QUANTA LiteTM dsDNA
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1. Prossiga com a coordena o da incuba o durante 30 minutos a partir do momento da adi o do QUANTA Plex Negative Control Coloque a tira de micropo os temperatura ambiente numa superf cie nivelada e afastada da luz solar directa durante o resto do per odo de incuba o 6 No final do primeiro per odo de incuba o adicione 50 uL do conjugado fluorescente a cada micropo o e pipete vigorosamente pelo menos 60 uL do conte do do micropo o para cima e para baixo quatro vezes Para adicionar o conjugado mantenha a mesma sequ ncia de coordena o utilizada nos passos 4 e 5 O conjugado deve ser removido do frasco em condi es ass pticas padr o e utilizando boas t cnicas de laborat rio Retire apenas do frasco a quantidade de conjugado necess ria para o ensaio PARA EVITAR POTENCIAL CONTAMINA O MICROBIANA E OU QU MICA NUNCA VOLTE A COLOCAR CONJUGADO N O UTILIZADO NO FRASCO Incube as tiras de micropo os durante 30 minutos temperatura ambiente numa superf cie nivelada e afastada da luz solar directa O per odo de incuba o inicia se depois da primeira adi o do conjugado 7 No prazo de uma hora depois da conclus o da incuba o de 30 minutos do conjugado fluorescente leia a placa de Celiac IgA Profile no Luminex conforme detalhado na sec o acima Utiliza o do Analisador de Fluxo Luminex 100 ou 200 CONTO de qualidade O Celiac IgA Calibrator em duplicado o Celiac IgA Positive Control o QU2. Diluente para Amostras HRP 1 frasco de cor rosa contendo solu o salina com tamp o Tris Tween 20 estabilizadores proteicos e conservantes 50mL tamb m utilizado como Isento de Soro 6 Conjugado IgA marcado com fluoresc ncia cabra anti lgA humana cadeia alfa espec fica 1 frasco castanho p liofilizado contendo tamp o estabilizadores proteicos e conservantes Consulte a sec o de M todos para as instru es de reconstitui o 7 QUANTA Plex Conjugate Diluent 1 frasco de cor rosa contendo tamp o estabilizadores proteicos e conservantes 7mL Advert ncias 1 ADVERT NCIA Este produto cont m um qu mico 0 02 cloranfenicol no diluente da amostra considerado como cancer geno no Estado da Calif rnia 2 Todo o material de origem humana utilizado na prepara o dos controlos deste produto foi testado e deu resultados negativos para m todos aprovados pela FDA para anticorpos anti HIV HBsAg e HCV Contudo nenhum teste pode garantir com certeza absoluta a aus ncia de HIV HBV HCV ou outros agentes infecciosos Assim QUANTA Plex Negative Control e Celiac IgA Calibrator e Celiac IgA Positive Control devem ser manipulados como se fossem material potencialmente infeccioso 3 A azida de s dio utilizada como conservante Este produto venenoso e pode ser t xico se for ingerido ou absorvido pela pele ou pelos olhos A azida de s dio pode reagir com componentes de chumbo ou cobre das canaliza es
3. Gastrenterologia e Nutri o Pedi trica recomendou a utiliza o de marcadores anticorpos tais como os anticorpos da anti gliadina e anti endomisial para reduzir o n mero de bi psias necess rias para fazer um diagn stico O antig nio endomisial identificou se como a enzima de liga o cruzada com a prote na tTG Os procedimentos espec ficos do ELISA integrando tTG como o antig nio proporcionam uma alternativa fi vel e objectiva aos ensaios tradicionais por imunofluoresc ncia utilizando finas sec es de es fago de primata como substrato O antig nio h tTG tem sido produzido por tecnologia recombiante e pode ter certas vantagens comparando com o antig nio do f gado de porquinho da ndia Trabalhos recentes revelaram que os anticorpos da gliadina reactiva de doentes cel acos se ligam a um n mero muito limitado de ep topos espec ficos da mol cula de gliadina Al m disso estes estudos revelam que a desamida o selectiva da gliadina pela enzima associada doen a cel aca tTG resulta numa liga o aumentada dos anticorpos anti gliadina Os ensaios que utilizam pept deos de gliadina desamidados possuem uma maior precis o de diagn stico para a doen a cel aca do que os ensaios anti gliadina e mesmo at os anti tTG 2 Adicionalmente estes anticorpos s o de interesse para acompanhar a actividade da doen a ao longo do tempo e para controlar a ades o a uma dieta sem gl ten Uma quantidade significativa
4. IgA Os soros de 5 doentes conhecidos por terem a defici ncia selectiva de IgA testaram se no Celiac IgA Profile tal como 949 outros doentes conforme acima descrito Esses 5 mais 21 doentes suplementares apresentaram propor es no anti lgA UL IgA UL inferiores a 0 5 tendo assim IgA insuficiente para o Perfil de IgA Celiaco A Sensibilidade e a Especificidade para a propor o anti lgA UL IgA UL no QUANTA Plex Celiac IgA Profile Positivo QUANTA QUANTA Cl nica Sensibilidade Tudo QUANTA QUANTA Cl nica Controles Plex Plex QUANTA Plex Negativo Plex Plex Especificidade N 5 Rela o Rela o 95 Cl Controles Rela o Rela o QUANTA Plex gt 0 5 lt 0 5 N 949 gt 0 5 lt 0 5 95 Cl 99 98 100 Rela o Com base em par metros sorol gicos 12 destes doentes aparentavam ser Doentes Cel acos com defici ncia em IgA e 7 tinham controlos altamente dilu dos e 1 era conhecido por ter um baixo n vel total de IgA no soro Com base numa incid ncia de 1 em 500 IgA deficient esperava se que 2 amostras adicionais fossem positivas pela incid ncia taxa C lculos baseados em 18 soros supostamente deficientes 100 82 100 Anti lgA IgA 928 Rela o Precis o e Reprodutibilidade Varia o intra ensaio e varia o inter ensaio Para a varia o intra ensaio ensaiaram se 18 amostras 10 vezes cada num nico ensaio Na tabela abaixo lista se a varia o de 3 para 5 amostras representativa
5. da m dia Sensibilidade e Especificidade Cl nica Para determinar a sensibilidade cl nica dos ensaios de anticorpos testaram se 29 amostras de doentes com a doen a cel aca activa que tinham IgA suficiente no QUANTA Plex Celiac IgA Profile e nos ELISA correspondentes A sensibilidade cl nica para IgA anti h tTG foi de 93 com um Intervalo de seguran a de 95 IS de 77 99 A sensibilidade cl nica para IgA anti DGP foi de 73 IS de 95 de 53 92 Para determinar a especificidade cl nica testaram se 494 doentes que n o foram diagnosticados com a doen a cel aca Este grupo incluiu os dadores de sangue normais doentes com doen as reum ticas hep ticas gastrointestinais e infecciosas A especificidade cl nica para anti h tTG foi de 98 com IS de 95 de 96 99 A especificidade cl nica de anti DGP foi tamb m de 98 95 IS de 96 99 A Sensibilidade e a Especificidade Cl nica para os testes anti h tTG e DGP no Celiac IgA Profile 5 Diagn stico Positivo DC com IgA Negativo Controlos h tTG IgA suficiente e n o numa dieta sem n o diagnosticados gl ten com DC Tudo Luminex Positivo 21 11 38 Negativo 2 483 485 Tudo 29 494 523 Ambas estas amostras foram negativas no tTG ELISA Dez destes s o positivos perto ELISA Sensibilidade 27 27 2 x100 93 1 IS 77 99 Especificidage 483 11 483 x100 97 8 IS 96 99 Diagn stico Positivo DC com IgA Negativ
6. ANTA Plex Controlo Negativo e o Controlo Isento de Soro devem executar se com uma s rie de amostras para assegurar que todos os reagentes e procedimentos foram realizados adequadamente 2 Note que o Celiac IgA Calibrator o Celiac IgA Positive Control e o QUANTA Plex Negative Control est o pr dilu dos pelo que n o controlam os procedimentos associados s dilui es de amostras 3 Outros controlos podem ser testados de acordo com as directivas ou requerimentos locais e ou nacionais ou de acordo com as disposi es de organiza es acreditadas Outros controlos adequados podem ser preparados efectuando al quotas de amostras de soro humano e conservando a lt 20 C 4 Para se considerar v lidos os resultados do teste tem de se cumprir todos os crit rios abaixo listados Se n o se cumprir algum deles deve considerar se o teste inv lido e repetir o ensaio O valor em Unidades Luminex UL do Calibrador para cada antig nio encontra se no r tulo da caixa para esse kit Consulte a f rmula na sec o de C lculo dos Resultados para determinar as UL do QUANTA Plex Negative Control Celiac IgA Positive Control e dos Controlo Isentos de Soro a O valor do QUANTA Plex Negative Control tem de ser lt 20 UL para h tTG e DGP Tem de ser entre 10 e 40 UL tanto para as esferas de controlo IgA como para as anti lgA b O valor do Celiac IgA Positive Control tem de ser gt 30 UL para h tTG e entre 30 UL e 130 UL para DGP Tem d
7. QUANTA Plex Celiac IgA Profile 708940 Para utiliza o em diagn stico In Vitro Complexidade CLIA Elevada Aplica o Diagnostica O QUANTA Plex Celiac IgA Profile um imunoensaio de fluoresc ncia para a detec o semi quantitativa de auto anticorpos os anticorpos da transglutaminase tecidular anti numana da IgA Imunoglobulina A h tTG e pept deo de gliadina anti desamidado DGP e a detec o de uma quantidade insuficiente de IgA no soro humano A presen a destes anticorpos juntamente com outras descobertas laboratoriais e cl nicas uma ajuda no diagn stico da enteropatia sens vel ao gl ten da doen a cel aca A IgA insuficiente indica que n o existe IgA suficiente para permitir a detec o de IgA anti h tTG ou anti DGP Resumo e Explica o do teste A doen a cel aca uma condi o cr nica cujas caracter sticas principais incluem a inflama o e o esmagamento caracter stico da mucosa intestinal resultando numa sindroma de m absor o conhecida como uma enteropatia sens vel ao gl ten A etiologia exacta da doen a permanece desconhecida excep o da gliadina frac o sol vel do lcool de gl ten do trigo que claramente o agente t xico recentemente t m sido sugeridos testes sorol gicos para anticorpos de anti gliadina anti endomisial e anti tTG para examinar os doentes com enteropatia sens vel ao gl ten assim como para controlar a conformidade diet tica A Sociedade Europeia de
8. VA Diagnostics Inc 9900 Old Grove Road San Diego CA 92131 United States of America Representante Autorizado Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D 66386 St Ingbert Germany Tel 49 6894 581020 Fax 49 6894 581021 www mt procons com Technical Service 888 545 9495 628940 July 2007 Revision PRTO
9. ac disease in adults Digestive Diseases and Science 41 83 87 1996 Walker Smith JA Guandalini S Schmitz J et al Revised criteria for diagnosis of celiac disease Report of working group of European Society of Pediatric Gastroenterology and Nutrition ESPGAN Arch Diseases of Childhood 65 909 911 1990 Dieterich W Ehnis T Bauer M et al Identification of tissue transglutaminase as the autoantigen of celiac disease Nature Medicine 3 797 801 1997 Sardy M Odenthal U Karpati S et al Recombinant human tissue transglutaminase ELISA for the diagnosis of gluten sensitive enteropathy Clin Chem 45 2142 1999 Sblattero D Berti 1 Trevisiol C et al Human recombinant tissue transglutaminase ELISA an innovative diagnostic assay for celiac disease Am J Gastroenterology 95 1253 1257 2000 Osman AA G nnel T Dietl A et al B Cell epitopes of gliadin Clin Exp Immunol 121 248 254 2000 Aleanzi M Demonte AM Esper C et al Celiac disease Antibody recognition against native and selectively deamidated gliadin peptides Clin Chem 47 2023 2028 2001 Schwertz E Kahlenberg F Sack U et al Serologic assay based on gliadin related nonapeptides as a highly sensitive and specific diagnostic aid in celiac disease Clin Chem 50 2370 2375 2004 Prince HE Evaluation of the INOVA Diagnostics enzyme linked immunosorbent assay kits for measuring serum immunoglobulin G IgG and IgA to deamidated gliadin peptides Clin Vaccine Immuno
10. aio estiverem fora do intervalo ou conforme for necess rio Luminex demora 30 minutos a aquecer depois de ter sido ligado Quando o per odo de aquecimento se concluir efectue as opera es de purga irriga o com lcool e lavagem recomendadas pelo fabricante Utilizar a Vers o do software IS carregue o modelo QP Celiac IgA Profile e assegure se de que todas as informa es de lote est o correctas Se for necess rio actualize as informa es do lote Os par metros no modelo s o os seguintes As cores das esferas s o h tTG 27 DGP 28 anti IgA 29 IgA 30 Os eventos por esfera s o 50 o tamanho da amostra para 50 uL o d bito para 60 uL minuto r pido e o port o para aproximadamente 7500 a 17000 Utilizam se os valores medianos para a Intensidade M dia de Fluoresc ncia MFI Introduza os nomes da amostra manualmente ou clicando em Load Pa List Carregue a placa na plataforma XY do Luminex Fa a funcionar o Luminex clicando no bot o Start Plate Quando terminar o dia execute as opera es de sanear e embeber antes de desligar o instrumento odo Antes de iniciar Para programar informa es para o equipamento automatizado contacte a Assist ncia T cnica da INOVA Diagnostics Inc Ligue o analisador de fluxo Luminex 100 ou 200 assegure se de que aqueceu e efectue todas as opera es de manuten o di rias conforme previamente descrito Se for necess rio calibre o instrumento e confirme q
11. aixo UL Negativa lt 20 Positiva fraca 20 30 Positiva gt 30 A reactividade est relacionada com a quantidade de auto anticorpo presente na esfera de forma n o linear Embora aumentos e diminui es das concentra es de anticorpos dos doentes se reflictam num aumento ou diminui o correspondentes da reactividade da fluoresc ncia a altera o n o proporcional ou seja uma duplica o da concentra o de anticorpos n o se reflecte numa duplica o da reactividade Para al m disso a quantidade total de IgA no soro de um doente afecta a MFI determinada Caso seja necess ria uma quantifica o mais rigorosa dos auto anticorpos do doente a amostra deve ser submetida a um teste quantitativo Interpreta o dos resultados A QUANTA Plex Assay consiste numa t cnica extremamente sens vel e tem capacidade para detectar pequenas diferen as em popula es de doentes Cada laborat rio deve estabelecer o seu pr prio intervalo do normal com base nas suas t cnicas controlos equipamento e popula o de doentes de acordo com os seus procedimentos estabelecidos Sugere se que os resultados reportados pelo laborat rio devam incluir a declara o Os resultados que se seguem foram obtidos com o INOVA QUANTA Plex Celiac IgA Profile Valores obtiveram com m todos de ensaio de outros fabricantes n o podem ser utilizados em substitui o A magnitude dos n veis de auto anticorpos IgA reportados nem sempre pode estar corre
12. antes e conservadas a 2 8 C Colheita da amostra Este procedimento deve ser efectuado com uma amostra de soro A adi o de azida ou de outros conservantes s amostras do teste pode interferir negativamente nos resultados As amostras de soro com contamina o bacteriana que sofreram tratamento t rmico ou contendo part culas vis veis n o devem ser utilizadas Amostras ou soro muito hemolizados ou lip micos devem ser evitados Ap s a colheita o soro deve ser separado do co gulo O documento H18 A3 da CLSI anteriormente NCCLS recomenda as seguintes condi es de armazenamento para as amostras 1 N o armazenar as amostras temperatura ambiente durante mais de 8 horas 2 Se o teste n o for conclu do num prazo de 8 horas guardar a amostra a 2 8 C 3 Se o teste n o for conclu do num prazo de 48 horas ou se houver transporte da amostra congelar a 20 C ou a uma temperatura inferior As amostras congeladas devem ser bem agitadas depois de descongelarem e antes de serem testadas Procedimento Material fornecido A A of Placa de micropo os de Celiac IgA Profile 12 1 x 8 po os com suporte 1 2 mL pronto a utilizar QUANTA Plex Negative Control pr diluido 1 2 mL pronto a utilizar Celiac IgA Calibrator pr diluido 1 2 mL pronto a utilizar Celiac IgA Positive Control pr diluido 50 mL Diluente da amostra HRP tamb m utilizado como Isento de Soro Conjugado IgA marcado com fluoresc ncia cabra a
13. anti lgA e uma esfera revestida de IgA s o misturadas em conjunto e colocadas em po os de uma placa de micropo os sob condi es que conservam os antig nios no seu estado reactivo Adicionam se os controlos pr dilu dos um controlo sem soro consistindo em diluente da amostra sem qualquer soro adicionado e soro de doentes dilu dos a micropo os separados permitindo que qualquer anticorpo DGP ou h tTG presente se ligue aos antig nios imobilizados nas esferas assim como liberta IgA para se ligar esfera anti lgA De seguida adiciona se uma IgA anti humana conjugada com uma sonda de fluoresc ncia a cada micropo o Uma segunda incuba o permite ao conjugado IgA anti humano fluorescente ligar se a quaisquer anticorpos dos doentes que se ligam aos antig nios nas esferas ou s o capturados pela esfera anti lgA e IgA na esfera de IgA As amostras s o depois medidas no analisador de fluxo Luminex Este analisador 100 ou 200 cit metro de fluxo tem capacidade para separar a cor de cada esfera assim como para medir a intensidade da fluoresc ncia do conjugado em cada esfera A intensidade da fluoresc ncia na esfera proporcional quantidade de conjugado ligado que por sua vez proporcional quantidade de anticorpos do doente ligados s esferas revestidas por antig nio ou esfera anti lgA Cada anticorpo pode ser semi quantificado atrav s da compara o da intensidade de fluoresc ncia da amostra do doente com a intensidad
14. ba o 6 As caracter sticas de desempenho do ensaio n o foram determinadas para outras matrizes al m do soro 7 A falha na manuten o dos tempos de adi o dos reagentes pode provocar um aumento Front to back das varia es dos testes Valores esperados A capacidade do teste QUANTA PlexTMCeliac IgA Profile assay para detectar anticorpos anti h tTG e anti DGP foi avaliada mediante compara o com testes ELISA dispon veis no mercado comercializados pela INOVA Diagnostics Inc Os resultados do ELISA e de cada um dos testes de QUANTA Plex Celiac IgA Profile foram considerados positivos se a amostra do doente foi igual ou superior a 20 Unidades Luminex ou Unidades ELISA e negativos se foram inferiores a 20 UL ou EU Intervalo de valores normais 278 amostras de dadores de sangue saud veis no teste QUANTA Plex Celiac IgA Profile 277 amostras normais 99 6 foram negativas na parte h tTG do teste QUANTA Plex A amostra mais elevada apresentou um valor de 29 UL O valor m dio foi de 3 2 UL com um desvio padr o DP de 1 5 O cutoff foi de 11 DP acima da m dia Todas excep o de 3 das 278 amostras normais 98 9 foram negativas na por o de DGP do teste de QUANTA Plex Celiac IgA Profile A amostra mais elevada apresentou um valor de 88 UL Os memos amostras foi tamb m positiva no DGP ELISA N o incluindo a amostra duplamente positiva o valor m dio foi de 4 4 UL com um DP de 5 8 O cutoff foi de 2 7 DP acima
15. de doentes cel acos tem a IgA deficiente Assim uma estrat gica de rastreio sens vel para as popula es em risco inclui testes para anticorpos IgA anti DGP e anti h tTG assim como testes para a defici ncia selectiva de IgA A dermatite herpetiforme DH uma doen a de pele que tal como a doen a cel aca causada pela ingest o da prote na do trigo A maioria dos doentes com DH apresenta atrofia das vilosidades jejunais id ntica encontrada nos casos de doen a cel aca e uma dieta rigorosa sem gl ten melhora tanto as les es intestinais como as dermatol gicas 8 Os m todos sorol gicos actuais como os ensaios endomisiais de gliadina nativa e tTG apresentam desempenhos decepcionantes quando usados para a DH com sensibilidades de apenas 60 75 quando comparados com os valores de 95 ou superiores para a doen a cel aca QUANTA Plex Celiac IgA Profile um teste de rastreio para anticorpos encontrados em pessoas com a doen a cel aca e com dermatite herpetiforme relacionada com dist rbios de sensibilidade ao gl ten Permite a detec o simult nea de anticorpos IgA quer para um peptideo de gliadina desamidado sint tico quer para tTG humana recombinante e ao mesmo tempo detecta uma defici ncia de IgA Princ pio do m todo O h tTG recombinante e o DGP sint tico ligam se a diferentes esferas coloridas por fluoresc ncia As duas esferas revestidas por antig nio diferentes assim como uma esfera revestida
16. e do Calibrador correspondente Atrav s da compara o das Unidades Luminex calculadas da esfera anti lgA e da esfera anti lgA pode identificar se um soro com defici ncia selectiva de IgA como abaixo descrito na interpreta o dos resultados Estas duas esferas de controlo tamb m podem utilizar se para assegurar que os resultados falsos negativos decorrentes de um erro operacional sejam detectados como descrito no Controlo de Qualidade Note que estas esferas apresentam os mesmos resultados quando uma pessoa deficiente em IgA assim como quando n o se adiciona soro ao po o neagentes Placa de micropo os de poliestireno prateado estampado na cor 12 1 x 8 tiras de micropo os com suporte contendo esferas de 4 cores diferentes Cada uma das esferas coloridas est revestida com um antig nio purificado diferente h tTG DGP anti IgA ou IgA numa embalagem de folha de alum nio contendo exsicantes 2 QUANTA Plex Negative Control 1 frasco de tamp o contendo conservante e soro humano sem anticorpos IgA humanos contra antig nios no Celiac IgA Profile pr dilu do pronto a utilizar 1 2mL 3 Celiac IgA Calibrator 1 frasco de tampao contendo conservante e anticorpos de soro humano contra os antig nios h tTG e DGP pr dilu do pronto a utilizar 1 2mL 4 Celiac IgA Positive Control 1 frasco de tamp o contendo conservante e anticorpos de soro humano contra os antig nios h tTG e DGP pr dilu do pronto a utilizar 1 2mL 5
17. e ser entre 10 e 40 UL tanto para as esferas de controlo IgA como para as anti lgA C O valor do Controlo Isento de Soro tem de ser lt 20 UL para h tTG e DGP Para a esfera anti lgA o valor tem de ser lt 5 0 UL e para a esfera IgA tem de estar entre 15 e 40 UL d A propor o das UL para Anti IgA IgA tem de ser gt 0 50 para o QUANTA Plex Negative Control e o Celiac IgA Positive Control lt 0 50 para o Controlo Isento de Soro e As esferas anti IgA e IgA utilizam se para detectar a defici ncia selectiva de IgA e para assegurar que os erros nos resultados falsos negativos do doente decorrentes de erros operacionais s o detectados Se qualquer uma das duas esferas de controlo tiver um resultado calculado inferior a 5 UL para qualquer doente em particular na Vers o IS 2 0 e superior aparecer um resultado de Novo Teste i Existe a possibilidade de o doente ter a defici ncia selectiva de IgA se os resultados para anti h tTG e DGP forem negativos que seja inferior a 20 UL e a esfera anti IgA for inferior a 5 UL enquanto que ao mesmo tempo o valor da esfera de controlo IgA seja superior a 20 UL apresentando uma propor o de anti lgA UL IgA UL 0 5 Tenha em aten o que este mesmo resultado pode encontrar se se o soro do doente n o foi adicionado ao po o ii Se ambas as esferas anti lgA e IgA forem inferiores a 5 0 UL existe a possibilidade de n o se ter adicionado o conjugado ao po o O doente deve ser testado novame
18. en o consist ncia para se obterem resultados rigorosos e reprodut veis 5 O protocolo deve ser criteriosamente respeitado 6 Uma selagem inadequada da saqueta com tiras de micropo os e dessecantes pode provocar a degrada o do antig nio e baixa precis o dos resultados te Pode ser observada uma fluoresc ncia inaceitavelmente baixa depois de m ltiplas utiliza es de um nico frasco de conjugado de fluoresc ncia durante algum tempo importante cumprir todos os procedimentos recomendados para manipula o dos conjugados fluorescentes visando prevenir esta ocorr ncia 8 A contamina o qu mica do conjugado fluorescente pode resultar de uma limpeza ou lavagem inadequadas do equipamento ou instrumentos Res duos de subst ncias qu micas vulgares de laborat rio tais como formalina lix via etanol ou detergente ir o provocar degrada o do conjugado fluorescente no decurso do tempo Lave exaustivamente todo o equipamento ou instrumentos com gua destilada ou desionizada depois da utiliza o de desinfectantes produtos de limpeza qu micos Precau es particulares de conserva o 1 Conservar todos os reagentes a 2 8 C N o congelar Os reagentes permanecem est veis at data de validade indicada quando armazenados e manipulados conforme descrito no protocolo 2 As tiras dos micropo os revestidas com antig nios que n o forem logo utilizadas devem ser seladas na embalagem protectora original com dessec
19. formando azidas met licas explosivas Por esta raz o ao deitar fora os restos de reagentes necess rio deixar correr gua em quantidade abundante para evitar a forma o destas subst ncias 4 Usar equipamento de protec o apropriado para trabalhar com os reagentes 5 Os salpicos de reagentes devem ser limpos imediatamente Observar todas as regulamenta es ambientais nacionais e locais relativas elimina o de res duos Precau es Utilizar somente para diagn stico In Vitro A substitui o de componentes do dispositivo por outros que n o perten am a este sistema pode originar resultados inconsistentes Todos os controlos s o espec ficos para o n mero de lote do kit 3 A adaptagao total ou parcial deste teste para processadores automatizados e outros aparelhos de processamento de liquidos pode dar origem a diferengas nos resultados obtidos nos testes por t cnica manual da responsabilidade de cada laborat rio garantir que o seu procedimento autom tico d origem a resultados dentro dos limites aceit veis 4 Existem v rios factores que influenciam o desempenho do ensaio Entre estes inclui se a temperatura inicial dos reagentes a temperatura ambiente a precis o e reprodutibilidade da t cnica de pipetagem a reprodutibilidade da t cnica de mistura o analisador de fluxo Luminex 100 ou 200 utilizado para ler os resultados e a dura o dos tempos de incuba o durante o ensaio necess ria especial at
20. i o de amostras a todas as 12 tiras de uma placa inteira e ir o minimizar a varia o da frente para tr s do ensaio 4 Submeter ao V rtice e depois adicionar 50uL de cada um dos controlos pr dilu dos seguintes o QUANTA Plex Negative Controlno primeiro micropo o o Celiac IgA Calibrator no segundo e no terceiro micropo os e o Celiac IgA Positive Control no quarto micropo o Tem que ser utilizada uma pipeta electr nica quando se adicionarem manualmente as amostras e se misturarem as esferas Utilize uma das sequ ncias de coordena o para adicionar os controlos conforme descrito o passo 3 Pipete vigorosamente pelo menos 30 uL do QUANTA Plex Negative Control do Celiac IgA Calibrator e o Positive COntrol para cima e para baixo quatro vezes de modo a misturar as esferas e os controlos em cada micropo o O tempo de incuba o de 30 minutos inicia se depois de adicionar o QUANTA Plex Negative Control ao primeiro micropo o 5 Prossiga imediatamente com o ensaio adicionando 5 uL do diluente da amostra HRP ao quinto po o o controlo isento de soro e 5 uL de soro do doente dilu do nos restante micropo os adequados nota tal produz uma dilui o final a 1 1010 do soro do doente Mantenha a mesma sequ ncia de coordena o utilizada no passo 4 Misture a amostra do doente dilu da e o HRP Diluente para Amostras no micropo o pipetando vigorosamente pelo menos 30 uL dos conte dos do micropo o para cima e para baixo quatro vezes
21. l 13 150 151 2006 Sugai E Vazquez H Nachman F et al Accuracy of testing for antibodies to synthetic gliadin related peptides in celiac disease Clin Gastroenterol Hepatol 4 1112 1117 2006 Collin P Maki M Keyrilainen O et al Selective IgA deficiency and celiac disease Scand J Gastroenterol 27 367 371 1992 Cataldo F Marino V Ventura A et al Prevalence and clinical features of selective immunoglobulin A deficiency in coeliac disease an Italian multicentre study Gut 42 362 365 1998 Fernandez E Blanco C Garcia S et al Use of low concentrations of human IgA anti tissue transglutaminase to rule out selective IgA deficiency in patients with suspected celiac disease Clin Chem 51 1014 1016 2005 Dahlbom I Olsson M Forooz NK et al Immunoglobulin G IgG anti tissue transglutaminase antibodies used as markers for IgA deficient celiac disease patients Clin Diag Lab Immunol 12 254 258 2005 Chorzelski TP Sulej J Tcherzewska H et al IgA class endomysium antibodies in dermatitis herpetiformis and celiac disease Ann NY Acad Sci 420 325 334 1983 Martins TB Burlingame R von M hlen CA et al Evaluation of multiplexed fluorescent microsphere immunoassay for detection of autoantibodies to nuclear antigens Clin Diagn Lab Immunol 11 1054 1059 2004 Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories Centers for Disease Control National Institutes of Health Fifth Edition 2007 Fabricado por INO
22. lacionada com um t tulo de par metro de avalia o final Para determinar se o doente tem quantidade suficiente ou insuficiente de IgA no seu soro divida a UL da esfera anti lgA pela UL da esfera IgA Se o resultado for inferior a 0 5 e o doente for negativo para ambos anti h tTG e anti DGP o deve testar se novamente a amostra para confirmar o resultado Se se confirmar que o doente tem uma quantidade insuficiente de IgA a amostra deve reflectir se para os testes IgG anti h tTG e IgG anti DGP Se for necess ria a confirma o de defici ncia em IgA a amostra deve testar se num teste IgA quantitativo Limita es do m todo A presen a de imuno complexos ou de outros agregados de imunoglobulinas na amostra do doente podem causar um aumento do n vel de liga o n o espec fica e produzir resultados falsos positivos neste ensaio 2 Nem todos os doentes com doen a cel aca e Dermatite Herpetiforme h tTG ou DGP IgA antibodies positivos 3 Os resultados deste ensaio devem ser utilizados em conjunto com as conclus es cl nicas e outros testes serol gicos 4 N o agitar adequadamente os controlos e ou as amostras de soro diluidas com as microesferas conservados na placa pode aumentar os valores de CV em rela o aos valores tipicos encontrados nos testes ELISA 5 Depois da meia hora de incuba o com o conjugado fluorescente ocorre um aumento de fluoresc ncia de aproximadamente 10 por cada meia hora adicional ao tempo de incu
23. nte para confirmar o resultado negativo 5 QUANTA Plex Negative Control O Celiac IgA Calibrator e Positive Control e as Controlo Isento de Soro para monitorizar falhas substanciais dos reagentes O Positivo alto ENA Profile 5 n o garante precis o no ponto de decis o do teste O utilizador deve recorrer ao documento C24 A3 da CLSI anteriormente NCCLS para obter instru es suplementares sobre as pr ticas do Controlo de Qualidade apropriadas C lculo dos resultados As MFI para todos os controlos e amostras do doente para cada antig nio e as duas esferas de controlo determinam se em primeiro lugar A reactividade em UL de uma determinada amostra para cada tipo de antig nio pode ser depois calculada atrav s da f rmula que se segue Divida a MFI da amostra pela MFI do Celiac IgA Calibrator para esse antig nio ou esfera de controlo e multiplique o resultado pelo n mero de ULs atribu das ao Celiac IgA Calibrator para 4 esse antig nio A UL valor do Calibrador para cada antig nio encontra se no r tulo da caixa para esse lote do kit O exemplo seguinte destina se a determinar a reactividade anti h tTG Utilize a f rmula equivalente para a esfera DGP e para as duas esferas de controlo MFI da Amostra para h tTG Valor da amostra em UL _____ __ _ x Valor do h tTG Calibrator em UL MFI h tTG Calibrator A reactividade do anticorpo em IgA para h tTG e DGP pode ent o classificar se de acordo com a tabela ab
24. nti lgA humana 7 mL QUANTA Plex Conjugate Diluent Material adicional necessario mas nao fornecido Micropipetas de 5 e 500 uL Pontas descart veis para as micropipetas Tubos de teste para dilui es de amostras de doentes volume de 1 4 mL gua destilada ou desionizada Fluido de preserva o de fluxo analisador Luminex 100 ou 200 Analisador de fluxo Luminex 100 ou 200 Pipetador electr nico de 8 canais para a dispnesa de 5 30 45 50 e 60yL ou dispositivo de pipetagem dilui o automatizado quiza o do Analisador de Fluxo Luminex 100 ou 200 CONDON Met 1 Consulte o manual do utilizador fornecido com o Luminex para instru es detalhadas sobre o funcionamento do analisador de fluxo Luminex 100 ou 200 e a Vers o Sistema Integrado IS do programa de software do Luminex ou Vers o 2 0 ou superior Para mais informa es e para a resolu o de problemas com este ensaio contacte a assist ncia t cnica da INOVA Diagnostics Inc na morada ou n mero de telefone presentes na ltima p gina do Folheto Informativo Seguem se instru es resumidas para funcionamento do analisador de fluxo Luminex 100 ou 200 Calibre o Luminex utilizando as esferas de Calibra o e Controlo da fornecidas pela Luminex Corporation pelo menos uma vez por m s e confirme que a calibra o tem sucesso Para al m disso calibre o Luminex se a temperatura de calibra o delta for superior a 3 graus se os controlos do ens
25. o Controlos DGP IgA suficiente e n o numa dieta sem n o diagnosticados gl ten com DC Tudo Luminex Positivo 18 12 30 Negativo 11 482 493 Tudo 29 494 523 Dez destes sao negativo perto ELISA Dez destes sao positivos perto ELISA Sensibilidade 18 18 11 x100 62 1 IS 53 92 Especificidage 482 12 482 x100 97 6 IS 96 99 Compara o entre os Ensaios QUANTA Plex e ELISA Calculou se a percentagem total de concord ncia relativamente positiva negativa com Intervalos de Seguran a de 95 dos ensaios anticorpo do QUANTA Plex comparada com o ELISA para todas as amostras testadas e exibe se nas tabelas abaixo h tTG IgA ELISA Positivo Negativo Tudo Luminex Positivo 174 2 176 Negativo 21 757 778 Tudo 195 759 954 Concord ncia de percentagem de positivos Concord ncia de percentagem de negativos Concord ncia de percentagem global 174 174 21 x100 89 2 84 93 757 2 757 x100 99 7 99 100 174 757 174 2 21 757 x100 97 6 DGP IgA ELISA Positivo Negativo Tudo Luminex Positivo 136 4 140 Negativo 31 783 814 Tudo 167 787 954 Concord ncia de percentagem de positivos Concord ncia de percentagem de negativos Concord ncia de percentagem global 136 136 31 x100 81 4 75 87 783 4 783 x100 99 5 99 100 136 783 136 4 31 783 x100 96 3 Detec o de quantidade insuficiente de
26. s de come ar o ensaio Coloque o n mero necess rio de micropo os tiras no suporte Volte imediatamente a colocar as tiras nao utilizadas no saco contendo exsicantes e vede com firmeza para minimizar a exposi o a vapor de gua e luz Adicionar 45uL de Diluente de Amostra HRP a cada micropo o que contenha uma amostra do doente e o Controlo sem Soro N o adicionar Diluente de Amostra HRP aos quatro primeiros micropo os uma vez que estes cont m o QUANTA Plex Negative Control O Celiac IgA Calibrator em duplicado e o Celiac IgA Positive Control N o adicione as amostras dos doentes dilu das aos micropo os neste momento Mantenha um das seguintes sequ ncias de coordena o quando adicionar controlos amostras e conjugado ao micropo os Em virtude das amostras serem lidas sucessivamente a uma taxa de aproximadamente 1 amostra a cada 19 segundos ou uma tira de 8 po os em aproximadamente 2 minutos pelo Luminex as amostras dos doentes e tamb m o conjugado devem ser adicionados aos micropo os a esta taxa para minimizar 3 qualquer varia o da frente para tr s do ensaio Se os controlos amostras ou o conjugado forem adicionados um de cada vez protele a adi o destes ao pr ximo micropo o em 19 segundos Se os controlos amostras ou o conjugado forem adicionados 8 de cada vez a uma tira protele cada adi o tira seguinte 2 minutos Estes dois esquemas de coordena o ir o demorar aproximadamente 30 minutos para a ad
27. s para cada teste Para a varia o inter ensaios analisaram se 20 amostras em 6 testes executados em 6 dias diferentes Na tabela abaixo lista se a varia o de 3 para 5 amostras representativas para cada teste Varia o intra ensaio Varia o inter ensaios Antigeno M diaLU CN Ant geno M diaLU C V h tTG 22 6 h tTG 23 9 h tTG 23 T h tTG 26 8 h tTG 31 1 h tTG 31 8 h tTG 89 9 h tTG 102 3 h tTG 255 4 h tTG DGP 17 12 DGP DGP 8 DGP DGP 8 DGP DGP 4 DGP DGP 8 DGP anti IgA 5 5 anti lgA 5 8 anti lgA 11 4 anti lgA 11 5 anti lgA 20 2 anti lgA 20 5 IgA 27 5 IgA 28 4 IgA 10 4 IgA 10 5 IgA 21 2 IgA 23 4 Refer ncias 1 2 3 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Trier JS Celiac Sprue N Engl J Med 325 1709 1719 1991 Strober W Gluten sensitive enterophy A nonallergic immune hypersensitivity of the gastrointestinal tract J Allergy Clin Immunol 78 202 211 1986 McMillan SA Haughton DJ Biggart JD et al Predictive value for coeliac disease of antibodies to gliadin endomysium and jejunum in patients attending for jejunal biopsy BMJ 303 1163 1165 1991 Valdimarsson T Franzen L Grodzinsky E et al Is small bowel biopsy necessary in adults with suspected celiac disease and IgA anti endomysial antibodies 100 positive predictive value for celi
28. ue a calibra o teve sucesso Coloque todos os reagentes e amostras do doente temperatura ambiente 20 26 C e misture bem Se o conjugado fluorescente de anti lgA humana n o tiver sido reconstitu do adicione 6mL de QUANTA Plex Conjugate Diluent ao frasco castanho contendo o p liofilizado e rode o recipiente durante aproximadamente 30 segundos para dissolver o conte do O conjugado fluorescente reconstitu do permanece est vel durante 3 meses entre 2 e 8 C N o congele Certifique se de que o recipiente do fluido de preserva o no Luminex est cheio de fluido de protec o dispon vel na Luminex Corporation e que o frasco de desperd cios est vazio Prepare uma dilui o a 1 101 de cada amostra do doente adicionando 5uL de cada soro a 500uL de Diluente para Amostras HRP e depois coloque no v rtice para misturar exaustivamente a solu o As amostras dilu das devem ser utilizadas no prazo de 8 horas depois da prepara o N O DILUA o QUANTA Plex Negative Control o Celiac IgA Calibrator e o Positive Control A determina o da presen a ou aus ncia de anticorpos IgA anti h tTG e anti DGP utilizando unidades arbitr rias e a detec o selectiva da defici ncia de IgA requer dois po os para o Calibrador e um po o para cada Controlo Negativo Positivo e Isento de Soro Recomenda se a execu o das amostras em singleto T cnica 1 Todos os reagentes devem ser colocados temperatura ambiente 20 26 C ante
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