ne B Ici nous avons donc s lectionn DAPI Alexa 488 et TRITC 3 Visualisez les spectres d excitation et d mission des fluorochromes de l chantillon Passez le curseur de la souris sur les spectres pour visualiser les valeurs de longueurs d ondes aux diff rents pics Tetremethylrhodemine TAMRA TRITC DAPI Alexa Fluor 488 Relative Intensity 300 400 500 600 700 800 900 Wavelength nm d Pointer Location 498nm 99 Fluorophores Alexa Fluor 488 Copie d cran 10 Spectres des fluorochromes L gende En pointill s Spectre d excitation En continu Spectre d mission 4 Pour chaque fluorochrome notez la valeur du pic d excitation et du pic d mission en remplissant le tableau ci dessous vous trouverez des tableaux vierges sur le bureau Fluorochrome s Valeur du Pic d excitation nm Valeur du Pic d mission nm Disponible en t l chargement sur le site du SCM la rubrique Documentation Pour notre exemple nous avons Fluorochrome s Valeur du Pic d excitation nm Valeur du Pic d mission nm Version 1 01 14 Service Commun de Microscopie 25 Manuel d Utilisation Microscope Confocal Zeiss LSM 710
20. 63x 1 40 Oil DC M27 Copie d cran 26 V rification objectif Panneau Acquisition Mode A Attention V rifiez bien l objectif De nombreux param tres que vous allez r gler dans la suite de la proc dure d pendent directement de l objectif utilis Dans notre exemple nous avons bien l objectif 63x 1 4 Oil 3 DanslazoneB Scan mode s lectionnez Frame CO Plus pr cis ment Zone Scan Mode Permet de d finir un mode de scan Frame permet de scanner en x et y donc d acqu rir selon une forme carr e ou rectangulaire Line permet de scanner sur une ligne uniquement L image recueillie est donc une simple ligne Frame Line Dans notre exemple nous choisissons Frame Voir Copie d cran 25 Le panneau Acquisition Mode p 38 Version 1 01 14 Service Commun de Microscopie 39 Manuel d Utilisation Microscope Confocal Zeiss LSM 710 Pr cis 01 2014 eg e Optimal Ges x 4 Cliquez sur l ic ne C pour d finir la r solution optimale dans la zone D Frame Size Vous voyez maintenant en zone D le nombre de points faire en x et en y pour r cup rer toute l information Ou est capable de d livrer l objectif Dans notre exemple nous avons 1800 x 1800 pixels 5 Si votre probl matique exige de r cup rer toute l information par exemple sur une probl matique de colocalisation prot ine prot ine ne modifiez pas la r solution optimale d finie l tape 4
21. H comprenant les raies suivantes L gt 1 Diode Laser CW pulsed 405 nm de 30 mW L gt 1 Argon multiraies 458 488 514 nm de 25 mW L gt 1 Diode Laser DPSS 561 nm de 20 mW L gt 1 H lium N on 633 nm de 5 0 mW 1 t te confocale voir Photo s 1 p 1 1 comprenant L Un scanner X Y L gt Des photomultiplicateurs pour la d tection du signal Version 1 01 14 Service Commun de Microscopie 2 Le logiciel Zen 2011 de Zeiss pilote ce microscope L ensemble des op rations de contr les du microscope pourra se faire directement dans le logiciel Copie d cran 1 Fen tre 1 Copie d cran 2 Fen tre 1 en mode Acquisition Copie d cran 3 Fen tre 1 en en mode Locate mode Processing b_ Acquisition Parameter c_Multidimensional Acquisition ere sl es sl y 2 D LO D al Gm 9 21 m Copie d cran 4 Logiciel LSM Zen 1 Manuel d Utilisation Microscope Confocal Zeiss LSM 710 Pr cis 01 2014 Le logiciel LSM Zen se d compose de la fa on suivante une barre de menu A 3 fen tres principales 1 2 et 3 Voir page pr c dente une barre d activit B Description des fen tres principales La fen tre de gauche 1 voir Copie d cran 1 Fen tre 1 en mode Locate Copie d cran 2 Fen tre 1 en mode Acquisition Copie d cran 3 Fen tre 1 en mode Processing et Copie d cran 4 Logiciel LSM Zen
22. Il existe 3 fa ons de piloter et manipuler le microscope L gt Depuis le logiciel dans l onglet a Locate D Depuis l cran de contr le L gt Directement sur le statif Ce que vous pouvez faire dans le logiciel Pour acc der aux fonctions de pilotage vous devez tre sur la fen tre Locate onglet A l ci dessous avec l ic ne Online activ e ic ne B ci dessous Vous pourrez alors gt Ouvrir Fermer le shutter de la lampe fluo Cliquez sur l ic ne C Choisir votre cube de fluorescence Bleu Vert ou Rouge Cliquez sur l ic ne D puis choisissez le cube voulu Choisir votre objectif 10x sec 20x sec 63x eau 63x huile Cliquez sur l ic ne E puis cliquez sur l objectif voulu gt Allumer Eteindre la lampe halog ne cliquez sur l ic ne E puis cliquez sur on pour allumer Recliquez sur On pour teindre a Loc te FSet49 wf zm FSet38 wf FSet43 wf I None SE SW None Ocular L NoneLSM None None None None Closed Plan Apochromat 20x 0 8 M27 EC Plan Neofluar 10x 0 30 M27 Plan Apochromat 20x 0 8 M27 C Apochromat 63x 1 20 W Korr M27 Aperture 0 43 HF Plan Apochromat 63x 1 40 Oil DIC M27 APO Calibration LSM Empty position Copie d cran 7 Fen tre 1 Onglet Locate D tails Voir Copie d cran 4 Logiciel LSM Zen 1 p 3 Fen tre 1 Zone Onglets x Voir Copie d cran 7 Fen tre 1 Onglet Locate
23. cela agit sur l image 12 Cliquez sur l ic ne Live voir Copie d cran 2 Fen tre 1 en mode Acquisition a Colonne a Zone Experiment Manager L acquisition de l image se fait maintenant en boucle avec des param tres d acquisitions acc l r s qui permettent d avoir un rafraichissement de la vue assez rapide Bi A savoir Notez bien Si vous souhaitez faire une observation en boucle de l image avec vos param tres d acquisitions cliquez Continuous sur Continuous Tous vos param tres seront pris en compte pour r aliser la vue en boucle Attention le rafraichissement de l image peut tre plus lent qu en Live 13 En bas de la zone de l image voir ci dessous s lectionnez Range Indicator pour changer l affichage de l image a D K A T Range indicator activ Auto Minmi Best ft lt Range indicator d sactiv yane indicator Copie d cran 36 Range Indicator Manuel d Utilisation Microscope Confocal Zeiss LSM 710 Pr cis 01 2014 Une fois le Range Indicator activ vous voyez en bleu les pixels dans l offset consid r s comme nuls sur l image finale et en rouge les pixels saturation 14 Balayez en z toute l paisseur de l chantillon gr ce la vis microm trique vis la plus ext rieur de l cran de contr le Element n 6 voir Ce que vous pouvez faire sur l cran de contr le p 13
24. d placement en x y Le d placement en x et y de la platine s effectue avec le joystick x y pos droite du statif voir Photo s 1 Vue d ensemble du microscope confocal Zeiss LSM 710 p 1 Ic ne C Plus vous loignez le manche du centre plus le d placement de la platine est rapide De plus vous pouvez basculer de la gamme de vitesses rapides la gamme de vitesses tr s lentes id ale en mode confocal en appuyant sur la touche au sommet du manche voir Photo s 10 Utilisation joystick ci contre Photo s 10 Utilisation joystick Version 1 01 14 Service Commun de Microscopie 15 Manuel d Utilisation Microscope Confocal Zeiss LSM 710 Pr cis 01 2014 A Attention Si vous constatez que la platine ne se d place pas lorsque vous actionnez le joystick v rifiez que vous n tes pas en mode lent a Pour cela appuyez simplement sur la touche au sommet du manche et r essayez de d placer la platine Version 1 01 14 Service Commun de Microscopie 16 Manuel d Utilisation Microscope Confocal Zeiss LSM 710 Pr cis 01 2014 Installation de l chantillon Avant de sortir vos chantillons allumez une ou des lampes de bureau et teignez l clairage principal de la pi ce Chaque lampe de bureau est quip e d un variateur d intensit Utilisez le variateur pour ajuster la luminosit en fonction de vos besoins W SCH y Photo s 11 Variateur lumi re Gi ATTENTION
25. en contact avec l objectif quand vous voyez apparaitre un petit clat de lumi re dans la lame 16 Coupez la lampe halog ne l chantillon est maintenant install Si vous avez le moindre doute ou si vous rencontrez une difficult rapprochez vous imm diatement du Responsable de la Plate Forme Voir Initiation pilotage manipulation du microscope p 12 Version 1 01 14 Service Commun de Microscopie 21 Manuel d Utilisation Microscope Confocal Zeiss LSM 710 Pr cis 01 2014 R alisation de la mise au point Vous devez tre en mode Locate avec l ic ne Online activ e voir Installation de l chantillon p 17 Etape 1 Pour faire la mise au point en fluorescence 1 Mettez en place l cran de protection pour la fluorescence ee a e Zeck a o mg Photo s 18 Ecran de s lection SS Choisissez un cube de fluorescence Ouvrez le shutter de la lampe fluo Regardez dans les oculaires R glez l cartement interpupillaire si besoin AS E Ajustez la mise au point en tournant d licatement UNE vis microm trique gauche ou droite Para Photo s 19 Mise au point 6 Quand vous avez votre mise au point centrez votre champ d int r t sur le r ticule pr sent dans l oculaire droit a Zoom gt te Photo s 20 R ticule de vis e Vous pouvez mettre au point le r ticule en tournant uniquement le haut de l oculaire droit Voir In
26. milieu d immersion 9 Positionnez votre lame sur le porte objet Poussez l d licatement jusqu au fond pour ne pas se bloquer la lame doit rester bien parall le par rapport au bord haut et bas du porte objet lorsque vous la faites glisser jusqu au fond Version 1 01 14 Service Commun de Microscopie 20 10 11 12 13 14 15 D Manuel d Utilisation Microscope Confocal Zeiss LSM 710 Pr cis 01 2014 Photo s 16 Mise en place de la lame Allumez la lampe halog ne et r glez l intensit de fa on visualiser un spot de lumi re Centrez votre chantillon dans le spot de lumi re gr ce au joystick x y Appuyez sur la touche a Focus Position pour retourner la derni re position de focus enregistr e Comme vous avez manuellement descendu la position de focus l tape 3 vous devriez maintenant vous situer quelques millim tres en dessous de l objectif Recentrez au besoin votre chantillon dans le spot de lumi re Eteignez la lumi re halog ne Si vous tes avec un objectif sec passez directement l tape 16 Sinon terminez d approcher l il nu et manuellement la lame de l objectif jusqu ce que le milieu d immersion entre en contact avec l objectif Photo s 17 Approche de l objectif Information compl mentaire Utilisez la vis macrom trique pour approcher la lame de l objectif Tournez doucement la vis macrom trique vers le mur pour monter L huile est
27. minutes Photo s 21 Arr t Laser Argon 5 R cup rez votre chantillon a Descendez manuellement un petit peu la position de focus en tournant vers vous de quelques tours a vis macrom trique de gauche voir Initiation pilotage manipulation du microscope p 12 b Appuyez sur la touche Load Position sur la droite du statif pour descendre la platine voir Initiation pilotage manipulation du microscope p 12 c Descendez au maximum la platine en appuyant et maintenant appuy jusqu l arr t la touche Load position sur la droite du statif voir Initiation pilotage manipulation du microscope p 12 Retirez d licatement votre lame du porte objet faites glisser doucement la lame vers vous Nettoyez soigneusement votre lame 6 Si vous tiez sur un objectif immersion nettoyez soigneusement l objectif sinon passez directement l tape 7 a Prenez un papier optique et pliez le en 4 b Essuyez d licatement l objectif n appuyez pas fort Version 1 01 14 Service Commun de Microscopie 74 Manuel d Utilisation Microscope Confocal Zeiss LSM 710 Pr cis 01 2014 c Repliez votre papier optique d Ressuyez une nouvelle fois l objectif d licatement e Prenez un nouveau papier optique et pliez le en 4 Impr gnez le d alcool 50 puis essuyez une nouvelle fois d licatement l objectif avec ce papier Prenez un dernier papier optique et pliez le en 4 g Essuyez d licatement l objectif S
28. ouvrir une fen tre d authentification Entrez le nom d utilisateur et le mot de passe qui vous ont t fournis pendant la formation et appuyez sur Enter Attendez que la session s initialise Une fois la session initialis e quand l horloge et le calendrier sont affich s en haut droite de l cran sur le remote control mettez l interrupteur Components sur On puis attendez que la t te confocal s initialise vous entendrez diff rents bruits qui vous indiquent que la t te s initialise Photo s 5 Remote control 2 A NE PAS FAIRE N OUBLIEZ PAS DE METTRE L INTERRUPTEUR COMPONENT sur ON A CE MOMENT LA L tape de d marrage du microscope est maintenant termin e Si vous avez le moindre doute ou si vous rencontrez une difficult rapprochez vous imm diatement du Responsable de la Plate Forme Version 1 01 14 Service Commun de Microscopie 8 Manuel d Utilisation Microscope Confocal Zeiss LSM 710 Pr cis 01 2014 La gestion des donn es Une gestion des donn es efficace est primordiale pour permettre aux utilisateurs de pouvoir utiliser les quipements dans de bonnes conditions En effet une mauvaise gestion des donn es entrainerait une saturation des disques durs et diminuerait consid rablement les performances de l ordinateur de pilotage Pendant la session Pendant la session enregistrez vos images dans VOTRE dossier personnel sur le disque dur loc
29. statif voir Initiation pilotage manipulation du microscope p 12 Coupez la lumi re transmise voir Initiation pilotage manipulation du microscope p 12 Ajustez votre mise au point voir R alisation de la mise au point p 22 Faites vos nouvelles acquisitions voir Acquisition et enregistrement d images p 54 Si vous tes sur un objectif immersion V rifiez qu aucune acquisition confocale n est en cours absence de barre de progression dans la zone d activit Passez sur l onglet Locate voir Copie d cran 1 Fen tre 1 en mode Locate p 3 V rifiez que l ic ne Online est activ e voir Installation de l chantillon p 17 Etape 1 Appuyez sur la touche Load Position sur la droite du statif pour descendre la platine voir Initiation pilotage manipulation du microscope p 12 Descendez au maximum la platine en appuyant et maintenant appuy jusqu l arr t la touche Load position sur la droite du statif voir Initiation pilotage manipulation du microscope p 12 Retirez d licatement votre lame du porte objet faites glisser doucement la lame vers vous D posez une petite goutte de milieu d immersion sur votre nouvelle lamelle voir Installation de l chantillon p 17 Etape 9 Mettez en place votre nouvelle lame sur le porte objet voir Installation de l chantillon p 17 Etape 10 Allumez la lumi re transmise voir Initiation pilotage manipulation du micros
30. 165 19 Z Network 7 l Foer Fille name Save as type LSM SC lest Copie d cran 51 Fen tre Save As A Gg 4 Cliquez sur Computer Computer puis double cliquez sur le disque de stockage local D indiqu par DATA D 939 GE free of 1 81 TE l tiquette jaune sur l cran Le disque D s ouvre Version 1 01 14 Date modified 7 9 2013 1001 AM 7 9 2013 101 AM 10 4 2013 10 16 AM 12 10 2013 11 36 8 20 2013 11 31 AM 10 29 2012 9 32 AM 12 10 2013 12 59 11 18 2013 2 30 PM 11 14 2013 4 00 PM 6 5 2013 3 39 PM 6 20 2013 11 41 AM 11 6 2013 4 33 PM 7 12 2013 2 50 PM 10 29 2013 10 06 10 24 2013 8 36 AM 12 30 2013 12 50 12 30 2013 10 16 11 5 2013 10 45 AM 9 2 2013 227 PM 8 1 2013 12 56 PM 2 8 2013 1206 PM 8 2 2013 4 07 PM 3 16 2013 3 16 PM 10 29 2012 9 32 AM 12 12 2013 1 25 PM 6 24 2013 1 35 PM 2 18 2013 1 46 PM 12 19 2013 3 31 PM 8 6 2013 1101 AM 6 29 2013 11 45 AM 7 25 2013 12 53 PM 12 10 2013 10 02 11 1 2012 4 50 PM 10 23 2012 1 18 PM 7 8 2013 10 10 AM 7 24 2013 509 PM 12 13 2013 10 21 11 16 2012 9 59 AM 11 29 2013 6 06 PM 12 10 2013 502 PM 11 16 2012 10 00 10 22 2013 9 43 AM 9 6 2013 10 55 AM 4 26 2013 12 20 PM 8 29 2013 2 39 PM 12 23 2013 9 32 AM 4 8 2013 5 57 PM 11 8 2013 1 38 PM 5 28 2013 405 PM 12 20 2013 5 16 PM 7 5 2013 1 32 PM Copie d cran 52 Disque D Service Commun de Microscopie LA Cse m 59 Manuel d Uti
31. 488 514 Visible light Invisible light Panneau Light Path Nom du fluorochrome Raies d excitation visibles Raie d excitation invisible Miroirs dichro ques principaux pour la voie visible Miroirs dichro ques principaux pour la voie invisible Cubes de fluorescence Echantillon Photomultiplicateur pour la lumi re transmise Service Commun de Microscopie 30 Dans la Copie d cran 16 Panneau Light Path La zone D repr sente le trajet optique mis en place uniquement pour la track s lectionn e en zone C tack mis en surbrillance ici track 1 Notre exemple se compose de 3 tracks Pour visualiser le trajet optique de chacune des tracks cliquez simplement sur la track que vous souhaitez visualiser Zone C pour la mettre en surbrillance h La zone D se met alors jour et vous montre le trajet optique pour la track 1 Pour notre exemple nous avons donc Track 1 Track 2 Track 3 Frame L Frame Track Track kend Traki Track2 Track3 k Track 1 Color Detector Range Use Dye Detector Range Detector Range Chl 410 515nm Chi 415 735nm Chi 415 735nm ChS1 414 725nm v Alexa Fluor 488 ChS1 491 550nm ChS1 414 725nm Ch2 415 735nm Chi 415 735nm Ch2 Reflection Reflection 566 670nm Reflection MBS z K sac S MBS 405 NoneLSM Visible light Invisible light 488 561 633 Y Plate P NoneLSM Visible light Invisible light
32. A NE PAS FAIRE N utilisez pas le variateur pour allumer teindre la lampe Utilisez l interrupteur de la lampe de bureau Pour installer votre chantillon suivez les tapes indiqu es ci dessous 1 Choisissez votre objectif em Ls Cliquez sur l onglet Locate Voir Copie d cran 1 Fen tre 1 en mode Locate p 3 g L gt Une fois sur l onglet Locate cliquez sur Online MA voir Copie d cran 7 Fen tre 1 Onglet Locate D tails p 12 Ic ne B pour d verrouiller le mode pifluorescence L gt S lectionnez votre objectif en cliquant sur l ic ne Objectives g Voir Copie d cran 7 Fen tre 1 Onglet Locate D tails p 12 Ic ne E puis sur l objectif de votre choix EC Plan Neofluar 10x 0 30 M27 Les objectifs votre disposition sont les suivants A 10x sec JAMAIS D HUILE SUR CET OBJECTIF B 20x sec JAMAIS D HUILE SUR CET OBJECTIF C 63x Immersion EAU UTILISEZ UNE GOUTTE DU MILIEU d he ee ER GE D IMMERSION EAU UNIQUEMENT APO Calibration LSM D 63x Immersion HUILE UTILISEZ UNE GOUTTE DU MILIEU D IMMERSION HUILE UNIQUEMENT Plan Apochromat 20x 0 8 M27 C Apochromat 63x 1 20 W Korr M27 Empty position L objectif se met alors en place Si vous passez d un objectif sec un objectif immersion ou inversement le message suivant apparaitra sur l cran de contr le Comme vous n avez pour le moment pas de lame mont e sur le microsco
33. Acquisition Mode ci dessus Cadre bleu Pour r initialiser le zoom cliquez sur l ic ne N Reset All taille d image standard V rifiez que la valeur de zoom en M soit bien 1 0 Sinon cliquez sur Reset All pour obtenir une taille d image standard Dans notre exemple nous avons bien une taille de zoom gale 1 0 en M On ne touche donc rien A Attention Si des modifications ont t apport es cette zone Scan Area ou si vous avez cliquez sur Reset All a il faut red finir la r solution l tape 4 et 5 Voir Copie d cran 25 Le panneau Acquisition Mode p 38 Version 1 01 14 Service Commun de Microscopie 42 Manuel d Utilisation Microscope Confocal Zeiss LSM 710 Pr cis 01 2014 Le panneau Channels Ce panneau va vous permettre de r gler les param tres concernant les diff rentes channels A Channels w i Show all Tracks Channels S Track 1 DAPI S Track A488 M Track 3 Ke LT Select All Unselect All Asma 488 w d lege z Z z 405 458 488 514 561 633 405 458 488 514 561 633 405 458 488 514 561 633 Copie d cran 29 Panneau Channels L gende A S lection des tracks C R glage du pourcentage de transmission du laser B Zone de visualisation et d ajustement des param tres pour la track D R glage de la taille du pinhole s lectionn e en A E Raccourci pour d finir la taille du pinhole 1 Airy Unit F R
34. C ajustez le pourcentage de transmission du laser Evitez de d passer 2 risque de photoblanchiement tr s rapide au del de 2 L id al pour ce r glage est entre 0 1 et 1 Vous pouvez commencer par 1 5 R p tez cette l tape pour toutes les tracks pr sentes dans la zone A Pour l exemple nous avons donc r p t l tape 2 pour le DAPI l Alexa 488 et le TRITC 3 S lectionnez la track avec la plus courte longueur d onde d mission ici la track 1 puis cliquez sur l ic ne E pour d finir la taille du pinhole 1 AU Max Copie d cran 31 S lection 1AU Panneau Channels CO Plus pr cis ment L unit d Airy est bas e sur les disques d Airy Ces disques sont en fait la figure de diffraction d un point voir illustration ci dessous Figure 1 Figure de CH diffraction d un point Voir Copie d cran 29 Panneau Channels p 43 Version 1 01 14 Service Commun de Microscopie 44 Manuel d Utilisation Microscope Confocal Zeiss LSM 710 Pr cis 01 2014 Si l on mesure l intensit le long de la ligne trac e ci dessous on obtient le profil d intensit suivant Mesure de l intensit le long dela sr te D A ligne Profil d intensit gt lt D D 1 Airy Unit La distance D du 1 pic d intensit correspond 1 Airy Unit 1 AU La largeur de ce premier pic varie en fonction de la longueur d onde d mission du fluorochrome et de l ouverture n
35. Hi BW N R ajustez vos param tres d acquisitions en prenant en consid ration ce nouvel objectif voir R glage des param tres d acquisition p 38 8 Faites vos nouvelles acquisitions voir Acquisition et enregistrement d images p 54 Passage d un objectif sec un objectif immersion 1 V rifiez qu aucune acquisition confocale n est en cours absence de barre de progression dans la zone d activit Passez sur l onglet Locate voir Copie d cran 1 Fen tre 1 en mode Locate p 3 V rifiez que l ic ne Online est activ e voir Installation de l chantillon p 17 Etape 1 S lectionnez votre objectif dans le logiciel Onglet e Locate voir Initiation pilotage manipulation du microscope p 12 Hi BB UN L objectif se met en place automatiquement et la platine descend automatiquement en position load a L cran de contr le indique Change Immersion 6 Allumez la lumi re transmise voir Initiation pilotage manipulation du microscope p 12 7 Descendez au maximum la platine en appuyant et maintenant appuy jusqu l arr t la touche Load position a sur la droite du statif voir Initiation pilotage manipulation du microscope p 12 8 D posez une petite goutte d huile sur la lamelle dans le spot de lumi re 9 Appuyez sur la touche Focus Position sur la droite du statif voir Initiation pilotage manipulation du microscope p 12 a Coupez la lu
36. PORTENT DES BAGUES Si le porte objet est positionn correctement passez directement l tape 8 sinon suivez l tape 7 Photo s 13 Montage platine 2 7 A r aliser uniquement si le porte objet n est pas mont ou mal mont sur la platine Montez correctement le porte objet sur la platine Tenez le porte objet avec les 2 mains La main gauche tenant le c t gauche en bas et la main droite tenant le c t droit en bas Photo s 14 Mise en place du porte objet Manuel d Utilisation Microscope Confocal Zeiss LSM 710 Pr cis 01 2014 L gt Tirez doucement le porte objet vers vous en le faisant glisser sur le rail jusqu en but e Zoom gt Gi ATTENTION A NE PAS FAIRE Tirez tr s d licatement le porte objet vers vous Ne forcez jamais surtout quand vous arrivez en but e sinon vous risquez de d placer et de d calibrer la platine Vous risquez aussi d endommager les moteurs L gt Maintenez le coin en bas gauche avec l index gauche puis poussez d licatement le coin en haut droite vers le coin en bas gauche avec l index droit jusqu enclenchement complet du porte objet Comme pour l tape f ne Ee QE Zoom gt Fin tape facultative 8 Si vous avez choisi un objectif sec 10x ou 20x passez directement l tape 9 Si vous avez choisi un objectif immersion d posez une petite goutte de milieu d immersion sur votre lame Photo s 15 D p t
37. Pr cis 01 2014 Configuration du trajet optique en mode confocal 1 Cliquez sur l onglet acquisition ess Smart Setup 2 Cliquez sur Smart Setup a_Experiment Manager La fen tre Smart Setup s ouvre L gende A Choix des fluorochromes Configure your expermient B Choix du type de configuration e Proposals al C Ic ne e Apply pour valider le choix Copie d cran 11 Fen tre Smart Setup La fen tre Smart Setup voir Copie d cran 4 Logiciel LSM Zen 1 p 3 Fen tre 1 Zone Onglets voir Copie d cran 2 Fen tre 1 en mode Acquisition p 3 Colonne a Zone 3 Choisissez vos fluorochromes les uns apr s les autres gr ce au menu d roulant voir Copie d cran 11 Fen tre Smart Setup ci dessus Zone A Copie d cran 12 S lection fluorochromes et Copie d cran 13 Liste des fluorochromes ci dessous smart Setup Recent Alexa Fluor 633 Alexa Fluor 488 delia Alexa Fluor 546 Alexa Fluor 594 T API none 1 ANS 2 Methylbenzoxazole 3 3 dimethyloxatricarbocya 5 CNF 5 FAM 5 ROX 5 TAMRA 6 CR 6G 6 HEX 6 JOE 6 TET 7 MeO Coumarin AcOH Acridine Orange Acridine Yellow Adirondack Green 520 Copie d cran 12 S lection fluorochromes Copie d cran 13 Liste des fluorochromes L gende A Liste des fluorochromes r cemment utilis s B Zone de recherche de fluorochromes C Liste compl te des fluor
38. Remote control 1 ci dessus n 16 SUR ON MAINTENANT LAISSEZ CET INTERRUPTEUR SUR OFF 5 V rifiez que les 2 boitiers au dessus du statif sur l tag re sont bien allum s Si un ou les deux boitiers sont teints les allumer maintenant Information Compl mentaire Boitier de gauche Alimentation du statif Boitier de droite Alimentation de la platine x y 6 V rifiez que l cran de contr le du statif est bien allum et qu il affiche bien des informations 7 V rifiez qu au moins une led est allum e sur le statif en bas droite AN Attention Si l tape 6 et ou 7 ne sont pas valid es coupez puis rallumez le statif interrupteur on off en bas gauche 8 Allumez la lampe HXP L gt Mettez l interrupteur sur On L gt V rifiez que la molette d intensit n est pas au minimum pour commencer vous pouvez mettre cette molette sur la position centrale Information Compl mentaire La molette permet de r gler l intensit de la lumi re d excitation pour la fluorescence Si vous ne voyez rien lors de votre mise au point v rifiez que cette molette n est pas au minimum A l inverse si votre fluorochrome photoblanchie rapidement lors de votre mise au point vous pouvez diminuer l intensit d excitation en utilisant cette molette de r glage L gt V rifiez que la led bleue est allum e indique que le shutter est bien ouvert S il n y a pas de led bleue allum e app
39. a rien a r fl chir mettez None Les miroirs disponible en K sont les suivants Le MES 458 E MES 458 A MES 458 54 None MES 488 P MBS 488 5 None MBS 488 51 MBS T80 R20 Plate Copie d cran 19 Miroirs dichro que Voie visible Pour notre exemple nous devons donc mettre en place un miroir dichro que capable de r fl chir 488 nm et 561 nm Nous choisissons donc le miroir suivant MBS 488 561 11 Toujours dans la track 1 mettez en L un miroir dichro que capable de r fl chir toutes les longueurs d ondes not es dans la case Toutes tracks confondues de la ligne o voir tableau ci dessus S il n y a rien a r fl chir mettez None Les miroirs disponible en L sont les suivants Copie d cran 17 Configuration des tracks pour l exemple p 31 Plate None A MES 405 A MES 445 None None None None MBS T80 R20 None Version 1 01 14 Service Commun de Microscopie Copie d cran 20 Miroirs dichro que Voie invisible 34 Manuel d Utilisation Microscope Confocal Zeiss LSM 710 Pr cis 01 2014 Pour notre exemple nous devons donc mettre en place un miroir dichro que capable de r fl chir 405 Nous Es SS 7 MARE ADS choisissons donc le miroir suivant Madi ci 12 V rifiez que les miroirs que vous avez mis en place dans la track 1 sont bien pr sents dans les autres tracks Pour l exemple nous sommes maintena
40. acc der directement ce formulaire en double cliquant sur le lien pr sent sur chaque bureau d ordinateur de la Plate Forme Cliquez pour signaler un incident Version 1 01 14 Service Commun de Microscopie 79 Manuel d Utilisation Microscope Confocal Zeiss LSM 710 Pr cis 01 2014 Version 1 01 14 Service Commun de Microscopie 80 Manuel d Utilisation Microscope Confocal Zeiss LSM 710 Pr cis 01 2014 Table des illustrations Copies Copie d cran 1 Copie d cran 2 Copie d cran 3 Copie d cran 4 Copie d cran 5 Copie d cran 6 Copie d cran 7 Copie d cran 8 Copie d cran 9 Copie d cran 10 Copie d cran 11 Copie d cran 12 Copie d cran 13 Copie d cran 14 Copie d cran 15 Copie d cran 16 Copie d cran 17 Copie d cran 18 Copie d cran 19 Copie d cran 20 Copie d cran 21 Copie d cran 22 Copie d cran 23 Copie d cran 24 Copie d cran 25 Copie d cran Ap Copie d cran 27 Copie d cran 28 Copie d cran 29 Copie d cran 30 Copie d cran 31 Copie d cran 32 Copie d cran 33 Copie d cran 34 Copie d cran 35 Copie d cran 36 Copie d cran 37 Copie d cran 38 Copie d cran 39 Version 1 01 14 d cran Fenere EE EIERE 3 LE ele ee ane ee dde ee de den a a a 3 EE tee Processing E 3 OS OEM AR es ea de es 3 PNC Re ee EE ee ea a be a ee oies 5 PAR N e O E 5 Fenere L
41. ais vos mains ou un objet dans la zone d limit e par la platine O set Exposure 10 Cliq uez sur Set Exposure voir Copie d cran 2 Fen tre 1 en mode Acquisition Colonne a Zone e Experiment Manager AF O E J EU Find Focus Set Exposure Live Continuous snap Copie d cran 33 Ic nes Experiment Manager Le logiciel fait diff rents essais de Gain Master et de Digital Offset jusqu trouver du signal sur l image Vous pouvez r appuyer sur l ic ne Set Exposure si la tentative chou e Voir Copie d cran 29 Panneau Channels p 43 Version 1 01 14 Service Commun de Microscopie 47 Le logiciel affiche maintenant dans la fen tre 2 voir Copie d cran 4 Logiciel LSM Zen 1 p 3 Une image de l chantillon A B Profile AA AA Unmixing c Info Copie d cran 34 Fen tre 2 Zone Image L gende A Affichage 2D Merge B Affichage Split Visualisations des canaux s par ment merge C Informations concernant l image 11 Cliquez sur l ic ne B voir Copie d cran 34 Fen tre 2 Zone Image ci dessus pour spliter l image Copie d cran 35 Fen tre 2 Image Split Il faut maintenant affiner le r glage du Gain Master et du Digital Offset Pour cela il faut un retour visuel en live de l image L image live se met jour en boucle En jouant sur un param tre on voit donc directement comment
42. al Zeiss LSM 710 Pr cis 01 2014 12 Avant de lancer votre premi re acquisition d exp rience multiparam trique a Ouvrez le panneau Auto Save en bas de la colonne c Multidimensional Acquisition voir Copie d cran 2 Fen tre 1 en mode Acquisition p 3 colonne c IN Auto Save Directory File Name File Format Copie d cran 47 Panneau Auto Save Auto Save b V rifiez que la case Auto Save est bien d coch e 13 Dans la zone Experiment Manager voir Copie d cran 2 Fen tre 1 en mode Acquisition p 3 colonne a cliquez sur B Start Experiment l ic ne Start Experiment L acquisition du Z stack d marre Pendant l acquisition la barre d activit en bas de la fen tre du logiciel Copie d cran 4 Logiciel LSM Zen 1 p 3 Zone B affiche une barre de progression Cette barre vous indique l avancement de l acquisition Le temps restant et le temps total sont aussi indiqu s Format d affichage du temps 00 00 00 Heures Minutes Secondes Copie d cran 48 Barre de progression Z Stack 14 La barre de progression dispara t quand elle arrive 100 L acquisition est alors termin e Votre image est affich e dans la zone d image voir Copie d cran 4 Logiciel LSM Zen 1 p 3 Fen tre 2 15 Avant de faire quoi que ce soit d autre enregistrez votre image Voir Enregistrement des images p 58 Ver
43. al de l ordinateur l adresse indiqu e sur l tiquette jaune en haut droite de l cran gt D Images LSM 710 Un raccourci nomm Stockage Local est disponible sur le bureau de l ordinateur Vous pouvez aussi rejoindre le stockage local en cliquant sur le chemin suivant Logo Microsoft en bas gauche de l cran gt Computer gt Disque dur correspondant au stockage local A Attention Les images sont conserv es 6 mois sur les disques durs locaux puis sont SUPPRIMEES AUTOMATIQUEMENT Les images qui ne sont pas enregistr es l adresse indiqu e par l tiquette jaune en haut droite de l cran sont SUPPRIMEES AUTOMATIQUEMENT En fin de session Transf rez vos images dans VOTRE dossier personnel sur le serveur de stockage du SCM Pour acc der au serveur de stockage double cliquez sur le raccourci e SCMRAID pr sent sur le bureau de l ordinateur Pour transf rer vos images faites simplement un copier coller de votre dossier local votre dossier serveur AN Attention Les images sont conserv es 900 jours sur le serveur de stockage puis sont SUPPRIMEES AUTOMATIQUEMENT Veillez bien transf rer vos images dans votre dossier personnel serveur Une fois de retour dans votre laboratoire acc dez au serveur de stockage SCMRAID puis transf rez vos images sur votre ordinateur personnel Vous pouvez maintenant explorer ou traiter vos images depuis votre ord
44. alisation des images en cours d acquisition et acquises 3 Sauvegarde des images Version 1 01 14 Service Commun de Microscopie 4 Manuel d Utilisation Microscope Confocal Zeiss LSM 710 Pr cis 01 2014 Gestion de l espace de travail Chaque utilisateur peut r organiser l espace de travail comme il le souhaite Il est donc possible de se retrouver avec une organisation des fen tres qui ne corresponde pas vos attentes Pour r tablir l affichage standard 1 Cliquez sur le dossier e Worksapce configuration Voir Copie d cran 4 Logiciel LSM Zen 1 p 3 Zone droite 1 Standard SCM 2 S lectionnez 1 Standard SCM a La taille de l affichage peut aussi tre ajust e en utilisant le curseur Workspace Zoom Voir Copie d cran 4 Logiciel LSM Zen 1 p 3 Zone o droite Cliquez sur Reset a pour r initialiser la taille de l affichage Les panneaux Les fen tres et colonnes sont compos es de diff rents panneaux Ces panneaux regroupent par cat gories des fonctions qui vous permettront de r aliser vos acquisitions e Acquisition Mode Chaque panneau peut tre ouvert ou ferm en GEET N Frame v cliquant sur la petite fl che en haut gauche du a am 1024 vr wf Show al panneau voir ic ne A ci contre Chaque panneau dispose d une option Show All voir ic ne B ci contre qui doit tre coch e pour vous permettre d acc der toutes les option
45. and Documents Demno lem Copie d cran 55 Image enregistr e Enregistrement de nouvelles images Une fois votre 1 image enregistr e le logiciel m morise le dernier lieu d enregistrement Pour enregistrer une nouvelle image suivez simplement les tapes 1 2 3 9 10 et 11 de la proc dure pr c dente Gi ATTENTION NE PAS FAIRE N ENREGISTREZ JAMAIS VOS IMAGES DIRECTEMENT SUR LE SERVEUR DE STOCKAGE SCMRAID a PENDANT LA SESSION ENREGISTREZ TOUJOURS VOS IMAGES SUR LE DISQUE DUR LOCAL A L ADRESSE INDIQUEE SUR L TIQUETTE JAUNE COLLEE SUR L ECRAN DE L ORDINATEUR L acquisition et l enregistrement des images sont maintenant termin s Si vous avez le moindre doute ou si vous rencontrez une difficult rapprochez vous imm diatement du Responsable de la Plate Forme Voir Copie d cran 54 Enregistrement d image p 60 Version 1 01 14 Service Commun de Microscopie 61 l N A Fa PM FR PR PR FO FR PO PA PR PR Wm WA ai D A PF aa K A NG D DA G IN LP N g MN WA WW e J KE Copie d cran 56 Logiciel LSM Zen 2 D D D D LA D bt D D Si vous souhaitez observer une image qui n est pas pr sente dans la zone d image Z double cliquez sur une image pr sente dans la fen tre 2 L image s affiche alors dans la zone d image Pour passer d une image une autre dans la zone d image Z cliquez simplement sur l onglet souhait en haut de la zone image Image8 lsm
46. ans l autre Gi ATTENTION A NE PAS FAIRE Ne modifiez pas les valeurs du Gain Master brusquement Modifiez les valeurs de mani re progressive L gt Pour chacune des tracks efforcez vous d obtenir des valeurs de Gain Master comprises entre 400 et 800 zone lin aire du gain Digital Offset Digital Gain Digital Offset Digital Gain Copie d cran 40 Valeurs de Gain Master apr s ajustement Manuel d Utilisation Microscope Confocal Zeiss LSM 710 Pr cis 01 2014 S il vous faut mettre un gain tr s sup rieur 800 pour arriver la saturation vous pouvez augmenter le pourcentage de transmission du laser correspondant la channel vitez toujours de d passer 2 Zone C du panneau e Channel L augmentation du pourcentage de transmission vous permettra de diminuer la valeur de gain A l inverse s il vous faut mettre un gain inf rieur 400 pour n avoir que quelques pixels rouges vous pouvez diminuer le pourcentage de transmission du laser correspondant la channel n allez pas en dessous de 0 1 Zone C du panneau e Channel La diminution du pourcentage de transmission vous permettra d augmenter la valeur de gain 16 Pour toutes les tracks pr sentes dans la zone A du panneau o Channels s lectionnez les tracks une une puis L Dans la zone G du panneau Channels ajustez la valeur du Digital offset si besoin Copie d cran 41 Ajustement
47. ant lors de l ajustement des largeurs de bandes passantes de d tection Fin du panneau Light Path Le trajet optique en mode confocal est maintenant configur et optimis Si vous avez le moindre doute ou si vous rencontrez une difficult rapprochez vous imm diatement du Responsable de la Plate Forme Version 1 01 14 Service Commun de Microscopie 35 Manuel d Utilisation Microscope Confocal Zeiss LSM 710 Pr cis 01 2014 Enregistrement et rappel de configuration Enregistrement de configuration Si vous le souhaitez vous pouvez enregistrer la configuration du trajet optique Pour cela 1 Dans la zone Experiment Manager voir Copie d cran 2 Fen tre 1 en mode Acquisition p 3 Colonne a Zone Experiment Manager cliquez sur la disquette BEN 131030 PKR 405 488 561 E Smart Setup Show all Tools AF l EJ Find Focus Set Expos Continuous Z Stack Time Series Bleaching Tile Scan Positions Regions Copie d cran 21 Zone Experiment Manager 2 Nommez votre configuration Par exemple Vos Initiales Le nom des fluorochromes dans la configuration l objectif utilis Save current acquisition configuration as e Configuration Demo SCM Ok Cancel Copie d cran 22 Sauvegarde configuration 3 Cliquez sur Ok pour enregistrer Rappel de configuration 1 Dans la zone Experiment Manager voir Copie d cran 2 Fen tre 1 en mode Acqu
48. chondries voir ci dessus Les informations concernant l exemple seront bord es de cette ligne Conna tre ses fluorochromes Avant de vous lancer dans la configuration du trajet optique confocal il est primordial que vous connaissiez les spectres d excitation et d mission des fluorochromes pr sents dans votre chantillon Ici nous avons dans la lame de d mo du DAPI de l Alexa 488 du TRITC Pour connaitre l allure des spectres d excitation et d mission 1 Rendez vous sur le site internet de Life Technologies dans la rubrique SpectraViewer a Cliquez sur l ic ne Mozilla Firefox dans la barre de t che Windows b Cliquez sur le raccourci 8 SpectraViewer dans la barre de t che Firefox en haut de la fen tre Adresse http wwvw lifetechnologies com fr fr home life science cell analysis labeling chemistry fluorescence spectraviewer html 100 L gende N n A Choix des fluorochromes Relative Intensity on CH N on B Ajout de fluorochrome 0 300 400 500 600 700 800 900 Wavelength nm Pointer Location 857nm 73 Fluorophores Light Sources Excitation Filters Emission Filters Reset Category Optional Fluorophore Show plot esej esee z V Excitation M Emission Remove E e e Add Copie d cran 9 Fen tre SpectraViewer Version 1 01 14 Service Commun de Microscopie 24 Manuel d Utilisation Microscope Confocal Zeiss LSM 710 Pr cis 01 2014
49. cope p 12 Centrez votre chantillon dans le spot de lumi re gr ce au joystick x y Appuyez sur la touche Focus Position sur la droite du statif voir Initiation pilotage manipulation du microscope p 12 Coupez la lumi re transmise voir Initiation pilotage manipulation du microscope p 12 Ajustez votre mise au point voir R alisation de la mise au point p 22 Faites vos nouvelles acquisitions voir Acquisition et enregistrement d images p 54 Version 1 01 14 Service Commun de Microscopie 69 Manuel d Utilisation Microscope Confocal Zeiss LSM 710 Pr cis 01 2014 Rappel des param tres d acquisition d une image Nous avons d j vu au chapitre Enregistrement et rappel de configuration p 36 comment rappeler une configuration de trajet optique confocal Cette technique permet de remettre en place rapidement le trajet optique enregistr pour de futures acquisitions Si vous souhaitez comparer des images que vous avez acquises la session 1 avec des images que vous allez faire la session 2 vous devez non seulement recharger la configuration du trajet optique confocal mais aussi l int gralit des autres r glages que vous aviez effectu s R solution Dynamique de transmission des lasers Taille des pinholes Gain Offset JL Si un des r glages varie d une session l autre il n est plus possible de comparer de fa on quantitative les images Pour vous remettre dans les m mes condition
50. de p 39 Etape 11 nous avons r gl la dynamique du capteur sur 8 bit Cela signifie que les images que nous alons acqu rir seront compos es de pixels qui auront des valeurs comprises entre 0 et 255 soit 256 niveaux de gris Le Gain Master permettra d amplifier le signal au niveau du photomultiplicateur pour exploiter toute la dynamique du capteur C est dire amplifier le signal jusqu ce que le pixel le plus intense ait la valeur 255 ce pixel sera alors la saturation Le Digital Offset permettra de retirer de l image finale les pixels de faibles intensit s le Digital Offset retire les pixels de O la valeur d intensit de votre choix Ceci permet de supprimer le background Attention Un Digital Offset trop fort supprimera de fortes intensit s qui correspondent peut tre votre signal Assurez vous que le Digital Offset ne risque pas de supprimer votre signal d intr t 8 V rifiez votre focus voir R alisation de la mise au point p 22 L gt Cliquez sur Locate V rifiez de l ic ne Online est activ e Ouvrez le shutter Choisissez un cube de fluorescence Ajustez la mise au point si besoin LEE LEE Fermez le shutter 9 Cliquez sur l onglet Acquisition voir Copie d cran 4 Logiciel LSM Zen 1 p 3 Fen tre 1 Zone Onglets A Attention partir de maintenant le microscope va utiliser les lasers Ne pr n trez jam
51. e 23 REALISATION DE Ee le ele aile TE 24 Ref Cd e geet lge 24 Configuration du trajet optique en mode confocal sis iiiissieeessssseeeesesseeeeseeeeneseeseee 26 A quoi servent les diff rents l ments du trajet optique 31 Aguoisert E E 32 Enregistrement et rappel de configuration iii ienessescenessecenennsecenenseeeeeeseeeenensnee 36 Enreeictrement de CO EPS e EE 36 Roppeide Conie uO ee a a a Sa ain los de on te 36 REGLAGE DES PARAMETRES D ACQUISITION ggk gesichggrgeug tee egeeteeE deeg deeg EEd gd EEN tennagh eee n corse n caneuenenesiese 38 Le panneau Acguisition ModE Sn RD aber een peace Genet eq ete dote nada et caen nee ai 38 Le panneau e Diet RE ET snes rrer inss SrO Sesen TORDEN TON PENE NENS NEOS S EESTE TSEN ETEN IN S EA SEES N EPESA ESSN iSSi 43 ACQUISITION ET ENREGISTREMENT d Eeer 54 Acquisition d images simples uniquement le plan focal sis 54 Acquisition de Z stacks d images piles d images enz 55 Enregistrement le EE 58 EXPLORER SES IMAGES Ee 62 OO TO A E a OR ce 62 Les EE eege 63 Les outils compl mentaires siens seneessesenesseccennnsecennncecenenseceeenseceeneneeeeennnseee 64 CHANGER D OBJECTIF AU COURS DE LA el 67 Passage d un objectif sec un autre objectif ser 67 Passage d un objectif sec un objectif immersion iii ceessessenenseesennnes 67 Passage d un objectif immersion un objectif eer 67 CHANGER DE LAME AUCOURS DE LA SESSION eege 69 Si vo s tes s r e e EE 69
52. e Onglet Locate EE 12 EE COINS E E E E D ee eo 17 Fen e Pea N NET e O 24 Specie d s Or ROE E pE E E 25 PETE E E E 26 Selecon JOro M OMNES ia ea eee ce 26 Wede de geet ie el 26 S l CHONOeS Tluorochromes aa be ae ane ea a au 27 Fenere Sman Setup COM ll seissen fonn NEN 27 Panneau LIEN gn ME 30 Configuration des tracks pour l exemple sisi 31 Fenetre mfo Frame Fosi EE 33 Miroirs dichroig e Voie Ce 34 Miroirs dichro que Voie invisible essssssssesesessensssreresrrrsssrrresrreresreressrenssreresereessreresererssreresererseeere 34 Zone EXO CM ARR nn ne 36 EEGENEN 36 Rappelde conie ura Oi Sa te den 36 Choix d une configuration eArTeBISTF E 2 danses tsec casses sopnneen encens enteccu secs dass oser cessen 37 Le panneau Acguisition MO a ee ee 38 V rification objectif Panneau Acquisition Mode ss 39 Zone Speed Panneau Acquisition Mode 40 Scan Area Panneau Acquisition Mode sise scene 42 PS CA 43 S lection Track Panneau Channels inserer 44 S lection 1AU Panneau CARE nn rt tn 44 V rification taille du Phinhole Panneau Channels a 46 CONS Expenment Ma Re a 47 PR 2 ZO ER 48 Fenetre SIA SOIR a ee dre 48 RARES NO EE 49 Recherche du zle pus ARS ao E N 50 RES CS M 50 Valeurs Gain EE EE TU En En WE 51 Service Commun de Microscopie 81 Copie d cran 40 Copie d cran 41 Copie d cran 42 Copie d cran 43 Copie d cran 44 Copie d cran 45 Copie d cran 46
53. en Cependant chaque changement de track les miroirs dichro ques K et L changent Ces changements font perdre un temps consid rable lors de l acquisition L id al serait donc de trouver un miroir pour la zone K et un miroir pour la zone L qui fonctionnent pour toutes les tracks Ceci viterait des changements de miroirs au moment des changements de tracks Pour cela suivez la suite de la proc dure 6 S lectionnez le mode switch Frame Fast Ic ne B A quoi sert le Frame Fast En utilisant le mode Frame Fast vous optimisez au maximum la vitesse d acquisition pour les configurations multi tracks En effet le Frame Fast emp chera le changement de miroir dichro que lors du changement de track emp chera le chevauchement des bandes passantes de d tection et emp chera les changements de tailles de pinholes entre les tracks Voir Copie d cran 16 Panneau Light Path p 30 Voir Copie d cran 17 Configuration des tracks pour l exemple p 31 Version 1 01 14 Service Commun de Microscopie 32 Manuel d Utilisation Microscope Confocal Zeiss LSM 710 Pr cis 01 2014 7 La fen tre suivante apparait Several settings will be overwritten Settings of the first track will be used Continue Copie d cran 18 Fen tre info Frame Fast Cette fen tre vous avertit que diff rents miroirs dichro ques sont utilis s dans les diff rents tracks Le passage en Frame Fas
54. es d acquisition voir Installation de l chantillon p 17 R alisation de la mise au point p 22 R alisation de la configuration confocale p 24 et R glage des param tres d acquisition p 38 doivent avoir t r alis es avant de suivre la proc dure suivante Proc dure 1 Dans la zone Experiment Manager voir Copie d cran 2 Fen tre 1 en mode e Acquisition p 3 colonne a cochez Z ja T A LL l exp rience multiparam trique Z stack M Z Stack Demo SCM Smart Setup s Show all Tools New AF O Ech Gi Find Focus Set Exposure Continuous snap ZStack 21 Slices Time Series Bleaching Tile Scan Positions P Start Experiment Regions Copie d cran 45 Experiment Manager Z stack 2 Apr s avoir coch la case Z stack le panneau Z stack s ouvre dans la colonne c Multidimensional Acquisition voir Copie d cran 2 Fen tre 1 en mode Acquisition p 3 colonne c Version 1 01 14 Service Commun de Microscopie 55 Manuel d Utilisation Microscope Confocal Zeiss LSM 710 Pr cis 01 2014 sional Acquisition Z Stack v i Show all First Last Set Last 5000 00 20 00 um 21 1 00 D 37 um Interval slic 5000 00 1754 Oo Optimize Sectioning and Step Correction 1 Information On Experiment Overview 3 j 8 Bit 1024 x 1024 63 00 MB 11 62 sec NI Auto Save Copie d cran 46 Panneau Z Stack
55. et une AT puis fait la moyenne sur les images La valeur par d faut est Line Dans notre exemple nous choisissons Line 10 Dans la zone I mettez la m thode sur Mean 11 Dans la zone J mettez la dynamique du capteur Bit Depth sur 8 bit CO Plus pr cis ment 8bit 256 niveaux de gris 12 bit 4096 niveaux de gris 16 bit 65536 niveaux de gris Adaptez ce r glage en fonction de votre probl matique Sachez que 8 bit permet d j de r pondre beaucoup de probl matiques Dans notre exemple nous choisissons 8 bit Voir Copie d cran 25 Le panneau Acquisition Mode p 38 Version 1 01 14 Service Commun de Microscopie 41 Manuel d Utilisation Microscope Confocal Zeiss LSM 710 Pr cis 01 2014 12 Dans la zone K choisissez la direction de scan gt Aller simple le plus pr cis lt gt Aller Retour le plus rapide Par d faut vous pouvez choisir Aller Retour Choisissez Aller Simple si votre probl matique exige une grande pr cision en x y Dans notre exemple nous choisissons lt gt 13 Dans la zone L Scan Area vous pouvez d finir une taille de zoom pr cis dans le champ M i T i T Reset All Copie d cran 28 Scan Area Panneau Acquisition Mode La zone L Scan Area vous indique la taille de l image et la taille d un pixel voir Copie d cran 28 Scan Area Panneau
56. ice Commun de Microscopie 65 Player EI sw Z Position Copie d cran 61 Onglet Player Cet onglet permet de faire d filer les images qui composent une exp rience multi param triques Pour intervenir sur le d filement utilisez les ic nes suivantes Graphics Keep Tool Auto Color Copie d cran 62 Onglet Graphics Cet onglet permet d annoter vos images avec diff rents l ments S lectionnez les l ments que vous souhaitez et positionnez les l endroit de votre choix sur l image Pour ajouter un l ment utilisez les ic nes suivantes Manuel d Utilisation Microscope Confocal Zeiss LSM 710 Pr cis 01 2014 Changer d objectif au cours de la session Si vous souhaitez changer d objectif pendant la session suivez la proc dure suivante Passage d un objectif sec un autre objectif sec 1 V rifiez qu aucune acquisition confocale n est en cours absence de barre de progression dans la zone d activit Passez sur l onglet Locate voir Copie d cran 1 Fen tre 1 en mode Locate p 3 V rifiez que l ic ne Online est activ e voir Installation de l chantillon p 17 Etape 1 S lectionnez votre objectif dans le logiciel Onglet Locate voir Initiation pilotage manipulation du microscope p 12 L objectif se met en place automatiquement Ajustez votre mise au point voir R alisation de la mise au point p 22 zl OD
57. icroscope Confocal Zeiss LSM 710 Pr cis 01 2014 Ce que vous pouvez faire sur le microscope C t Gauche Face Statif C t droit Photo s 9 Vues statif L gende A Ouverture Fermeture shutter lampe fluo 1 Vis macrom trique B Changement de cube de fluorescence tourne dans le sens 1 2 Vis microm trique C Changement de cube de fluorescence tourne dans le sens 2 D R glage intensit lumi re transmise E Allumage Extinction lumi re transmise F Mise en place de la platine la derni re position de focus enregistr e G Mise en place de la platine la position de chargement des lames Le statif est quip de vis macro et microm triques Ces vis de r glage de la mise au point sont disponibles gauche et droite du statif Gi ATTENTION A NE PAS FAIRE Lors du r glage de la mise au point avec les vis macro et microm triques utilisez les vis de gauches OU les vis de droites mais JAMAIS LES 2 COTES EN MEME TEMPS Version 1 01 14 Service Commun de Microscopie 14 Manuel d Utilisation Microscope Confocal Zeiss LSM 710 Pr cis 01 2014 Sur le c t droit du statif vous trouverez 2 touches de raccourcis vous permettant de g rer la position en z de la platine L gt Touche Focus Position voir Photo s 9 p 14 F En appuyant sur cette touche vous retournez automatiquement la derni re mise au point qui a t effectu e sur le microscope Gi ATTENTION
58. inateur Version 1 01 14 Service Commun de Microscopie 9 Manuel d Utilisation Microscope Confocal Zeiss LSM 710 Pr cis 01 2014 Gi A NE PAS FAIRE NE BRANCHEZ JAMAIS DE PERIPHERIQUE SUR LES ORDINATEURS DU SCM Pas de cl USB Disques durs externes Pour ne pas ralentir ou bloquer le serveur N OUVREZ JAMAIS VOS IMAGES A PARTIR DU SERVEUR N ANALYSEZ JAMAIS VOS IMAGES A PARTIT DU SERVEUR Version 1 01 14 Service Commun de Microscopie 10 Manuel d Utilisation Microscope Confocal Zeiss LSM 710 Pr cis 01 2014 D roulement d une session D marrage du logiciel 1 Lancez le logiciel de pilotage en double cliquant sur l ic ne LSM Zen 2011 bureau de l ordinateur en haut gauche du Login ZEN 2011 9 Start System 2 Cliquez sur Start System 3 Attendez que la barre de progression arrive 100 Login ZEN 2011 Login ZEN 2011 Ha A savoir Notez bien Si la barre de progression n avance pas pendant plus de 5 minutes il y a un probl me de lancement du logiciel Cliquez sur Cancel puis fermez le logiciel V rifiez que vous avez bien connect tous les composants Allumez les composants qui n auraient pas t allum s puis red marrez le logiciel Version 1 01 14 Service Commun de Microscopie 11 Manuel d Utilisation Microscope Confocal Zeiss LSM 710 Pr cis 01 2014 Initiation pilotage manipulation du microscope
59. isition p 3 Colonne a Zone Experiment Manager cliquez sur le dossier KH 131030 PKR 405 488 561 Copie d cran 23 Rappel de configuration Version 1 01 14 Service Commun de Microscopie 36 Manuel d Utilisation Microscope Confocal Zeiss LSM 710 Pr cis 01 2014 2 Choisissez votre configuration Load configuration Recent Demo SCM Amelyne 633 488 5661 DAPI Veat NG2 GFP x63 tile scan M DAPI CC1 NG2 DsRed x63 tile scan Search Configurations Celine _A488 A546 DAPI CC1 NG2 DsRed x63 tile scan DAPI K67 NG2 DsRed x10 Madda DAPI Ki67 MG2 DsRed x63 tile scal DAPI Veat NG2 GFP x63 tile scan M Ok 546 A633 FL A405 GP A546 A633 FL A405 GFP mCh A633 FL eGFP mCh A633 LD 405 488 IM775 DTF Copie d cran 24 Choix d une configuration enregistr e 3 La configuration se recharge alors Trajet optique objectif AN Attention Lors du rappel d une configuration selon cette m thode le trajet optique et l objectif utilis s au moment de l enregistrement sont restaur s Cependant le mode de switch n est pas restaur Pensez remettre le mode de switch sur Frame Fast pour optimiser le temps d acquisition Gi ATTENTION A NE PAS FAIRE Si vous tes avec un objectif immersion et que vous souhaitez recharger une configuration r alis e avec un objectif sec NETTOYEZ D ABORD VOTRE LAMELLE AVANT DE RAPPELER LA CONFIGURATION Voir Passage d un objectif im
60. itiation pilotage manipulation du microscope p 12 Version 1 01 14 Service Commun de Microscopie 22 Manuel d Utilisation Microscope Confocal Zeiss LSM 710 Pr cis 01 2014 7 Regardez si vous le souhaitez les autres fluorochromes en changeant le cube de fluorescence 8 Coupez le shutter Bi A savoir Notez bien D une mani re g n rale pensez couper d s que possible la lumi re d excitation fluo en fermant le shutter pour viter de photoblanchir votre chantillon Pour faire la mise au point en lumi re blanche Mettez en place une position vide au niveau de la tourelle de cube de fluorescence Allumez la lumi re transmise Baissez l intensit de la lumi re en tournant la molette de r glage sur le statif Regardez dans les oculaires R glez l cartement interpubpillaire si besoin Ajustez l intensit de la lumi re en tournant la molette de r glage sur le statif Ajustez la mise au point en tournant d licatement UNE vis microm trique gauche ou droite UN RE e Es Quand vous avez votre mise au point centrez votre champ d int r t sur le r ticule pr sent dans l oculaire droit Vous pouvez mettre au point le r ticule en tournant uniquement le haut de l oculaire droit 8 Eteignez la lumi re transmise A Attention La technique de mise au point est assez d licate ma triser lors des premi res utilisations du microscope Prenez votre temps pour r ali
61. l 6 R cup rez vos affaires personnelles 7 Fermez bien la porte cl en quittant le Service Votre session est maintenant termin e Si vous avez le moindre doute ou si vous rencontrez une difficult rapprochez vous imm diatement du Responsable de la Plate Forme Version 1 01 14 Service Commun de Microscopie 73 Manuel d Utilisation Microscope Confocal Zeiss LSM 710 Pr cis 01 2014 Proc dure de Fin n 2 Arr t complet de l quipement Cette proc dure est suivre uniquement si Ilya plus de 3 heures de libre entre vous et l utilisateur suivant Vous tes le dernier utilisateur de la journ e Apr s avoir correctement suivi les tapes initiales de fin de session voir Etapes initiales p 71 suivez la proc dure suivante 1 R ouvrez le logiciel LSM Zen en cliquant sur l ic ne LSM Zen dans la barre de t ches Windows 2 Fermez le logiciel LSM Zen en cliquant sur l ic ne de fermeture 3 Une fois le transfert d images termin coupez l ordinateur a Cliquez sur le Logo Microsoft en bas gauche de l cran b Cliquez sur Shut Down 4 Mettez le laser Argon en refroidissement a Mettez le switch de la t l commande sur Idle position basse Zone B ci contre b Tournez la cl sur 0 Zone A ci contre lI Ne touchez pas l interrupteur not Ne pas toucher a Le laser commence refroidir temps de refroidissement environ 7
62. lisation Microscope Confocal Zeiss LSM 710 Pr cis 01 2014 5 S lectionnez votre dossier personnel local 6 Dans votre dossier personnel local cr ez vous un nouveau dossier pour la session en cours Faites un clic droit sur une zone vide puis s lectionnez New gt Folder Catalyst TM Control Center View Sort by Group by Refresh Paste Faste shortcut Undo Delete Share with New Properties Folder Shortcut Eitmap image Contact Journal Document Text Document Compressed zipped Folder Eriefcase Copie d cran 53 Cr ation nouveau dossier 7 Renommer le nouveau dossier avec la date du jour le nom de l exp rience par exemple Version 1 01 14 e aen 17 3 2014 10 18 AM File folder Date modified Type Size No items match your search rage S LSM SC lem DI Copie d cran 54 Enregistrement d image Service Commun de Microscopie 60 Manuel d Utilisation Microscope Confocal Zeiss LSM 710 Pr cis 01 2014 9 Une fois dans votre dossier nommez votre image dans la zone File name en bas de la fen tre Zone A avec le nom de votre choix 10 Dans la zone B File Type choisissez le format LSM 5 format de base Consultez le personnel de la Plate Forme pour les autres formats Save as type LSM 5 lsm 11 Cliquez sur Save Ic ne C 12 Votre image est maintenant enregistr e Ti Images
63. mersion un objectif sec p 67 L enregistrement et le rappel de la configuration confocale sont maintenant termin s Si vous avez le moindre doute ou si vous rencontrez une difficult rapprochez vous imm diatement du Responsable de la Plate Forme Version 1 01 14 Service Commun de Microscopie 37 Manuel d Utilisation Microscope Confocal Zeiss LSM 710 Pr cis 01 2014 7 A 2 e e e R glage des param tres d acquisition Les diff rents r glages des param tres d acquisition sont accessibles dans la fen tre 1 en mode Acquisition colonne b voir Copie d cran 2 Fen tre 1 en mode Acquisition p 3 colonne b Vous trouverez dans cette fen tre 2 panneaux importants 6 Le panneau Acquisition mode 7 Le panneau Channels a Le panneau Acquisition Mode Ce panneau va vous permettre de r gler les param tres concernant le scanner du microscope confocal Acquisition Mode Plan Apochromat 20x 0 5 M27 Frame B 512 X 512 Optimal Max 1024 x 1024 Ge Scan Area Reset All N Copie d cran 25 Le panneau Acquisition Mode L gende A Rappel de l objectif utilis H Mode de moyenne ou de somme line ou frame B Mode de scan Line ou Frame l M thode Moyenne ou somme C Ic ne pour d finir la r solution optimale J Choix de la dynamique du capteur 8 12 ou 16 bit D R solution de l image nombre de pixels en x y pour une taille K Direction du
64. mi re transmise voir Initiation pilotage manipulation du microscope p 12 11 Ajustez votre mise au point voir R alisation de la mise au point p 22 12 R ajustez vos param tres d acquisitions en prenant en consid ration ce nouvel objectif voir R glage des param tres d acquisition p 38 a id Faites vos nouvelles acq uisitionsS voir Acquisition et enregistrement d images p 54 Passage d un objectif immersion un objectif sec 1 V rifiez qu aucune acquisition confocale n est en cours absence de barre de progression dans la zone d activit Version 1 01 14 Service Commun de Microscopie 67 13 14 15 16 17 18 19 20 Manuel d Utilisation Microscope Confocal Zeiss LSM 710 Pr cis 01 2014 Passez sur l onglet Locate voir Copie d cran 1 Fen tre 1 en mode Locate p 3 V rifiez que l ic ne Online est activ e voir Installation de l chantillon p 17 Etape 1 Appuyez sur la touche Load Position sur la droite du statif pour descendre la platine voir Initiation pilotage manipulation du microscope p 12 Descendez au maximum la platine en appuyant et maintenant appuy jusqu l arr t la touche Load position a sur la droite du statif voir Initiation pilotage manipulation du microscope p 12 Retirez d licatement votre lame du porte objet faites glisser doucement la lame vers vous Nettoyez soigneusement votre lame Ne
65. mun de Microscopie 29 Manuel d Utilisation Microscope Confocal Zeiss LSM 710 Pr cis 01 2014 Le panneau Light Path Le panneau EE se situe dans la de la fen tre 1 en mode a Acquisition a colonne a a et zone Setu p Ma nager Voir Copie d cran 2 Fen tre 1 en mode Acquisition p 3 Colonne a Zone Setup Manager Ce panneau repr sente le trajet optique en mode confocal Des ic nes vous permettent de modifier et d adapter le trajet optique Plate None MBS 405 MBS 445 None None None None MBS T80 R20 None L gende Version 1 01 14 E Light Path Channel Frame Tracki Track2 Track3 Track 1 7 MBS 458 MBS 458 514 MBS 458 561 None Use Dye Color Detector Range P MBS 488 P MBS 488 561 None MBS 488 561 633 MBS T80 R20 Plate FSet49 wf FSet38 wf FSet43 wf None None NoneLSM None None None None Copie d cran 16 Choix du mode d acquisition Channel Lambda Online Fingerprinting Choix du Switch Line Frame Frame Fast Visualisation et s lection des tracks de la configuration Trajet optique les informations affich es concernent uniquement la track s lectionn e en C Valeur de la raie d excitation Spectre d mission du ou des fluorochrome s dans la track Bande passante pour la d tection 410 515 414 725nm 415 735nm Reflection 458
66. nnels Pour l exemple nous avons L d EM 43 3 1 AU max Track 1 DAPI gt 1AU OK A 43 3 M 1AU max Track 2 Alexa 488 gt 0 87 AU OK IAU max Track 3 TRITC gt 0 74 AU Trop petit 5 Si l tape 4 un ou plusieurs pinholes sont trop petits s lectionnez la track 2 fluorochrome avec longueur d onde d mission plus grande puis cliquez dans cette track sur l ic ne E pour d finir la taille du pinhole 1 AU 6 V rifiez nouveau les pinholes dans les autres tracks Les pinholes doivent tous tre entre 0 8 et 1 AU Le pinhole peut d passer l g rement 1 AU Pour l exemple nous avons Track 1 DAPI gt 1 16 AU OK Track 2 Alexa 488 gt 1 AU OK 1 AU max Track 3 TRITC gt 0 85 AU OK 7 Si certains pinholes sont encore trop petits s lectionnez la track 3 fluorochrome avec longueur d onde d mission encore plus grande puis cliquez dans cette track sur l ic ne E pour d finir la taille du pinhole 1 AU et ainsi de suite jusqu obtenir des pinholes compris entre 0 8 et 1 AU Voir Copie d cran 29 Panneau Channels p 43 Version 1 01 14 Service Commun de Microscopie 46 Manuel d Utilisation Microscope Confocal Zeiss LSM 710 Pr cis 01 2014 Il reste maintenant 2 param tres ajuster Le Gain Master et le Digital Offset OO Plus pr cis ment Dans la section R glage du panneau Acquisition Mo
67. nt dans la configuration suivantes Ge 1488 1514 1561 1633 1458 11488 1514 1561 1633 11458 1488 1514 1561 1633 7405 Z405 Z405 MBS 488 561 MBS 488 561 t gt Le miroir en K permet Conclusion bien de r fl chir la raie 405 bien de r fl chir la raie 488 nm bien de r fl chir la raie 561 nm s lectionn e en J s lectionn e en I nm s lectionn e en I La configuration fonctionne maintenant dans toutes les tracks sans aucun changement de miroir dichro que La configuration est donc optimis e Cet ajustement vous permettra de gagner un temps pr cieux lors de vos acquisitions 13 Ajustez si besoin pour chaque track la largeur des bandes passantes de d tection La bande passante doit a Laisser passer dans la mesure du possible le pic d mission du fluorochrome b Bloquer la longueur d onde d excitation c Bloquer l mission provenant ventuellement d autres fluorochromes pr sents dans l chantillon Pour ajuster la largeur de la bande cliquez et maintenez sur une extr mit de la bande puis faites glisser avec la souris A Attention Le mode de switch Frame Fast ne permet pas de faire de chevauchement de bande passante de d tection entre les tracks Soyez donc prudent quand vous ajustez la largeur des bandes Une bande trop large dans une track diminuera la largeur des bandes dans les autres tracks De plus des bandes trop larges peuvent entra ner des fuites spectrales Soyez vigil
68. nt sur l ic ne Stop 4 Cliquez sur l ic ne Snap pour faire l acquisition de votre image au plan focal avec vos param tres L acquisition de l image d marre Copie d cran 43 Image simple acquise zk Voir Copie d cran 2 Fen tre 1 en mode Acquisition Colonne a Zone Experiment Manager Version 1 01 14 Service Commun de Microscopie 54 Manuel d Utilisation Microscope Confocal Zeiss LSM 710 Pr cis 01 2014 Pendant l acquisition la barre d activit en bas de la fen tre du logiciel Copie d cran 4 Logiciel LSM Zen 1 p 3 Zone B affiche une barre de progression Cette barre vous indique l avancement de l acquisition Copie d cran 44 Barre de progression 1 5 La barre de progression dispara t quand elle arrive 100 L acquisition est alors termin e Votre image est affich e dans la zone d image voir Copie d cran 4 Logiciel LSM Zen 1 p 3 Fen tre 2 6 Avant de faire quoi que ce soit d autre enregistrez votre image Voir Enregistrement des images p 58 Acquisition de Z stacks piles d images en z L acquisition de Z stacks vous permet de recueillir toute l information en Z de votre chantillon Pour acqu rir ce type d Images suivez la proc dure suivante ATTENTION Toutes les op rations d installation de l chantillon de mise au point de configuration du trajet optique confocal et de r glages des param tr
69. o s 7 Ecran de contr le Onglet Microscope inner snnessssssenessssssnnss 13 Photo s S Ecran Tee EA de TOCUS a a dan eb da aa de a ae tee 13 ATOS rei E Re AA PTE SAINS E 14 Photo s 10 Photo s 11 Photo s 12 Photo s 13 Photo s 14 Photo s 15 Photo s 16 Photo s 17 Photo s 18 Version 1 01 14 COR 15 VS ee 17 Vome ORDRE E 18 Montone poine EN 18 Val Ee AU DO d EE 19 D pot Kielen D ee 20 VIE Ee de GII eais a aa a a a 21 Approche de TObject EE 21 Seele Te ea 22 Service Commun de Microscopie Photo s 19 Photo s 20 P E NEEN 74 Photo s 22 Photo s 23 Photo s 21 Manuel d Utilisation Microscope Confocal Zeiss LSM 710 Pr cis 01 2014 VG LU ee E 22 R ticul E ssrscisocese su nasenedeatadees sine esscte e eat Do eaec inde cen bad tea iaaa 22 AIT ne CON E 75 Arret pouteille ait COM 75 Version 1 01 14 Service Commun de Microscopie 83 Manuel d Utilisation Microscope Confocal Zeiss LSM 710 Pr cis 01 2014 Version 1 01 14 Service Commun de Microscopie 84 Manuel d Utilisation Microscope Confocal Zeiss LSM 710 Pr cis 01 2014 Pour toute remarque ou suggestion concernant ce guide merci d envoyer un e mail l adresse suivante scm parisdescartes fr Version 1 01 14 Service Commun de Microscopie 85
70. ochromes Version 1 01 14 Service Commun de Microscopie 26 Vous pouvez changer les couleurs propos es en cliquant sur la petite fl che sous la colonne Color voir Copie d cran 11 Fen tre Smart Setup ci dessus Zone AN Attention Afin de faciliter la suite de la configuration veuillez entrer vos fluorochromes de la plus courte longueur d onde la plus grande r f rez vous au tableau que vous avez rempli tape 4 de la section Conna tre ses fluorochromes Pour notre exemple nous avons donc Dye DAFI Alexa Fluor 488 De la longueur d onde la plus courte TRITC la plus lonque Copie d cran 14 S lection des fluorochromes 2 4 Choisissez maintenant votre type de configuration voir Copie d cran 11 Fen tre Smart Setup p 26 Zone B Smart Setup Dye DAPI Alexa Fluor 488 TRITC Best signal Best compromise Emission signal Copie d cran 15 Fen tre Smart Setup compl t e Manuel d Utilisation Microscope Confocal Zeiss LSM 710 Pr cis 01 2014 L gende A Intensit du signal pour chaque fluorochrome B Pourcentage de fuite spectrale cross talk La loupe pointe sur le passage du fluorochrome bleu dans le canal vert C Vitesse relative d acquisition Vous avez le choix entre 3 propositions de configuration L gt Fastest L gt Best Signal L gt Best compromise D Fastest Cette proposition cr
71. oir correctement suivi les tapes initiales de fin de session voir Etapes initiales p 71 suivez la proc dure suivante 1 R cup rez votre chantillon a Descendez manuellement un petit peu la position de focus en tournant vers vous de quelques tours a vis macrom trique de gauche voir Initiation pilotage manipulation du microscope p 12 Appuyez sur la touche Load Position sur la droite du statif pour descendre la platine voir Initiation pilotage manipulation du microscope p 12 Descendez au maximum la platine en appuyant et maintenant appuy jusqu l arr t la touche Load position sur la droite du statif voir Initiation pilotage manipulation du microscope p 12 Retirez d licatement votre lame du porte objet faites glisser doucement la lame vers vous Nettoyez soigneusement votre lame 2 Si vous tiez sur un objectif immersion nettoyez soigneusement l objectif sinon passez directement l tape 3 a b C d Prenez un papier optique et plier le en 4 Essuyez d licatement l objectif n appuyez pas fort Repliez votre papier optique Ressuyez une nouvelle fois l objectif d licatement 3 Nettoyez si besoin la platine avec un Kimtech impr gn d alcool 4 Appuyez sur la touche Focus Position sur la droite du statif voir Initiation pilotage manipulation du microscope p 12 pour remonter la platine 5 Nettoyez si besoin le bureau avec un Kimtech impr gn d alcoo
72. ope confocal Zeiss LSM 710 L gende A Bouteille d air comprim F Lampe fluo HXP B Statif du microscope G Remote Control C Joystick x y H Banc Lasers D Ecran de contr le l T te confocale E Boitier d alimentation Satif et Platine x y J Ordinateur Le microscope confocal Zeiss LSM 710 est mont sur un statif d pifluorescence droit Axioimager Z1 voir Photo s 1 p 1 B Ce statif est compos De 2 sources de lumi re L gt 1 source halog ne pour l observation de l chantillon en transmission L gt 1 source Metal Halide HXP pour l excitation et l observation des fluorochromes voir Photo s 1 p 1 F gt D un trajet optique comprenant diff rentes lentilles des miroirs des filtres et des objectifs pour guider la lumi re jusqu l chantillon puis jusqu aux yeux de l observateur Les objectifs pr sents sur ce microscope sont les suivants L gt 1 objectif 10x sec O N 0 3 L gt 1 objectif 20 x sec O N 0 8 L gt 1 objectif 63x immersion eau O N 1 2 L gt 1 objectif 63x immersion huile O N 1 4 CO Ce microscope n est pas quip de cam ra CCD puisqu il n est pas destin faire des acquisitions en pifluorescence classique Version 1 01 14 Service Commun de Microscopie 1 Manuel d Utilisation Microscope Confocal Zeiss LSM 710 Pr cis 01 2014 Pour transformer ce statif en microscope confocal il a fallu rajouter 1 banc lasers voir Photo s 1 p 1
73. our l exp rience du jour Se MRAID c Ouvrez le serveur de stockage SCMRAID en double cliquant sur l ic ne SCMRAID a Rejoignez votre dossier personnel serveur Coller votre dossier exp rience du jour x Voir Bureau de l ordinateur Version 1 01 14 Service Commun de Microscopie 71 Manuel d Utilisation Microscope Confocal Zeiss LSM 710 Pr cis 01 2014 5 Fermezles fen tres du dossier local et serveur 6 V rifiez le planning de r servation en double cliquant sur l ic ne Planning a Ge Le planning de la semaine en cours s ouvre 09 00 10 00 10 00 11 00 11 00 12 00 Copie d cran 63 Planning de r servation S il y a un utilisateur juste apr s vous exemple le 17 juin ci dessus ou s il y a 1 2 ou 3 heures de libre entre vous et le suivant exemple le 16 et 18 juin ci dessus suivez la proc dure de fin n 1 S il y a plus de 3 heures de libre entre vous et les suivants exemple le 19 juin ci dessus ou si vous tes le dernier utilisateur de la journ e exemple le 20 juin suivez la proc dure de fin n 2 zk Voir Bureau de l ordinateur Version 1 01 14 Service Commun de Microscopie 72 Manuel d Utilisation Microscope Confocal Zeiss LSM 710 Pr cis 01 2014 Proc dure de Fin n 1 Sans arr t de l quipement Cette proc dure est suivre uniquement si Ilya un utilisateur juste apr s vous Ilya un utilisateur 1 2 ou 3 heures apr s vous Apr s av
74. pe appuyez simplement sur Done pour terminer la mise en place de l objectif que vous avez choisi 2 V rifiez que la platine est en position focus en appuyant une fois sur la touche Focus Position voir Photo s 9 Vues statif p 14 Ic ne F 3 Descendez manuellement la position de focus en tournant la vis macrom trique droite de mise au point vers vous de telle sorte que la platine soit clairement plus basse que l objectif 3 4 tours suffisent la plupart du temps De cette fa on vous d finissez une nouvelle position de focus et ne risquerez pas de casser votre Version 1 01 14 Service Commun de Microscopie 17 lame lorsque VOUS appuierez sur Focus Position Voir Ce que vous pouvez faire sur le microscope section Touche Focus Postion p 14 Appuyez maintenant sur Load position voir Photo s 9 Vues statif p 14 Ic ne F pour descendre la platine 5 R appuyez et maintenez Load position voir Photo s 9 Vues statif p 14 Ic ne F pour descendre au maximum la platine 6 V rifiez que le porte objet est correctement mont sur la platine L gt Posez vos 2 majeurs sur la jonction porte objet platine est faites le tour Photo s 12 V rification porte objet Gi ATTENTION A NE PAS FAIRE NE PASSEZ JAMAIS VOS DOIGTS SOUS LES OBJECTIFS QUAND VOUS VERIFIEZ QUE LE PORTE OBJET EST BIEN MONTE VOUS RISQUEZ D ABIMER LES OBJECTIFS SURTOUT SI VOS DOIGTS
75. processus Le r glage des param tres d acquisition est maintenant termin Si vous avez le moindre doute ou si vous rencontrez une difficult rapprochez vous imm diatement du Responsable de la Plate Forme Version 1 01 14 Service Commun de Microscopie 53 Manuel d Utilisation Microscope Confocal Zeiss LSM 710 Pr cis 01 2014 Acquisition et enregistrement d images Acquisition d images simples uniquement le plan focal L acquisition d images simples permet d acqu rir uniquement l information provenant du plan focal actuellement visible sur le microscope Pour acqu rir ce type d Images suivez la proc dure suivante ATTENTION Toutes les op rations d installation de l chantillon de mise au point de configuration du trajet optique confocal et de r glages des param tres d acquisition voir Installation de l chantillon p 17 R alisation de la mise au point p 22 R alisation de la configuration confocale p 24 et R glage des param tres d acquisition p 38 doivent avoir t r alis es avant de suivre la proc dure suivante Proc dure 1 Cliquez sur l ic ne Live Choisissez le plan focal que vous souhaitez imager en balayant en z votre chantillon gr ce la vis microm trique vis la plus l ext rieur de l cran de contr le El ment n 6 voir Ce que vous pouvez faire sur l cran de contr le p 13 Arr tez vous sur le plan focal de votre choix 3 Stoppezle live en cliqua
76. s d acquisitions m me trajet optique et m mes r glages qu une image de r f rence suivez la proc dure suivante 1 Cherchez votre image de r f rence dans le disque dur local D et faites la glisser dans la zone image du logiciel ou utilisez File gt Open puis recherchez votre image sur le disque du local D L image s ouvre 2 Dans la zone image section Outils Compl mentaires voir Copie d cran 58 Outils compl mentaires p 64 et onglet Dimensions voir L onglet Dimensions p 64 cliquez sur l ic ne Reuse Cette option recharge alors le trajet optique confocal avec l objectif et tous les param tres qui ont t utilis s pour acqu rir l image de r f rence Gi ATTENTION A NE PAS FAIRE Si vous tes avec un objectif immersion et que vous souhaitez recharger des param tres d acquisition r alis s avec un objectif sec NETTOYEZ D ABORD VOTRE LAMELLE AVANT DE RECHARGER LES PARAMETRES AVEC LA FONCTION REUSE Voir Passage d un objectif immersion un objectif sec p 67 Version 1 01 14 Service Commun de Microscopie 70 Manuel d Utilisation Microscope Confocal Zeiss LSM 710 Pr cis 01 2014 Fin de session Veuillez respecter vos horaires de sessions Pensez garder du temps en fin de session pour r aliser les tapes de r cup ration des chantillons nettoyage et arr t de l quipement si besoin Etapes initiales Lorsq
77. s de param trage Cochez donc la case Show All si elle n est pas d j coch e Scan Area Reset All Line Select Copie d cran 5 Panneau ouvert ca Acquisition Mode J Showall A Copie d cran 6 Panneau ferm Version 1 01 14 Service Commun de Microscopie 5 Manuel d Utilisation Microscope Confocal Zeiss LSM 710 Pr cis 01 2014 D marrage du microscope Je Photo s 2 Etape de d marrage du microscope Les num ros indiqu s sur la photo ci dessus correspondent aux num ros de la liste qui suit 1 16 A et B Avant toute chose retirez la housse de protection pr sente sur le statif Pour d marrer le microscope 1 Ouvrez la bouteille d air comprim pour mettre la table antivibratoire sous pression A Attention Utilisez le robinet principal pour ouvrir et fermer la bouteille R glez la pression sur 1 5 bar sur le cadran de droite Utilisez le robinet du manom tre pour r gler la pression Version 1 01 14 Service Commun de Microscopie 6 Manuel d Utilisation Microscope Confocal Zeiss LSM 710 Pr cis 01 2014 Sur le boitier Remote Control 2 3 et 4 2 Mettez la cl Laser sur On 3 Mettez l interrupteur Main switch sur On 4 Mettez l interrupteur a System PC sur On Photo s 3 Remote control 1 Gi A NE PAS FAIRE NE PAS METTRE l INTERRUPTEUR COMPONENTS voir Photo s 3
78. scan aller simple ou aller retour d image donn e L Zone de r glage du zoom crop E Line step permet de sauter des lignes 1 10 M Ic ne pour d finir un zoom de 1 taille d image standard F Vitesse d acquisition N Ic ne pour r initialiser tous les param tres du zoom G Nombre d it rations pour la moyenne ou la somme 1 16 Version 1 01 14 Service Commun de Microscopie 38 Manuel d Utilisation Microscope Confocal Zeiss LSM 710 Pr cis 01 2014 R glage du panneau e Acquisition Mode Toutes les valeurs indiqu es dans la suite de la proc dure sont donn es titre indicatif Elle constitue un bon point de d part pour commencer faire des observations Ces valeurs ne sont en aucun cas universelles et ne seront pas forc ment adapt es votre probl matique Les valeurs indiqu es ci apr s sont des valeurs par d fauts Ne les appliquez pas sans avoir v rifi que ces r glages r pondent vos besoins Analysez votre question biologique et adaptez les r glages pour r pondre le plus efficacement possible votre probl matique En cas de doute n h sitez pas vous rapprocher du personnel de la Plate Forme La proc dure 1 Ouvrez le panneau Acquisition Mode s il n est pas ouvert puis cochez l option Show All si elle n est pas activ e 2 V rifiez que l objectif indiqu en zone A est bien celui que vous souhaitez utiliser pour faire vos r glages Plan Apochromat
79. ser votre mise au point V rifiez r guli rement la mont e de l chantillon par rapport l objectif pour viter toute casse de votre lame et de l optique N h sitez pas vous rapprocher du Responsable de la Plate Forme en cas de besoin La mise au point de l chantillon est maintenant termin e Si vous avez le moindre doute ou si vous rencontrez une difficult rapprochez vous imm diatement du Responsable de la Plate Forme Voir Initiation pilotage manipulation du microscope p 12 Version 1 01 14 Service Commun de Microscopie 23 Manuel d Utilisation Microscope Confocal Zeiss LSM 710 Pr cis 01 2014 R alisation de la configuration confocale Afin comprendre plus facilement la proc dure de configuration du trajet optique en mode confocal nous utiliserons un exemple concret Description de l exemple Pour r aliser la configuration confocal nous nous appuierons sur l chantillon suivant intitul Lame de d mo gt Cellules endoth liales bovines marqu es de la fa on suivante L gt DAPI pour le marquage du noyau L gt Alexa 488 pour le marquage des filaments d actine L gt TRITC pour le marquage des mitochondries Ce type de triple marquage est tr s r guli rement utilis en microscopie photonique Le but de ce chapitre est de param trer le trajet optique en mode confocal afin de pouvoir visualiser les 3 l ments marqu s de notre chantillon Noyaux filaments d actine et mito
80. sion 1 01 14 Service Commun de Microscopie 57 Manuel d Utilisation Microscope Confocal Zeiss LSM 710 Pr cis 01 2014 Enregistrement des images Les images acquises s affichent en miniatures dans la fen tre 3 du logiciel voir Copie d cran 4 Logiciel LSM Zen 1 p 3 Fen tre 3 Images and Documents Image 1 Copie d cran 49 Fen tre 3 Image non sauvegard e Images and Documents Image Lem C 3 0 MB Image4 lsm C 3 0 MB Image5 lsm C 3 0 MB Image6 lsm SC 48 ME Image7 lsm E 3 0 ME Image8 lsm EC 45 ME Image Lem C 3 0 MB Image Lem ZC 28 MB x Copie d cran 50 Fen tre 3 Images sauvegard es Proc dure 1 Dans la fen tre 3 Sauvegarde des images voir ci dessus cliquez sur l image que vous souhaitez enregistrer Par d faut le logiciel s lectionne automatiquement la derni re image acquise 2 Cliquez sur la disquette CI sous la derni re image voir Copie d cran 49 Fen tre 3 Image non sauvegard e ci dessus 3 La fen tre Save As s ouvre Version 1 01 14 Service Commun de Microscopie 58 Manuel d Utilisation Microscope Confocal Zeiss LSM 710 Pr cis 01 2014 Savein Ip Computer ep Er Sy Hard Disk Drives 2 SYSTEM C DATA D D 27 D BEEN Ka 0 Deeg ES 539 Ce free of 151 TE Devices with Removable Storage 1 Desktop 5 DVD RW Drive E Lbranes A Network Location 1 inteme 172 20
81. t crasera les r glages de miroirs dichro ques Les r glages de miroirs dicho ques utilis s en track 1 seront appliqu s toutes les autres tracks Nous nous retrouvons donc avec la configuration suivante RO KS E MBS 405 gt ce miroir permet bien de Conclusion r fl chir la raie 405 nm s lectionn e en J La track 2 et 3 ne fonctionnent plus Il faut donc adapter la configuration en faisant en sorte qu un miroir choisi dans une track fonctionne aussi pour les autres le mode Frame Fast emp chant le changement de miroir entre les tracks pour gagner du temps 8 Pour chacune des tracks notez dans le tableau ci dessous quelles sont les raies lasers utilis es visibles et invisible puis remplissez la case Toutes tracks confondues en notant toutes les raies utilis es dans chacune des tracks vous trouverez des tableaux vierges sur le bureau Toutes tracks confondues Visible light Invisible light Version 1 01 14 Service Commun de Microscopie 33 Manuel d Utilisation Microscope Confocal Zeiss LSM 710 Pr cis 01 2014 Pour notre l explemple nous avons Visible light Invisible light 9 S lectionnez la track 1 Toutes tracks confondues 4SSnm SGL nm 10 Mettez enk un miroir dichro que capable de r fl chir toutes les longueurs d ondes not es dans la case Toutes tracks confondues de la ligne oO tableau ci dessus Sil n y
82. t le microscope en respectant bien la proc dure d arr t 2 Prot gez le microscope avec les b ches que vous trouverez dans le meuble clapets gris fonc situ en face du microscope confocal Zeiss LSM 510 casier du bas not BACHES DE PROTECTION 3 tailles de b ches sont disponibles Small Medium et Large 3 Contactez le plus rapidement possible le Responsable de l Atelier voir fiche de contact ci dessus 4 Envoyez un e mail l adresse suivante scm parisdescartes fr pour signaler l incident Version 1 01 14 Service Commun de Microscopie 78 Manuel d Utilisation Microscope Confocal Zeiss LSM 710 Pr cis 01 2014 Proc dure en cas d incident Equipement En cas d absence du Responsable de la Plate Forme Si vous rencontrez un probl me lors de l utilisation d un quipement et que le Responsable de la Plate Forme n est pas disponible vous pouvez contacter M TOURAIN Christophe N de Poste 01 42 86 21 08 E Mail christophe tourain parisdescartes fr Localisation 3 tage Pi ce P326 N oubliez pas d envoyer un e mail l adresse suivante scm parisdescartes fr pour notifier l incident Si vous ne trouvez personne pour r soudre le probl me Si personne ne peut vous aider merci de remplir le formulaire Incident Microscope disponible sur le site du SCM l adresse suivante htto Wwww biomedicale univ parisS fr scm formulaire incident equipement Vous pouvez
83. tre 2 vous trouverez une s rie d outils compl mentaires Outils compl mentaires Copie d cran 58 Outils compl mentaires Dimensions Dans cette zone vous trouverez les onglets Dimensions Dimensions Interpolation BR Single Channel Range Indicator Quick Color Setup y Merged Reuse x Crop Positions Stage Copie d cran 59 Onglet Dimensions Manuel d Utilisation Microscope Confocal Zeiss LSM 710 Pr cis 01 2014 Cet onglet permet de naviguer dans vos exp riences multi param triques 50 Interpolation d activer ou masquer des canaux et changer leur couleur d affichage Ch1 T1 ChS1 T2 Cn2 13 i WW r Cliquez sur une ic ne de ce type AMBE pour afficher masquer le canal correspondant Cliquez sur une ic ne de ce type mm pour modifier la couleur d affichage du canal correspondant d activer d sactiver la fonction de Range Indicator Range Indicator d acc der la fonction Reuse qui permet de recharger tous les param tres d acquisition d une image Feuse L onglet e Display Display Display Auto Min Max Bestfit 0 40 Copie d cran 60 Onglet Display Cet onglet permet de visualiser et manipuler l histogramme des images de fa on global ou canal par canal Pour choisir le mode global All ou s lectionner les canaux cliquez sur les ic nes suivantes Version 1 01 14 Serv
84. ttoyez soigneusement l objectif avec du papier optique Appuyez sur la touche Focus Position sur la droite du statif voir Initiation pilotage manipulation du microscope p 12 S lectionnez votre objectif dans le logiciel Onglet Locate voir Initiation pilotage manipulation du microscope p 12 L objectif se met en place automatiquement et la platine descend automatiquement en position load a L cran de contr le indique Change Immersion Descendez au maximum la platine en appuyant et maintenant appuy jusqu l arr t la touche Load position a sur la droite du statif voir Initiation pilotage manipulation du microscope p 12 Remettez en place votre lame sur le porte objet voir Installation de l chantillon p 17 Etape 10 Allumez la lumi re transmise voir Initiation pilotage manipulation du microscope p 12 Centrez votre chantillon dans le spot de lumi re gr ce au joystick x y Appuyez sur la touche Focus Position sur la droite du statif voir Initiation pilotage manipulation du microscope p 12 Coupez la lumi re transmise voir Initiation pilotage manipulation du microscope p 12 Ajustez votre mise au point voir R alisation de la mise au point p 22 R ajustez vos param tres d acquisitions en prenant en consid ration ce nouvel objectif voir R glage des param tres d acquisition p 38 Faites vos nouvelles acquisitions voir Acquisition et enregistrement d images p 54
85. ue vous avez termin vos acquisitions suivez la proc dure suivante 1 V rifiez que toutes les images que vous souhaitez conserver sont bien enregistr es absence du logo ES sur les images dans la fen tre de sauvegarde voir Copie d cran 4 Logiciel LSM Zen 1 p 3 Fen tre 3 2 Fermez toutes les images ouvertes dans le logiciel re a Cliquez sur la 1 image de la liste dans la fen tre de sauvegarde voir Copie d cran 4 Logiciel LSM Zen 1 p 3 Fen tre 3 b Appuyez et maintenez enfonc e la touche SHIFT du clavier c Tout en maintenant la touche SHIFT enfonc e cliquez sur la derni re image de la liste dans la fen tre de sauvegarde voir Copie d cran 4 Logiciel LSM Zen 1 p 3 Fen tre 3 Toutes les images sont ainsi s lectionn es Cliquez sur l ic ne Supprimer pe en dessous de la derni re image de la liste e Si certaines images n ont pas t enregistr es un message vous propose de les enregistrer Cliquez sur Yes pour les enregistrer ou sur No pour les supprimer 3 REDUISEZ MAIS NE FERMEZ PAS le logiciel gr ce l ic ne de r duction sur la croix Ne cliquez pas 4 Transf rez vos images sur le serveur de stockage SCMRAID a Rejoignez votre dossier personnel local disque D Pour rejoindre le lieu de stockage local vous ar Images LSM 710 pouvez aussi double cliquer sur l ic ne Stockage Local b Copiez votre dossier p
86. um rique de l objectif utilis 0 61 x Longueur d onde en nm La formule est D en nm 2 x Ouverture num rique de l objectif Donc plus la longueur d onde est grande plus la largeur du 1 pic est grande Pour tre confocal le pinhole doit avoir une taille comprise entre 0 8 et 1 AU Mais attention si nous calons la taille du pinhole 1 AU par rapport au dapi nous serons en dessous de l unit d Airy pour les autres canaux Le mode de switch Frame Fast voir Le panneau Light Path p 30 Etape 7 ne permet pas de changer la taille du pinhole entre les tracks DAPI nE D 1 Airy Unit Alexa 488 I D D 0 8 Airy Unit I l I I I I I TRITC l l I I Di D 0 4 Airy Unit Il faut donc trouver un bon compromis pour que la taille du pinhole soit dans l intervalle 0 8 1 AU pour toutes les tracks voir tape 4 ci apr s Un pinhole trop grand ne vous donnerait plus une image confocale Un phinhole trop petit ne permettrait plus de recueillir suffisamment de signal Version 1 01 14 Service Commun de Microscopie 45 Manuel d Utilisation Microscope Confocal Zeiss LSM 710 Pr cis 01 2014 4 S lectionnez les autres track puis v rifiez la taille des pinholes Voir zone E et cadre bleu ci dessous P P h K T 1 AU max Copie d cran 32 V rification taille du Phinhole Panneau Cha
87. ur le boitier Remote Control Etape 7 8 9 et 10 7 Coupez l interrupteur Components n 16 ci contre 8 Quand l ordinateur est bien compl tement teint coupez l interrupteur System PC n 4 ci contre Photo s 22 Arr t Remote Control Avant de r aliser l tape 9 ci dessous assurez vous que le laser Argon a bien termin son refroidissement Il y a 3 indicateurs de refroidissement termin Le bruit de la ventilation s arr te On ne sent plus de vibration sur l alimentation du laser Argon On ne sent plus de courant dar l arri re de l alimentation du laser Argon Tant que le refroidissement n est pas termin ne r alisez SURTOUT PAS l tape 9 ci dessous 9 Quand le refroidissement du laser Argon est bien termin e mettez le main switch sur OFF n 3 ci dessus 10 Mettez la cl laser sur O n 2 ci dessus Fin Remote Control 11 Fermez bien la bouteille d air comprim Tournez le robinet principal fond vers la droite Photo s 23 Arr t bouteille air comprim Version 1 01 14 Service Commun de Microscopie 75 Manuel d Utilisation Microscope Confocal Zeiss LSM 710 Pr cis 01 2014 12 Remttez la housse de protection sur le devant du statif Votre session est maintenant termin e Si vous avez le moindre doute ou si vous rencontrez une difficult rapprochez vous imm diatement du Responsable de la Plate Forme Version 1
88. uyez simplement sur l interrupteur Shutter a Version 1 01 14 Service Commun de Microscopie H Manuel d Utilisation Microscope Confocal Zeiss LSM 710 Pr cis 01 2014 Etape facultative 9 Cette tape allume le laser Argon Si vous avez besoin d une des raies laser indiqu es ci dessous r alisez l tape 9 Sinon passez directement l tape 10 Raies lasers allum es l tape 9 L 458 nm 488 nm et 514 nm Pour allumer le laser Argon Sur l alimentation pos e sur le banc laser gauche du statif I Ne touchez pas l interrupteur not Ne pas toucher Tournez la cl sur Sur la t l commande pos e droite de l alimentation mettez le switch sur la position Run Position haute c Le laser mettra environ 6 minutes pour chauffer Apr s ces 6 minutes de chauffe v rifiez sur la t l commande du laser Argon que la led verte est bien allum e et que Photo s 4 D marrage Laser Argon la led rouge est bien teinte Si la led rouge est allum e tournez vers la gauche TRES DELICATEMENT le potentiom tre de la t l commande jusqu ce que la led rouge soit JUSTE teinte Fin tape facultative 10 11 12 13 14 15 16 Allumez l ordinateur Allumez l cran s il n tait pas en veille Attendez que l cran affiche le message suivant Press CTRL ALT DELETE to log on Appuyez sur les touches CTRL ALT DELETE pour
89. w Show all 3 Activez la case Show All were c ne A 4 Cliquez sur l option First Last 5 Cliquez sur l ic ne B pour d finir l intervalle en z optimal entre 2 images 6 Cliq uez sur l ic ne Live voir Copie d cran 2 Fen tre 1 en mode Acquisition a Colonne a Zone Experiment Manager Vous devez maintenant d finir le haut et le bas de votre chantillon 7 Balayer en z votre chantillon gr ce la vis microm trique vis la plus l ext rieur de l cran de contr le El ment n 6 voir Ce que vous pouvez faire sur l cran de contr le p 13 Arr tez vous l extr mit en z de votre choix D D GE H ct A LA D LA D LA 8 Cliquez sur Set First Ic ne C pour m moriser cette extr mit 9 Balayer en z votre chantillon dans l autre sens gr ce la vis microm trique vis la plus l ext rieur de l cran de contr le Element n 6 voir Ce que vous pouvez faire sur l cran de contr le p 13 Arr tez vous l autre l extr mit en z de votre choix set Last z i e 10 Cliquez sur Set Last AE Ic ne D pour m moriser cette autre extr mit Les bornes haute et basse de votre chantillon sont maintenant enregistr es 11 Stoppez le live en cliquant sur l ic ne Stop Voir Copie d cran 46 Panneau Z Stack p 56 Version 1 01 14 Service Commun de Microscopie 56 Manuel d Utilisation Microscope Confoc

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