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Evaluierung des vollautomatischen Hämatologiegerätes Celltac

1. 1 52 Eeer 0 41 a Y 2 35 Ne ERE e 2 4 6 Average Mean Median Manual 0 40 0 27 Celltac 0 82 0 60 MONO canine 10 L 10 S fei E 1 92 0 05 NM BEE 1 82 e LI 2 4 6 8 10 Average Mean Median Manual 0 77 0 51 Celltac 0 67 0 50 Difference Manual Celltac Difference Manual Celltac 2 5 5 0 b EOS feline 10 L 10 5 o m r 1 16 Fa 0 68 D 2 36 e 2 4 6 8 Average Mean Median Manual 0 49 0 33 Celltac 1 17 1 00 d MONO feline 10 L 5 0 2 5 0 0 0 5 1 0 1 5 2 0 2 5 3 0 Average Mean Median Manual 0 42 0 26 Celltac 0 32 0 20 Fig 4 Bland Altman plots for comparison of EOS and MONO count 55 III Publikation 6 Tables Table 1 Precision of the Celltac Within batch precision of ten replicates of five canine and five feline samples The range of the variation coefficient CV in 96 and the range of data measured in the five samples is shown Maximum allowed imprecision according to a published guideline for quality assurance of quantitative laboratory assays and the Westgard Biological variation database amp desirable quality specifications Between batch precision mean and SD of stabilized control samples 20 measurements of one batch on 20 consecutive days 56 III Publikation r0 0F 0 0 9T OF OT OF D0 Is Gol Oz Ditz SC Us as TI ToO 05 50 Lt 60 T6T 9r TOR S8T
2. Levey und Jennings light emitting diode Leuchtdiode Low Fluorescence Reticulocyte lobularity index Grad der Lobularitat Lymphocytes Lymphozyten Lymphocytes Lymphozyten mean cell hemoglobin H moglobingehalt der einzelnen Erythrozyten mean corpuscular hemoglobin concentration mittlere H moglobinkonzentration der Erythrozytenmasse mean cell volume mittleres Erythrozyteneinzelvolumen III MER MONO MPV NCCLS NH4CL nm PCT PCV PDW PLT R r RBC RDW RET RNS SLS SOP VK WBC WBC DIFF z B Abk rzungsverzeichnis Medium Fluorescence Reticulocyte Monocytes Monozyten mean platelet volume durchschnittliches Thrombozytenvolumen Fallzahl National Committee on Clinical Laboratory Standards Ammoniumchlorid Nanometer 10 Meter plateletcrit Thrombocrit packed cell volume im weiteren Sinne Synonym f r H matokrit platelet distribution width Platelet Thrombozyten Differenz der ersten und zweiten Z hlung Korrelationskoeffizient red blood cell Erythrozyt red blood cell distribution width Erythrozyten Verteilungsbreite reticulocytes Retikulozyten Ribonukleins ure sodium lauryl sulfate Natriumlaurylsulfat Standard Operating Procedure Standardvorgehensweise Variationskoeffizient white blood cell white blood cell differential Differentialblutbild zum Beispiel IV I Einleitung I EINLEITUNG Im medizinischen Alltag ist im Rahmen der diagnostischen Aufarbeitung die Blutanalyse n
3. Prevalence of Low Automated Platelet Counts in Cats Comparison with Prevalence of Thrombocytopenia Based on Blood Smear Estimation Vet Clin Pathol 30 137 140 Ogawa I Furukawa S Abe M Hagio S Hayashi S amp Usuda K 2010 The use of an automated hematology analyzer to observe cell growth in the chromosome aberration test using human lymphocytes J Toxicol Sci 35 923 927 Pankraz A Bauer N amp Moritz A 2009 Comparison of flow cytometry with the Sysmex XT2000iV automated analyzer for the detection of reticulated platelets in dogs Vet Clin Pathol 38 30 38 Pastor J Cuenca R Velarde R Vinas L amp Lavin S 1997 Evaluation of a hematology analyzer with canine and feline blood Vet Clin Pathol 26 138 147 Pedersen H D H ggstr m J Olsen L H Christensen K Selin A Burmeister M L amp Larsen H 2002 Idiopathic Asymptomatic Thrombocytopenia in Cavalier King Charles Spaniels Is an Autosomal Recessive Trait Journal of Veterinary Internal Medicine 16 169 173 Ratomski K Zak J Kasprzycka E Hryniewicz K amp Wysocka J 2010 The estimation of the number of platelets by different methods Pol Merkur Lekarski 28 379 386 Ricos C A V Cava F Garcia Lario JV Hernandez A Jimenez CV Minchinela J Perich C Simon M 1999 Desirable Biological Variation Database specifications 79 VII Literaturverzeichnis Roleff S Arndt G Bottema B Junker L Grab
4. weiterentwickelt wobei sich manche der Messmethoden nicht etablieren konnten Dazu z hlt beispielsweise die Methode die den Grad der Tr bung einer Blutprobe in ein direktes Verh ltnis zur Zellzahl setzt Weiss et al 2010 In Gegensatz dazu steht die Methode von Coulter Electronics einem Vorreiter der zuverl ssigen Analysemethoden Bereits in den f nfziger Jahren brachte Coulter Electronics Ger te auf den Markt die einen oder mehrere Blutparameter analysieren konnten Die darin verwendete Messmethode basierte auf elektrischem Widerstand In den 70er Jahren wurden von Ortho Diagnostik Systems Ger te vermarktet welche hydrodynamische Fokussierung an Laser Streulicht als Messmethode zur Zellz hlung koppelten Stiene Martin et al 1998 Nachdem die Anzahl der Zellen gemessen werden konnte wurden Methoden zur Differenzierung der Zellen erforscht Dazu z hlen entweder in Kombination oder allein e elektrischer Widerstand e selektive Lysierung bestimmter Zelltypen e Trennung nach Zelldichte e zytochemische F rbeverfahren e Streulichtmessung Automatische Ger te arbeiten mit mindestens zwei dieser Methoden in separaten Kan len Bain and Huhn 1997 So verf gt ein Ger t ber mindestens einen Kanal zur Erythrozytenz hlung und einen zur selektiven Lyse der Erythrozyten wonach dann Leukozyten bestimmt werden k nnen In den nachfolgenden Abs tzen soll n her auf diese Methoden eingegangen werden Um die Bestimmung von Retikuloz
5. 6 9 8F9 I0I 8 6E 6 L Wuereyeq 69 96 00r TvVC COSL 6 TT 0 8T1 EE IT GII SS LE ST W AD LI 0 FI F0 GE ST SI Ct SIS TIT 801 8 60r 8c og to Zoe ee CV8 8 0C v6 C8C OIS S EL 67 09 67 91 t CC CL 9 ST IT 99 AO y 40 V601 V601 V601 oww 60T eat ONOIN SO WAT NV LOH 85H LId 28A ro seo SZ LY t KI 08T OL Dat Dot CS r9 er rT cc 19 L E 96 AD o1uoo gotst aid qojeq uasAgag 201 Fa x0 x0 C x0 L x0 9 96 AD uorspaadur pamore Key je wors paard qojeq urqin A Sop uorsra1d q jeq urgra 57 III Publikation Table 2 Analytical error flags Error flag RBC Ghost insufficient red blood cell lysis error flag can t diff WBC unable to analyze the 4 part differential WBC count amp eight samples were flagged with both errors and flags for values outside the reference range in canine and feline blood samples The same samples were flagged outside reference range on both analyzers for the variables WBC count GRAN count and HGB Values with a statistical significant difference p 0 05 to the Celltac are marked with Fisher s Exact test NA not applicable 58 III Publikation 9661 IT HET ADd 97 ATT ADd ET 9601 set Sot ADd UL 9681 ADd T x968 SI VN VN VN S1 9 HE b EI EI 96 AZS bS AST VN 8c VN VN 0 VN VN ST7 399 VN 097 097 9E popu VIJ IMPI poypw VIJA s ep s ep sSoq ALT pA AT Sot VN 01 Sot vol
6. 6450 Nihon Kohden Tokyo Japan ist ein neues auf der Impedanzmethode basierendes H matologiesystem das mit einer Software f r die Anwendung in der Veterin rmedizin ausgestattet ist Im offenen Modus werden 30ul Blut f r die Analyse verwendet Die Messung im Kapillar Modus ist ebenfalls verf gbar Dabei kann zwischen einer Probengr e von 10 oder 20ul gew hlt werden Mit der derzeitigen Software Version 2009 heute werden f r die Tierarten Hund Katze Pferd und Rind 20 Parameter ausgewiesen Leukozytenzahl Erythrozytenzahl Thrombozytenzahl H moglobinkonzentration sowie ein vierteiliges Differentialblutbild Lymphozyten Granulozyten Monozyten und eosinophile Granulozyten werden gemessen Es werden drei Histogramme erstellt RBC PLT und WBC Daraus werden automatisch RDW RBC distribution width MCV mean cell volume mittleres Erythrozyteneinzelvolumen PCT platelet crit Thrombocrit MPV mean platelet volume durchschnittliches Thrombozytenvolumen und PDW platelet distribution width abgeleitet MCH mean cell hemoglobin H moglobingehalt der einzelnen Erythrozyten und MCHC mean corpuscular hemoglobin concentration mittlere H moglobinkonzentration der Erythrozytenmasse werden anschlie end berechnet Die x Achse der Histogramme stellt die Zellgr e und die y Achse die Zellzahl dar Die Referenzbereiche k nnen manuell angepasst werden so dass der Verweis auf ber oder Unterschreitung bestimmter Parameter den hause
7. Analyseger te mit einem begrenzten Angebot an analysierbaren Parametern werden trotz begrenzter Kapazit t f r Tierarztpraxen als n tzlich erachtet Ger te mit weniger analysierbaren Parametern haben einen niedrigeren Anschaffungspreis und geringeren Wartungsaufwand als komplexe Systeme welche in kommerziellen Laboren zu finden sind und k nnen dennoch belastbare Ergebnisse zeitnah in der eigenen Einrichtung liefern Manuelle Methoden sind zeitaufw ndig und personalintensiv Insbesondere bei der manuellen Zellz hlung und differenzierung ist ein hoher Grad an Variation der Ergebnisse abh ngig von der subjektiven Einsch tzung und den F higkeiten der durchf hrenden Person festzustellen so dass die Messunsicherheit steigt Durch Analyse vor Ort kann auch die Alterung der Blutprobe durch den Versand an ein externes Labor als m gliche Fehlerquelle f r ein falsches Ergebnis vermieden werden Wichtige Parameter die im Entscheidungsprozess bei der Anschaffung eines automatischen Analyseger tes ber cksichtigt werden sollten sind Pr zision Richtigkeit Messgeschwindigkeit Benutzerfreundlichkeit sowie die Kosten f r die Analyse einzelner Proben VERGLEICHSMETHODEN Die Messergebnisse des in dieser Studie zu validierenden Ger tes Celltac alpha wurden mit denen des XT2000iV Sysmex verglichen Bei der Erfassung der Thrombozytenzahlen bei Katzen H matokrit bei Hunden und Katzen sowie die Differenzierung der Leukozyten wurde eine
8. Bei einer Linksverschiebung ist eine Abgrenzung nicht m glich und eine dementsprechende Meldung des Ger tes erfolgt Auch diese Funktion ist nur mit menschlichen Proben m glich 1 3 Quantitative Buffy Coat Analyse Die Buffy Coat Analyse nutzt die unterschiedlichen Zelldichten der Blutbestandteile Die in den 80er Jahren von Wardlaw und Levine entwickelte Methode misst nicht die Zellzahl anhand der einzelnen Zellen sondern analysiert die verschiedenen Zellschichten die aufgrund unterschiedlicher Zelldichten beim Zentrifugieren der Blutprobe entstehen Die mit EDTA Ethylendiamintetraessigs ure oder Ethylendiamintetraacetat antikoagulierte Blutprobe wird in einer H matokritkapillare bei 10 500 Umdrehungen Minute f r f nf Minuten zentrifugiert Dabei sorgt ein beweglicher Kunststoffschwimmer daf r dass der Buffy Coat k nstlich ausgedehnt wird Der Buffy Coat enth lt Leukozyten unterteilt in Granulozyten und Nicht Granulozyten und Thrombozyten und stellt die Grenzschicht zwischen Erythrozyten und Blutplasma dar Die Kapillare enth lt den Farbstoff Akridin Orange der nach Bindung an Nukleoproteine Jackson 1961 sowie Glyskosaminoglykane oder Lipoproteine der Leukozyten und Thrombozyten bei Beleuchtung mit violettem Licht 460 nm einen Zelltyp spezifisches Licht emittiert Leukozyten die keine Granula besitzen Lymphozyten LYM Monozyten MONO emittieren gr nes Licht In Granulozyten GRAN bindet Akridin Orange an Glykosami
9. Cell Dyn Rubys und des Sysmex XT20001 Das Ziel dieser Arbeit war es den Aufwand f r die Nacharbeitung nicht auswertbarer Proben zu definieren Die Ger te erbrachten bei der Analyse der g ngigen CBC Parameter hnliche Ergebnisse So ergab die Analyse der Gesamtleukozytenzahlen ein Bias von 0 0 und die des Differentialblutbilds ein Bias von 0 08 bis 0 06 Monozyten und Neutrophile respektive Der Sysmex konnte bei 3 196 der Proben kein Differenzialblutbild liefern oder hielt die Ergebnisse der Messungen zur ck w hrend der Cell Dyn Ruby ein Differenzialblutbild f r alle Proben lieferte Der Sysmex musste dementsprechend h ufiger eine zweite Analyse einer Probe anfertigen als der Cell Dyn Ruby 21 vs 4 3 Leers et al 2011 Durch unvollst ndige oder nicht zuverl ssige Ergebnisse ist die weitere Bearbeitung durch Personal erforderlich und es entsteht zus tzlicher Arbeitsaufwand Die Zuverl ssigkeit des Sysmex XT2000i wurde von Langford et al anhand von Proben von adulten und juvenilen Patienten n 114 am etablierten Vorg ngermodell dem XE 2100 gemessen F r den Sysmex XT2000i konnte eine exzellente bereinstimmung der Messwerte f r alle analysierten Parameter r gt 0 92 im Vergleich zu denen des XE 2100 nachgewiesen werden Eine Ausnahme bildete MCHC wo eine geringere aber dennoch als positiv einzustufende bereinstimmung r gt 0 8552 gezeigt werden konnte Langford et al 2003 Fernandes und Hamaguchi haben hnl
10. ET re 6 secl Co IMPI sSoq xouis s Tenue xoauis s Tenue Tenue xaws g xauis g xoauis g xoauis s popu 32u213 23 urqo SourgH oT LOH 07 urgoj3ow gt H q31H LOH WH eruadoj4 oquioq T eruadoj4 oquio q T eiruadoajnaN eruadosne T sisoj420xn2 28A HIP J UE Iso OJA se 10 119 JO ON so dures Joon 59 III Publikation Table 3 Spearman s correlation coefficient r and median difference in Diff of the Celltac results compared to those of the Sysmex or manual methods NA not applicable 960 LI AT l T VN Dal AL Bac IA syeg HT 9 AST ET VN 9661 oC T yel HO Enue ILM Enue ILH Enue ILM jenueyy ILH jenueyy LMP xaws g IBRD Enue LMP xams g 3 j 2 xams g 2 j 2 uosrieduro ONOW soa WAT NES LTd LTd A24 LOH 85H 284 ssoq 60 III Publikation 7 Letter of Acceptance Von Weber Karin Gesendet Mittwoch 17 Oktober 2012 09 37 An Barbara von Beust Betreff AW VCP 11 1756 R3 Dear Dr von Beust please find attached the edited version Authors names affiliations address are verified and do not need any changes The proposed changes have been accepted in the text and the comments have been taken care of except comment 1 which I also commented on because I don t understand it see text Thank you ver muc
11. Minuten erfasst werden kann Das Hinzuf gen eines nicht ionischen Detergens beschleunigt die Lyse der Erythrozyten und verringert den Grad der Tr bung durch Senkung der Lipoprotein mie Die Nutzung eines Filters mit der Porengr e von 0 2 0 25um reduziert das Risiko falscher Ergebnisse durch die Entfernung etwaiger Partikel Die Probe wird anschlie end bei 540 nm photometrisch gemessen indem das transmittierte Licht von einer photoelektrischen Zelle aufgefangen wird Diese Methode hat den deutlichen Nachteil dass daf r die toxische Substanz Zyanid als Verbrauchsstoff erforderlich ist Dennoch k nnen damit drei Formen von H moglobin einschlie lich Carboxyh moglobin und Meth moglobin erfasst und in Zyanmeth moglobin umgewandelt werden Ebenso bestehen f r diese Methode standardisierte und von dem ICSH anerkannte Substanzen f r die Eichung Zwart et al 1996 Aufgrund der breiten Absorptionsbande von Zyanmeth moglobin bei 540nm ist die Messung mit diversen Photometern m glich und f hrt somit dazu dass diese Methode auch mit unterschiedlicher Ausstattung durchgef hrt werden kann Zyan freie Methoden wurden analysiert und inzwischen auch in automatischen Analyseger ten und tragbaren H moglobinometern umgesetzt Zwei Beispiele hierf r sind die Verwendung von Natriumlaurylsulfat oder die Umwandlung zu Azidmeth moglobin durch Zusatz von Natriumazid und Natriumnitrat II Literatur bersicht 2 Celltac Der Celltac alpha MEK
12. Pathol 40 324 339 Wardlaw S C amp Levine R A 1983 Quantitative buffy coat analysis A new laboratory tool functioning as a screening complete blood cell count JAMA 249 617 620 80 VII Literaturverzeichnis Wassmuth A K Riond B Hofmann Lehmann R amp Lutz H 2011 Evaluation of the Mythic 18 hematology analyzer for use with canine feline and equine samples J Vet Diagn Invest 23 436 453 Weiss D J Wardrop K J amp Schalm O W 2010 Schalm s veterinary hematology 6th edn Ames Iowa Wiley Blackwell Wenger Riggenbach B H ssig M Hofmann Lehmann R amp Lutz H 2006 Evaluation of the LaserCyte an in house hematology analyzer for dogs and cats Comp Clin Path 15 117 129 Westgard J 1995 A Method Evaluation Decision Chart MEDX Chart for Judging Method Performance American Society for Medical Technology Washington DC USA p Westgard J 1998 Points of Care in Using Statistics in Method Comparison Studies Clin Chem 44 2240 2242 Westgard J 2003 Internal quality control planning and implementation strategies Annals of Clinical Biochemistry 40 593 611 Westgard J Carey R amp Wold S 1974 Criteria for Judging Precision and Accuracy in Method Development and Evaluation Clin Chem 20 825 833 Westgard J Groth T Aronsson T Falk H amp de Verdier C 1977 Performance characteristics of rules for internal quality control probabilities for false r
13. Simpson V Z Higgins J M Hu Z Stevens R A Metcalf J A amp Baseler M 2009 Evaluation of the Performance of the Sysmex XT 2000i Hematology Analyzer With Whole Bloods Stored at Room Temperature Lab Med 40 709 718 ICSH 1967 Recommendations for Haemoglobinometry in Human Blood Br J Haematol 13 71 75 Incz dy J Lengyel T Ure A M amp International Union of Pure and Applied Chemistry 1998 Compendium of analytical nomenclature definitive rules 1997 3rd edn Blackwell Science Osney Mead Oxford Malden MA 76 VII Literaturverzeichnis Jackson J F 1961 Supravital Blood Studies Using Acridine Orange Fluorescence Blood 17 643 649 Jain N C Hrsg 1993 Essentials of veterinary hematology Philadelphia Wiley Blackwell Jensen AL K H M 2010 Diagnostic Test Validation In Schalm s Veterinary Hematology Ed W K Weiss DJ Ames Iowa Wiley Blackwell 1027 1034 Jensen A L amp Kjelgaard Hansen M 2006 Method comparison in the clinical laboratory Vet Clin Pathol 35 276 286 Jordan H L Grindem C B amp Breitschwerdt E B 1993 Thrombocytopenia in Cats A Retrospective Study of 41 Cases Journal of Veterinary Internal Medicine 7 261 265 Klee G G 1990 Performance goals for internal quality control of multichannel haematology analysers Clin Lab Haematol 12 Suppl 1 65 74 Kondo H Akiyama T Tatsumi N amp Nagai Y 2004 Performance evaluation of the
14. als mangelhafte Abgrenzung zur Lymphozytenpopulation dargestellt Abbildung 8 Zu den m glichen Ursachen geh ren eine schlechte H molyse Thrombozytenaggregation und gro e Thrombozyten 19 II Literatur bersicht Zellzahl RBC ghosts Zellvolumen Abbildung 8 F1 Die Leukozytenverteilung kann aufgrund r ckst ndiger Erythrozytenbestandteile nicht analysiert werden nach Benutzerhandbuch F2 Lymphozyten k nnen nicht analysiert werden Die mangelhafte Bestimmung der Lymphozyten Abbildung 9 entsteht berwiegend aufgrund einer geringen Anzahl an Lymphozyten welche dann nicht von der Granulozytenpopulation abgegrenzt werden k nnen vgl Abbildung 7 Zellzahl Granulozytenverteilung Zellvolumen Abbildung 9 F2 Im Histogramm kann die Lymphozytenverteilung nicht von den Granulozyten abgegrenzt werden und somit nicht analysiert werden nach Benutzerhandbuch 20 II Literatur bersicht F3 Granulozyten k nnen nicht analysiert werden Bei dieser Fehlermeldung ist die Erkennung einer Granulozytenpopulation nicht m glich Abbildung 10 Die m glichen Ursachen hierf r sind vielfaltig So ist es m glich dass der Zeitabstand zwischen Blutabnahme und analyse mehr als acht Stunden betrug die Blutprobe nicht sachgem gelagert wurde die Granulozyten aufgrund schwacher Membranen zu fr h lysiert wurden oder die falschen Reagenzien eingesetzt wurden Es kann aber auch tats chlich nur eine geringe Anz
15. einen ber dem physiologischen Referenzbereich liegenden H matokrit aufweisen Dieser Effekt k nnte auf die falsche Zuordnung von Thrombozyten als Erythrozyten aufgrund der berlappenden Zellgr e zur ckzuf hren sein Leider liegen in dieser Studie keine expliziten Werte zu MPV und Erythrozytengesamtzahl vor Somit m ssten hierzu weitere Untersuchungen get tigt werden um die genau Ursache f r den erh hten H matokritwert bei Katzenproben zu erkl ren Die klinische Relevanz dieses Fehlers h lt sich f r niedrige und mittlere H matokritwerte in Grenzen bei hohen Werten kann eine Relevanz bestehen da eine Abweichung von 9 festgestellt wurde 68 IV Diskussion Eine Aussage ber den h matologischen Zustand eines Hundes in Behandlung mithilfe der Gesamtanzahl der Leukozyten neutrophilen Granulozyten Thrombozyten und Erythrozyten ist mit hoher Messsicherheit durch den Celltac m glich Die zuverl ssige Kennzeichnung des Celltacs der abnormalen Proben bei Hunden wird durch die hohe berschneidung der Werte zwischen den Ger ten und den manuellen Methoden bei Leukozytose Leukopenie Neutropenie Thrombozytopenie und H matokrit au erhalb des Referenzbereiches verdeutlicht Diese Hinweise haben durchaus klinische Relevanz um beispielsweise weitere diagnostische Schritte einzuleiten oder um die Kontraindikation einer Therapie zu stellen PR ZISIONSMESSUNGEN Pr zisionsmessungen wurden in dieser Studie nur f r den Celltac
16. p 328 Bayer Health Care 2004 ADVIA 120 Operator s Guide Becker M Moritz A amp Giger U 2008 Comparative clinical study of canine and feline total blood cell count results with seven in clinic and two commercial laboratory hematology analyzers Vet Clin Pathol 37 373 384 Bourg s Abella N Geffr A Concordet D Braun J P amp Trumel C 2011 Canine reference intervals for the Sysmex XT 2000iV hematology analyzer Vet Clin Pathol 40 303 315 Briggs C Carter J Lee S H Sandhaus L Simon Lopez R Vives Corrons J L amp International Council for Standardization in H 2008 ICSH Guideline for worldwide point of care testing in haematology with special reference to the complete blood count Int J Lab Hematol 30 105 116 Bundes rztekammer F M C 2001 Bekanntmachungen Richtlinie der Bundes rztekammer zur Qualit tssicherung quantitativer laboratoriumsmedizinischer Untersuchungen Dtsch Arztebl International 98 A2747 A2759 Chew D J Leonard M amp Muir W W 3rd 1991 Effect of sodium bicarbonate infusion on serum osmolality electrolyte concentrations and blood gas tensions in cats American journal of veterinary research 52 12 17 Dotson M A 1998 Multiparameter Hematology Instruments In Stiene Martin E A Hrsg Clinical Hematology Zweite Aufl Philadelphia Lippincott Raven 519 551 England J M Rowan R M van Assendelft O W Bull B S Coulter W H Fu
17. t analyzel Y Fehlermeldungen Can t analyze GR Can t diff WBC Thrombopenia WBC RBC H68 HCT PLT Abbildung 12 Ergebnisausdruck einer Katzenprobe mit Fehlermeldungen F1 F3 F4 und Thrombozytopenie 23 II Literatur bersicht 2 5 H moglobin Bestimmung Die H moglobinkonzentration HGB wird durch Spektrophotometrie bestimmt und wird gemessen an der optischen Dichte die proportional zur H moglobinkonzentration ist Der Messvorgang l uft in einem sogenannten Messbad measurement bath und frei von Zyanid ab Um das H moglobin der Erythrozyten freizusetzen wird die Blutprobe mit einem H molyse induzierenden Mittel HEMOLYNAC 3N Nihon Kohden Tokyo Japan versetz Die verd nnte Blutprobe wird von einer LED light emitting diode Leuchtdiode durchleuchtet Das auf eine Photodiode treffende Licht welches nicht durch die Blutprobe absorbiert wird wird durch diesen Rezeptor in ein elektrisches Signal bersetzt Dieses wird amplifiziert konvertiert und vom Hauptprozessor in Verh ltnis zu den Absorptionswerten der unverd nnten Probe und dem reinen Verd nnungsmittel gestellt Nach einer weiteren logarithmischen Konversion sowie Multiplikation durch einen Kalibrationskoeffizienten werden die Ergebnisse am Bildschirm dargestellt 2 6 Qualit tssicherung Um die Richtigkeit und Pr zision der Messungen zu gew hrleisten werden Qualit tskontrollen durchgef hrt Das System der Qualit tssicherung beinhaltet T X b
18. the new instrument was analyzed to determine its precision and its ability to flag erroneous or incomplete results Correlation and Bland Altman analyses were used to compare the methods The within batch precision of the Celltac was evaluated using five canine and five feline samples which were each analyzed ten times consecutively The results showed acceptable coefficients of variation for the leucocyte count lt 4 platelet count 8 hemoglobin concentration 3 and hematocrit 3 while precision was poor for leukocyte subpopulations Comparing these values to another trial conducted by Lilliehook and Tvedten 2009 the Sysmex showed consistently superior precision values to the Celltac albeit that this is a cross trial comparison Leukopenia and leukocytosis were reliably detected with the Celltac The hemoglobin concentration and the leukocyte count agreed well with the comparator methods The coefficient of variation for the granulocyte count was 2 9 in cats and 6 29 in dogs The coefficient of variation of the lymphocyte count was 8 2096 in cats and 13 5196 in dogs Negative biases as well as proportional systematic error were apparent for platelet count feline hematocrit concentration and eosinophil count Analytical error flags and incomplete results were reported for 11 8 of canine and 25 4 of feline samples This is a relevant aspect for the clinical setting since this portion of samples requires fur
19. wird ebenfalls zur Z hlung der Retikulozyten verwendet Hierbei kann die F rbung von RNS ber Fluorochrome erfolgen so dass die Fluoreszenz im Durchflusszytometer erfasst werden kann Eine weitere M glichkeit ist die F rbung mithilfe von nicht fluoreszierenden Farbstoffen wie Methylenblau oder Oxazin 750 so dass Retikulozyten ber den Grad der Lichtabsorption erkannt und gez hlt werden k nnen Retikulozyten werden dann 8 II Literatur bersicht durch Gr e und Lichtabsorption oder intensit t der Fluoreszenz von Leukozyten abgegrenzt Der Reifegrad der Retikulozyten steht im proportionalen Verh ltnis zur Intensit t der Nukleins uren F rbung oder Fluoreszenz und somit der vorhandenen Menge an RNS Informationen ber den Reifegrad der Retikulozyten im Verh ltnis zur Gesamtzahl der Erythrozyten erm glicht R ckschl sse ber die Art der Erkrankung 1 6 H moglobin Messmethode Seit dem 23 August 1966 empfiehlt das ICSH International Council for Standardization in Hematology die Zyanmeth moglobin Methode als Referenzmethode f r die Erfassung der H moglobinkonzentration ICSH 1967 Dabei erfolgt eine photometrische Bestimmung von H moglobinzyanid HiCN Die Blutprobe wird 1 251 verd nnt mit Kaliumzyanid und Kaliumferrizyanid Es entsteht Meth moglobin Die Hinzugabe von Kaliumdihydrogenphosphat KH2PO f hrt zur Senkung des pH Werts und f hrt zur Beschleunigung der Reaktion so dass ein Ergebnis bereits nach 3
20. 00 Zellvolumen SD SD MCV Abbildung 2 RBC Histogramm nach Benutzerhandbuch 2 4 3 PLT Distribution Histogram Aus dem Thrombozyten Verteilungshistogramm PLT Distribution Histogram werden folgende Parameter berechnet Platelet Crit Mean Platelet Volume und Platelet Distribution Width Das Thrombocrit Plateletcrit PCT stellt das Verh ltnis des Thrombozytenvolumens zum aspirierten Blutvolumen dar Thrombocrit erlaubt R ckschl sse ber die gesamte zirkulierende Thrombozytenmasse und ist der Anteil des Blutvolumens der aus Thrombozyten besteht Thrombocrit wird berechnet aus der Anzahl der Thrombozyten und dem mittleren Thrombozytenvolumen Ein Beispiel f r den diagnostischen Wert dieses Parameters wurde durch Tvedten et al bei der Hunderasse Cavalier King Charles Spaniel gezeigt Diese Rasse weist eine hohe Pr valenz an einer genetischen Pr disposition f r Makrothrombozytopenie Pedersen et al 2002 auf So sind Thrombozyten in reduzierter Anzahl vorhanden und k nnen aufgrund der Makrozytose schlecht von Erythrozyten abgegrenzt werden Dadurch wird ein h herer Grad an Thrombozytopenie diagnostiziert als durch diese genetische Pr disposition idiopathisch und regelhaft asymptomatisch auftritt Mit Thrombocrit konnte eine Aussage ber den Thrombozytenstatus getroffen werden die f r die Klink die h chste Relevanz hatte Tvedten et al 2008 15 II Literatur bersicht Das mittlere Thrombozytenvolumen Me
21. 000000200000000 020000000 sets 0200000000000 00000000000 4 Abstract eg EENS dE NEES 42 Manuseriptiss Em 43 Reference m 48 Figure e 50 Fisures EE 52 E OT 56 Letterof ACGeptance ute eo erre iet e Rp ree 61 DISKUSSION E 64 ZUSAMMENFASSUNG piter vert seek vun Seo I erre VER eu vara SURE NEMPE SFR eR USER 72 SUMMARY P nenn 73 LITERATURVERZEICHINIS e eeee esent teen tens 020000000 000000000 000 75 ABBILDUNGSVERZEICHNTIS cresce eee eene 02000000 220000000000000000 83 RENE BET 84 II Abk rzungsverzeichnis ABK RZUNGSVERZEICHNIS X ul um BALF BASO CLSI CV DAPI DNS EDTA F1 4 GR GRAN HFR HGB HiCN ICSH KH PO4 L amp J LED LFR LI LY LYM MCH MCHC MCV Prozent x Bar Mittelwert der ersten und zweiten Z hlung Mikroliter 10 Liter Mikrometer 10 Meter bronchoalveol re Lavagefl ssigkeit Basophil basophiler Granulozyt Clinical Laboratory and Standards Institute coefficient of variation Variationskoeffizient 4 6 Diamidin 2 phenylindol Desoxyribonukleins ure Ethylendiamintetraessigs ure Ethylendiamintetraacetat Flags 1 4 Fehlermeldungen 1 4 Femtoliter 107 Liter Granulocyte Granulozyt Granulocyte Granulozyt High Fluorescence Reticulocyte Hamoglobinkonzentration Hamoglobinzyanid International Council for Standardization in Hematology Anzahl der Tage Kaliumdihydrogenphosphat Liter
22. 2009 38 175 182 48 11 12 13 14 15 16 17 18 19 III Publikation Pankraz A Bauer N Moritz A Comparison of flow cytometry with the Sysmex XT20001V automated analyzer for the detection of reticulated platelets in dogs Vet Clin Pathol 2009 38 30 38 Tvedten H Johansson P Feline platelet counting with prostaglandin EI on the Sysmex XT 2000iV Vet Clin Pathol 2010 39 190 192 Jensen AL Kjelgaard Hansen M Method comparison in the clinical laboratory Vet Clin Pathol 2006 35 276 286 Linnet K Necessary sample size for method comparison studies based on regression analysis Clin Chem 1999 45 882 894 Bundes rztekammer Federal Medical Council Richtlinie der Bundes rztekammer zur Qualit tssicherung quantitativer laboratoriumsmedizinischer Untersuchungen Guidelines of the Federal Medical Council for quality assurance for quantitative laboratory medical examinations Dt rzteblatt 2001 98 A2747 2759 Klee GG Performance goals for internal quality control of multichannel haematology analysers Clin Lab Haematol 1990 12 Suppl 1 65 74 Ricos C Alvarez V Cava F et al Desirable Biological Variation Database specifications http www westgard com biodatabasel htm Accessed 20 10 2011 Pastor J Cuenca R Velarde R Vinas L Lavin S Evaluation of a hematology analyzer with canine and feline blood Vet Clin Pathol 1997 26 138 147 Norman EJ Barron RC Nash AS Clampitt R
23. B Prevalence of low automated platelet counts in cats comparison with prevalence of thrombocytopenia based on blood smear estimation Vet Clin Pathol 2001 30 137 140 49 III Publikation 4 Figure Legends Fig 1 Bland Altman plots for comparison of canine and feline WBC count Fig a and b and platelet PLT count Fig 1 c and d The results of the Celltac were subtracted from the results of the Sysmex 1 a b c and from the manual count for feline PLT count 1 d The dashed line shows the bias Sysmex minus Celltac manual count minus Celltac the dotted lines show the 95 limits of agreement The exact values are annotated at the corresponding lines The values for mean and median of the reference method and the Celltac are inserted below the figure Bias for WBC is close to zero A negative bias is seen for PLT since the Celltac counts more platelets than the Sysmex in canine samples or the observer of the manual method in feline samples Both canine and feline blood samples show a trend for increased negative bias when the values for PLT are high Fig 2 Bland Altman plots for comparison of HGB and HCT The results of the Celltac were subtracted from the results of the Sysmex for HGB 2 a and b and from the manual count for HCT 2 c and d The dashed line shows the bias Sysmex minus Celltac manual count minus Celltac the dotted lines show the 95 limits of agreement Bias for HGB is close to zero When c
24. Evaluierung des vollautomatischen H matologieger tes Celltac alpha im klinischen Einsatz bei Hund und Katze Von Barbara Jane McDaniel Inaugural Dissertation zur Erlangung der Doktorw rde der Tier rztlichen Fakult t der Ludwig Maximilians Universitat M nchen Evaluierung des vollautomatischen H matologieger tes Celltac alpha im klinischen Einsatz bei Hund und Katze von Barbara Jane McDaniel aus Ansbach M nchen 2015 Aus dem Zentrum f r Klinische Tiermedizin der Tier rztlichen Fakult t der Ludwig Maximilians Universit t M nchen Lehrstuhl f r Innere Medizin der kleinen Haus und Heimtiere Arbeit angefertigt unter der Leitung von Univ Prof Dr med vet Dr habil Johannes Hirschberger Mitbetreuung durch Dr med vet Karin Weber Gedruckt mit der Genehmigung der Tier rztlichen Fakult t der Ludwig Maximilians Universit t M nchen Dekan Univ Prof Dr Joachim Braun Berichterstatter Univ Prof Dr Johannes Hirschberger Korreferent en Univ Prof Dr Andrea Meyer Lindenberg Tag der Promotion 18 Juli 2015 Inhaltsverzeichnis INHALTSVERZEICHNIS I EINE OLG Hi Ju E 1 II LITERA TURUBERSICHT geesde 3 1 Analyseger te und Messmethoden esesossensssssssonnnsonenssssnsnnenenennes 3 1 1 Jmpedan zmetbode A 3 1 2 Selektive Lyse bestimmter Zelltypen 2220002222000220ssnsssnnnesennnnn 5 1 3 Quantitative Buftv Coat Analyse 6 1 4 Zytochemische F rbever
25. Monozyten MONO eosinophile Granulozyten EOS und Granulozyten basophile und neutrophile Granulozyten GRAN Die Differenzierung der Leukozyten white blood cell differential WBC Diff kann f r die Tierarten Hund Katze Pferd und Rind durchgef hrt werden Es werden sowohl die absoluten Leukozytenzahlen als auch Prozentwerte einer Population in Relation zur Gesamtleukozytenpopulation angegeben Das vierteilige WBC DIFF Histogramm wird anhand der H hen und Tiefen des Verteilungshistogramms beurteilt Abbildung 7 18 II Literatur bersicht Zellzahl Lymphocyte distribution Eosinophil distribution Monocyte PT t distribution Granulocyte distribution Zellvolumen Abbildung 7 WBC Histogramm nach Benutzerhandbuch Untypische Verteilungen der Zelltypen werden im Histogramm durch die Software erkannt Die Ergebnisse der Messung werden daraufhin als nicht belastbar charakterisiert und eine dementsprechende Fehlermeldung Flag F1 F4 wird angezeigt Im folgenden Abschnitt werden die einzelnen Fehlermeldungen die am Ger t angezeigt werden k nnen erl utert e FI RBC Ghost too many RBC ghost e F2 Can t analyze LY Lymphocyte cannot be analyzed e F3 Can t analyze GR Granulocyte cannot be analyzed e F4 Can t diff WBC WBC cannot be differentiated Fl Zu viele RBC R ckst nde Zu viele r ckst ndige Erythrozytenmembrane RBC Ghosts die nach der Lyse Phase noch intakt sind werden im Histogramm
26. RBC Population aufgrund Makrozytose mit errechnetem PLT Hi Schwellenwert Benutzerhandbuch 7 WBC Histogramm Benutzerhandbuch 8 F1 Die Leukozytenverteilung kann aufgrund r ckst ndiger Erythrozytenbestandteile nicht analysiert werden nach Benutzerhandbuch 9 F2 Im Histogramm kann die Lymphozytenverteilung nicht von den Granulozyten abgegrenzt werden und somit nicht analysiert werden nach Benutzerhandbuch 10 F3 Die Granulozytenpopulation kann nicht definiert werden nach Benutzerhandbuch 11 F4 Die Leukozytenzellpopulationen k nnen nicht differenziert werden nach Benutzerhandbuch 12 Ergebnisausdruck einer Katzenprobe mit Fehlermeldungen F1 F3 F4 und Thrombozytopenie 13 Berechnungen des E R Programms 14 L amp J Diagramm Benutzerhandbuch 15 ZB zugrunde liegenden Berechnungen 16 Dem i D CV zugrundeliegenden Berechnungen 17 Fehlerkategorien nach Jensen und Kjelgaard Hansen 2006 83 IX Danksagung IX DANKSAGUNG Mein besonderer Dank gilt Herrn Professor Johannes Hirschberger f r seine hilfreichen Anregungen und f r die Bereitstellung des Themas Die freundliche Art Mitarbeiter zu leiten und motivieren werde ich in meiner weiteren beruflichen Laufbahn stets in Erinnerung behalten Ich m chte mich bei Frau Professor Katrin Hartmann bedanken da ich durch sie die M glichkeit zur Promotion in ihrer Klinik erhalten habe Mein Dank gilt ebenfalls Frau Dr Karin Weber f r die Betreuung und fachkomp
27. T MCV EL MCH pg MCHC 33 PLT N 0 P DD 0 NN 00 o0 N e WBC Histogramm 5 RBC Histogramm AUTO PLT Histogramm untere Grenze des Referenzbereichs obere Grenze des Referenzbereichs gemessener Wert Abbildung 1 Ergebnisausdruck einer Kontrollmessung 13 II Literatur bersicht 2 4 Histogramme Volumenverteilungskurven werden aus den durch die Zellen verursachten Impulsen abgeleitet und als Histogramme dargestellt Abbildung 1 An der y Achse werden die gez hlten Werte aufgelistet Es besteht die M glichkeit entweder die absoluten Zellzahlen oder die Prozentwerte der Messwerte anzeigen zu lassen Die x Achse zeigt das Blutzellvolumen in fL fL 1 x 10 L Aus den Histogrammen werden weitere Werte abgeleitet 2 4 1 RBC Distribution Histogram RDW red blood cell distribution width Verteilungsbreite der Erythrozyten wird automatisch aus den Daten des RBC Verteilungshistogramms berechnet Zellzahl und Zellvolumen werden gegen bergestellt und bieten Aufschluss ber das Abweichungsverh ltnis der Erythrozytenvolumina im Histogramm Abbildung 2 Die Verteilungsbreite der Erythrozyten erlaubt R ckschl sse ber den Grad der Anisozytose die Zunahme der Variabilit t der Erythrozytengr De und stellt den Wert des folgenden Quotienten dar Standardabweichung des Erythrozytenvolumens SD RDW 26 Mittleres zelull res Volumen MCV 14 II Literatur bersicht Zellzahl 100 2
28. ahl an Granulozyten vorhanden sein Zellzahl Lymphozytenverteilung Zellvolumen Abbildung 10 F3 Die Granulozytenpopulation kann nicht definiert werden nach Benutzerhandbuch F4 Leukozyten k nnen nicht differenziert werden Im Falle einer generellen mangelhaften Differenzierung erscheint die Fehlermeldung F4 mit dem Hinweis dass keine einzige Leukozytenpopulation differenziert und abgegrenzt werden kann Abbildung 11 Zu den m glichen Ursachen hierf r z hlen dass Granulozyten aufgrund schwacher Membranen zu fr h lysiert oder dass Reagenzien falsch angewendet wurden 21 II Literatur bersicht Zellzahl Zellvolumen Abbildung 11 F4 Die Leukozytenzellpopulationen k nnen nicht differenziert werden nach Benutzerhandbuch In der aktuellen Software existieren bei diesem Ger t keine spezifischen Fehlermeldungen f r die unklare Trennung zwischen der PLT und RBC Volumenverteilungen Wird ein neben den Ergebnissen der Leukozytenanzahl angezeigt so sind ebenfalls Erythrozytenr ckst nde vorhanden wodurch die Leukozytenanzahl verf lscht und die Messung nicht belastbar ist Abbildung 12 22 II Literatur bersicht 20 OCT op 12 52 8 ID CTK 102399 M MODE OPEN ANIMAL TYPE Cat WBC 7 8 D i RBC 8 48 OYL HGR 7 4 mme l l HCT 352 L L MCV 41 5 fL MCH 0 87 fnc MCHC 20 9 mmol l PLT 96L OYL LY 3 3 42 8F 1 MO F3 Fehlermeldungen EO ON GR 57 2F 42 Flags RBC ghost Can
29. alen und Werten im oberen Referenzbereich permanent h here Thrombozytenwerte ausgewiesen als durch die jeweilige Vergleichsmethode Somit wurden die Thrombozytenwerte als f lschlich hoch ausgewiesen Dies hatte zur Folge dass Proben weniger h ufig mit Thrombozytopenie gekennzeichnet wurden Bei Proben mit geringen Werten von 90 260x 10 Zellen uL wurde die Thrombozytenzahl wiederum untersch tzt Thrombozyten der Katze k nnen aufgrund von Polymorphologie und der Tendenz zur Aggregation nur schlecht mit der Impedanzmethode gez hlt werden und werden aufgrund der sich berschneidenden Zellgr en h ufig als Erythrozyten gez hlt Norman et al 2001a Pastor et al 1997 Diese fehlerhafte Zuweisung f hrt eigentlich zu niedrigeren Thrombozytenwerten und somit zu h ufigeren Meldungen einer Thrombozytopenie Nach diesen Gegebenheiten besteht somit bei den meisten Ger ten die Gefahr einer fehlerhaften Meldung einer Thrombozytopenie die als Pseudothrombozytopenie einzuordnen ist Eine echte Thrombozytopenie lt 200 x 10 Zellen uL bei Katzen ist selten wie in einer retrospektiven Analyse von 3300 Katzenblutproben gezeigt wurde Nur 41 1 2 der Katzen hatten eine echte Thrombozytopenie Jordan et al 1993 In einer weiteren Studie mit 359 Katzen wurden eine Rate von 71 Thrombozytopenie mithilfe impedanzbasierter Ger ten erhoben Nach manueller Ausz hlung in diesem Versuch hatten jedoch nur 11 Proben 3 1 tats chlich einen Th
30. allsfehler random error ist ein qualitativer Wert der die Pr zision einer Messmethode beschreibt Er steht aber nicht im Zusammenhang mit dem wahren Wert Westgard 1995 1998 Der Variationskoeffizient coefficient of variation CV stellt das Ma an Pr zision dar und h ngt von der Konzentration des gemessenen Parameters ab Der Variationskoeffizient ist der Quotient der Standardabweichung standard deviation SD und des Mittelwerts Systematische Fehler oder Messabweichungen systematic error beeinflussen die Richtigkeit und werden als Bias erfasst Mechanische Fehler falsche Einstellungen der Software oder Verunreinigungen innerhalb des Analyseger tes k nnen hierf r beispielsweise eine Ursache darstellen Die Beurteilung der Pr zision eines Ger tes erfolgt durch wiederholte Messungen mit identischem Material Dieses ist bei der Kalibration von Ger ten standardisiertes Kontrollmaterial w hrend in der Validierungsphase mit derselben Blutprobe mehrere Messungen durchgef hrt werden Zur Beurteilung der Richtigkeit werden in der Validierungsphase zwei 37 II Literatur bersicht Vorgehensweisen empfohlen Im Rahmen genereller Qualit tskontrolle werden Kontrollmaterialien mit bekannten Messwerten t glich gemessen um systematische Fehler weitestgehend ausschlie en zu k nnen Wichtiger ist aber der Vergleich der Messergebnisse anhand Patientenproben des zu testenden mit denen eines bereits validierten Ger tes Ei
31. an Platelet Volume MPV bietet eine Sch tzung der Thrombozytengr e Abbildung 3 und ist bei manchen Spezies umgekehrt proportional zur Thrombozytenanzahl Erh hte Thrombozytenvolumenwerte k nnen allerdings auch ein Artefakt sein das zum Beispiel durch verl ngerte oder verz gerte Exposition der Blutprobe mit EDTA Ethylendiamintetraessigs ure oder Ethylendiamintetraacetat McShine et al 1991 oder einer verz gerten K hlung der Blutprobe entstehen kann Die Spanne der Volumenverteilung der Thrombozyten wird mit dem Parameter Platelet Distribution Width PDW aufgezeigt und repr sentiert den Variationsindex der Thrombozytengr De Dieser Parameter wird in humanmedizinischen Einrichtungen zur Differenzierung der Art der Thrombozytopenie verwendet und k nnte in der Veterin rmedizin in Einrichtungen von Nutzen sein die selten Blutausstriche mikroskopisch analysieren Zellzahl SO SD e t P MPV Zellvolumen Abbildung 3 PLT Histogramm nach Benutzerhandbuch Bei Blutproben mit physiologischer Verteilung von Zellpopulationen und klarem Unterschied in der Morphologie der Zellen ist die eindeutige Trennung der PLT Volumenverteilung und der RBC Volumenverteilung Abbildung 4 m glich Somit kann theoretisch eine akkurate Z hlung der Thrombozyten erfolgen 16 II Literatur bersicht Count Normal blood amplitude volume volume range volume range Abbildung 4 Ideale Verteilungskurve u
32. an analysis for comparison of the Celltac to the Sysmex and manual methods was used to determine the source of bias The Celltac functioned well for the duration of this study Operation and maintenance of the instrument was easy and only little time had to be spent for priming rinsing and control measurements Clogging due to clots in the samples could be easily removed and the turnaround time was about one sample per minute The range of CV values and the data range for the precision study of canine and feline samples are shown in Table 1 In the pathologic samples with high WBC count the CV values were not consistently higher or lower for the different variables than in samples with normal WBC count The within batch precision for WBC count and HCT was within the range of maximum allowable imprecision for these variables as published in guidelines for the quality control of hematologic analyzers and was only slightly over the limits for HGB and PLTP 6 However for LYM and EOS the within batch CV values ranged much higher than published maximum allowable imprecision limits especially in canine samples For GRAN and MONO no maximum imprecision limits are published but the within batch CV values range is considered too wide when compared to the values calculated when using the same samples on the Sysmex GRAN CV 1 1 2 9 MONO 3 1 11 8 For the judgment of acceptability as well as for the method comparison of the Celltac results it wo
33. ann mithilfe von kommerziell erh ltlichem Kontrollmaterial durchgef hrt werden Die Ergebnisse der Messungen sollten dokumentiert werden Durch Qualit tssicherungsmethoden wie Levey Jennings Diagrammen wird die Verlaufskontrolle erm glicht Jensen und Kjelgaard Hansen haben ein umfassendes Protokoll f r Methodenvalidierung erstellt Jensen and Kjelgaard Hansen 2006 Nach Jensen und Kjeelgard Hansen gliedert sich die Validierung neuer Tests in drei Aspekte Jensen AL 2010 e Analytisches Verhalten Analytical Performance e berschneidungsverhalten Overlap Performance e Klinisches Verhalten Clinical Performance In der ersten Phase die besonders f r Analyseger te relevant ist werden unter anderem die Pr zision Messsicherheit und der Methodenvergleich behandelt Um darzustellen wie pr zise oder unpr zise Messungen sind werden Analysen innerhalb einer Messwertreihe within run und zwischen Messwertreihen between run durchgef hrt Bei diesen Analysen werden mehrere Messungen an einer Probe oder Probengruppe entweder nacheinander oder in definierten Zeitabst nden z B zwei Mal t glich ber f nf Tage hinweg durchgef hrt Das Ergebnis der Pr zision wird als Variationskoeffizient in Prozent dargestellt coefficient of variation CV 39 II Literatur bersicht Der Variationskoeffizient sollte 5 oder ein Achtel des Referenzintervalls Prozent vom Mittelwert der Spannweite f r automatisierte Analysen
34. ar R L amp J r BATCH und x Day CV T stellt den Mittelwert einer Datenreihe dar Auf die einzelnen Programme wird im Folgenden eingegangen 2 6 1 r R Programm Das T R Programm berechnet die t glichen Werte von X die Mittelwerte der ersten und zweiten Z hlung derselben Kontrolle sowie R Differenz der Werte der ersten und zweiten Z hlung derselben Kontrolle Das R Programm berechnet auch X und R welche die Mittelwerte f r und R ber mehrere Tage hinweg darstellen Abbildung 13 Die Kontrolle wird mindestens zweimal t glich gemessen ber mehrere k Tage 24 II Literatur bersicht X Mittelwert f r einen Tag X Mittelwert f r mehrere k Tage R Differenz eines Tages R Differenz ber k Tage Abbildung 13 Berechnungen des R Programms Der Hersteller empfiehlt als Kontrollmaterial ausschlieBlich das firmeneigene MEK 3D Nihon Kohden Tokyo Japan zu verwenden um die Zuverl ssigkeit der Daten des R Programms zu sichern Die oberen und unteren Limits werden mit der Drei Sigma Regel statistisch berechnet k nnen aber auch manuell angepasst werden Die Ergebnisse werden in graphischer Form mit oberen und unteren Grenzwerten dargestellt so dass ein Referenzbereich entsteht Es gibt mehrere typische Fehlerquellen die dazu f hren dass Datenpunkte auDerhalb des Referenzbereiches von liegen k nnen Dazu geh ren veraltete Verbrauchsmaterialien des Ger tes und Unterschiede in der Zusammen
35. complete blood count and white blood cell differential parameters obtained using a Celltac F automated hematology analyzer Lab Hematol 10 3 13 Kondo H Nagai Y Kishita T Kamimura Y Saito F amp Tatsumi N 2005 Evaluation of White Blood Cell Differential Parameters Obtained with an Automated Hematology Analyzer Igaku to seibutsugaku Medicine and biology 149 281 285 Langford K Luchtman Jones L Miller R amp Walck D 2003 Performance evaluation of the Sysmex XT 2000i automated hematology analyzer Lab Hematol 9 29 37 Leers M P Goertz H Feller A amp Hoffmann J J 2011 Performance evaluation of the Abbott CELL DYN Ruby and the Sysmex XT 2000i haematology analysers Int J Lab Hematol 33 19 29 77 VII Literaturverzeichnis Lewis S M Garvey B Manning R Sharp S A amp Wardle J 1991 Lauryl sulphate haemoglobin a non hazardous substitute for HiCN in haemoglobinometry Clin Lab Haematol 13 279 290 Lilliehook I amp Tvedten H 2009a Validation of the Sysmex XT 2000iV hematology system for dogs cats and horses I Erythrocytes platelets and total leukocyte counts Vet Clin Pathol 38 163 174 Lilliehook I amp Tvedten H 2009b Validation of the Sysmex XT 2000iV hematology system for dogs cats and horses II Differential leukocyte counts Vet Clin Pathol 38 175 182 Lillieh k I amp Tvedten H W 2011 Errors in basophil enumeration with 3 veterina
36. cos 1999 Die manuelle Methode gilt weiterhin als Goldstandard in der Leukozytendifferenzierung aufgrund der Messsicherheit obgleich 69 IV Diskussion Variationskoeffiziente von 10 bis 25 in der Humanmedizin dokumentiert wurden Harrison et al 2000 Die Gesamtanzahlen der Monozyten und eosinophilen Granulozyten weisen beim Hund eine h here Variabilit t auf als bei der Katze und auch hier sind die erreichten Variationskoeffizienten denen der Messungen vom Sysmex unterlegen Eine breitere Datenstreuung kann auf der geringen Anzahl der einzelnen Zelltypen basieren allerdings ist der Celltac im Vergleich zu anderen Instrumenten in Bezug auf die Pr zision durchgehend unterlegen Im Rahmen von Studien wurden ebenfalls Pr zisionsmessungen zur Leukozytendifferenzierung innerhalb einer Messreihe mit dem Sysmex XT2000iV anhand von Patientenproben durchgef hrt Die Variationskoeffizienten bei der Pr zisionsmessungen mit dem XT2000iV waren durchweg niedriger Lilliehook and Tvedten 2009b bei Lymphozyten sogar mehr als eine Zehnerpotenz Lymphozyten VK Celltac 7 8 51 0 VK XT2000iV 1 5 3 4 als die der Messungen des Celltacs Der Vergleich ist nur bedingt m glich da diese Daten nicht im Rahmen derselben Studie erhoben wurden Die spezifische Identifikation der basophilen Granulozyten ist durch den Celltac nicht gegeben Basophile Granulozyten werden stattdessen laut Angaben des Herstellers im Granulozytenkanal gemessen Der Sys
37. durchgef hrt und anhand des Variationskoeffizienten bewertet Der Variationskoeffizient zeigt das relative Streuungsma Die Pr zision des Celltacs innerhalb einer Messwertreihe within run in Bezug auf Leukozytenzahl und H moglobinkonzentration WBC lt 4 HBG lt 4 3 war im Vergleich zu anderen Analyseger ten wie dem Sysmex WBC x 1 77 HGB 0 93 und den sieben von Becker et al evaluierten Analyseger ten WBC 1 4 3 2 HGB 0 6 2 9 unterlegen Becker et al 2008 Lilliehook and Tvedten 2009a Jedoch waren die Ergebnisse nach aktuell publizierten Referenzbereichen noch ausreichend f r die Analyse von Hund und Katzenproben Klee 1990 Bundes rztekammer 2001 Auswertungen des H matokrit mit einem Variationskoeffizient lt 3 wurde f r sowohl Hunde als auch Katzenproben erreicht Da die manuelle Z hlung von Thrombozyten aufw ndig ungenau und zeitintensiv ist ist eine zuverl ssige automatisierte Z hlung durchaus w nschenswert Multiple Messungen des Celltacs anhand Thrombozyten zeigten geringere Pr zision als Messungen des H matokrit wobei bei Katzen lt 11 9 eine geringere Pr zision als bei Hunden lt 7 2 erreicht wurde Die Ergebnisse sind f r beide Tierarten f r den klinischen Gebrauch ausreichend pr zise wobei hier erneut die Richtigkeit hinterfragt werden muss Die maximal zul ssigen Variationskoeffizienten bei der Leukozytendifferenzierung wurden nicht eingehalten Bundes rztekammer 2001 Ri
38. e Korrelation f r Lymphozyten Eosinophilen und Monozyten zeigte kann die Schlussfolgerung dass der Celltac nicht sehr akkurat bei der Differenzierung dieser Zelltypen ist erfolgen MESSSICHERHEIT Die Richtigkeit der Messungen des Celltacs wurde anhand des Vergleichs zum Sysmex XT2000iV und zu manuellen Methoden bewertet Die berschneidung der verschiedenen Ergebnisse kann erfahrungsgem nicht bei 100 liegen allerdings erm glicht eine Evaluierung mittels Bland Altman Analysen die Beurteilung der allgemeinen Abweichung des neuen Ger tes im Vergleich zu etablierten Methoden Die Ergebnisse des Celltacs f r Leukozytenzahlen und H moglobinkonzentration k nnen als akkurat f r beide Tierarten betrachtet werden da die Korrelation hoch w hrend die Abweichungen zu anderen Methoden gering und klinisch nicht relevant waren Ergebnisse zu H matokrit bei Hunden gemessen durch den Celltac stimmten in hohem Ma e mit Ergebnissen vom XT2000iV sowie manueller Erhebung berein Dagegen zeigte sich bei den Ergebnissen des H matokrit bei Katzen ein systematischer Fehler wodurch h here Werte berichtet wurden als die manuelle Ausz hlung ergaben wie durch den dazugeh rigen Bland Altman Plot und einer Abweichung Bias von 44 6 deutlich wurde Es zeichnet sich ein Trend zur gr eren Abweichung in Abh ngigkeit von ansteigenden Mittelwerten ab Die Messungen des Celltacs zeigten dass Katzen im Vergleich zu anderen Messmethoden vermehrt
39. een made throughout the text to conform to journal style and use of language Please read the entire manuscript very carefully to ensure that 62 III Publikation unintentional changes in meaning have not occurred 1 Title 2 Names Co authors Affiliations Please confirm names and affiliations of all authors Affiliations of all authors should be where they were at the time the work was performed 3 Mailing and E mail address Please verify your mailing and email addresses 4 Key words 5 Abstract The abstract has been edited Please confirm it is OK a Introduction section Please confirm rephrasing is OK b Materials and methods section Please confirm rephrasing is OK and address comments c Results section Please confirm rephrasing is OK and address comments d Discussion section Please confirm rephrasing is OK Please address issues addressed in comments and edit unclear statements 6 References References and reference citations please address comment for ref 17 7 Acknowledgements 8 Tables 9 Figures Figure captions have been slightly edited please accept of edit Please see also Author Guidelines at http onlinelibrary wiley com journal 10 1111 28ISSN 291939 165X homepage ForAuthors html 63 IV Diskussion IV DISKUSSION Die Blutanalyse ist ein wichtiger Bestandteil des diagnostischen Vorgehens in der Veterin rmedizin Kompakte automatisierte h matologische
40. eiden Eine weitere Methode die Peroxidase Reaktion wurde urspr nglich in dem Ger t Technicon D 90 95 Bayer Health Care verwendet um ein f nfteiliges Differentialblutbild zu erstellen Der Advia 120 Bayer Health Care sowie die Technicon H Ger teserie H 1 H 2 H 3 und H 6000 basieren auf dieser Technik bei der im Rahmen der Leukozytendifferenzierung Zellen anhand der granul ren Peroxidaseaktivit t differenziert werden Das Substrat 4 Chlor 1 naphthol wirkt auf die Zellen ein und es entsteht ein schwarzer Farbstoff der Licht absorbiert Dieser Farbstoff entsteht durch die Ausf llung von Wasserstoffperoxid an Orten der Peroxidaseaktivit t in Granula der Leukozyten Die Lichtabsorption ist proportional zur Intensit t der Peroxidase Reaktion Bei den meisten Tierarten weisen Lymphozyten eine geringe Aktivit t auf w hrend eosinophile Granulozyten die h chste Peroxidaseaktivit t aufweisen II Literatur bersicht 1 5 Streulichtmessung Das Prinzip der hydrodynamischen Fokussierung und die darauffolgende Zellzihlung und Analyse der Zellen als Abfolge der Vorg nge in der Impedanzmessung wird prinzipiell ebenfalls bei der Streulichtmessung angewandt Hierbei verursachen Zellen die in einer Durchflusszelle einzeln einen Lichtstrahl durchqueren eine Brechung oder Beugung und Streuung des Lichts Als Lichtquelle werden z B Laser Argon oder Xenonlampen verwendet In lteren Ger ten wurden auch Quecksilber oder Halogenlampen
41. eine Zellgruppe spezifischen Leitf higkeit Dieser Impuls ist direkt proportional zu der Zellgr6Be w hrend die Anzahl an Unterbrechungen die Anzahl der Zellen widerspiegelt Bain and Huhn 1997 Der Widerstand die induktive Spannung und die Kapazit t bestimmen die Impedanz in der Messzelle Damit diese Z hlung und Gr enbestimmung akkurat verlaufen kann sind sogenannte Schwellenwerte erforderlich Ein Schwellenwert stellt eine Spannungsgrenze dar Wenn diese berschritten wird wird das ausl sende Partikel wahrgenommen und dessen Gr e gemessen Es besteht die M glichkeit die Schwellenwerte obere sowie untere zu manipulieren um eine Zielspannweite zu erzeugen die sich nach den Partikelgr en richtet und in der Veterin rmedizin speziesspezifisch definiert werden muss Eine Koinzidenzkorrektur soll anhand eingebauter Stromkreise falsche Zellz hlungen kompensieren die durch simultane Zellpassage durch die Mess ffnung entstehen k nnten Vor allem impedanzbasierte Messger te die Zellen anhand der Gr e differenzieren k nnen nur bedingt speziesspezifische Besonderheiten der Morphologie der Blutzellen kompensieren Dies betrifft in der Kleintiermedizin an erster Stelle Thrombozyten der Katze Die echte Thrombozytopenie bei Katzen hat eine geringe Pr valenz Norman et al 2001a dennoch wird diese labordiagnostisch h ufig festgestellt Diese Fehldiagnose beruht auf der 4 II Literatur bersicht Morphologie der Thrombo
42. eingegeben werden Wird bei einer Probe ein sehr niedriger Thrombozytenwert festgestellt wird die Probe automatisch erneut analysiert und die Werte RBC HCT PLT MCV PCT MCH MCHC und RDW neu berechnet Der Schwellenwert der einen sehr niedrigen Thrombozytenwert darstellt kann entweder bei 50x 10 ul oder 100 x 10 ul festgelegt werden 2 3 RBC Count Es stehen f nf Verd nnungs Modi zu Verf gung normal 10 bis 30 ul abh ngig davon ob im Kapillarmodus gemessen wird pre dilution high kommt bei sehr hohen WBC Werten zum Einsatz 10 ul der Blutprobe werden bis zu drei Mal der normalen Verd nnung verd nnt higher ebenfalls bei sehr hohen Leukozytenwerten Sul der Blutprobe zur sechsfachen der normalen Verd nnung und low bei sehr niedriger Leukozyten oder Thrombozytenanzahl Bei sehr hohen Werten ber 15 000 000 Gesamterythrozytenanzahl sollte die Verd nnung der Probe angepasst werden Die Software bietet einen double count Modus Im Gegensatz zur einfachen Messung wird hier die Blutprobe automatisch doppelt analysiert Es wird dann der Mittelwert beider Analysen gespeichert Bei einer Abweichung von mehr als 10 wird die Probe automatisch ein drittes Mal gez hlt wobei dann der Mittelwerte der hnlichsten Werte berechnet und gespeichert wird 12 II Literatur bersicht 20 OCT 09 11 38 ER ID GJB 0896 E MODE OPEN Messmodus ANIMAL TYPE Control WBC 7 3 103 uL RBC 4 77 10 uL HSB 13 8 g dL HC
43. ejection and error detection Clin Chem 23 1857 1867 Westgard J amp Hunt M 1973 Use and Interpretation of Common Statistical Tests in Method Comparison Studies Clin Chem 19 49 57 Westgard J Seehafer J amp Barry P 1994 Allowable imprecision for laboratory tests based on clinical and analytical test outcome criteria Clin Chem 40 1909 1914 81 VII Literaturverzeichnis Zelmanovic D amp Hetherington E J 1998 Automated Analysis of Feline Platelets in Whole Blood Including Platelet Count Mean Platelet Volume and Activation State Vet Clin Pathol 27 2 9 Zwart A van Assendelft O W Bull B S England J M Lewis S M amp Zijlstra W G 1996 Recommendations for reference method for haemoglobinometry in human blood ICSH standard 1995 and specifications for international haemiglobinocyanide standard 4th edition J Clin Path 49 271 274 82 VIII Abbildungsverzeichnis VIII ABBILDUNGSVERZEICHNIS 1 Ergebnisausdruck einer Kontrollmessung 2 RBC Histogramm nach Benutzerhandbuch 3 PLT Histogramm nach Benutzerhandbuch 4 ideale Verteilungskurve unter physiologischen Bedingungen des Histogramms mit Trennung der PLT und RBC Populationen Benutzerhandbuch 5 nicht ausreichende Trennung der PLT und RBC Population aufgrund Mikrozytose mit errechnetem PLT HI Schwellenwert Benutzerhandbuch 6 nicht ausreichende Trennung der PLT und
44. elltac Average Median 320 0 326 0 Mean 342 4 395 6 Manual Celltac Fig 1 Bland Altman plots for comparison of canine and feline WBC count 52 Difference Sysmex Celltac Difference Manual Celltac III Publikation HGB canine mmol l HGB feline mmol l I 7 9 x S a 8 QO Average Average Mean Median Mean Median Sysmex 9 1 9 7 Sysmex 7 2 7 4 Celltac 8 6 9 0 Celltac 7 2 7 3 HCT canine HCT feline 96 Qd 8 T Q E S 8 S A Average Average Mean Median Mean Median Manual 41 7 43 0 Manual 34 0 35 0 Celltac 42 7 44 4 Celltac 36 8 37 8 Fig 2 Bland Altman plots for comparison of HGB and HCT 53 Difference Manual Celltac Difference Manual Celltac III Publikation GRAN canine 10 L b GRAN feline 10 L E E E E 8 9 D 10 20 30 40 Average Average Mean Median Mean Median Manual 10 30 7 15 Manual 9 43 7 62 Celltac 8 44 6 30 Celltac 9 06 7 70 LYM canine 10 L LYM feline 10 L gt A o oO e 9 i DE MEE E 4 19 v 0 11 4 3 90 s TU MT B e a 5 10 15 20 Average Average Mean Median Mean Median Manual 1 97 1 71 Manual 2 53 1 97 Celltac 2 34 2 00 Celltac 2 70 2 00 Fig 3 Bland Altman plots for comparison of GRAN and LYM count 54 Difference Manual Celltac Difference Manual Celltac III Publikation EOS canine 10 L a 10 5 e S
45. en erforderlich Zu den Vorteilen des Celltacs z hlen neben der kurzen Einarbeitungszeit aufgrund der intuitiven Benutzeroberfl che und dem minimalen Zeitaufwand f r Wartung und Kalibrierung vor allem das geringe erforderliche Probenvolumen von 30 ul Da h ufig nur sehr geringe Volumina an Patientenproben gewonnen werden k nnen ber cksichtigt das Design des Ger tes einen wichtigen Aspekt der Kleintiermedizin Allerdings kann das Ger t lediglich zur Anwendung im Rahmen eines kleinen Blutbildes empfohlen werden und es muss bei der Nutzung ber cksichtigt werden dass die Parameter Thrombozyten bei Hunden und Katzen sowie H matokrit bei Katzen systematischen Fehlern unterliegen und manuell berpr ft werden m ssen 72 VI Summary VI SUMMARY The objective of this study is the clinical validation of the fully automated hematology analyzer Celltac alpha MEK 645 Nihon Kohden Tokyo Japan for feline and canine blood samples collected within routine diagnostic workups in the Clinic of Small Animal Medicine LMU Munich Germany This was accomplished using a systematic comparison of the analyses from the Celltac alpha and two established techniques manual methods and the Sysmex XT20001V Sysmex Corporation Kobe Japan A total of 623 blood samples 363 canine 260 feline were analyzed Manual methods were used for the leukocyte differential count hematocrit packed cell volume and feline platelet count The output of
46. es Sysmex XT2000i humanmedizinische Ausf hrung und des Advia 120 Somit kann das Ger t auch zur Analyse nicht h matologischer Proben eingesetzt werden Mathers et al 2007 Die veterin rmedizinische Ausf hrung des Ger ts der Sysmex XT2000iV ist mittlerweile durch die genannten Studien als Referenzmethode etabliert und wurde seither in zahlreichen Studien als Referenzemethode verwendet Bourges Abella et al 2011 Pankraz et al 2009 Tvedten 2010 Tvedten et al 2008 Tvedten and Lillieh k 2011 Wassmuth et al 2011 35 II Literatur bersicht 4 Evaluierung von Messger ten Die Evaluierung von Messger ten Methodenvalidierung stellt einen essentiellen Teil der Qualit tssicherung in klinischen Laboratorien dar Nachdem die Kalibrierung neuer Analyseger te mit Proben gesunder Tiere erfolgt muss sichergestellt werden dass auch die Messung von Blutproben von Patienten zuverl ssige Ergebnisse liefert Zu den Aufgaben eines Labors geh rt es Fehler zu minimieren um die korrekte Interpretation der Ergebnisse zu erm glichen und dadurch die Versorgung der Patienten sicherzustellen Fehler k nnen entweder durch die Abl ufe der Analyse selbst oder durch den Anwender entstehen Um alle m glichen Fehlerquellen und Variablen in der Analyse von Blutproben abzudecken wird empfohlen die folgenden Aspekte zu beachten und sicherzustellen Jensen and Kjelgaard Hansen 2006 e Verwendung validierter Methoden e Durchf hrung in
47. es for practitioners Performance criteria were set according to the suggestions made by Jensen and Kjelgaard Hansen Blood samples were collected during diagnostic work ups in the Clinic for Small Animal Medicine in Munich from 363 canine and 260 feline patients from November 2009 to March 2010 The number of samples was decided to be sufficient since the lowest range ratio maximum value divided by the minimum value was 5 75 for feline hemoglobin The samples were anticoagulated using EDTA coated collection tubes Sarstedt N mbrecht Germany and automatically analyzed within two hours using the Celltac alpha MEK 6450 Nihon Kohden Tokyo Japan Software Version V01 01 01 and the Sysmex XT 20001V Sysmex Corporation Kobe Japan Software Version 00 10 Control material was run daily on both instruments For canine blood the impedance based PLT count was used in the Sysmex and the optical based PLT count was used for feline blood The same reference values as used in house for the Sysmex were programmed into both analyzers and were also used for manual methods Two blood smears were prepared for manual WBC differentiation from all samples and stained with a modified Wright s stain Hematek Bayer Germany Three hundred cells were microscopically differentiated into five populations neutrophils eosinophils basophils monocytes lymphocytes by one observer B M on one or two slides depending on WBC count A manual platelet count wa
48. etente Unterst tzung dieser Arbeit Meinen Eltern die immer an mich glaubten und mich zu allen Zielen welche ich mir je gesetzt habe ermutigten gilt mein unendlicher Dank Schlie lich m chte ich meinem Partner Dirk danken der mich besonders in der h rtesten Phase dieser Arbeit unterst tzte und mir die n tige Ruhe und Kraft verlieh 84
49. etikulozyten reticulocytes werden Retikulozyten mithilfe der Fluoreszenz Durchflusszytometrie erfasst Vorwi rtsstreulicht und Fluoreszenzintensit t werden analysiert Die Blutprobe wird mit einem spezifischen Reagenzgemisch Retsearch II Sysmex Corporation Kobe Japan inkubiert Die Membranen aller Blutzellen werden perforiert so dass der Fluoreszenzfarbstoff in die Zelle eindringen und an Nukleins uren im Zellkern und Zytoplasma binden kann Zellarten k nnen aufgrund ihres Gehalts an Nukleins uren klar voneinander getrennt werden da der Nukleins uregehalt in der Zelle mit zunehmender Reifung der Retikulozyten kontinuierlich abnimmt Anhand der Fluoreszenz unterscheidet das Ger t drei Retikulozytenpopulationen reife Retikulozyten Low Fluorescence Reticulocyte LRF halbreife Retikulozyten Medium Fluorescence Reticulocyte MFR und unreife Retikulozyten High Fluorescence Reticulocyte HFR Informationen zur Retikulozytenpopulation erm glichen die diagnostische Differenzierung zwischen einer regenerativen und aregenerativen An mie 3 6 Evaluierung Die Evaluierung des Sysmex XT2000i im humanmedizinischen Umfeld erfolgte bereits in mehreren Studien unter Ber cksichtigung der diversesten Parameter Fernandes and Hamaguchi 2003 Fujimoto et al 2000 Hill et al 2009 Langford et al 2003 Ogawa et al 2010 Ratomski et al 2010 Leers et al analysierten 32 II Literatur bersicht n 418 Proben in einem Vergleich des
50. ewandt wird stellt eine unvollst ndige Lyse der Zellen dar Dabei wird die Klassifikation des Leukozyten erst anhand des freigelegten Nukleus m glich Die Struktur des Nukleus oder die Differenzierung der basophilen Leukozyten erfolgt beim ADVIA 120 Bayer Health Care durch die Lyse der Erythrozyten RBC und Thrombozyten PLT gefolgt von der Entfernung des Zytoplasmas mittels Phtals ure einem Tensid in Kombination mit erh hter Temperatur in einer II Literatur bersicht Reaktionskammer Die Klassifizierung des Leukozyten als mononuklear oder polymorphonuklear erfolgt durch Streulichtmessung Bayer Health Care 2004 Die Annahme der unterschiedlichen Lyseresistenzen zur Differenzierung der basophilen Granulozyten BASO von anderen Leukozyten WBC basiert auf Eigenschaften menschlicher basophiler Granulozyten Dass diese nicht ohne Adaptionen f r Blutproben von Tieren bernommen werden k nnen zeigte sich in einem Versuch mit Cell Dyn 3500 ADVIA 2120 und dem Sysmex XT2000iV Keines der Ger te konnte basophile Granulozyten im veterin rmedizinischen Bereich zuverl ssig erkennen Lillieh k and Tvedten 2011 Weitere Auswertungen sind ebenfalls nur f r Proben menschlichen Bluts m glich Beispielsweise berichtet der ADVIA 120 neben dem WBC und BASO count aus dem oben beschriebenen Kanal auch den Lobularity Index LI oder dem Grad der Lobularit t der die Abgrenzung von mononuklearen und polymorphonuklearen Leukozyten darstellt
51. fahren esee 7 1 5 Streulichtmessung e e ro edere eee ie rennen 8 1 6 H moglobin Messmethode eese nnne nnne 9 2 EA E EAEE TETT ege 10 2 1 bere me 11 2 2 PET E 11 2 3 RBC CNN er N RR ete tet 12 2 4 Histogramme 555i Odit monito es 14 2 4 1 RBC Distribution Histogram esee eere nennen nennen 14 2 4 2 PLT Distribution Histogram eese ener 15 2 4 3 WBC Distribution Histoeram neret 18 2 3 Hamoglobin Bestimmung nn 24 2 6 Qualit tssicherung eeesesssssssseseesee eene nennen nnne eene nnne 24 2 6 1 T R EE 24 2 6 2 RRE EE 25 2 6 3 SB ACH PIOS EE 26 2 6 4 E EE 27 2 T Evaluierung 3e oe ex etico OH ERRRE E EE SU Se RENE 28 3 Sysmex X T20001V cis sssesusvesveceunshcusduavscsenbaveacsuosasateceuvsovteissaasapsnisoovassceey 29 3 1 RBC PIT Kanal io toe Er e teo Perte Rete re Rr etaed stehe 29 3 2 H moglobin Kanal eese seen eee ener 30 3 3 WBCE Zahlung een ekian a Fises aat 31 3 4 WBC Z hlung und Dufferenzierung esee 31 3 5 Erfassung von Retikulozyten essere 32 3 6 Evaluierung reset ei 32 4 4 2 HL SU ep Uo dec Cep ar ES VI VII VIII IX Inhaltsverzeichnis Evaluierung von Messger ten eee eee eese eee ee neenon esee et ettnaua 36 Fehler nahen nalen nein 36 Methodenvalidicrung nn 38 PUBLIKATION 220000000000002
52. ford E Cue S Dodkin S German AJ Papasouliotis K Analysis of canine and feline haemograms using the VetScan HMT analyser J Small Anim Pract 2003 44 443 448 Papasouliotis K Cue S Graham M Sparkes AH Gruffydd Jones T Analysis of feline canine and equine hemograms using the QBC VetAutoread Vet Clin Pathol 1999 28 109 115 Roleff S Arndt G Bottema B Junker L Grabner A Kohn B Clinical evaluation of the CA530 VET hematology analyzer for use in veterinary practice Vet Clin Pathol 2007 36 155 166 Welles EG Hall AS Carpenter DM Canine complete blood counts a comparison of four in office instruments with the ADVIA 120 and manual differential counts Vet Clin Pathol 2009 38 20 29 Kondo H Akiyama T Tatsumi N Nagai Y Performance evaluation of the complete blood count and white blood cell differential parameters obtained using a Celltac F automated hematology analyzer Lab Hematol 2004 10 3 13 Nagai Y Kondo H Tatsumi N Validation of platelet counting accuracy with the celltac f automated hematology analyzer J Autom Methods Manag Chem 2005 2005 235 239 Lilliehook I Tvedten H Validation of the Sysmex XT 2000iV hematology system for dogs cats and horses I Erythrocytes platelets and total leukocyte counts Vet Clin Pathol 2009 38 163 174 Lilliehook I Tvedten H Validation of the Sysmex XT 2000iV hematology system for dogs cats and horses II Differential leukocyte counts Vet Clin Pathol
53. gkeit die an ein hochwertiges Ger t gestellt werden k nnen nicht im selben Ma an einfachere und damit g nstigere Ger te gestellt werden Vor allem in der Veterin rmedizin hat die Auswahl an voll und halbautomatischen H matologiesystemen in den letzten Jahren stark zugenommen Diese leiten sich berwiegend von humanmedizinischen Ger ten ab und verf gen ber Softwarepakete die auf verschiedene Tierarten zugeschnitten sind Die Parameter und Messschwellen dieser Ger te werden gr tenteils anhand von Proben gesunder Versuchstiere eingestellt wobei speziesspezifische Referenzwerte gelten Die Evaluierung im klinischen Umfeld anhand 1 I Einleitung physiologischer sowie pathologischer Blutproben ist erforderlich um den zuverl ssigen Einsatz bei Patienten zu gew hrleisten Das Ziel dieser Arbeit ist es die Genauigkeit und Richtigkeit der Messungen des vollautomatischen H matologiesystems Celltac alpha MEK 6450 Hersteller Nihon Khoden Tokyo Japan im klinischen Einsatz in der Medizinischen Kleintierklinik der Ludwig Maximilians Universit t M nchen bei Patientenproben von Hunden und Katzen im Vergleich mit dem mehrfach klinisch validierten Sysmex XT2000iV zu validieren II Literatur bersicht II LITERATUR BERSICHT 1 Analyseger te und Messmethoden Seit ber 80 Jahren stehen der medizinischen Diagnostik automatische Ger te zur Blutzellzihlung zur Verf gung Methodisch wurden die Ger te kontinuierlich
54. h for your time and effort in the editing process Kind regards Karin 61 III Publikation Von Barbara von Beust mailto barbara vonbeust bluewin ch Gesendet Samstag 13 Oktober 2012 01 03 An karin weber Imu de Betreff VCP 11 1756 R3 13 October 2012 Dear Dr Weber Your article entitled Validation of the automated Hematology Analyzer Celltac Alpha for canine and feline blood samples is being edited for publication in Veterinary Clinical Pathology It will be an excellent contribution to an upcoming issue of the journal Your article has been edited for grammar style and consistency Please refer to the attached Word document and consider the editorial suggestions comments listed in the manuscript and questions listed below in this message also attached I would appreciate receiving your response within 14 days I suggest you may make your revisions directly on the attached manuscript in track mode either by accepting the proposed changes or by further editing Once these changes are made or approved your article will be sent to the publisher for copyediting and layout You will have the opportunity to review the final proofs of the article prior to publication Please let me know if you have any questions I appreciate your consideration and look forward to working with you towards the publication of your paper Dr Barbara R von Beust Co Editor in Chief Veterinary Clinical Pathology Changes have b
55. iche Ergebnisse erzielt und best tigten dass bei allen gemessenen Parametern die Herstellerangaben bertroffen wurden Fernandes and Hamaguchi 2003 F r die Adaption des Ger tes an veterin rmedizinische Anforderungen liegen ebenfalls zahlreiche Studien zur Evaluierung vor In diesen Studien wurde der Sysmex allgemein als robust und zuverl ssig bewertet wobei die ersten Untersuchungen anhand Proben gesunder Versuchstiere durchgef hrt wurden Toyota 2004 Lillieh k und Tvedten validierten den Sysmex XT2000iV ausf hrlich im klinischen Umfeld und verwendeten dementsprechend Proben von klinisch kranken Tieren 133 Hunde 65 Katzen und 73 Pferde Die Z hlung der Erythrozyten Thrombozyten und Leukozyten lieferte im Vergleich zum Cell Dyn 3500 sehr gute Ergebnisse und zeigte eine hohe bereinstimmung r20 98 Die Messungen von H matokrt und des mittleren Erythrozytenvolumens wiesen einen systematischen Unterschied bei Katzen und 33 II Literatur bersicht Pferdeproben auf Die Messungen der mittleren korpuskul ren H moglobinkonzentration mean corpuscular cellular hemoglobin concentration MCHC stimmten bei allen Tierarten wenig mit den Ergebnissen den Cell Dyns berein r 0 33 0 67 Zum Zeitpunkt dieser Studie wurde der XT2000iV noch mit menschlichen standardisierten Proben kalibriert was eine m gliche Erkl rung f r diese Abweichung darstellt Seit der Softwareversion 9 0 ist jedoch die individuelle Kalibration
56. icht mehr wegzudenken Ob in der Tiermedizin oder Humanmedizin einer der ersten internistischen diagnostischen Schritte beinhaltet das gro e Blutbild Die Rahmenbedingungen die f r diese Analyse gelten sind jedoch in der Veterin rmedizin sehr heterogen Somit ben tigen Forschungseinrichtungen Ger te die Proben mit einem hohen Durchsatz pr zise bearbeiten k nnen und ein breites Spektrum an messbaren Parametern bieten w hrend die Bed rfnisse des praktizierenden Tierarztes bei geringen Kosten Schnelligkeit und Verl sslichkeit liegen Aufgrund der vielf ltigen Faktoren die bei der Anschaffung eines h matologischen Analyseger tes zu beachten sind verf gen nicht alle Praktiker der Kleintiermedizin ber solche Ger te Zu ber cksichtigen sind hierbei Anschaffungskosten Wartungs Reagenzien und Qualit tskontrollkosten sowie Schulungsaufwand des Praxispersonals Aus diesem Grund verzichten manche Praktiker entweder ganz auf die h matologische Diagnostik evaluieren die Proben mittels manueller Methoden oder versenden die Proben an kommerzielle Labore und beauftragen diese mit der Analyse Die technische Ausstattung der h matologischen Analyseger te wird stets weiterentwickelt und damit werden mehr Messsicherheit und Messm glichkeiten im Sinne verschiedener Parameter geboten Die gesteigerten technischen M glichkeiten f hren allerdings zu h heren Anschaffungskosten Die Anforderungen in Bezug auf Zuverl ssigkeit und Genaui
57. iert und es ist nachgewiesen worden dass die Messungen mithilfe der 30 II Literatur bersicht Zyanid Methode gut mit denen der SLS Methode bereinstimmen Lewis et al 1991 Zwart et al 1996 AA WBC Zahlung Die Z hlung der Leukozyten und Basophilen findet in WBC BASO Kanal im CBC Modus Complete Blood Count kleines Blutbild mithilfe der Durchflusszytometrie statt Das Blut wird mit Stromatolyser FB Sysmex Corporation Kobe Japan im Verh ltnis von 1 50 verd nnt Dadurch soll eine komplette Lyse der Erythrozyten erreicht werden Das saure Reagenz bewirkt zudem ein Schrumpfen der Leukozyten lediglich die Basophilen werden dabei stabilisiert Gr e und Struktur der Zellen bleiben zumindest bei menschlichen Proben erhalten Vorw rts und Seitw rtsstreulicht werden gemessen Das Vorw rtsstreulicht korreliert mit der Zellgr e w hrend das Seitw rtsstreulicht innere Struktur und die Komplexit t der inneren Beschaffenheit also die Granularit t der Zelle widerspiegeln Die Detektion von Basophilen ist derzeit nicht zuverl ssig bei Proben von Hunden und Katzen Lillieh k and Tvedten 2011 Die Ursache liegt in der unterschiedlichen Lyseresistenz der Basophilen von Menschen im Vergleich zu denen von Hunden und Katzen Menschliche Basophile sind stabiler und damit zu einem h heren Grad lyseresistent als Basophile von Hunden und Katzen Somit kann diese Methode nicht ohne weitere Anpassungen f r die Erfassung vo
58. ifferential WBC count lymphocytes granulocytes monocytes eosinophils and MCV are measured and the variables HCT MCH MCHC RBC distribution width plateletcrit and platelet distribution width are calculated The granulocyte count of the Celltac does not differentiate between neutrophils and basophils Flags for analytical errors are given in case of too high or too low WBC count poor RBC lysis PLT clumps or inability to measure granulocyte GRAN lymphocyte LYM eosinophil EOS and monocyte MONO or WBC differential When WBC count is too high or too low for a measurement the instrument shows the option to automatically dilute the sample differently and re measure it Samples are flagged when out of the reference range for the variables WBC RBC HGB RDW MCV MCHC and PLT In this study we compared the results of the Celltac to a laboratory hematology analyzer Sysmex XT 2000i1V which has been validated extensively for veterinary clinical use and to manual reference methods using blood samples of canine and feline patients in order to assess its reliability and accuracy The frequency of flags and precision of the Celltac were assessed The results of the most commonly used variables WBC HGB HCT PLT GRAN LYM EOS and MONO were compared between the different methods The aim of this study was to test the reliability of the Celltac to perform on site 43 III Publikation hematologic analysis of feline and canine blood sampl
59. igenen Referenzbereichen entspricht Bei der Erfassung der Granulozyten kann nicht zwischen neutrophilen und basophilen Granulozyten unterschieden werden F r die Tierarten Kaninchen und Ratte stehen dieselben Parameter bis auf das Differentialblutbild zur Verf gung Der MEK 6450 verwendet Verd nnungsmittel Reinigungsmittel und H molysin vertreten durch die folgenden vier Reagenzien e SOTONAC 3 Diluent e CLEANAC Detergent e CLEANAC 3 Detergent e Hemolynac 3N Lysing Reagent 10 II Literatur bersicht CLEANAC wird zur regelm igen Reinigung des Ger tes eingesetzt w hrend CLEANAC 3 f r die Strong Clean Funktion zur Wartung des Ger tes eingesetzt wird 21 WBC Count Im WBC Modus wird die Zellmembran der Leukozyten und Erythrozyten lysiert Anschlie end werden die Zellkerne der Leukozyten gez hlt Falls Proben von Tieren mit kernhaltigen Erythrozyten z B Reptilien V gel analysiert werden deren Zellkerne in diesem Modus nicht lysiert werden k nnen ist das Ergebnis der Leukozytenmessung als nicht belastbar zu werten Ebenfalls beeinflussen manche Krankheitsbilder z B Hepatophathien und artspezifische Eigenschaften die Lyseresistenz der Erythrozyten 22 PLT Count Thrombozyten und Erythrozyten werden anhand Gr enunterschiede bei der Impedanzmethode voneinander differenziert Bereits die Bedingungsanleitung des MEK 6450 weist auf die Gefahr der Pseudothrombozytopenie bei der Thrombozytenmessung hi
60. ist ein an die Anspr che der Veterin rmedizin angepasstes Model des in der Humanmedizin eingesetzten Sysmex XT2000i Es stehen folgende Kan le der Messung zur Verf gung e RBC PLT Kanal e Hamoglobin Kanal e WBC Kanal Bestimmung im Modus CBC e DIFF Kanal 31 RBC PLT Kanal Erythrozyten und Thrombozyten werden im RBC PLT Kanal in einer gemeinsamen Messkammer analysiert und gemessen Der bei menschlichem Blut sowie Hundeblut physiologisch vorhandene Gr enunterschied zwischen Thrombozyten und Erythrozyten erm glicht hier eine eindeutige Trennung Katzenblut stellt eine gr ere Herausforderung dar da Thrombozyten zu Polymorphologie und Aggregation neigen Mischke 2003 29 II Literatur bersicht F r das Messverfahren mittels hydrodynamischer Fokussierung und Impedanz werden 4ul Blut der Probe verwendet entspricht einem F nftel des Gesamtprobenvolumens und mit CELLPACK Sysmex Corporation Kobe Japan im Verh ltnis 1 501 in der Mischkammer verd nnt Im weiteren Verlauf werden 10 3ul in die Messkammer gef llt und durch eine Kapillare welche als Mess ffnung dient hindurchgesogen Wenn die Zellen einzeln durch die Mess ffnung treten wird ein elektrischer Widerstand nach dem Impedanz Prinzip erzeugt s Abschnitt 1 1 Dieser Widerstand ist proportional zur Zellgr e Das Ergebnis wird als Histogramm graphisch dargestellt Der H matokritwert wird anhand der kumulativen Impulsh hensummierung ebenfalls i
61. jimoto K Groner W Jones A R Koepke J A Lewis S M Shinton N K 75 VII Literaturverzeichnis Tatsumi N Thom R Verwilghen R L amp McLaren C E 1994 Guidelines for the evaluation of blood cell analysers including those used for differential leucocyte and reticulocyte counting and cell marker applications Clin Lab Haematol 16 157 174 Fernandes B amp Hamaguchi Y 2003 Performance characteristics of the Sysmex XT 20001 hematology analyzer Lab Hematol 9 189 197 Flatland B Freeman K P Friedrichs K R Vap L M Getzy K M Evans E W amp Harr K E 2010 ASVCP quality assurance guidelines control of general analytical factors in veterinary laboratories Vet Clin Pathol 39 264 2777 Flatland B Freeman K E Vap L M Harr KE 2013 ASVCP guidelines quality assurance for point of care testing in veterinary medicine Vet Clin Pathol 42 405 423 Fujimoto H Sakata T Hamaguchi Y Shiga S Tohyama K Ichiyama S Wang F S amp Houwen B 2000 Flow cytometric method for enumeration and classification of reactive immature granulocyte populations Cytometry 42 371 378 Grouven U Bender R Ziegler A amp Lange S 2007 Vergleich von Messmethoden Dtsch med Wochenschr 132 e69 e73 Harrison P Horton A Grant D Briggs C amp MacHin S 2000 Immunoplatelet counting a proposed new reference procedure Br J Haematol 108 228 235 Hill V L
62. llen Methode ergaben H matokrit packed cell volume PCV ist der Volumenanteil von Erythrozyten am Gesamtblutvolumen Die Parameter MCV und Erythrozytenanzahl wurden in dieser Studie nicht explizit verglichen zwischen verschiedenen Methoden Denkbar w re dennoch dass falls zahlreiche Thrombozyten als Erythrozyten gemessen werden die gemessene Erythrozytenanzahl dadurch erh ht werden w rde Eine erh hte Erythrozytenanzahl w rde proportional zu einem erh hten H matokritwert f hren Weitere Auswertungen w ren erforderlich um diese Theorie zu best tigen ERGEBNISSE LEUKOZYTEN Die manuelle Methode wurde als Goldstandard zur Leukozytendifferenzierung angesehen Einzelne Subpopulationen der Leukozyten wurden zuverl ssig detektiert Die Messungen von Granulozyten der automatischen und manuellen Methoden entsprechen einander mit hoher Korrelation und lediglich geringen Abweichungen Bias w hrend Ergebnisse der Lymphozytenmessungen nur geringe Korrelation aufweisen mit hoher Streuung der Datenpunkte bei Hunden und Katzen Geringe Abweichungen Bias wurden bei den Zellzahlen f r eosinophile Granulozyten und Monozyten festgestellt Bei h heren Zellzahlen der eosinophilen Granulozyten wurde jedoch ein Trend zur bersch tzung durch den Celltac ersichtlich Die bereinstimmung der Werte beider Zellarten zu anderen 67 IV Diskussion Methoden war sehr gering Da der Vergleich zwischen dem XT2000iV und der manuellen Methode gut
63. mall Animal Medicine LMU University of Munich Veterinaerstr 13 80539 Munich Germany Phone 49 89 21801672 FAX 49 89 21806240 e mail karin weber lmu de Key words cat dog hematology packed cell volume platelets white blood cell Running title Validation of the Celltac alpha for dogs and cats 41 III Publikation 1 Abstract Background Small hematology analyzers for veterinary practices improve point of care diagnostics of companion animals Validation of these instruments is needed to ensure accuracy of results Objectives To validate the Celltac alpha by measuring feline and canine blood samples Methods A total of 623 blood samples 363 canine 260 feline were analyzed on a Celltac alpha and a Sysmex XT 2000iV Manual methods were applied for WBC differential count PCV and feline platelet count Flagging and precision of the new instrument were analyzed Correlation and Bland Altman analyses were used to compare the methods Results Within batch precision of the Celltac showed acceptable coefficients of variation for WBC lt 4 PLT count 8 HGB concentration 3 and HCT lt 3 while precision was poor for the leukocyte subpopulations HGB and WBC count agreed well between the methods CV for the GRAN count was 2 996 in cats and 6 29 in dogs CV for the LYM count was 8 20 in cats and 13 51 in dogs Negative bias and a proportional systematic error were apparent for PLT count bias S
64. manuelle Ausz hlung als Vergleichsmethode der Wahl herangezogen Obgleich die manuelle Ausz hlung aufgrund der Variation in der Durchf hrung und oder Auswertung unpr zise sein kann und damit eine Messunsicherheit mit sich bringt stellt diese dennoch die Referenzmethode f r die Auswertung von Thrombozytenzahlen bei Katzen und der Erstellung eines Leukozyten Differentialblutbildes bei Hunden und Katzen dar 64 IV Diskussion Der Sysmex wurde aus diversen Gr nden als besonders geeignetes Vergleichsger t erachtet Es existieren bereits zahlreiche Validierungsstudien und das Ger t ist deutlich h her technisch ausgestattet als der Celltac Die M glichkeit Thrombozyten sowohl durch Impedanz als auch durch optische Erfassung analysieren zu k nnen war hinsichtlich der Problematik bei der Z hlung der Thrombozyten in Proben von Katzen von besonderem Interesse Aufgrund der bekannten Problematik mit Impedanz basierter Messung wurde bei Katzenproben standardm ig die im optischen Kanal gemessenen Thrombozytenwerte PLT O verwendet ERGEBNISSE Der Celltac alpha konnte zuverl ssig Leukopenien und Leukozytosen in Proben von Hunden und Katzen erkennen Somit waren die Messungen zur Leukozytengesamtzahl belastbar Die klinikeigenen Referenzbereiche wurden bei allen hier angewendeten Methoden ber cksichtigt und durch Softwareeinstellungen im Sysmex und Celltac hinterlegt Die Messungen zur Anzahl der Granulozyten der H moglobinkonze
65. mex XT2000iV f hrt im Rahmen der Leukozytendifferenzierung die Gesamtanzahl f r basophile Granulozyten f r Proben von Hunden und Katzen auf Dadurch dass diese Methode aber auf die Eigenschaften von basophilen Granulozyten von Menschen beruht und diese von den veterin rmedizinischen Gegebenheiten abweichen insbesondere in Bezug auf die Lyseresistenz der Zellen sind die Ergebnisse leider nicht zuverl ssig Lilliehook and Tvedten 2009b FEHLERMELDUNGEN Bei den ausgewerteten Katzenproben wurde bei 25 der Proben eine Fehlermeldung durch den Celltac angezeigt Folglich m sste in der Praxis jede vierte Probe mittels der aufw ndigeren manuellen Ausz hlung oder durch andere Ger te nochmals analysiert werden vorausgesetzt es wurde gen gend Probenmaterial am Patient daf r gewonnen Bei 38 Katzenproben 15 wurde die Fehlermeldung f r r ckst ndige Erythrozytenmembranen RBC Ghost herausgegeben Dies k nnte 70 IV Diskussion m glicherweise ein Indiz daf r sein dass Erythrozyten von Katzen resistenter gegen die vom Celltac verwendete Lysereagenz sind als die anderer Spezies Eine Ursache hierf r k nnte sein dass das Plasma und die Erythrozyten von Katzen eine andere Osmolarit t haben als das Plasma von Menschen Chew et al 1991 und die Herstellung der Reagenzien sich prim r nach den Charakteristika von menschlichen Blutproben richten Bei 34 der Hunde und 36 der Katzenproben 9 und 14 respektive konnte das vier
66. mit Proben der einzelnen Tierarten m glich das k nnte dazu beitragen diese Messfehler zu beheben Lilliehook and Tvedten 2009a Die Z hlungen der Retikulozyten bei Proben von Hunden korrespondierten mit den manuellen Z hlungen r gt 0 90 Bei Katzenproben stimmten die Messungen von aggregierten Retikulozyten gr tenteils berein r 0 86 w hrend die bereinstimmung bei der Messung der punktierten Retikulozyten nicht zufriedenstellend war r 0 50 Lilliehook and Tvedten 2009a Das vierteilige Differenzialblutbild wurde mit manuellen Auswertungen und Ergebnissen des Cell Dyns 3500 verglichen Die Differenzierung der Leukozyten stimmte gr tenteils mit den Vergleichsmethoden berein Die Messwerte f r die Neutrophilen und Lymphozyten zeigten bei allen drei getesteten Tierarten eine hohe bereinstimmung zwischen den Methoden Neutrophile r gt 0 97 Lymphozyten r 70 87 Die gemessenen Gesamtzahlen der Leukozyten waren beim Sysmex 10 26 h her als beim Cell Dyn und der manuellen Bestimmung Eosinophile wurden im Streuungsdiagramm Scattergram als eigenst ndige Gruppe gegen ber den anderen Leukozyten gut differenzierbar dargestellt Auch der gezeigte Wert von r gt 0 93 spricht f r eine hohe bereinstimmung Einzig bei der Tierart Pferd gab es eine geringere Korrespondenz zur manuellen Messung r 0 72 Basophile Granulozyten wurden bei sieben Hunden und f nf Katzen die laut manueller Bestimmung eine Basophilie auf
67. n Basophilen in die Anwendung in der Veterin rmedizin bernommen werden AA WBC Zihlung und Differenzierung Im CBC DIFF Modus werden mithilfe von Fluoreszenz Durchflusszytometrie die vier Zellpopulationen der Leukozyten bestimmt Neutrophile Eosinophile Lymphozyten und Monozyten Die Blutprobe wird mit der Reagenzmischung bestehend aus Fluoreszenzfarbstoff und Lysereagenz im Verh ltnis von 1 51 verd nnt Das Lysereagenz Stromatolyser 4DL Sysmex Corporation Kobe Japan bewirkt eine Lyse der Erythrozyten und die Perforation der Zellmembranen der Leukozyten 3l II Literatur bersicht Stromatolyser 4DS ist ein Polymethin Fluoreszenzfarbstoff der in die Leukozyten eindringt und die Nukleins uren im Nukleus und Zytoplasma f rbt Durch das Anf rben der RNS und DNS kann die Zellaktivit t und der Reifegrad der Zellen beurteilt werden Die Probe wird mit einem Halbleiterlaser mittels Durchflusszytometrie analysiert indem die Fluoreszenzintensit t und das Seitw rtsstreulicht der Zellen gemessen werden Die gemessene Fluoreszenz gibt Auskunft ber den Gehalt der in der Zelle vorhandenen RNS DNS w hrend das Seitw rtsstreulichtintensit t von der inneren Beschaffenheit der Zelle Granularit t Gr e und Lobularit t des Kerns abh ngt Besonders eosinophile Granulozyten k nnen dadurch gut von den anderen Zellenpopulationen abgegrenzt und dargestellt werden 3 5 Erfassung von Retikulozyten Im RET Kanal R
68. n Da es berschneidungen bei der Gr fe von Thrombozyten und Erythrozyten besonders bei Katzen gibt werden Zellen inkorrekt zugeordnet So wird zwar in der Laborauswertung eine Thrombozytopenie aufgezeigt diese aber als Pseudothrombozytopenie einzuordnen ist Echte Thrombozytopenie lt 200 x 10 Zellen uL ist selten wie in einer retrospektiven Analyse von n 2 3300 Katzen gezeigt wurde in der nur n 41 1 2 der Katzen eine echte Thrombozytopenie hatten Jordan et al 1993 Mittels Impedanzmethode wurden in einem weiteren Versuch mit n 359 Katzen allerdings eine Rate von 71 Thrombozytopenie erhoben Nach manueller Z hlung in diesem Versuch zeigten allerdings nur n 11 Proben 3 1 tats chlich einen Thrombozytenwert von lt 200 x 10 Zellen uL Norman et al 2001b In vitro Aggregatbildung die durch die unsachgem e Blutentnahmetechnik gef rdert werden kann erschwert die korrekte Erfassung der Anzahl an Thrombozyten zus tzlich Die Aggregate werden als gro e Zellen erkannt und f lschlicherweise anderen Zellgruppen zugeordnet diese Zellzahlen fehlen im PLT Count wodurch die Zahl an Thrombozyten geringer dargestellt wird Manuelle Kontrollen mithilfe eines Blutausstriches sollten bei angezeigter 11 II Literatur bersicht Thrombozytopenie durchgef hrt werden Der Wert der eine Ihrombozytopenie Meldung hervorruft sowie die klinikintern verwendeten Referenzwerte f r andere Parameter k nnen manuell
69. n between erythrocytes and platelets Significantly more samples were flagged for high HCT in both species when 46 III Publikation compared to the manual method while low HCT was found in comparable quantities when compared to the manual count Table 2 A negative bias and a proportional systematic error was also found in the Bland Altman plots of the feline samples but not in the ones for the canine samples Fig 2 This systematic error leads to overestimation of HCT values in feline samples above HCT values of 25 While the clinical impact of this error may be negligible for low and medium HCT values it may gain clinical significance with high HCT values where deviations of about 996 were detected For WBC differential the manual count was considered the gold standard Correlation was good for GRAN count between the Celltac and the manual count which includes neutrophils and basophils since the Celltac does not differentiate these cells but poor for LYM EOS and MONO counts The difference between the manual count and the Celltac was high for canine LYM count and feline MONO count Table 2 the 9596 limits of agreement are quite wide for these variables and the plots are very spread out Fig 3 and 4 indicating that the methods do not agree The difference of the Celltac EOS count to the manual count was very high in both species and Bland Altmann plots showed a proportional systematic error Figure 4 Poor correlations and la
70. n diesem Kanal ermittelt MVC MCH und MCHC werden aus diesem Wert berechnet 32 H moglobin Kanal Im H moglobin Kanal wird die SLS H moglobinmethode angewendet Die Besonderheit dieser Methode ist dass daf r kein Zyanid erforderlich ist Stattdessen wird das Reagenz SULFOLYSER Sysmex Corporation Kobe Japan das Natriumlaurylsulfat Sodium Lauryl Sulfate SLS enth lt verwendet SLS verf gt ber einen seifenartigen Charakter und erm glicht die Messung von fettreichen Blutproben weil SLS die Tr bung die durch den hohen Fettgehalt verursacht wird weitestgehend bereinigt Die f r die RBC PLT Messung hergestellte Verd nnung wird zus tzlich mit SULFOLYSER vermischt so dass eine Verd nnung von 1 751 entsteht SLS l st Lipoproteine in den Zellmembranen der Erythrozyten Dadurch wird H moglobin freigesetzt SLS bindet nun an den Globin Anteil und f hrt zu einer Konformations nderung im H moglobinmolek l wodurch die Oxidation des zwei zum dreiwertigen Eisen m glich wird So entsteht aus H moglobin Meth moglobin Die hydrophoben Teile des SLS binden an den Globin Anteil w hrend die hydrophilen Teile nun an das jetzt dreiwertige Eisen binden k nnen Dadurch entsteht der stabile Farbkomplex SLS HB der bei einem Absorptionsmaximum von 555nm gemessen werden kann Die Zyanid Messmethode ist die vom ICSH empfohlene Standardmethode s Abschnitt 1 6 Allerdings ist die SLS H moglobinmethode seit circa 20 Jahren etabl
71. nblutproben eine sehr gute Korrelation zur ICSH ISLH Referenzmethode r 2 0 99 und zur manuellen Methode r 0 93 aufweist Nagai et al 2005 In der Humanmedizin zeigte der Vergleich vom Celltac F zum Sysmex XE 2100 eine gute Korrelation f r die meisten CBC und Differentialparameter Eine sehr 28 II Literatur bersicht gute Korrelation wurde f r WBC RBC H moglobin H matokrit und PLT r gt 0 98 und die weiteren Erythrozytenparameter r gt 0 93 im Vergleich mit dem XE 2100 erreicht Longair et al 2011 Die klinische Evaluierung mit Referenz zum Cell Dyn 4000 erfolgte ebenfalls wobei auch Lagerungseffekte der Blutproben beriicksichtigt wurden Hierbei war die Korrelation fiir CBC sowie Leukozytendifferenzierung gut abgesehen von den Messwerten der Basophilen Auch der Vergleich zur manuellen Methode ergab eine sehr gute Korrelation fiir Neutrophile r 0 956 Lymphozyten r 0 951 und Eosinophile r 0 834 Kondo et al 2004 Kondo et al 2005 Der Vergleich zum Sysmex SF 3000 bewies gute Korrelation bei der automatischen Z hlung der unreifen Granulozyten sowie bei der Analyse der blich erhobenen Blutbildparameter F r die Leukozytenparameter wurde im Vergleich zum SF 3000 eine sehr gute Korrelation f r Neutrophile r 0 971 Lymphozyten r 0 967 und Eosinophile r 0 960 gezeigt Bei Monozyten wurde positive Korrelation r 0 76 der beiden Methoden beschrieben 3 Sysmex XT2000iV Der Sysmex XT2000iV
72. ne weitere Methode zur Qualit tskontrolle bieten Ringversuche Dabei wird ein Material durch am Ringversuch beteiligte Institute analysiert und die Ergebnisse daraufhin verglichen Ringversuche sind in der Humanmedizin bereits etabliert 4 2 Methodenvalidierung Die Validierung von neuen Methoden und Evaluation im klinischen Umfeld wurde bereits h ufig in Fachmedien diskutiert Briggs et al 2008 England et al 1994 Flatland et al 2010 Jensen and Kjelgaard Hansen 2006 Klee 1990 Tonks 1963 Westgard 1995 1998 2003 Westgard et al 1974 Westgard and Hunt 1973 Westgard et al 1994 Es gibt eine Vielzahl von Publikationen Richtlinien und Empfehlungen zu diesem Thema Das International Council for Standardization in Hematology ICSH und das National Committee on Clinical Laboratory Standards NCCLS das inzwischen Clinical Laboratory and Standards Institute CLSI genannt wird haben mehrere Richtlinien und Empfehlungen zum Thema Methodenvalidierung und Messgenauigkeit ver ffentlicht Dabei wird die Messgenauigkeit oder richtigkeit als bereinstimmung des gemessenen Wertes mit dem wahren Wert definiert ICSH 1994 Der wahre Wert wiederum muss ebenfalls anhand etablierter und vorgegebener Referenzmethoden ermittelt werden Es existieren unter anderem Empfehlungen zur H moglobinmessung ICSH 1987 NCCLS 1994 der Thrombozyten ICSH 1988b und Retikulozytenz hlung ICSH 1992 NCCLS 1993 zur Bestimmung de
73. ner A amp Kohn B 2007 Clinical evaluation of the CA530 VET hematology analyzer for use in veterinary practice Vet Clin Pathol 36 155 166 Stiene Martin E A Lotspeich Steininger C A amp Koepke J A Hrsg 1998 Clinical Hematology principles procedures correlations 2nd edn Philadelphia Lippincott Raven Sysmex 2008 Fluoreszenz Durchflusszytometrie in der H matologie XT Serie Sysmex Xtra 1 2008 Tonks D B 1963 A study of the accuracy and precision of clinical chemistry determinations in 170 Canadian laboratories Clinical Chem 9 217 233 Toyota N O M Hanaka N Tanaka M Oda Y 2004 Basic evaluation of hematology analyzer XT 2000i for laboratory animals Journal of Toxicological Sciences 29 487 Tvedten H 2010 What is your diagnosis Discrepancy in platelet counts determined using a Sysmex XT 2000 iV hematology analyzer Vet Clin Pathol 39 395 396 Tvedten H Johansson P 2010 Feline platelet counting with prostaglandin E1 on the Sysmex XT 20001V Ver Clin Pathol 39 190 192 Tvedten H Lillieh k I Hillstr m A amp H ggstr m J 2008 Plateletcrit is superior to platelet count for assessing platelet status in Cavalier King Charles Spaniels Vet Clin Pathol 37 266 271 Tvedten H W amp Lillieh k I E 2011 Canine differential leukocyte counting with the CellaVision DM96Vision Sysmex XT 2000iV and Advia 2120 hematology analyzers and a manual method Vet Clin
74. nicht berschreiten Tonks 1963 Die Richtigkeit oder Messsicherheit stellt die bereinstimmung zwischen dem Mittelwert einer Anzahl von Messungen der gleichen Probe und des wahren Wertes dar Die Messunsicherheit wird auch als Bias oder systematischer Fehler bezeichnet Systematische Fehler werden in konstante und proportionale systematische Fehler unterteilt Ein konstanter Fehler liegt vor wenn beim Vergleich zweier Methoden eine Methode konsequent h here oder niedrigere Werte misst im Vergleich zur zweiten Methode Bei einem proportionalen systematischen Fehler ist die Abweichung zwischen den Messungen der beiden Methoden proportional zur H he der gemessenen Werte Um die Art und H he des systematischen Fehlers zu ermitteln wird ein Methodenvergleich durchgef hrt s Abschnitt 4 1 Bei der Validierung neuer Methoden speziell beim Methodenvergleich empfehlen Jensen und Kjelgaard Hansen ein neun stufiges Protokoll in dem die Vorbereitung und Definition der Rahmenbedingungen einen besonderen Stellenwert einnehmen Jensen and Kjelgaard Hansen 2006 40 III Publikation III PUBLIKATION VALIDATION OF THE AUTOMATED HEMATOLOGY ANALYZER CELLTAC ALPHA FOR CANINE AND FELINE BLOOD SAMPLES Barbara Jane McDaniel Johannes Hirschberger Karin Weber Clinic of Small Animal Medicine LMU University of Munich Munich Germany Corresponding Author Dr Karin Weber Centre for Clinical Veterinary Medicine Clinic of S
75. nokykane der 6 II Literatur bersicht Granula und f hrt zu orange emittiertem Licht und Thrombozyten werden als gelb fluoreszierend wahrgenommen Wardlaw and Levine 1983 Um eine bessere Abgrenzung der unteren Granulozytenschicht zur RBC Schicht zu gew hrleisten werden die Erythrozyten mit Kaliumoxalat geschrumpft und dadurch die RBC Schicht kondensiert Die St rke der Fluoreszenz wird mit einem elektronischen Mikrometer kombiniert mit einem Fluoreszenz Mikroskop ausgewertet und gibt Aufschluss ber das Verh ltnis der verschiedenen Zelltypen Die Schichtdicke der einzelnen Zellschichten steht im direkten Verh ltnis zu den Zellzahlen Jain 1993 Dieses Messprinzip findet auch in vollautomatischen H matologiesystemen wie dem QBC VetAutoread H matologiesystem IDEXX Inc Westbrook USA Anwendung 1 4 Zytochemische Farbeverfahren Zytochemische Farbeverfahren stellen einen integralen Teil der Abl ufe eines vollautomatischen H matologiesystems dar Je nach verwendetem Farbstoff und Zellstruktur an welche dieser bindet emittieren Zellen eine f r den jeweiligen Zelltyp und Farbstoff spezifische Fluoreszenz So wird beispielsweise die Messung der DNA Menge in einer Zelle durch Farbstoffe wie DAPI 4 6 Diamidin 2 phenylindol Polymethin Fluoreszenzfarbstoff oder Propidiumiodid erm glicht In der Durchflusszytometrie wird die Fluoreszenz in Kombination mit Streulichtmessung eingesetzt um Zellpopulationen voneinander zu untersch
76. ntage of canine and feline samples were flagged for WBC GRAN and HGB outside the reference range on both analyzers Table 2 and Bland Altmann analysis revealed biases close to zero for these variables in both species although feline WBC count displayed much larger 9596 limits of agreement than canine samples Fig 1 and 2 A negative bias i e overestimation for PLT count in both canine and feline samples was found and in the corresponding Bland Altman plots a proportional systematic error was apparent Fig 1 Feline platelets are difficult to differentiate in all impedance based instruments since they are large and show a tendency to form platelet aggregates which are then counted in the RBC channel resulting in underestimated respectively thrombocytopenia flagging of feline PLT by most analyzers 17 The Celltac however systematically overestimates PLT count in feline samples in the normal and high value range Importantly close inspection of the values revealed that the Celltac underestimates PLT count in the low range ie a range from 90 260 10 by manual PLT count When using the same reference ranges the Celltac therefore reports nearly twice as many thrombocytopenic samples than the manual count 15 vs 8 Table 2 This instrument seems to have an unusual platelet count error in its feline software that should be corrected The manufacturer should also consider adding an instrument error flag for poor separatio
77. nter physiologischen Bedingungen des Histogramms mit Trennung der PLT und RBC Populationen Benutzerhandbuch Die unter physiologischen Umst nden m gliche Abgrenzung der Volumina der Zelltypen kann aufgrund verschiedener Ursachen erschwert werden mit der Folge dass sich die Volumenverteilungen der Zelltypen berschneiden Abbildungen 5 und 6 In diesem Fall ermittelt das Ger t anhand der Verteilungsmuster gestrichelte Linie die berschneidung und die Talsohle und setzt anhand dessen den oberen Schwellenwerte der PLT fest PLT HD Count Microcytic blood Microcythemia amplitude volume volume range volume range Abbildung 5 Nicht ausreichende Trennung der PLT und RBC Population aufgrund Mikrozytose mit errechnetem PLT HI Schwellenwert Benutzerhandbuch 17 II Literatur bersicht Count Macro platelet amplitude e volume RBC volume range volume range Abbildung 6 Nicht ausreichende Trennung der PLT und RBC Population aufgrund Makrozytose mit errechnetem PLT Hi Schwellenwert Benutzerhandbuch Bei reduzierten Thrombozytenwerten sollte eine manuelle Z hlung der Thrombozyten zur Kontrolle erfolgen um Pseudothrombozytopenie auszuschlieDen s Abschnitt 2 2 2 4 3 WBC Distribution Histogram Leukozyten werden anhand verschiedener physikalischer Eigenschaften die nach Entfernung des Zytoplasmas messbar sind in vier Gruppen eingeteilt Lymphozyten LYM
78. ntration sowie dem H matokrit bei Hunden wiesen eine akzeptable bereinstimmung zu den Ergebnissen der Referenzmethoden auf Die Ergebnisse der Leukozytendifferenzierung Zellzahlen f r Lymphozyten eosinophile Granulozyten und Monozyten stimmen nicht in ausreichendem Ma mit denen der manuellen Auswertung berein Dadurch dass die manuelle Ausz hlung aktuell den Goldstandard darstellt ist die N tzlichkeit der Leukozytendifferenzierung mithilfe des Celltacs im klinischen Einsatz in Frage zu stellen ERGEBNISSE THROMBOZYTEN Seit 1988 gilt international die manuelle Ausz hlung der Thrombozyten als der Goldstandard ICSH 1988 Die Pr zision dieser Methode wird allerdings nicht als zufriedenstellend angesehen In der Humanmedizin wird die Variation mit Variationskoeffizienten von 10 25 beschrieben wenn die Ausz hlung von verschiedenen Personen durchgef hrt wird Harrison et al 2000 Pr zisere Thrombozytenmessung liefert der Sysmex durch Fluoreszenz Durchflusszytometrie Bei Hunden Katzen und Pferden wurden bei der Ausz hlung im optischen Kanal PLT O Variationskoeffizienten von 2 4 65 IV Diskussion erreicht Lilliehook and Tvedten 20092 Bei der Thrombozytenmessung mit dem Celltac wurde generell eine negative Abweichung Bias zur manuellen Ausz hlung Katzen und zu den Werten des Sysmex Hunde festgestellt der sich als proportionaler systematischer Fehler erwies Dabei wurden speziell bei Katzenproben mit norm
79. ompared to manual PCV values in feline samples the negative bias is more pronounced than in the canine samples the Celltac measures higher HCT values than the manual method A trend for increased negative bias with high HCT values can be seen in the feline samples Fig 3 Bland Altman plots for comparison of GRAN and LYM count The results of the Celltac were subtracted from the results of the manual count The dashed line shows the bias manual count minus Celltac the dotted lines show the 95 limits of agreement Bias is close to zero for both GRAN and LYM counts 50 III Publikation Fig 4 Bland Altman plots for comparison of EOS and MONO count The results of the Celltac were subtracted from the results of the manual count The dashed line shows the bias manual count minus Celltac the dotted lines show the 95 limits of agreement Bias is negative for EOS count and an increasing negative bias is detectable with higher EOS counts in both feline and canine samples 51 Difference Sysmex Celltac Difference Sysmex Celltac 5 Figures a WBC canine 10 L Average Mean Median Sysmex 13 4 10 0 Celltac 13 0 10 3 c PLT canine 10 L 500 1000 1500 Average Mean Median Sysmex 308 8 280 0 Celltac 382 5 346 5 III Publikation D WBC feline 10 L Difference Sysmex Celltac Average Mean 12 9 13 5 Median 11 5 11 8 Sysmex Celltac PLT feline 10 L Difference Manual C
80. rge differences to the manual count for WBC differential have also been found in other impedance based instruments In conclusion the Celltac alpha is easy to use and maintenance is not very time consuming Leukocytic and leukopenic samples are reliably detected with the Celltac Incomplete results are released for 12 of canine and 25 of feline samples due to error flags The instrument gives acceptable results for total WBC count GRAN count HGB concentration and HCT in canine blood samples but PLT count is proportionally overestimated In feline blood samples both low and high PLT counts are inaccurate and a proportional systematic error for HCT leads to overestimation of this variable The differentiation of lymphocytes eosinophils and monocytes shows high within batch imprecision and the results of the Celltac do not agree well with manual differentiation For reliable WBC differentiation and in case of incomplete results the evaluation of blood smears is often necessary 47 10 III Publikation References Becker M Moritz A Giger U Comparative clinical study of canine and feline total blood cell count results with seven in clinic and two commercial laboratory hematology analyzers Vet Clin Pathol 2008 37 373 384 Bienzle D Stanton JB Embry JM Bush SE Mahaffey EA Evaluation of an in house centrifugal hematology analyzer for use in veterinary practice J Am Vet Med Assoc 2000 217 1195 1200 Dewhurst EC Craw
81. rombozytenwert von lt 200 x 10 Zellen uL Norman et al 2001a Um Aggregatbildung zu vermeiden wurde in einer Studie zus tzlich zu EDTA Prostaglandin El den Blutproben von Katzen beigemischt Als diese im optischen Kanal vom Sysmex XT2000iV gemessen wurden wurden weniger Pseudothrombozytopenien ausgewiesen als durch Vergleichsmethoden Somit konnte gezeigt werden dass mithilfe weiterer Bearbeitung der Blutproben von Katzen m glicherweise eine zuverl sigere Aussage ber den Thrombozytenstatus von Katzen m glich ist Tvedten and Johansson 2010 66 IV Diskussion Wie Studien belegen ist die Unterausweisung von Thrombozyten aufgrund der berschneidung in Zellgr e zu Erythrozyten ein Problem welches aktuell technisch noch nicht komplett zu l sen ist Eine berausweisung aufgrund der Kalibrierung der Software liefert dennoch auch keine L sung dieses Problems Es sollte berdacht werden seitens des Herstellers die Software diesbez glich anzupassen und eine weitere Fehlermeldung zu integrieren die auf mangelhafte Trennung von Erythrozyten und Thrombozyten hinweist ERGEBNISSE HAMATOKRIT Erhebliche Unterschiede bei den H matokritmessungen von Katzenproben wurden zwischen dem Celltac dem Sysmex und der manuellen Methode festgestellt Laut Messungen des Celltacs wiesen etwa die dreifache Anzahl der Proben H matokritwerte au erhalb des oberen Referenzbereichs gt 44 auf als die Messungen des Sysmex und die der manue
82. ry hematology systems and observations on occurrence of basophils in dogs Vet Clin Pathol 40 450 458 Longair I Briggs C amp Machin S J 2011 Performance evaluation of the Celltac F haematology analyser Int J Lab Hematol 33 357 368 Mathers R Evans G Bleby J amp Tornow T 2007 Total and differential leucocyte counts in rat and mouse bronchoalveolar lavage fluids using the Sysmex XT 2000iV Comp Clin Path 16 29 39 Mathers R Evans G Bleby J amp Tornow T 2008 Evaluation of the Sysmex XT 2000iV haematology analyser for rat dog and mouse whole blood samples Comp Clin Path 17 137 144 McShine R L Das P C Sibinga C T S amp Brozovic B 1991 Effect of EDTA on Platelet Count and Other Platelet Parameters in Blood and Blood Components Collected with CPDA 1 Vox Sanguinis 61 84 89 Mischke R Hrsg 2003 Praktische H matologie bei Hund und Katze Hannover Schl tersche 78 VII Literaturverzeichnis Nagai Y Kondo H amp Tatsumi N 2005 Validation of platelet counting accuracy with the celltac f automated hematology analyzer J Autom Methods Manag Chem 2005 235 239 Norman E J Barron R C Nash A S amp Clampitt R B 20012 Prevalence of low automated platelet counts in cats comparison with prevalence of thrombocytopenia based on blood smear estimation Vet Clin Pathol 30 137 140 Norman E J Barron R C J Nash A S amp Clampitt R B 2001b
83. s Mikroh matokrits ICSH 1989 der Erythrozyten ICSH 1988 und Leukozytenanzahl ICSH 1988 und zur Erstellung des Differenzialblutbilds NCCSL H20 A Auch einzelne Autoren oder Verb nde haben Empfehlungen verfasst So hat beispielsweise die American Society for Veterinary Clinical Pathology ASVCP 1996 das Quality Assurance and Laboratory Standards Committee QAS gegr ndet Empfehlungen des QAS Committees werden in drei Kategorien unterteilt generelle analytische Fehler in der Leistung von veterin rmedizinischen 38 II Literatur bersicht Laboreinrichtungen und darauf bezogene Vergleiche H matologie und H mostase und klinische Chemie endokrine Funktionspr fung und Urinanalyse Die Empfehlungen wurden aufgrund mangelnder Kontrolle durch die Regierung herausgegeben Flatland et al 2010 und skizzieren schrittweise die Prinzipien der Qualit tssicherung und Sicherstellung von Qualit tsstandards Parameter der Qualit tskontrolle Quality Control QC im Rahmen der Selbstkontrolle beinhalten unter anderem die Festlegung von Kriterien zur Sicherstellung eines akzeptablen Leistungsbereiches von QC Materialien H ufigkeit der berpr fung des Kontrollmaterials beispielsweise nach dem Wechsel einer Charge eines Reagenz berpr fung kumulierter QC Ergebnissen und das Befolgen von Herstelleranweisungen zur Routine Wartung von Ger tschaften Flatland et al 2013 ASVCP 2009 Eine interne Qualit tskontrolle k
84. s performed by one observer B M on feline blood samples 20 ul EDTA blood were collected in an end to end capillary and placed into a Thromboplus vial Sarstedt N mbrecht Germany containing a lysis reagent After five minutes platelets were counted in a Neubauer counting chamber Manual PCV was determined by microhematocrit centrifugation using heparinized hematocrit capillaries Hirschmann Laborger te Ebersberg Germany and a Haematokrit 210 centrifuge Hettich Tuttlingen Germany The within batch precision of the Celltac was tested on five canine and five feline samples For each species three samples had normal and two samples had abnormal high WBC count Ten replicate analyses were done on each sample within 20 minutes The coefficient of variation CV in was calculated for the variables WBC count HCT PLT count HGB concentration GRAN LYM EOS and MONO count as standard deviation SD mean x 100 The between batch precision was tested using stabilized human control blood material level 1 44 III Publikation normal provided by the manufacturer on 20 consecutive days Data were statistically analyzed with GraphPad Prism GraphPad version 5 GraphPad Software Inc La Jolla CA USA Fisher s exact test was used to compare the proportions of flagged samples The D Agostino Pearson test was used as normality test for the data Spearman s correlation coefficient r was calculated to assess data range and Bland Altm
85. setzung der Kontrollmaterialien aufgrund unterschiedlicher Chargen oder Ger tefehler Bei abweichenden Datenpunkten der R Analyse sind die zugrundeliegenden Fehlerquellen h ufig ein unzureichendes Mischen der Kontrolle Temperaturschwankungen des Verd nnungsmittels oder Verschmutzungen innerhalb des Ger tes Aber auch Ger tefehler wie ein Fehler im Verd nnungsverh ltnis dilution ratio error oder im Stromkreis circuit error k nnen eine Rolle spielen 2 6 2 L amp J Programm Das L amp J Levey und Jennings Programm analysiert t glich eine Kontrolle wovon der Mittelwert sowie die Standartabweichung automatisch berechnet werden Die Datenpunkte werden graphisch als L J Diagramm dargestellt Abbildung 14 25 II Literatur bersicht EE T Upper limit 3 SD 4 80 MARNE CG EEN 472 SD Lower limit 3 SD 4 707 Abbildung 14 L amp J Diagramm Benutzerhandbuch Die Westgard Regeln welche spezifische Grenzwerte f r die Leistung einer Methode definieren werden durch die Programmierung in dieser Qualit tskontrollma nahme ber cksichtigt Westgard et al 1977 Die unteren und oberen Limits werden berechnet Wenn ein Datenpunkt au erhalb des Referenzbereiches liegt wird eine entsprechende Meldung out of range angezeigt Die Fehlerquellen sind analog zu den in Abschnitt 2 6 1 X R aufgef hrten Es wird vom Hersteller empfohlen ausschlie lich die drei firmeneigenen Kontrollma
86. siologischen Bereich oder im programmierten Normalbereich liegen 27 II Literatur bersicht XD XB Daily mean value of daily sample data Standard deviation CV Coefficient of Variation Variationskoeffizient XD x 100 96 xx x SD Standard deviation Standardabweichung Ni X Mittelwert X gemessener Wert N H ufigkeit der Messungen Abbildung 16 Dem D CV zugrundeliegenden Berechnungen 2 7 Evaluierung Ger te der Celltac Linie wurden bereits mehrmals in der Humanmedizin evaluiert In diesen Evaluierungen ist der Korrelationskoeffizient r der Indikator f r den Grad der bereinstimmung zwischen Celltac und Vergleichsmethoden Eine Korrelation von r gt 0 5 wurde als eine gute Korrelation und gt 0 7 als sehr gute Korrelation bewertet Die Korrelation kann durch verschiedene Variablen beeinflusst werden die nicht unbedingt etwas mit der eigentlichen bereinstimmung zu tun haben So steigt beispielsweise der r Wert auch bei einer hohen Spannweite der Messergebnisse ohne dass es auf eine eigentliche bereinstimmung der Messergebnisse zur ckzuf hren ware Ebenso eignet sich die alleinige Analyse durch Regressionsanalysen beim Vergleich von Messmethoden nicht Es sollte stattdessen ein kombinierter Ansatz wie er durch die Bland Altman Analyse geboten wird angewendet werden Grouven et al 2007 Von Nagai et al wurde gezeigt dass der Celltac F MEK 8222 bei der Thrombozytenmessung von Huma
87. tac alpha leicht zu bedienen und fordert nur geringen Wartungsaufwand Proben von Patienten mit Leukozytose oder Leukopenie werden erfolgreich detektiert Unvollstindige Ergebnisse im Zusammenhang mit Fehlermeldungen werden bei bis zu 25 der Katzen berichtet Das Ger t liefert im Vergleich zu Referenzmethoden manuell und Sysmex XT20001V bereinstimmende Ergebnisse f r Leukozytenzahl Thrombozytenzahl Granulozytenzahl H moglobinkonzentration und H matokrit bei Hundeblutproben Bei Katzenblutproben sind die Ergebnisse ebenfalls belastbar f r Leukozytenzahl Granulozytenzahl und H moglobinkonzentration aber systematische Fehler sind bei der Messung von Thrombozyten und H matokrit vorhanden Bei hohen H matokritwerten kann dieser Fehler auch klinisch signifikant sein Ein m glicher Softwarefehler der die berausweisung der Thrombozytenzahl zur Folge hat sollte durch den Hersteller gepr ft werden und die Software dementsprechend angepasst werden Die Programmierung einer zus tzlichen Fehlermeldung f r mangelhafte Differenzierung von Thrombozyten und Erythrozyten k nnte f r den Anwender ein wichtiger und hilfreicher Hinweis sein Die Differenzierung von Lymphozyten Eosinophilen und Monozyten ist nicht zuverl ssig f r Proben beider Tierarten mit sehr geringer bereinstimmung zur Vergleichsmethode und niedriger Pr zision Um eine zuverl ssige Leukozytendifferenzierung zu gew hrleisten ist die manuelle Evaluierung der Blutausstrich
88. teilige Differenzialblutbild auch nach wiederholtem Messen mit ver ndertem Verd nnungsverh ltnis nicht erstellt werden Es konnte kein eindeutiger Zusammenhang erkannt werden weshalb diese Proben nicht vollst ndig analysiert werden konnten Auch bei anderen automatischen Analyseger ten wie dem LaserCyte Wenger Riggenbach et al 2006 dem CA530 Vet Roleff et al 2007 und dem Sysmex Lilliehook and Tvedten 2009b wurden Probleme der vollst ndigen Differenzierung der Leukozyten in vergleichbarem Ma e beschrieben Dies gilt ebenso f r in der Humanmedizin verwendete hochwertige Ger te wie dem Sysmex XT2000i der das Pendant zum in der Veterin rmedizin eingesetzten XT2000iV darstellt So berichten Leers et al in ihrer Studie bez glich der Differenzierung von Leukozyten von Fehlermeldungen bei 21 der Proben die durch den XT2000i gemessen wurden und folglich eine weitere Bearbeitung erforderten Leers et al 2011 Dies l sst erkennen dass die automatisierte Analyse von Blutproben von Patiententieren welche Abweichungen von den Referenzbereichen aufweisen weiterhin eine technische Herausforderung darstellt In der Tiermedizin bereiten vor allem die Differenzierung der Leukozyten und die Z hlung der Thrombozyten bei Katzen Probleme so dass die manuelle Probenbearbeitung weiterhin unumg nglich f r eine zuverl ssige Auswertung der Proben bleibt 71 V Zusammenfassung V ZUSAMMENFASSUNG Zusammenfassend ist der Cell
89. terialien zu verwenden MEK 3DN Normal MEK 3DH High Hoch und MEK 3DL Low Niedrig Nihon Kohden Tokyo Japan 2 6 3 r BATCH Programm Das t BATCH TB Programm teilt die t glichen Messungen in Gruppen von 20 Messungen ein Der Mittelwert der jeweiligen Messungen von MCV MCH und MCHC in einer Gruppe wird berechnet Abbildung 15 Der Durchschnitt der XB Messungen erm glicht eine bersicht der Pr zision des Systems da physiologische Variationen in diesen Parametern MCV MCH und MCHC minimal sind Somit werden die EB Werte minimal durch die Unterschiede zwischen den Blutproben beeinflusst und der Grad der Pr zision kann uneingeschr nkt widergespiegelt werden 26 II Literatur bersicht X B i X B i 1 SGN F x F N F XSGN X X B i 1 x X X Bii 1 N X B i XB of present batch X each data in batch X B i 1 XB of previous batch SGN sign function N number of samples in batch Abbildung 15 EB zugrunde liegenden Berechnungen Die X B Werte der vorangegangenen 20 Messungen previous batch sind erforderlich um die XB Werte der gegenw rtigen 20 Messungen present batch zu berechnen 2 6 4 rDay CV Das D CV Day Coefficient of Variation Programm berechnet den taglichen Durchschnittswert der an dem jeweiligen Tag gemessenen Proben den Variationskoeffizient hiervon sowie die Standardabweichung Abbildung 16 Es werden nur Proben einbezogen deren Messwerte im phy
90. terner und externer Qualit tskontrollen e Sicherstellen der Fachkenntnisse des Anwenders bez glich der Methoden und potentieller Fehlerquellen e Kalibrierung und Wartung der Ger tschaften e Standardvorgehensweise Standard Operating Procedure SOP als Bestandteil hauseigener Protokolle 4 1 Fehler Falsche Testergebnisse k nnen je nach Zeitpunkt relativ zur Messung in drei Kategorien unterteilt werden pr analytische Fehler Gesamtfehler und postanalytische Fehler Jensen and Kjelgaard Hansen 2006 Die Validierung von Analyseger ten im klinischen Umfeld soll Aufschluss ber den Gesamtfehler geben Unter pr analytische Fehler fallen beispielsweise unsachgem e Blutabnahmetechnik oder falsche Lagerung der Proben Ein klassischer postanalytischer Fehler besteht in der inkorrekten Ablesung der Ergebnisse Gesamtfehler k nnen unterschieden werden in systematische und zuf llige Fehler Abbildung 17 36 II Literatur bersicht Fehler im Labor Gesamt E Praanalytische Een Postanalytische Fehler us Fehler Fehler ee Systematische ame Konstante Proportionale Henke Fehler Fehler E Abbildung 17 Fehlerkategorien nach Jensen und Kjelgaard Hansen 2006 Der Gesamtanalytische Fehler total analytical error oder Gesamtfehler ist eine quantitative Messgr e Incz dy et al 1998 Das Gegenst ck dazu im Rahmen qualitativer Untersuchungen wird als Richtigkeit oder Messsicherheit bezeichnet Der Zuf
91. ther processing and evaluation consuming resources and time To conclude the Celltac alpha is easy to use and maintain Samples with 73 VI Summary leukocytosis or leukopenia were reliably detected with the Celltac Incomplete results were often returned due to error flags which was the case for every fourth feline sample Thereby re evaluation and the use of manual methods become necessary The instrument gives acceptable results for total leukocyte count platelet count granulocyte count hemoglobin concentration and hematocrit in dog blood samples In feline blood samples both low and high platelet counts are inaccurate and a systematic error for hematocrit leads to overestimation of this parameter For high hematocrit values this error may be of clinical significance The differentiation of lymphocytes eosinophils and monocytes appears to be not very accurate for both species with very low correlations and low intra assay precision For reliable WBC differentiation and in case of incomplete results the evaluation of blood smears remains necessary 74 VII Literaturverzeichnis VII LITERATURVERZEICHNIS American Society for Veterinary Clinical Pathology ASVCP 2009 Principles of Quality Assurance and Standards for Veterinary Clinical Pathology Aufrufbar im Internet URL www asvcp org Stand 26 05 2014 Bain B J amp Huhn D 1997 Roche Grundkurs H matologische Morphologie 1 Aufl edn Thieme Stuttgart
92. uld be preferable to calculate the total allowable error for all variables In most studies within batch precision is reported to be better than between batch precision Surprisingly in our study between batch precision was superior for most parameters to within batch precision probably because abnormal veterinary samples were included while the human control sample consisted of stabilized material for the normal range A linearity study was not done on our samples 45 III Publikation About 12 of canine samples and 25 of feline samples could not be analyzed completely due to error flags Table 2 No values for PLT and HCT were released with the error flag RBC ghost and for WBC differential with the error flag Can t diff WBC No apparent pathologic changes could be detected in most of these samples using other methods so the reason for the analytical errors remains unclear Similar problems with a high percentage of samples lacking WBC differential results have been reported in other impedance based analyzers Similar to other studies we performed a correlation analysis on the method comparison results The correlation coefficients were all found to be 0 99 and the median difference between the comparison methods was larger than 10 for several variables Table 3 The correlation coefficient cannot be used to judge accuracy of the methods since it does not assess agreement but association A comparable perce
93. verwendet Das abgeleitete Licht wird mittels strategisch angebrachten Photodetektoren erfasst Es gibt zwei verschiedene Methoden um das gestreute Licht zu erfassen die Dunkelfeld optische Methode und anhand eines Adsorptionskanals Das erfasste abgeleitete Licht wird als Vorw rts bzw Niedrigwinkelstreulicht oder Seitw rts bzw Gro winkelstreulicht klassifiziert und erm glicht die Trennung einzelner Zellpopulationen Dotson 1998 Die Intensit t des Vorw rts Niedrigwinkelstreulichts 1 3 ist proportional zur Zellgr e Vorw rts Gro winkelstreulicht 4 9 gibt Auskunft ber die Granularit t der Zelle wogegen Seitw rtsstreulicht 90 von der inneren Beschaffenheit und Struktur der Zelle abg ngig ist Eine Steigerung der Aussagekraft wird durch Fluoreszenz erm glicht Hierbei wird ein zus tzlicher Parameter festgehalten das Seitw rtsfluoreszenzlicht welches den Gehalt an Nukleins uren sowie Zellorganellen angibt Sysmex 2008 Diese Methode wird z B in Ger ten der Sysmex X Klasse verwendet Der Fluoreszenzfarbstoff Polymethin bei Sysmex XT2000iV Stromatolyser 4DS dringt durch eine Reihe an Reaktionen in die Zellen ein Dort bindet der Polymethin Fluoreszenzfarbstoff an die RNS oder DNS im Zellkern oder Zytoplasma der jeweiligen Zelle und fiihrt so zu einer Aussage tiber den Reifegrad und die Zellaktivit t Genauere Informationen zum Sysmex XT2000iV werden in Abschnitt 3 dargestellt Die Methode der RNS F rbung
94. wiesen durch den Sysmex nicht erkannt Unvollst ndige Ergebnisse wurden bei 18 der Katzenproben 13 der Hundeproben und 3 der Pferdeproben geliefert Viele dieser Proben wiesen allerdings starke Linksverschiebungen und toxische Ver nderungen auf Lilliehook and Tvedten 2009b In einer Studie zum Vergleich des Sysmex XT2000iV Advia 120 Siemens Healthcare Diagnostics AB Tarrytown NY USA und des Cell Dyns 3500 wurde gezeigt dass keines dieser Ger te basophile Granulozyten zuverl ssig 34 II Literatur bersicht erkennen konnte Dabei wurden 17 Proben von Hunden Katzen und Kaninchen mit manuell diagnostizierter Basophilie mithilfe dieser drei Ger te analysiert Keines der getesteten Ger te konnte basophile Granulozyten von Hunden erkennen Auch in den Streuungsdiagrammen war kein Hinweis auf eine Basophilie zu beobachten Lediglich bei einer Probe mit 54 basophilen Granulozyten gab der Sysmex die Meldung WBC Abn Scattergram aus womit auf eine abnormale Verteilung der Granulozyten im Streuungsdiagramm hingewiesen wird Lillieh k and Tvedten 2011 Mathers et al evaluierten den Sysmex im Vergleich zum Advia 120 und kamen zu einem guten Ergebnis Alle berpr ften Parameter stimmten bei beiden Ger ten nahezu berein R gt 0 986 Mathers et al 2008 Auch bei der Analyse von bronchoalveol rer Lavagefl ssigkeit BALF von Ratten und Mausen korrespondierten die vom Sysmex gelieferten Ergebnissen mit denen d
95. ysmex Celltac canine 70 09 x 10 L manual count Celltac feline 44 62 x 10 L for feline HCT bias manual PCV Celltac 3 38 and for eosinophil count Analytical error flags and incomplete results were reported for 11 8 of canine and 25 4 of feline samples Conclusions The PLT count of the Celltac was precise but systematically overestimated Feline HCT was systematically overestimated and WBC differential counts showed high imprecision 42 III Publikation 2 Manuscript Several small instruments for in clinic use have been developed to facilitate point of care hematologic diagnostics in veterinary practice Accuracy and reliability of different systems have been compared in several studies often revealing important limitations of in clinic analyzers compared to technically more advanced laboratory instruments 9 The Celltac Celltac alpha MEK 6450 Nihon Kohden Tokyo Japan is a fully automated impedance point of care hematology analyzer which has initially been developed and tested for the analysis of human samples but is available with a software for veterinary samples since 20077 8 Its small footprint and low sample volume are advantageous in veterinary practice but its performance has not yet been evaluated for animal patient samples The instrument reports 20 variables using a sample volume of 30 ul WBC count RBC count PLT count hemoglobin HGB concentration mean platelet volume MPV and a 4 part d
96. yten durchzuf hren w rde ein weiterer separater Kanal ben tigt werden 1 1 Impedanzmethode Diese Messmethode basiert auf elektrischem Widerstand und wird daher als Widerstands oder Impedanzmethode bezeichnet Es ist die bislang best ndigste Methode zur Blutzellz hlung und differenzierung die entweder alleine oder in 3 II Literatur bersicht Kombination mit anderen Verfahren eingesetzt wird und wurde in den 50er Jahren von Wallace Coulter entwickelt und von Coulter Electronics Inc patentiert Stiene Martin et al 1998 Bei der Impedanzmethode wird eine Blutprobe in einer Elektrolytl sung suspendiert Diese Mischung wird zun chst durch eine Mess ffnung gesaugt an der zwei Elektroden angrenzen Die Zellsuspension wird mit einer sogenannten Mantelstrom Fl ssigkeit vermischt F r die Bearbeitung von S ugetierproben ist dies meistens phosphatgepufferte Kochsalzl sung Durch die hydrodynamische Fokussierung die dazu f hrt dass der Strom in dem sich die zu analysierende Probe befindet unter h herem Druck steht als die Mantelstrom Fl ssigkeit entsteht koaxialer Strom Dieser Prozess erm glicht die singul re Passage von Zellen zu jeweils einem Zeitpunkt zwischen den Elektroden einer Messkammer Die Zelle leitet im Gegensatz zum Medium in dem sie sich befindet Elektrizit t schlecht Es kommt zu einem Anstieg des Widerstandes der proportional zum Zellvolumen ist Dadurch ndert sich der Leitwert in Abh ngigkeit der f r
97. zyten bei Katzen die Zellgr e der Thrombozyten und die der Erythrozyten berschneiden sich Somit kann keine akkurate Trennung der Zellpopulationen festgelegt werden und Thrombozyten werden als Erythrozyten gez hlt Ein weiteres Problem das bereits w hrend der Probenaufbereitung entsteht ist die in vitro Aggregation der Thrombozyten Aggregate k nnen nicht als einzelne Thrombozyten erkannt werden sondern werden als eine gro e Zelle gez hlt Zelmanovic and Hetherington 1998 Um die Messsicherheit zu erh hen wird bei einer Vielzahl der modernen Messger te die Methode der Impedanz mit neueren Methoden wie der Fluoreszenz Durchflusszytometrie verbunden Ein Beispiel hierf r ist der Sysmex XE 2100 1 2 Selektive Lyse bestimmter Zelltypen Die selektive Lyse bestimmter Zelltypen erm glicht die Auswahl einer Zellgruppe und somit deren Analyse Die daf r ben tigten Reagenzien greifen an physiologischen Strukturen die Zelltypen voneinander abgrenzen und unterscheiden an Die vollst ndige Lyse von Erythrozyten ist ein Kernelement im Prozess der Untersuchung einer Blutprobe Die Lyse ist notwendig f r die Quantifizierung des H moglobins oder die Differenzierung der Leukozyten Die Lyse von Erythrozyten ist mit verschiedenen Substanzen und Methoden m glich e Ammoniumchlorid NHACI e Diethylenglykol e Saponine e Hypotonischer Schock Die Entfernung des Zytoplasmas wie es bei der Differenzierung der Leukozyten ang

Evaluierung des vollautomatischen Hämatologiegerätes Celltac

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