Le clonage positionnel : ou comment chercher une
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1. Une h t rog neite clinique rend la recherche ardue et sujette r sultats discordants le nombre potentiel des familles une maladie extr mement rare a plus de difficul t b n ficier de ce type d approche la collection de l ensemble des membres d une famille pour une famille donn e la pr cision de la liaison ou linkage repose sur la coop ration de tous les membres de la famille atteints et non atteints indispen sable l tude ce qui conduit une collecte de pr l vements tendue souvent manuelle avec le g n ticien et l infirmi re dans la voiture sur les routes de France Il est donc crucial que l ensemble des membres des familles aient envie de contribuer la recherche dans un but curatif ou pour am liorer le diagnostic pr natal des maladies tr s s v res la possibilit de distinguer les sujets atteints et non atteints dans les maladies g n tiques dominantes p n trance variable expression plus ou moins visible de la maladie quand on est porteur du g ne mut le risque majeur est de consid rer comme 184 non atteinte une personne porteuse du g ne sans expres sion clinique L examen cli nique par un clinicien averti qui reconna tra tous les petits signes de la maladie est donc important le nombre des chercheurs et le budget du laboratoire ce type d tude n cessite au moins quatre ou cinq cher cheurs et techniciens sur2. j njouod SUOHPMNA s j njouod suonejnu suon 2Q S2PHO2 gt nu 1 2p suon2d 1 2p uolsuedx s j njouod suonejnu suon 2Q s j njouod SUOHEMNAY s jj npuod suonme nuu suoneoIijdn s j njouod suoneny S2PHO2 gt nu 1 p suon2d 1 p uosuedx s j njouod suoneny S2PHO2 gt nu 1 p suon2d 1 p uosuedx s jj npuod suonen y s j njouod suonen y 3 7 3 ode 2noS zouuo s jj npuod suonen A s j njouod SUOHPMNMY s j njouod suoneny s j njouod suoyeynw suon 2Q 24 24 ad s jj npuod suonenu suogeorjdnp suona s j njouod suoyeynw suon 2 s j njouod suon nui suon 2 s j njouod suonenui suon 2Q s j njouod suonejnu suona 2q s jj npuod suonen A s jj npuod suonen A s j njouod SUOHPMNAY s jj npuod suonme nuu suoneoijdn s j njouod suoneny s jj npuod suoenw sUOIj2 2q s j njouod suonejnu suon 24 2Q 2q 2q s j njouod suonejnu suon s j njpouod suone nui suo s j njouod suonejnu suon u28 np uone123le p 2dAL xe n j 5 PUBIS 2P 2u 21O1d NW uel ut21o1d uuO1 deu2 2ul21O1d Jgupuoupollu 2JJnos 1 In Sueu53 21Q xne5Ipe p uoneind3j i 2 91 21PURIQUAU 2u 2 O1d 2SPUN 2UI2J014 211PN 2912JUI JpejJuoO auku ej 2P 2u 21O1d auw ej 2P 2u 21O1d 2uuoizdeu gt 2ul21O1d 21N2U2JU
3. 83PX 1593 GEPEI 9 b S21IBJP212U XN2UI2APD S2WOIBU S211P NDSPA S21 PWOU 2 801 X 2P 2WOIPUAS jeAuauu p102 2JUEUIWOP jeijiuue nbiseds 2162 y2 up uy 2p 2IXP 2nbiydonoAwe 2 e12 e 2soj 5 S2API2U252POIN2N s Ipe e jA dei ed ssnJl21Q i2ug M ul 1 p luo o lA s ejnosnw s ludons Q X UJOO 2HP OEUT 2p 21PEJPIA g 2d4 2P too j auey 2P 21PEJP IA YI d4 2P yoo uey 01PY 2P 2lIpe elA s nbu ydu d saledoin2N 22 2Je1eJ jP uwej lutuosul Jeijluue qoer pza Ap uu y p Ipe ejAJ IS uolSunun p lpe elA 5o2 4d NQ2P eljiuue y a u l uz V PILE 12WI2UZ Jip g 22W12u7 eiue 12W2YZy 25o221d 1no p e 220921d 1no p e S2DU2W2 UOS IMA 2P 21PEJPA jeljiuue 2251212026 21U01SA xXNBAU29 su XNPAOU s p uyy nepuig j ddiH uoA 2p IpejejAJ 2 A2unogq 2P 2 N2120QN 2SO12 26 2 Z 2d4 p 2S0JPWOIQHOINZN 2 JA2UINOg p 25N212QN 25012 2dA p 2S0JPWOIQHOINZN s soleuuooeuq 10je7 2P Ipe e jA 2nbiyedoipl 2jei lue sd jid3 u ne Anou np u8lu q 2Isd jidg s isd j d AA Ie s nbijoqe1 ui s Ipe e AJ S21P NDHU2AU2A S21IBUIWE s ldo O1212 J X p 221 21jPYd2oU2ssI xayo 2 9n0 12 21Q 2 J IAJ 214544 gt ed 2145 2 PUOIN2U uone p 21 PUIOU X 9 221 21Pyd2301P4FJ ljJeud25u soudoj o ljJeud25u soudoj o l
4. d emploi chromosomique l infiniment invisible le triplet de bases nucl iques Et c t de cela trouver une aiguille dans une meule de foin c est bien connu pour tre beaucoup plus facile Act M d Int Neurologie 1 n 5 octobre 2000 En fonction de la localisation retrouv e des informations g n tiques pr cises ont d j pu tre recueillies dans la r gion ainsi le chro mosome X qui est multiexplor acc l rant cette tape 186 La technique de marche sur le chromosome consiste s appuyer sur des YAC BAC ou PAC chromosomes artificiels de levure bac t rie ou phage qui contiennent un fragment de g nome humain chevauchant la r gion d int r t En effet un ensemble de ces chromo somes artificiels parcourant l int gralit du g nome a t fabrique gr ce l action de plu sieurs quipes de recherche Cohen 1993 et est en perp tuel enrichissement Une fois le ou les YACS s lectionn s 1l faut aller la p che au g ne soit en s quen ant bestiale ment l ensemble du fragment de g nome soit en recherchant des s quences qui voquent une s quence codante l ments sp cifiques d un g ne exprime ou exon trapping G nes candidats Dans certains cas des g nes peuvent avoir pr alablement t localis s dans cette r gion d int r t La s quence de ces g nes sera sys t matiquement test e surtout si la fonction potentielle du g ne
5. peut avoir une liaison avec le ph notype ainsi l ost ogen se imparfaite et les g nes du collag ne Cette m thode permet alors de court circuiter la phase d ex ploration syst matique de la r gion Recherche de mutations Une fois la s quence codante du g ne d cou verte c est la course aux premi res mutations invalidant le g ne responsables de sa perte de fonction compl te ou partielle qu elles soient des insertions des d l tions ou des mutations non sens Il faut alors publier tr s vite par crainte d un scoop publi par l quipe adverse car 1l y a toujours une quipe adverse ce qui stimule la parano a des quipes de recherche Validation des mutations La validation des mutations de type faux sens modifiant simplement la s quence du g ne sans le d truire compl tement doit tre d montr e par la constatation d une anoma lie de la fonction de la prot ine cod e par ce g ne permettant ainsi de les diff rencier d un simple polymorphisme de s quence Cette tape est galement longue et fasti dieuse car elle implique de transfecter introduire la s quence du g ne porteuse de la mutation dans des cellules en culture pour v rifier que cette anomalie est bien respon sable d une non fonctionnalit de la prot ine produite N dro roriti r s Souris knock out La derni re tape de cette course au g ne consiste reproduire la maladie chez la sou ris en rem
6. Neuro Froni Le clonage positionnel ou comment chercher une aiguille Cloner pourquoi Le clonage positionnel ou d couverte du g ne respon sable d une maladie humai ne par g n tique inverse a t utilis avec succ s pour la premi re fois en 1986 avec la d couverte du g ne de l agranulocytose sep tique d ficit immunitaire s v re du gar on localis en Xp21 1 Royer Pakora 1986 Cette avanc e fonda mentale gratifi e d un article dans la revue presti gieuse Nature est le fruit de la recherche sur plus de cinq ans d un laboratoire sp cialis en immunologie Actuellement la puissance des outils de biologie mol cu laire et le perfectionnement de la carte du g nome humain permettent de r duire ce temps mais le clonage positionnel reste une prouesse technique salu e par les pairs Clonage positionnel pr requis L initiation d un clonage positionnel est un choix strat gique toujours m rement r fl chi qui entra ne un laboratoire complet dans une qu te du Graal longue co teuse et ris qu e La d cision prend en compte les cri t res suivants la pr cision du ph notype clinique ou comment tre s r que toutes les familles tu di es sont bien atteintes de la m me maladie Service de p diatrie n onatale h pital intercommunal Cr teil Act M d Int Neurologie 1 n 5 octobre 2000 dans une meule de foin M G rard Blanluet
7. P JUIOD p ins NUUODUI 2 0 2118N 224AUI EUSIS np 2u 21O1d nuuoouj 2 JIPUe0JQUUSUUISUPe1 2UI2 O1d JIeUeJQUUSUUSUEe1 2UI2 O1d ul oidod i 2PIOJAUE p in sin521q 2JAIN9 np In2yodsue1 2uuo1 deu2 2ul21O1d 1n uun p Inassz1ddns 2u2c 1In uun 2p Inass21ddns 2u2c 1In uun p Inass21ddns 2u2c 1In uun p In2ss21ddns 2u2c inaun p Inassz1ddns 2u2c sezeydsoyd 2uISOIA nb ssejod jeueO nb ssejod eueO s2uI201d s p UOHPASO C 2un2e g JUPI 25 2uI2 O1d s nonl1oJ2lui p 1n2 P51 IQPIS S2NQNJOIDIUI xn uoslel ej suep 2 9 21181N 29 uoIsaupe 2P 2uI21014 euoinau in2pnpul euoinzu in2pnpul euoinau An2Pnpul uoliu IWD2 AWI unsed 2 ulxe e1 GX se nuusip pZxoi dn uu ug uluolo jA GE 2ux uuoo Od GGdY d uoud np auia01d Nid s2U2601pUe xne 1n21d232y EJPION unsunun G 2ul lu2s21d 2UI IU2S214 yq 2ul l oidodijodvy ddV d d1V V 2UIS0 L4G THA uu qn uewe H auy 2UIWOIQHOINZN VGWd3 CONDA SONDXJ seynwouuewoydsoyd WW d 2uluue j auon 2 qnodq ISIT WSVNOlI EXIS GIZ Sou 5p 53luo 2UI2301d 2u28 np uonssi e5o1 b LGPX 1818 EIP6 6b r b G ElP6I EIPX G GGPl Z AI 51905 lbX l EId l o dry y l8b y br Elb l ISPIS c plbel y b6 GadE ldol p b6 IP35 11 1 ab9 yabg ElPOG G EIdO 85PX 6bXx ld
8. jJeud25u soudoj o s Je1Q2122 SUONIPULIOJ PJAJ s ipe ew 185 Neuro Fronti res p re atteint qui a transmis ses douze fils atteints le microsatellite DIS450 sous sa forme 32 r p titions ce qui n est pas le fruit du hasard On peut esp rer voir confirmer cette transmission pr f rentielle dans une autre famille B pour ce m me microsatellite D15450 avec la transmission d un all le 18 r p titions de la m re atteinte ses dix enfants atteints et dans la famille C L observation est particuli rement facilit e dans les cas de grandes familles compre nant de nombreux malades figure 1 Famille 3 Chromosome 1 Polymorphisme C Famille 2 Chromosome 1 Polymorphisme B er O E RU GUN GAN WOO rye W Len He Oe Bi AU CR CA N Famille Famille 6 Chromosome 1 Chromosome 1 Polymorphisme D Polymorphisme F Famille 1 Chromosome 1 Polymorphisme KO LHE j MANANNAN Maladie r cessive Le principe est le m me en comparant la transmission d un microsatellite d un parent porteur obligatoire h t rozytgote un enfant atteint homozygote La consanguini t favorise ce type d tude c est l Homozygoty Mapping Famille 5 Chromosome 1 Polymo
9. le sujet pour r ussir en moins de cinquante ans et une connaissance approfon die du domaine pour savoir vers quoi on se lance tableau Techniques utilis es G nome scan La premi re tape est de rechercher quelle partie du g nome est toujours transmise chez tous les patients atteints et transmise al a toirement pour les sujets sains L tude de cette liaison maladie localisation subchro mosomique est effectu e par l analyse syst matique de la transmission des marqueurs microsatellites s quences r p t es r parties sur l ensemble du g nome au sein de chaque famille pour trouver une liaison g n tique entre le locus suppos de la mala die et un ou plusieurs microsatellites Le principe est simple mais tr s r p titif regar der dans chaque famille quel microsatellite est toujours transmis d un parent atteint un enfant atteint Maladie dominante Par exemple dans la famille A le micro satellite DIS450 chromosome 1 est pr sent sous les formes 32 et 17 r p titions chez le Tableau non exhaustif des principales maladies neurologiques dont le g ne a t localis et clon par g n tique inverse en perp tuel remanie ment tant il est vrai qu il y a maintenant plusieurs g nes par maladie et plusieurs ph notypes par g ne clon s j njouod SUOMI S2PHO2 gt nu 1 2p suon2d 1 2p uolsuedx sa panpuod SUOHPINAY S2PHO2 gt nu 1 2p suoy2da1 2p uolsuedx s
10. nce Presses Flammarion 1992 Kitzis Warren P Kaplan JC G n tique inverse et mucoviscidose M decine Sciences Presses Flammarion 1988 4 151 6 e Laberge Le Couteulx S Jung HH Labauge P et al Truncating mutations in CCMI encoding KRITI cause hereditary cavernous angiomas Nature Genetics 1999 23 2 189 93 Minassian BA Lee JR Herbrick JA et al Mutations in a gene encoding a novel protein tyro sine phosphatase cause progressive myoclonus epilepsy Nature Genetics 1998 202 171 4 e Royer Pokora B Kunkel LM Monaco AP et al Cloning the gene for an inherited human disor der chronic granulomatous disease on the basis of its chromosomal location Nature 1986 322 32 8 e Singh NA Charlier C Stauffer D et al A novel potassium channel gene KCNO2 is mutated in an inherited epilepsy of newborns Nature Genetics 1998 18 1 25 9
11. pla ant le g ne normal de la souris par un g ne non fonctionnel porteur d une mutation perturbant la fonction normale de la prot ine Le ph notype pr sent par la souris est au mieux proche de la maladie d couverte chez l homme comme les souris sans yeux obtenues apr s inactivation du g ne fonda mental de la formation de l 1l le g ne PAX6 Mais il est vrai que l homme n est pas la souris et des diff rences fondamentales ont d j t d montr es souris porteuses d une mutation du g ne de la dystrophine sans myo pathie mutations d l t res chez l homme l tat h t rozygote et sans expression chez la souris Innovations technologiques La derni re technique actuellement d velop p e est celle des DNA MicroChips permettant P tude de multiples s quences g niques en m me temps ouvrant la porte des tudes complexes et pouvant faire r ver d une ana lyse d g n rescence spinoc r belleuse plus de 12 g nes tudi s retard mental avec dysmorphie au moins 50 g nes actuel lement clon s ou retard mental sans dys morphie plusieurs dizaines de g nes terme Cette technique permettrait m me l analyse de plusieurs centaines de polymor phismes et mutations Recette du clonage positionnel figure 2 Conclusion La technique de clonage positionnel est actuellement extr mement productive per mettant le clonage de plusieurs g nes fonda menta
12. rphisme E Figure 1 Localisation d un locus morbide mais quelle est donc la r gion chromosomique tou jours transmise d un parent atteint un enfant atteint Familles nombreuses souhait es G nome scan Cette tape est longue et d courageante puis qu il faut tester au pire 400 500 microsatel lites pour localiser la maladie sur une r gion chromosomique La m thode du Lod score permet de tester statistiquement cette associa tion maladie microsatellite et un r sultat est probant si le Lod score est sup rieur 3 pro babilit d une liaison significative mala die microsatellite sup rieure 1 sur 1 000 Clonage ou pas clonage Pr cision du ph notype Nombre de familles Pour raccourcir cette tape tout mouton cinq pattes est recueilli pr cieusement Ho n Marche sur chromosome association de la maladie une translocation chromosomique quilibr e tude des points de cassure G nes candidats association morbide de plusieurs maladies diff rentes r v latrice d une d l tion chro mosomique Recherche de mutations mme ie Bo Je Marche sur le chromosome Souris knout out Quand le Lod score permet de suspecter une r gion chromosomique donn e la cartogra phie physique de la r gion peut alors tre entreprise Et cette tape est celle du saut quantique passant de l infiniment visible Figure 2 Clonage positionnel mode
13. ux tous les mois R cemment des g nes de l pilepsie infantile KCNQ2 et KCNQ3 g nes de canaux potassiques res ponsables d pilepsie b nigne n onatale et encore EPM2A g ne de l pilepsie myoclo nique progressive ou maladie de Lafora ont t clon s ainsi que des g nes du fonctionne ment vasculaire c r bral KRITI g ne des 187 angiomes caverneux familiaux NOTCH3 g ne du CADASIL d mence vasculaire avec infarctus c r braux Malheureusement la d couverte de ces multiples g nes ne permet pas toujours de comprendre le rapport entre la fonction du g ne plus ou moins bien tudi e et l expression clinique chez l homme Cette phase de compr hension de la corr lation g notype ph notype est ardue et n cessite des investigations complexes Seront elles l ultime tape de la recherche Mois cl s Clonage positionnel G n tique inverse Pour en savoir plus e Charlier C Singh NA Ryan SG et al A pore mutation in a novel KOT like potassium channel gene in an idiopathic epilepsy family Nature Genetics 1998 18 1 53 5 e Cohen D Chumakov I Weissenbach J A first generation physical map of the human genome Nature 1993 366 698 701 Joutel Corpechot C Ducros et al NOTCH3 mutations in CADASIL an hereditary adult onset condition causing stroke and demen tia Nature 1996 383 707 10 e Kaplan JC Delpech M Biologie mol culaire et M decine M decine Scie
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